CN103897035A - 用于早期糖尿病诊断的多肽标志物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于早期糖尿病诊断的多肽标志物,首先选择人外周血高丰度蛋白HSA建立体外模拟糖基化模型,优化条件下酶切,将酶切后的空白对照组样品进行18O标记,与采用16O平行处理的反应组样品1:1(v/v)混合,进行HPLC/ESI-TOF MS检测。通过对HSA肽段的定量分析,找到最不易被葡萄糖修饰的肽段如SEQ ID NO.1所示,作为内标肽段,将易发生糖基化修饰的肽段与内标肽段峰面积之比用以衡量葡萄糖敏感肽的糖基化修饰程度,通过蛋白质组学方法最终发现3条肽段FKDLGEENFK、LDELRDEGK和KVPQVSTPTLVEVSR可作为生物标志物用于糖尿病的早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地,涉及用于检测早期糖尿病的多肽标志物及其应用。
背景技术
糖尿病是一组以慢性血葡萄糖(简称血糖)水平增高为特征的代谢性疾病,是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷所引起。目前,医学上将空腹血糖和糖化血红蛋白水平作为临床诊断糖尿病的直接标准。但对于糖尿病前期的人群来讲,血糖水平并不会明显率先表现出居高不下的状态,而是由于肌体对血糖水平调节能力的下降,表现为血糖水平的忽高忽低。糖化血红蛋白的测定则通常反映人相对长期(8–12周)的血糖状况。通常情况下一旦空腹血糖和糖化血红蛋白的水平达到了病理值,则“患有糖尿病”的结论不太可能出现逆转。虽然胰岛素及其它药物在很大程度上使糖尿病及其并发症得到了有效的控制,但目前糖尿病尚不能完全治愈,因此早期诊断对于糖尿病的治疗起着至关重要的作用。
目前,医学上将空腹血糖和糖化血红蛋白的水平定义为临床诊断糖尿病的直接标准。空腹血糖大于等于7.0mmol/L或者糖化血红蛋白水平大于等于6.5%即可诊断为糖尿病。尽管这一标准是现行权威的诊断标准,但由于性别、年龄,家族病史等不同个体差异的影响,单次空腹糖或糖化血红蛋白水平偏高并不能百分之百的准确预测所有的糖尿病病例,尤其在该疾病的早期阶段。在这种情况下,其它生物标志物的发现和研究应用于糖尿病的早期诊断越来越受到人们的重视。生物标志物可用于监测一个生理或者病理的过程,也可以用于跟踪一个药理反应,一个理想的生物标志物能够鉴定疾病发展的程度、也可有效提高疾病预警的准确性,还可指导疾病的治疗,甚至可以帮助研究人员洞悉疾病的发病机制。
人的血浆蛋白来源于各种组织或细胞的分泌或者泄漏,已有研究表明血浆蛋白的动态变化反映了人的生理或病理状态的变化,因此血浆蛋白质组的变化能很好地指示机体生理或病理状况。血浆蛋白执行着人体的许多生物功能,在人类健康与疾病中有着重要的意义,人类的很多疾病都会引起血浆中蛋白质性质和含量的改变。由于血浆取材容易,且血 浆中蛋白具有许多重要的生理功能,血清中某种蛋白浓度的变化往往预示某些疾病的发生。因此,监测血清蛋白浓度对于疾病的早期诊断、病因的阐明及药物疗效的监测方面都具有重要的意义。早期发现的某种蛋白在表达数量、水平及修饰状态上出现的差异,很有可能作为疾病诊断的重要生物标志物。
在蛋白质组学中,最常用的鉴定蛋白的方法之一是基于二维凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2DE)技术和质谱联用,通常在一块胶上可以使几千个蛋白得到分离,由于其第一维是等电聚焦,采用pH梯度根据蛋白质等电点的不同使之分离,第二维是聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据蛋白质分子量的大小进行分离,故可直接反映不同蛋白质的等电点和分子量的信息,而且也能反映蛋白质异构体和翻译后修饰等变化。由于2DE是在蛋白水平上进行定量,该技术存在自身难以克服的缺陷,故人们转向在肽段水平上进行定性和定量,进而实现蛋白的定量。基于质谱技术的定量方法大体上可以分为两种,一种是无标记定量技术,另外一种是同位素标记定量技术。基于同位素标记定量技术主要包括体内代谢标记和化学标记两种。体内代谢标记指生物体的外界培养环境中某一种元素或者氨基酸被某一同位素所取代,这样在生物体生长的过程中,同位素逐渐取代自身的天然元素或氨基酸,在蛋白水平或肽段水平上形成质量差。代谢标记主要包括细菌或细胞的15N标记法和细胞培养中氨基酸稳定同位素标记法(Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture,SILAC)。
目前绝大多数生物标志物均处于蛋白水平,常见的检测手段为酶联免疫吸附法(ELISA)。酶具有较高的催化效率,因此ELISA法具有较高的灵敏度,但该方法需要预先知道生物标志物及其相应的特异性抗体,在实际应用中存在一定的挑战。鉴于此,近年来以质谱为基础的定量蛋白质组学的方法越来越多被应用与生物标志物的寻找。然而,与蛋白类生物标志物相比,肽类生物标志物可能更便于采用质谱进行检测,其原因在于,蛋白在体内可能经历多种翻译后修饰,如:磷酸化、糖基化、乙酰化等等。每一种翻译后修饰都可能改变蛋白的分子质量,从而导致质谱这一基于对分子量进行测定的仪器在检测上的困难。相反,若采用多肽作为生物标志物则不存在这个问题。
近年来,糖尿病及其并发症的生物标志物逐渐成为研究的热点之一,目前已经有许多糖尿病生物标志物被广泛报道,例如C反应蛋白、丙氨酸转氨酶、甘油三酯等。这些生物标志物的发现和检测为早期糖尿病及 其并发症的发现和治疗提供了有利依据。但在一般情况下,分析过程中的需要添加内标物使得待测物质得以准确定量。但是内标物的寻找也常常成为分析方法的难点之一,主要因为对内标的选择有诸多要求,如:内标物添加至样品中能完全溶解、不与待测组分发生反应,且内标物与待测组分在色谱保留时间上应尽可能接近。若能解决内标肽段溶解性差且容易与其他肽段存在相互反应的问题,对于下一步筛选葡萄糖敏感肽段的糖尿病多肽标志物,用于糖尿病的早期诊断具有重要意义。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种人外周血蛋白HAS中对葡糖糖不敏感的内标肽段。
本发明的第二个目的在于提供用于糖尿病早期诊断的多肽标志物。
本发明的第三个目的在于提供一种基于质谱技术的早期糖尿病诊断试剂盒。
本发明提供的用于检测早期糖尿病的内标多肽,其来源于人血清白蛋白,具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列,m/z=977.4。
本发明提供了上述内标多肽在制备早期糖尿病诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了一种筛选上述内标多肽的方法,包括以下步骤:
(1)体外糖基化样品的制备,将无菌HSA于50mM pH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液,分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37℃水浴共同孵育10、20和30天,使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照;
