CN109709228A - 脂质联合标志物在制备诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途 - Google Patents
脂质联合标志物在制备诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了脂质联合标志物在制备诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途，脂质联合标志物由LPI16:1、PC34:3、PE38:4p(18:0p/20:4)、PE38:5p(18:1p/20:4)、TAG50:2(16:2)、TAG51:0(17:0)和TAG54:7(22:6)7种脂质中任意两种或两种以上组合而成，作为糖尿病诊断新型标志物，通过检测受试者血清样品中上述脂质联合标志物的浓度水平，基于ROC曲线计算糖尿病发生风险，当脂质血清浓度升高时糖尿病发病风险均显著上升，检测灵敏度高、检测成本低、重复性好，用于辅助糖尿病的早期临床诊断，与传统临床诊断标志物空腹血糖和餐后血糖具有协同作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及脂质联合标志物在制备诊断糖尿病的检测试剂 或检测物的用途。
背景技术
糖尿病(DM)是最常见的慢性疾病之一，以长期慢性高血糖为其主要临床特征，随着经 济全球化和生活现代化水平的提高，糖尿病的患病率日益增加，已成为重要的全球性公共卫 生问题。据世界卫生组织(WHO)报告，在2014年全球已有4.22亿成人患有糖尿病，糖尿 病的全球患病率达8.5％，中国是糖尿病患病大国，据中国疾病预防控制中心和上海交通大学 医学院附属瑞金医院于2010年开展的一项全国调查显示，我国成人糖尿病的患病率为11.6％， 成人罹患者高达1.1亿人，糖尿病并发症多且发生率高，一旦发现难以治愈，是造成患者高 死亡率的重要原因。
目前，糖尿病的诊断主要依据血浆葡萄糖的水平，但由于血糖检测易受药物、饮食、情 绪等因素影响，波动较大，其诊断具有一定的局限性，且早期糖尿病起病隐匿，缺乏或无典 型临床症状，一经发现往往为时已晚。因此，开发具有潜力的新型诊断检测方法，预测早期 糖尿病的发生，对于降低糖尿病的发病率和死亡率具有重要意义。
近年来，代谢组学技术在糖尿病领域快速发展，色谱质谱联用技术是代谢组学的主要研 究手段，脂质组学技术是利用代谢组学技术探究脂质对结果的作用和影响，多项研究表明脂 质能够预测新发糖尿病。Framingham队列首次提出血清甘油三酯(TAG)含量升高能显著增 加糖尿病发病风险，有研究指出溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰胆碱(PC)、鞘磷脂(SM) 和磷脂酰乙醇胺(PE)等脂质均与糖尿病的发生显著相关，目前尚无将脂质联合标志物应用 于新发糖尿病检测的研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供脂质联合标志物在制备诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途，为 临床上筛查早期糖尿病提供新的辅助检测方法。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
脂质联合标志物在制备诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途。
所述的脂质联合标志物由溶血磷脂酰肌醇16:1(LPI16:1)、磷脂酰胆碱34:3(PC34:3)、 磷脂酰乙醇胺38:4p(18:0p/20:4)[PE38:4p(18:0p/20:4)]、磷脂酰乙醇胺 38:5p(18:1p/20:4)[PE38:5p(18:1p/20:4)]、甘油三酯50:2(16:2)[TAG50:2(16:2)]、甘油三酯 51:0(17:0)[TAG51:0(17:0)]和甘油三酯54:7(22:6)[TAG54:7(22:6)]中任意两种或两种以上组合 而成。
所述的糖尿病为2型糖尿病。
所述的检测试剂或为血液检测试剂。
所述的检测物或为试剂盒，且所述试剂盒中包含LPI16:1、PC34:3、PE38:4p(18:0p/20:4)、 PE38:5p(18:1p/20:4)、TAG50:2(16:2)、TAG51:0(17:0)和TAG54:7(22:6)，作为分别用于对应的 血清代谢物LPI16:1、PC34:3、PE38:4p(18:0p/20:4)、PE38:5p(18:1p/20:4)、TAG50:2(16:2)、 TAG51:0(17:0)和TAG54:7(22:6)定性的标准品。
所述的用途通过超高效液相色谱-串联四级杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪检测人血 清中所述脂质联合标志物浓度水平。
进一步地，通过检测人血清中所述脂质联合标志物浓度水平后进行ROC曲线统计分析， 并经上述ROC曲线下面积判断受试者患2型糖尿病风险。
进一步地，当ROC曲线下面积＞0.7提示受试者患有2型糖尿病的风险。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：脂质联合标志物可用于预测2型糖尿病的发 生，为临床上筛查早期糖尿病提供新的辅助检测方法和理论依据。