所述HSA的生理浓度为40mM/mL。
(2)胰酶消化,将蛋白样品溶于50mM pH8.3的NH4HCO3缓冲液中,向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的10mM DTT(二硫苏糖醇)溶液进行变性,于37℃水浴孵育4h,再加入50mM IAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团,于黑暗处反应1h,再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶,使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1,于37℃水浴孵育8~20h;
(3)18O标记,将冻干后的肽段样品溶于50~150mM pH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次冻干备用;向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H2 18O和H2 16O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶= 1~125:1,w/w),在37℃水浴中标记8~24小时;
(4)对样品分别进行HPLC/ESI-TOF MS定量分析和HPLC/ESI-Ion Trap MS定性分析;
(5)数据分析与内标肽段的选择,Agilent公司Mass Hunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ESI-TOF MS的数据特征,提取参数:保留时间8.00-45.00min;质荷比m/z300-1800;信噪比阈值S/N5;谱峰数目1000×1000;选中肽同位素分布;PeakPair软件被用于挑选相应肽段的16O/18O峰对,并计算出16O/18O峰面积的比值用于肽段的定量分析,若16O/18O峰面积的比值小于1,则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗,该肽段拥有易被修饰的糖基化位点,经过糖基化过程,生成了带有糖链修饰的新肽段;若16O/18O峰面积的比值等于1,则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗,不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点;在TOF MS数据中,发现1个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK,m/z=977.4,Rt=28.7均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到,质谱信号达到105,肽段的16O/18O峰面积比例最接近1,且SD值最小0.961±0.077,选择该肽段为内标肽段。
优选地,步骤(2)中,HSA:胰蛋白酶的质量比=50:1,于37℃水浴孵育20h。
优选地,步骤(3)中,肽段样品溶于50mM pH6.0的KH2PO4溶液中后再次冻干备用;HSA:胰蛋白酶=50:1,在37℃水浴中标记20小时
进一步地,步骤(3)还包括在标记完成后,残余的胰蛋白酶需经灭活处理,将样品在沸水中煮10分钟,再按照体积比加入5%的甲酸。
更进一步地,步骤(3)中标记体系尿素浓度控制在2M以下。
在本发明的一个实施例中,步骤(4)中样品定量分析采用Agilent1100系列高效液相色谱仪串联ESI-TOF(Agilent6210)进行。
优选地,在HPLC/ESI-TOF MS分析之前,样品需经过离心处理,离心条件为17,000×g,15min。
其中,步骤(4)所述的HPLC/ESI-TOF MS定量分析的液相色谱条件为:色谱柱为Grace C18柱,300,2.1mm×150mm;流速0.2mL/min;进样量10μg;所用流动相为:A相为含0.1%甲酸的水溶液;B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件为:3%B,0→8min;3-40%B,8→35min;40-95%B,35→40min;95%B,40→43min以及95-3%B from43→45min;Post run为10min;ESI-TOF MS条件为:以氮气作为 干燥气和雾化气,干燥气流速10L/min;干燥气温度为350℃;雾化器压力为35psi;采用正离子模式;毛细管电压为-3.5kV;毛细管出口电压160V;锥孔电压60V;MS扫描范围为m/z300-1800;
另外,步骤(4)中,对于样品的定性分析,采用HPLC/ESI-Ion Trap MS方法分析,样品定性分析的液相色谱条件和质谱ESI离子源条件与上述HPLC/ESI-TOF分析的条件相同;MS扫描范围为m/z300-1800;最大累积时间100ms,MS谱图平均2次;目标质量数900,化合物稳定性100%,阱深100%;MS/MS才有优选方法;隔离宽度4;母离子数2;母离子强度绝对阈值100000,相对阈值0.1%;动态排除2次并在0.5min释放;MS/MS碎裂电压1.2V;MS/MS谱图平均2次。
本发明还提供了一种与上述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物,其来源于人血清白蛋白,具有SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列,m/z=614.8。
本发明提供了具有SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列的多肽在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了一种与上述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物,其来源于人血清白蛋白,具有SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列,m/z=537.7。
本发明提供了具有SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列的多肽在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了一种与上述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物,其来源于人血清白蛋白,具有SEQ ID NO.11所述的氨基酸序列,m/z=820.5。
本发明提供了具有SEQ ID NO.11所述的氨基酸序列的多肽在制备糖尿病早期诊断试剂盒中的应用。
本发明提供一种用于诊断早期糖尿病的试剂盒,其工作程序为:(1)采集血液以及获得血浆;(2)将血浆样本按照进行酶切,酶切条件为:向例血浆样品中加入16μL含8M尿素的10mM DTT溶液进行变性,于37℃水浴孵育4h,再加入50mM IAA溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团,于黑暗处反应1h,再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶,使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1,于37℃水浴孵育8~20h;(3)HPLC-ESI-TOF MS检测多肽样品;(4)读取生物标志物肽段(FKDLGEENFK、LDELRDEGK和/或KVPQVSTPTLVEVSR)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的质谱峰面积,分别计算生物标 志物肽段和内标肽段质谱峰面积的比值;(5)考察比值所处的范围,判断糖尿病发生的风险程度,对早期糖尿病进行诊断:若肽段FKDLGEENFK(m/z=614.8)与内标肽段离子(m/z=977.4)峰面积之比在0.012-0.026之间,则有样品来源的宿主有较大的罹患糖尿病的风险;若比值在0.034-0.121之间,则有潜在的罹患糖尿病的风险;若比值在0.115-0.330之间,则说明宿主罹患糖尿病的风险较小。若LDELRDEGK(m/z=537.7)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)峰面积之比值在0.075-0.609之间,则样品来源的宿主有较大的罹患糖尿病的风险。KVPQVSTPTLVEVSR(m/z=820.5)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)的比值中,若比值在0.010-0.031之间,则有较大的罹患糖尿病的风险;若比值在0.021-0.100之间,则有潜在的罹患糖尿病的风险;若比值在0.070-0.289之间,则说明样品来源的宿主罹患糖尿病的风险较小。
本发明还提供了一种体外模型筛选糖尿病多肽标志物的方法,包括以下步骤:
(1)体外糖基化样品的制备,将无菌HSA于50mM pH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液40mM/mL,分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37℃水浴共同孵育10、20和30天,使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照;
(2)胰酶消化,将蛋白样品溶于50mM pH8.3的NH4HCO3缓冲液中,向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的10mM DTT(二硫苏糖醇)溶液进行变性,于37℃水浴孵育4h,再加入50mM IAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团,于黑暗处反应1h,再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶,使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1,于37℃水浴孵育8~20h;
(3)18O标记,将冻干后的肽段样品溶于50~150mM pH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次冻干备用;向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H2 18O和H2 16O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶=1~125:1,w/w),在37℃水浴中标记8~24小时,标记完成后,残余的胰蛋白酶需经灭活处理,将样品在沸水中煮10分钟,再加入5%的甲酸(v/v);在HPLC-MS进行分析之前,样品需经过高速离心处理(17,000×g,15min),以确保无不溶物进到HPLC-MS分析系统里。体系尿素浓度控制 在2M以下;
(4)HPLC/ESI-TOF MS方法对样品进行定量分析,和用HPLC/ESI-Ion Trap MS方法对样品进行定性分析;
(5)数据分析与内标肽段的选择,Agilent公司Mass Hunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ESI-TOF MS的数据特征,提取参数:保留时间8.00-45.00min;质荷比m/z300-1800;信噪比阈值S/N5;谱峰数目1000×1000;选中肽同位素分布;PeakPair软件被用于挑选相应肽段的16O/18O峰对,并计算出16O/18O峰面积的比值用于肽段的定量分析,若16O/18O峰面积的比值小于1,则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗,该肽段拥有易被修饰的糖基化位点,经过糖基化过程,生成了带有糖链修饰的新肽段;若16O/18O峰面积的比值等于1,则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗,不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点;在TOF MS数据中,发现1个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK,m/z=977.4,Rt=28.7均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到,质谱信号达到105,肽段的16O/18O峰面积比例最接近1,且SD值最小0.961±0.077,选择该肽段为内标肽段;
(6)分别考察浓度为6.0mM、24.9mM、49.8mM以及249.0mM的葡萄糖溶液,在不同孵育时间10天、20天和30天下HSA糖基化修饰的浓度依赖性,以内标肽段的单同位素峰面积为标准,用其他3反应时间延长或葡萄糖溶液浓度变大而下调的肽段单同位素峰面积之比,选择具有质谱信号强度、肽段离子在每次质谱检测中均可被稳定的捕捉到,且在HPLC/ESI-TOF MS和HPLC/ESI-Ion Trap MS检测中同时满足相同的保留时间和质荷比的误差在可接受范围内,其中ΔRt=±0.2min,一级质谱Δm/z=±0.3,侧重于表现糖基化修饰具有时间依赖性和浓度依赖性的离子,筛选得到易被修饰的葡萄糖敏感肽段。
上述方法中,在本发明的实施例中,样品HPLC/ESI-TOF MS定量分析采用Agilent1100系列高效液相色谱仪串联ESI-TOF MS(Agilent6210)进行,样品定性分析采用均Agilent1100系列高效液相色谱仪串联ESI-Ion Trap MSD。