附图说明
图1为实施例中脂质联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图。
图2为(A)验证组贵州中心脂质联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图；(B)验证组四川中心脂质联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图；(C)验证组江西中心脂质联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图；(D)验证组湖北中心脂质联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图；(E)验证组甘肃中心脂质联合标志物用于诊断新发糖尿病的ROC曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
糖尿病的定义：空腹血糖(FBG)≥126mg/dL或餐后2小时血糖(2-h BG)≥200mg/dL， 或研究对象自报之前由专业医师诊断过糖尿病和正在服用降糖药物。
本实例先从发现人群(n＝200)中发现78种脂质与糖尿病的发生具有显著统计学意义， 采用超高效液相色谱-串联四级杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪(HPLC-MRM)对血清中 不同脂质进行检测，经校正后得到7种脂质LPI16:1、PC34:3、PE38:4p(18:0p/20:4)、PE38:5p(18:1p/20:4)、TAG50:2(16:2)、TAG51:0(17:0)、TAG54:7(22:6)，均与新发糖尿病显著 相关。
再在来自全国不同省份的5个验证中心(甘肃、四川、湖北、江西和贵州)人群(n＝724) 中对结果进行验证，发现以上7种脂质对糖尿病的发病风险仍具有显著相关性，如图2所示。
然后在ROC模型中显示，与传统诊断标志物空腹血糖(FBG)和餐后2小时血糖(2-hBG) 相比，当加上上述脂质联合标志物后，其对2型糖尿病的诊断灵敏度和特异度显著增高，曲 线下面积从0.713增加到0.795，如图1所示。
具体操作过程为：
(1)血清样品收集
所有纳入研究的志愿者在血清样品采集前均签署知情同意书。在相同条件下收集200例 (发现组)和724例(验证组)研究对象的血液标本，采集后静置60分钟后直接取血清，储 存于-80℃的冰箱中保存备用。
(2)研究对象
采用病例对照研究方法，发现组从上海市嘉定社区人群中纳入符合标准的基线葡萄糖耐 量正常(NGR)者共200例，其中包括随访后100例新发糖尿病者和100例NGR者。验证组从中国糖尿病患者的癌症风险评估纵向研究(REACTION)人群中纳入基线NGR者共724例，其中包括随访后362例新发糖尿病者和362例NGR者。纳入标准为：1)研究对象年龄 ≥40岁，2)接受口服葡萄糖耐量试验(OGTT)；排除标准：基线时已患有糖尿病或糖调节 功能受损。此外，所有受试者均接受标准的问卷调查和体格检查。
采用空腹静脉血浆标本检测FBG，OGTT-2h静脉血浆标本检测2-h BG。使用ADVIA-1650 化学自动分析仪(Bayer Diagnostics，Tarrytown，NY，USA)测量FBG和2-h BG的浓度。
表1：发现组人群的基线特征
| Case | Control | Pvalue | |
| N | 100 | 100 | |
| Age，years | 59.8±8.0 | 58.8±8.4 | 0.38 |
| Malegender，no.(％) | 36(36.0) | 36(36.0) | 1.00 |
| BMI，kg/m<sup>2</sup> | 25.2±3.3 | 25.0±2.9 | 0.70 |
| Educationno.(％) | 28(28.0) | 18(18.0) | 0.13 |
| Currentsmoking，no.(％) | 19(19.0) | 20(20.0) | 1.00 |
| Currentdrinking，no.(％) | 8(8.0) | 9(9.0) | 0.60 |
| Physicallyactive，no.(％) | 11(11.0) | 17(17.0) | 0.31 |
| Familyhistoryofdiabetes，no.(％) | 14(14.0) | 5(5.0) | 0.05 |
| SBP，mmHg | 142.1±18.9 | 139.5±18.9 | 0.34 |
| DBP，mmHg | 83.9±9.6 | 82.7±9.7 | 0.36 |
| FBG，mg/dL | 92.5±8.0 | 92.7±6.9 | 0.84 |
| 2-hBG，mg/dL | 113.1±20.9 | 102.4±20.8 | 0.0004 |
| HDL-c，mg/dL | 50.6±12.6 | 52.5±12.5 | 0.27 |
| LDL-c，mg/dL | 129.4±33.2 | 124.0±27.5 | 0.21 |