HPLC/ESI-TOF MS分析液相色谱条件为:色谱柱为Grace C18柱(300,2.1mm×150mm);流速0.2mL/min;进样量10μg;所用流动相为:A相为含0.1%甲酸的水溶液;B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件为:3%B,0→8min;3-40%B,8→35min;40-95%B,35→40min;95%B,40→43min以及95-3%B from43→45min;Post run 为10min;ESI-TOF MS条件为:以氮气作为干燥气和雾化气(干燥气流速10L/min;干燥气温度为350℃;雾化器压力为35psi);采用正离子模式;毛细管电压为-3.5kV;毛细管出口电压160V;锥孔电压60V;MS扫描范围为m/z300-1800amu;
HPLC/ESI-Ion Trap MS分析,样品定性分析的液相色谱条件和质谱ESI离子源条件与上述HPLC/ESI-TOF分析的条件相同;MS扫描范围为m/z300-1800;最大累积时间100ms,MS谱图平均2次;目标质量数900,化合物稳定性100%,阱深100%;MS/MS才有优选方法;隔离宽度4;母离子数2;母离子强度绝对阈值100000,相对阈值0.1%;动态排除2次并在0.5min释放;MS/MS碎裂电压1.2V;MS/MS谱图平均2次。
在过往的研究中,研究者们的传统观点普遍是认为功能性蛋白为低丰度蛋白,因而生物标志物也会来自低丰度蛋白,因而研究思路也往往偏离了本发明的方向。而本发明的主要创新之处在于选择了高丰度蛋白作为研究对象,研究发现,糖基化反应属于非酶催化的化学反应,不具有选择性。因此外周血高丰度蛋白有更高的概率被葡萄糖所修饰,而修饰的程度则反映体内尚未代谢掉的葡萄糖的水平,且血糖的改变也会在蛋白上得到体现,因而可以比测量血糖水平更敏锐的发现罹患糖尿病的趋势,同时规避了低丰度蛋白在检测上的困难,包括难以达到准确定量等不利因素。
本发明筛选并验证得到了一组有效、典型葡萄糖敏感肽段,这既弥补了单一生物标志物特异性不高、准确性欠佳等问题,又创新性的提出了用HSA自身酶切得到葡萄糖不敏感肽段作为内标,以葡萄糖敏感肽段和内标肽段峰面积之比作为糖基化修饰程度指标,这一新思路巧妙地解决了临床样品中存在较大个体差异,而使得相对定量存在较大困难的问题。本发明提出了定量肽类生物标志物作为临床糖尿病早期诊断的新策略,获得了预防和监测糖尿病的相关指标。这对于糖尿病的早期诊断和有效干预有重大意义和光明的前景。
附图说明
图1为不同胰蛋白酶与HSA的比例对酶解效率的影响图。
图2为不同酶解时间对酶解效率的影响图。
图3为18O标记与未标记肽段单独分析或1:1(v/v)混合分析质谱图:图3A为HSA酶切所得肽段m/z=537.7经18O标记后的质谱图。其中I0(m/z=537.7)为未标记18O原子的肽段的单同位素峰;I1(m/z=538.7) 为标记一个18O原子的肽段的单同位素峰;I2(m/z=539.7)为标记一个18O原子的肽段的单同位素峰。图3B1:1(v/v)混合分析时所得肽段(m/z=614.8,z=2)的16O-18O质谱峰对,18O标记与未标记肽段的单同位素峰其质量数相差4Da。图3B显示的是HSA肽段(m/z=614.8,z=2)在18O标记和未标记样品1:1(v/v)混合分析时的质谱图。其16O/18O峰面积的比值,按照简化后的方法仅计算单同位素的峰面积,应为m/z=614.8的峰面积比上m/z=616.8的峰面积等于0.81。
图4不同尿素浓度对标记比例的影响图,其中图4A可被稳定检测到的57个酶切后HSA肽段,在不同尿素浓度下标记比例的平均值;图4B标记比例值最低的4个肽段,其标记效率对尿素浓度的变化趋势。
图5标记缓冲液pH值、浓度以及酶切终止方式对标记比例的影响图,其中图5A标记缓冲液pH值对标记比例的影响;图5B为KH2PO4-K2HPO4浓度对4个标记比例最低的肽段的影响;图5C为使用甲酸终止酶解对后续标记步骤标记比例的影响。
图6标记时间对标记效率的影响。
图7为优化条件下57个可被稳定检测的HSA肽段标记效率的分布情况。
图8不同孵育时间与不同葡萄糖浓度下的葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的16O/18O相对峰面积比例。
图9为比较的方法示意图,其中比例1是与葡萄糖共育的葡萄糖敏感肽段与内标肽段的峰面积之比,这一比值越小说明糖基化的程度越高;比例2是对照组葡萄糖敏感肽段与内标肽段的峰面积之比,这一比例用于校正不同肽段之间由于其它因素导致的差异,如离子化效率等;而最终衡量一个葡萄糖敏感肽段的变化的比例为比例1与比例2之比。
图10为HSA与不同浓度葡萄糖溶液发生糖基化反应的情况,图10A为HSA肽段与葡萄糖溶液共育10天后各肽段的16O/18O峰面积之比;图10B为HSA肽段与葡萄糖溶液共育20天后各肽段的16O/18O峰面积之比;图10C为HSA肽段与葡萄糖溶液共育30天后各肽段的16O/18O峰面积之比。
图11软件模拟内标肽段与葡萄糖敏感肽段在HSA空间结构中的位置图。
图12为混合血浆样品中葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK在不同孵育时间与不同葡萄糖浓度下的 16O/18O相对峰面积比例。
图13HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段FKDLGEENFK,其中图13A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段FKDLGEENFK在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况;图13B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况;图13C为肽段FKDLGEENFK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。
图14是肽段ETYGEMADCCAK与6.0mM葡萄糖共孵育10天的质谱图。
图15HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段YLYEIAR,其中,其中图15A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段YLYEIAR在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况;图15B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段YLYEIAR在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况;图15C为肽段YLYEIAR在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。
图16HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段LDELRDEGK,其中图16A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段LDELRDEGK在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况;图16B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段LDELRDEGK在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况;图16C为肽段LDELRDEGK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。
图17HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段LSQRFPK,其中图17A为HPLC-MS检测混合血浆样本中目标肽段在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况;图17B为HPLC-MS检测混合血浆样本中目标肽段在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况;图17C为肽段LSQRFPK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。
图18HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段LVTDLTK,其中图18A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段LVTDLTK在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况;图18B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段LVTDLTK在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况;图18C为肽段LVTDLTK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。
图19HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段DVFLGMFLYEYAR,其中图19A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽 段DVFLGMFLYEYAR在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况;图19B为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段DVFLGMFLYEYAR在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况;图19C为肽段DVFLGMFLYEYAR在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。
图20HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段RHPDYSVVLLLR。
图21为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段CCAAADPHECYAK在不同孵育时间下被不同浓度葡萄糖修饰的情况。
图22A为HPLC-MS检测混合血浆样本中肽段CCAAADPHECYAK在浓度葡萄糖存在下于不同孵育时间被修饰的情况。
图22B为肽段CCAAADPHECYAK在不同孵育时间下与不同浓度葡萄糖共育后经HPLC-MS检测的质谱峰图。
图22C HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段KVPQVSTPTLVEVSR。
图23HPLC-MS检测混合血浆样品体外模型中的肽段CCTESLVNR。
图24为糖尿病肽类生物标志物临床验证实验流程图。
图25临床样品中内标肽段离子m/z=977.4峰面积信息的获得。
图26临床样品不同组别中检测目标肽段FKDLGEENFK。
图27临床样品不同组别中检测目标肽段YLYEIAR。
图28临床样品不同组别中检测目标肽段LDELRDEGK。
图29临床样品不同组别中检测目标肽段LVTDLTK。
图30HPLC-MS无法实现T2DM临床样品中肽段DVFLGMFLYEYAR的检测。
图31临床样品不同组别中检测目标肽段KVPQVSTPTLVEVSR。
图32糖尿病肽类生物标志物候选物在HSA上空间位置。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的生物化学试剂均为常规市售试剂,实施例中所用的仪器耗材均为市售;若未特别指明,实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1体外建立基于HAS单一蛋白筛选葡萄糖敏感肽段的模拟体内糖基化模型
1、体外糖基化样品的制备
体外糖基化样品的制备基本可依据文献报道的方法【Sattarahmady,N.,et al.,Formation of the molten globule-like state during prolonged glycation of human serum albumin.[J].Biochim Biophys Acta,2007.1770(6):p.933-42】。将未经修饰的人血清白蛋白(HAS)(纯度≥96%,购自北京拜尔迪生物技术有限公司)于50mM PBS(pH7.4)缓冲液中配成生理浓度的溶液(40mM/mL),分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37℃水浴共同孵育10天、20天和30天,使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415。4个葡萄糖浓度分别依据生理葡萄糖浓度(~12.05%糖基化位点覆盖率)、理论50%糖基化位点覆盖率、理论100%糖基化位点覆盖率以及葡萄糖过量5倍而设计。每个浓度和孵育时间下分别制备三个平行样品,以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照。所有溶液事先均经过无菌处理,方法如下:在超净工作台中,使用0.2μm无菌针头式过滤器(PALL,Φ13mm,Supor亲水性聚醚砜膜)过滤除菌,将样品转入经无菌处理的离心管中,密封。且共育过程中,使用对二甲苯作为抑菌剂对溶液进行液封。孵育结束后的样品,经冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中备用。
2、胰蛋白酶消化条件的考察及优化
实现完全酶解及保持酶解效率的稳定性是本发明的基础,有必要对酶解条件进行优化,主要针对以下两个方面。
2.1考察最佳的HSA与胰蛋白酶比例
为了了解最适宜的酶解时胰蛋白酶与HSA的比例,在固定了酶解时间为24h(保证充分酶解)的前提下,分别采用了trypsin:HSA=1:125、1:100、1:50、1:25以及1:10(w/w)五个条件进行测试,结果如图1所示:
在HSA酶解后进行HPLC/ESI-TOF分析时,随机选择了不同保留时间的肽段峰面积计算蛋白的酶解效率,在对比胰酶用量对酶切进行的影响时,每个比例下的进样均选择相同的肽段。在图1中,横坐标为胰蛋白酶用量从少到多的5个比例,纵坐标为胰蛋白酶与HSA不同比例下,HSA酶解效率与trypsin:HSA=1:50(w/w)时酶解效率的比值。从图1所示的结果来看,随着胰蛋白酶用量的增加,酶解效率从trypsin:HSA=1:125至1:50(w/w)逐渐增加,当胰蛋白酶的用量超过trypsin:HSA=1:50 (w/w)时,酶解效率不随胰酶用量的增多而提高,因此过多的胰酶使用量只能带来胰酶的浪费。经过考察,最佳的胰蛋白酶与HSA比例为1:50(w/w)。
2.2考察最佳的酶解时间
将HSA变性、封闭,加入胰酶之后在37℃水浴孵育,按设计的时间点取样,进样至HPLC/ESI-TOF MS,按照肽段的峰面积计算酶解效率,情况如图2所示。
图2的横坐标表示不同取样时间点,纵坐标为不同酶解时间下,HSA酶解效率与酶解16小时酶解效率的比值。从图2所示的结果来看,随着酶解时间的延长,酶解效率从0.5h至16h逐渐增加,当酶解时间超过16h以后,无论孵育时间延长多久,酶解效率不再随时间的延长而提高,而是稳定在一个平衡的状态。但是,最终的实验方案将酶解时间定为20h,这是为了确保HSA得到充分的酶解。
3、18O标记条件的考察及优化
用分步法分别实现蛋白的酶解和酶解后肽段的18O标记。在第一步的酶解过程中,需要引入尿素作为变性剂,使得蛋白结构变松散,有利于酶切位点的识别,而尿素会滞留在反应体系内,对接下来的18O标记过程具有一定的干扰作用。因此需考察标记反应时体系内的尿素浓度对标记效率的影响。标记缓冲液的条件也需要被考察,包括缓冲液的pH值及其浓度。pH值直接关系到催化标记反应的胰酶的活性,因此pH值的选择可能对标记效率有很大影响。此外,标记时间对18O标记效率也具有一定影响,时间过短达不到最大标记比例;时间过长亦不会对提高标记效率起到有利作用。最终,还要对优化条件在完成的18O标记的标记质量进行评估,以确定可达到稳定且高效率的标记。
不同的肽段由于其氨基酸序列不同,会有空间结构上的差异,以至于被胰酶催化进行18O标记的活性也不同,因此不同种类的肽段的标记效率也存在差异。但尽管如此,标记作为一个可逆反应,不同肽段在达到标记平衡时所能获得的最大标记比例是相同的。其原因在于,当达到标记平衡时,标记比例不再取决于胰酶催化的活性,而只与H2 18O纯度有关。对于本发明使用的97%的H2 18O而言,达到标记平衡时所标记上2个18O的最大比例为:97%×97%=94.09%。标记的速率不同,到达最大标记比例所用的时间就不同。
肽段经过18O标记后,由于无法实现完全标记因而存在三种类型的肽段:未标记上18O原子的肽段、标记上一个18O原子的肽段和标记上 两个18O原子的肽段,如图3A所示。在本发明中,标记比例指的是标记上两个18O原子的肽段占总肽段的百分比;而相对标记效率指的是标记比例与理论最大标记效率的相对比值。于是在本发明中,标记效率被定义为相对标记比例。为了简化计算,拟采用单同位素峰的峰面积来计算标记比例,计算方法如下:
其中:
E:18O标记比例;
I0:未标记18O原子的肽段的单同位素峰的峰强度
I1:标记一个18O原子的肽段的单同位素峰的峰强度
I2:标记两个18O原子的肽段的单同位素峰的峰强度
由于同位素峰之间存在叠加的情况,导致理论上18O1峰与18O2峰所对应的肽段不完全是18O1肽段与18O2肽段。但由于绝大多数肽段标记后的情况如图3A所示,18O0峰与18O1峰相对于18O2峰较小,因此本发明认为同位素峰对于18O2单同位素峰的影响小到可以在计算中忽略不计,因而此处近似认为I2等于18O2峰的峰面积,I1等于18O1峰的峰面积,而I0在本发明中因为太小而忽略不计。
差异肽段的选择是建立在16O标记的糖基化肽段与18O标记的空白对照肽段质谱峰面积的比值变化的基础上的,因此保证肽段18O标记的标记效率高且稳定,是这一相对定量方法具有可信度的前提。基于这一需要,有必要对18O标记条件进行考察及优化,包括对体系内尿素浓度、标记缓冲液pH值及其浓度、标记时间、回标问题等因素的考察。
3.1尿素浓度对标记效率的影响
尿素作为一种变性剂,用于破坏蛋白的二级结构;而酶的催化活性又与蛋白的空间结构相关。因此,尿素浓度的增加,会导致胰蛋白酶催化标记活性受到抑制,从而使得标记效率下降。在先前的酶解反应中,8M尿素首先被加入到体系内作为变性剂,而酶切时已将其稀释到1M。但对于酶切后的HSA肽段在标记时,尿素浓度对标记反应的影响仍需进行考察。图4A显示了可被稳定检测到的57个酶切后的HSA肽段(总结于表2)不同尿素浓度情况下,于37℃标记24h后标记比例的平均值。
由图4A可见,当尿素浓度由0.5M上升至1M时,标记比例有略微升高;继而当尿素浓度升至2M时,标记比例随之下降;当尿素浓度继续升高至3M及4M的过程中,标记比例显著下降。且由图可知,标记比 例的SD值也随尿素浓度的增加而增大,这说明随着标记比例的下降,不同肽段之间标记比例的差异性也在增大。
虽然标记比例在尿素浓度增加到3M或4M时下降极为显著,但在尿素浓度为0.5-2M之间变化较小,这表明尿素浓度在2M以下对标记比例影响较小。尿素浓度从1M增加到2M对标记效率的影响,不能通过标记比例平均值的变化反映出来,这是因为多数肽段的标记已达到或者十分接近标记平衡。达到标记平衡的肽段,不能反映不同标记条件对标记效率的影响,因此可通过考察标记比例较低的尚未达到标记平衡的肽段来反映。图4B显示了57个肽段中标记比例值最低的4个肽段,在尿素浓度由0.5M增加到2M时标记比例的情况。由图可知,这4个肽段的标记比例,均随尿素浓度的上升而下降,表明尿素在从0.5M升至2M的过程中,会在一定程度上抑制标记速度。但尽管如此,在0.5-2M这个尿素浓度范围内受影响的肽段只占总体很小的一部分,且随尿素浓度的上升而下降的程度也并不十分显著,就此可认为绝大多数HSA肽段在2M尿素浓度下标记24h均可达到或者接近标记平衡,这表明尿素浓度在2M以下是较为适宜的条件。为保险起见,在后面的标记过程中将体系尿素浓度控制在1M以确保不会影响标记效率。
3.2标记缓冲液pH值及其浓度对标记效率的影响
图5显示了在尿素浓度为1M、标记24h条件下不同标记缓冲液pH值对标记比例的影响。图5A反映了随着100mM KH2PO4-K2HPO4缓冲液的pH值从4.0增加到7.0,57个稳定出现的HSA肽段的标记比例情况。尽管胰蛋白酶在弱碱性条件下具有更佳的催化活性,但由图可知,绝大多数肽段的标记比例却在pH6.0时达到最佳。图5B显示了,pH6.0的KH2PO4-K2HPO4缓冲液浓度从50mM增加到150mM时,57个HSA肽段标记比例最低的4个肽段,其标记比例并无明显的上升或下降趋势,这说明50-150mM的浓度对标记效率并无明显影响。考虑到将来在HPLC-MS分析前并无单独的脱盐步骤,而是为了简化分析过程采用在线脱盐的方法,而盐的浓度过高对色谱柱及离子化效率都有负面影响,尽可能选择盐浓度较小的缓冲液,即50mM KH2PO4-K2HPO4。图5C显示了,在酶解步骤结束后,加入甲酸终止酶解会对后续的18O标记步骤产生非常不利的影响。因为甲酸不能被真空冷冻干燥除去,滞留在体系内的甲酸会降低标记缓冲液的pH值从而使标记效率降低。在本实验室前人的工作中,已经考察过甲酸的加入对于其它蛋白酶切肽段标记效率的影响,也得出了相应的结论。本发明得出了较为适宜的标记缓冲液条件, 即50mM KH2PO4-K2HPO4,pH~6.0。