| TG，mg/dL | 107.1(83.8-150.4) | 92.9(68.0-128.2) | 0.01 |
| Fastinginsulin，uU/mL | 7.22±5.66 | 7.18±3.50 | 0.95 |
| HOMA-IR | 1.65±1.31 | 1.65±0.84 | 0.99 |
从表1结果表明，与NGR者相比，糖尿病患者基线时仅TG存在显著差异，而HDL-c 和LDL-c在组间没有统计学差异。
(3)血清样本预处理
样品在4℃条件下解冻，取20μL血清，在真空离心蒸发浓缩器中以OH模式进行干燥。 在分析前，将脂质提取物重悬于氯仿：甲醇1：1(v/v)中，并掺入适当内标物。
(4)脂质组学分析
在HPLC-MRM上构建高覆盖率靶向脂质组学方法测量血清脂质谱，共测定脂质667种。 所有脂质组学分析在与QTRAP 6500PLUS系统(Sciex)偶联的Exion UPLC系统上进行，对 样本进行质谱分析时采取随机化顺序上机，并在每30个样品之间注入质量控制样品，以确保 质控脂质的质谱信号在整个分析过程中保持在12％或更低的变异系数内。
用多元Logistic回归方程对测量的脂质进行与新发2型糖尿病的风险评估后发现，在校 正了年龄、性别、体质量指数、吸烟、饮酒、体育活动、教育水平、糖尿病家族史、收缩压 和FBG后，共有78种脂质与2型糖尿病的发生风险显著相关。在进一步校正2-h BG和TG后，结果如表1所示，共有7种脂质LPI16:1、PC34:3、PE38:4p(18:0p/20:4)、PE38:5p(18:1p/20:4)、 TAG50:2(16:2)、TAG51:0(17:0)、TAG54:7(22:6)仍然与新发糖尿病具有显著相关性。
用数据统计软件SAS进一步将LPI16:1、PC34:3、PE38:4p(18:0p/20:4)、 PE38:5p(18:1p/20:4)、TAG50:2(16:2)、TAG51:0(17:0)和TAG54:7(22:6)作为脂质联合标志物通过ROC曲线判断其对2型糖尿病的检测效果，结果如图1和2所示。
图1中，发现组结果显示，与FBG和2-h BG对诊断糖尿病发生风险的曲线下面积0.713 相比，当联合标志物用于糖尿病的预测诊断时，得到ROC曲线的曲线下面积值增高到0.795。
图2A中，验证组贵州中心结果显示，与FBG和2-h BG用于诊断新发糖尿病的曲线下面 积0.745相比，联合标志物用于诊断新发糖尿病的曲线下面积增高到0.814。
图2B中，验证组四川中心的曲线下面积由0.695增高到0.757。
图2C中，验证组江西中心的曲线下面积由0.643增高到0.702。
图2D中，验证组湖北中心的曲线下面积由0.717增高到0.781。
图2E中，验证组甘肃中心的曲线下面积由0.793增高到0.819。
以上结果表明该联合标志物具有较好的糖尿病诊断潜力，同时与临床诊断指标FBG和 2-h BG具有较好协同作用。由此可见，由上述7中脂质组成的脂质联合标志物可以作为2型 糖尿病的新型血清标志物，用于糖尿病的早期筛查与诊断，为临床上评估糖尿病的发生风险 提供辅助检测途径。
以上所述为本发明的较佳实施例，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以 凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (8)
1.脂质联合标志物在制备诊断糖尿病的检测试剂或检测物的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的脂质联合标志物由LPI16:1、PC34:3、PE38:4p(18:0p/20:4)、PE38:5p(18:1p/20:4)、TAG50:2(16:2)、TAG51:0(17:0)和TAG54:7(22:6)中任意两种或两种以上组合而成。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖尿病为2型糖尿病。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂或为血液检测试剂。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测物或为试剂盒，且所述试剂盒包含LPI16:1、PC34:3、PE38:4p(18:0p/20:4)、PE38:5p(18:1p/20:4)、TAG50:2(16:2)、TAG51:0(17:0)和TAG54:7(22:6)，作为分别用于对应血清代谢物定性的标准品。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，通过超高效液相色谱-串联四级杆静电场轨道阱高分辨质谱联用仪检测人血清中所述脂质联合标志物的浓度水平实现。
7.根据权利要求1或6所述的用途，其特征在于，通过检测人血清中所述脂质联合标志物浓度水平后进行ROC曲线统计分析，并经上述ROC曲线下面积判断受试者患2型糖尿病风险。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，当ROC曲线下面积＞0.7提示受试者患有2型糖尿病的风险。
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