3.3标记时间对标记效率的影响
在上述已优化的条件下(即:稀释尿素浓度至1M;50mM KH2PO4-K2HPO4标记缓冲液pH~6.0),将HSA酶切肽段于37℃进行标记。图6显示了不同标记时间点检测到的57个稳定出现的肽段的标记比例的平均值。
由图6可知,在前16h中,随着标记反应时间的延长,肽段标记比例的平均值逐渐上升;其SD值逐渐减小,这说明肽段间标记比例的差异随时间的延长逐渐减小。16h后,绝大多数肽段达到最大标记比例,更长的标记时间并不能提高标记比例。因此本发明认为16h为适宜的标记时间,在实际操作中为了确保完全标记,因而采用标记20h。
3.4回标情况的考察
由于18O标记反应为可逆反应,当将18O标记肽段再置于H2 16O水中时,仍可使标记的肽段回标至16O的状态,因此回标是18O标记后的常见问题。在本实施例中,标记肽段将会与未标记的肽段1:1(v/v)混合进行HPLC-MS分析,为了避免生回标现象的发生,须在标记后对胰酶进行彻底地灭活。目前有文献报道的抑制回标的方法主要有酸中止法、超滤胰酶法和微波胰酶灭活法,但三者都不能完全抑制胰酶活性,18O标记后的样品置于H2 16O中仍能发生一定程度的回标。为了达到彻底灭活的效果,本实施例采用先将样品在沸水浴煮10min,再向样品中加入体积分数为5%甲酸的双重灭活步骤。表1列出了随机挑选的10个肽段,18O标记后经过上述双重灭活步骤,分别检测其与等体积H2 16O混合前后的标记效率。
表1胰酶灭活后18O标记肽段与等体积H2 16O混合前后的标记效率
通过对比可以看出,18O标记肽段在与H2 16O混合前后的标记效率并无明显差异,这说明灭活方法能够使得标记后样品中的胰酶被充分灭活,基本保证了无回标情况的发生。
3.5优化条件下18O标记质量的评估
在尿素浓度为1M和50mM KH2PO4-K2HPO4的标记缓冲液条件下标记20h后,57个可被稳定检测的HSA酶切肽段的平均标记效率达到98.5±0.7%(这一结果高于理论最大标记效率,是因为软件提取肽段质谱峰时引入误差所致)。该57个肽段的标记效率分布如图7所示。所有肽段的标记效率均在92%以上,而且绝大多数肽段的标记效率集中分布于99-100%,有高达97%的肽段标记效率超过了95%。这一实验结果表明,优化后的标记条件可得到更好的标记效果。从肽段标记效率的分布情况看,绝大多数肽段在上述标记条件下,已达到或十分接近标记平衡。
相同的HSA酶解标记后样品连续进样5针,计算57个可被稳定检测肽段的标记效率,其日内精密度为0.91%。连续进样5天考察其日间精密度为1.83%。
4、HPLC-MS分析
4.1HPLC/ESI-TOF MS分析
样品定量分析采用Agilent1100系列高效液相色谱仪串联ESI-TOF(Agilent6210)进行;液相色谱条件为:色谱柱为Grace C18柱(300,2.1mm×150mm);流速0.2mL/min;进样量10μg;所用流动相为:A相为含0.1%甲酸的水溶液;B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件为:3%B,0→8min;3-40%B,8→35min;40-95%B,35→40min;95%B,40→43min以及95-3%B from43→45min;Post run为10min。ESI-TOF MS条件为:以氮气作为干燥气和雾化气(干燥气流速10L/min;干燥气温度为350℃。雾化器压力为35psi);采用正离子模式;毛细管电压为-3.5kV;毛细管出口电压160V;锥孔电压60V;MS扫描范围为m/z300-1800amu。
4.2HPLC/ESI-Ion Trap MS分析
样品定性分析采用与上述相同的Agilent1100系列高效液相色谱仪 串联ESI-Ion Trap(Agilent MSD trap)质谱。液相色谱条件和质谱ESI离子源条件与上述HPLC/ESI-TOF分析的条件相同;MS扫描范围为仍为m/z300-1800;最大累积时间100ms,MS谱图平均2次;目标质量数900,化合物稳定性100%,阱深100%;MS/MS才有优选方法;隔离宽度4;母离子数2;母离子强度绝对阈值100000,相对阈值0.1%;动态排除2次并在0.5min释放;MS/MS碎裂电压1.2V;MS/MS谱图平均2次。
5、数据处理
Agilent公司Mass Hunter软件的MFE(Molecular Feature Extraction)算法被用于提取HPLC/ESI-TOF MS的数据特征。提取参数:保留时间8.00-45.00min;质荷比m/z300-1800;信噪比阈值S/N5;谱峰数目Mass spectral peaks to use1000×1000;选中肽同位素分布(peptide isotope distribution)。
PeakPair软件被用于挑选相应肽段的16O/18O峰对,并计算出16O/18O峰面积的比值用于肽段的定量分析。在此分别关注了两种峰面积的比值。若16O/18O峰面积的比值小于1,则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗,该肽段很有可能拥有易被修饰的糖基化位点,经过糖基化过程,生成了带有糖链修饰的新肽段;若16O/18O峰面积的比值等于1,则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗,很可能不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点。
6、HSA肽段的匹配与鉴定
将与葡萄糖共育的HSA样品和对照组样品分别在上述步骤2、3项优化条件下进行酶解和标记(其中糖基化HSA在H2 16O中标记,对照组样品在H2 18O中标记),将相应的两组样品进行1:1(v/v)混合后进样至HPLC/ESI-Ion Trap MS得到其MS和MS/MS信息。质谱检测数据经MASCOT Distiller软件处理生成*.mgf文件,以MASCOT2.1搜索引擎于Swiss-Prot数据库检索进行蛋白的匹配。其中MASCOT检索参数设置如下:允许的漏切位点为1;MS质量数误差为2Da;MS/MS质量数误差为0.8Da;固定修饰为Carbamidomethyl(C);可变修饰为Oxidation(M);如若所分析的样品含有18O标记的数据,可变修饰还应选择18O2标记;肽段电荷为:2+and3+。
经匹配得知肽段覆盖率达到了83%,与文献报道【Barnaby,O.S.,et al.,Quantitative analysis of glycation patterns in human serum albumin using16O/18O-labeling and MALDI-TOF MS.[J].Clin Chim Acta,2011.412(17-18):p.1606-15】的覆盖率相似,具有较高可信度,表2列出了每 次质谱分析和MASCOT检索均可被稳定检测到的57个未经修饰的HSA肽段。通过比较发现,随着葡萄糖浓度增加或孵育时间的延长,肽段的覆盖率也会随之下降。分析原因为随着葡萄糖浓度增加或孵育时间的延长,蛋白糖基化程度逐渐加剧,因而蛋白上有更多的糖基化位点(精氨酸或赖氨酸)被修饰。因胰酶的酶切位点同样是精氨酸或赖氨酸,糖基的存在使得胰酶无法识别该酶切位点而不易被酶切,所以酶切位点会移至下一个赖氨酸或精氨酸。而随着糖基化程度的逐渐加剧,未被修饰的肽段越来越少,因此肽段与数据库匹配后的覆盖率也会有所下降。
表2MASCOT检索未经修饰的HSA肽段
7、体外模拟糖基化过程考察葡萄糖对HSA的修饰
将HSA与葡萄糖溶液在37℃共同孵育,在体外建立模拟体内糖基化的模型,用以研究葡萄糖对HSA的修饰。随着葡萄糖浓度的增加或孵育时间的延长,HSA糖基化程度逐渐加剧,酶切后可能出现以下三种不同类型的肽段:1)葡萄糖不敏感肽段,即存在糖基化位点,但位点不易被葡萄糖修饰;2)已被葡萄糖修饰的葡萄糖敏感肽段,即存在糖基化位点,且位点已被葡萄糖修饰;3)未被葡萄糖修饰的葡萄糖敏感肽段,即存在糖基化位点,且位点尚未被葡萄糖修饰。在本发明中,既可以用糖基化反应后新生成的糖基化-HSA肽段的增加来表征蛋白糖基化的程度,又可以用未经修饰的HSA肽段在反应中的消耗情况来表征HSA的糖基化程度。相比这两类肽段,本发明认为未经葡萄糖修饰的肽段在MASCOT检索时,易获得更高的得分,因此有利于分析方法获得更高的可靠性。
采用18O标记的蛋白质组学方法在体外糖基化模型中寻找第一类与第三类肽段。将孵育后的对照组与反应组HSA分别在优化条件下进行酶切,继而在优化条件下分别在H2 18O和H2 16O配制的PBS缓冲液中完成标记后,将相应的糖基化HSA肽段与未经修饰的HSA肽段样品进行1:1(v/v)混合,将混合样品进样至HPLC/ESI-TOF MS进行定量分析,参见本实施例第4.1项。
7.1内标肽段的选择
在TOF MS数据中,本发明发现了一些第一类肽段,总结于表3中。
表3葡萄糖不敏感肽段
表3所示的三个葡萄糖不敏感肽段均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到,其中肽段离子m/z=927.6和977.4的质谱信号更强可达到105,有利于保证定量分析的准确度。最终本发明选择肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4,Rt=28.7)作为内标肽段,主要因为与4种不同浓度的葡萄糖溶液分别共育了10,20和30天后,经ESI-TOF MS检测(不同葡萄糖浓度和孵育时间有3个平行样品,共36个样品;每个样品平行进样2次,共72次进样),该肽段的16O/18O峰面积 比例最接近1,且SD值最小(0.961±0.077),如图8所示。经MASCOT检索,肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的得分为40,其假阳性结果出现的概率较低,具有较高可信度。
通常定量分析中的内标物是需要额外添加的,这对内标物有诸多要求,比如:内标物添加至样品中能完全溶解、不与待测组分发生反应,且内标物与待测组分在色谱保留时间上应尽可能接近。在本发明中,上述这些问题都因找到“内标肽段”而巧妙地解决了。肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(SEQ ID NO.1)是HSA蛋白本身酶切所得肽段,因此不存在溶解性差的问题,酶切后它与其它肽段也不存在相互反应的问题,HPLC分析的保留时间28.7min,也基本处于所有肽段保留时间的中间值。
7.2HSA肽段发生糖基化修饰的情况
HSA共有83个糖基化位点,分别为59个赖氨酸,23个精氨酸以及N-端自由胺基。本发明设计HSA分别与不同浓度的葡萄糖溶液共同孵育,以建立体外糖基化模型。葡萄糖溶液浓度的选择见表4。
表4葡萄糖溶液浓度的选择
a生理葡萄糖浓度
其中249.0mM的葡萄糖溶液是葡萄糖大大过量的糖基化条件,选择这样的葡萄糖浓度旨在加速糖基化进程。由于糖尿病是一种慢性疾病,其病理过程通常要经过几年甚至更长的时间。为了研究需要,可在短期内考察蛋白糖基化的情况,本发明选择这一远远高于病理值的葡萄糖浓度,使体外共育的样品尽快生成糖基化产物。49.8mM和24.9mM分别为理论糖基化位点覆盖率达到100%和50%时葡萄糖溶液的浓度,选择这两个葡萄糖浓度,旨在考察HSA在中等浓度的葡萄糖条件下以及葡萄糖相对不足的情况下,哪些位点更易发生糖基化修饰。而6mM的葡萄糖溶液是正常人的生理葡萄糖浓度,在该葡萄糖浓度下,短期的孵育可能仅仅会有少数几个肽段发生糖基化反应,但这些糖基化位点十分敏感的肽段对指导临床研究有着非同寻常的意义。下面分别讨论在不同孵育时间条件下以及不同葡萄糖浓度下,HSA发生糖基化修饰的情况。
内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的浓度不随糖基化的加剧而变化,因此在用m/z=977.4的单同位素峰衡量其它葡萄糖敏感肽段在不同葡萄糖浓度以及不同孵育时间条件下,发生糖基化修饰的程度。比较的方法如图9。
本发明选择了4个不同浓度(6.0mM、24.9mM、49.8mM以及249.0mM)的葡萄糖溶液,分别考察在不同孵育时间(10天、20天和30天)下HSA糖基化修饰的浓度依赖性,各肽段的16O/18O峰面积之比随葡萄糖浓度的变化情况如图10所示。由图10可以看出,葡萄糖溶液浓度越大,HSA来源各肽段的16O/18O峰面积之比越低,说明这些肽段发生糖基化反应转化率升高,HSA被修饰的程度随着葡萄糖浓度的增大而增加,因此葡萄糖对HSA的糖基化修饰具有浓度依赖关系。
由图10A可知,糖基化反应进行10天,共有22个肽段被检测到有 16O/18O峰面积之比降低的趋势。肽段YICENQDSISSK(m/z=694.3)的趋势在10天的反应结果表现反常,但是在20及30天的结果中也呈现峰面积之比随葡萄糖溶液浓度增加而减小的趋势。反应20天后,16O/18O峰面积之比较反应10天时普遍更低,体现了糖基化的浓度依赖性。其中肽段ECCEKPLLEK(m/z=596.8)、QNCELFEQLGEYK(m/z=801.0)和AVMDDFAAFVEK(m/z=672.8)在葡萄糖过量(249.0mM)的情况下,已检测不到,如图10B所示。而肽段TYETTLEK(m/z=492.3)和QTALVELVK(m/z=500.9)仅仅在被生理浓度葡萄糖修饰后的样品中可被检测到,而在与更高的葡萄糖浓度孵育后都无法被质谱检测到。这说明,上述这些肽段的对葡萄糖非常敏感,反应相对迅速,在反应20天后就已经被消耗殆尽。同样如图10C所示,肽段QNCELFEQLGEYK(m/z=801.0)与生理浓度以及24.9mM葡萄糖溶液共育后30天的样品,仍可被质谱检测,而与两个高浓度的葡萄糖溶液共育的样品则无法检测到;而肽段ECCEKPLLEK(m/z=596.8)、TYETTLEK(m/z=492.3)、QTALVELVK(m/z=500.9)和AVMDDFAAFVEK(m/z=672.8)则完全无法被稳定检测到。这表明以上这些肽段具有非常易被修饰的糖基化位点:K310、K383、K426、K558和K581。证明本发明建立的体外糖基化模型具有较高的可靠性,而糖基化位点K383尚未见文献报道,是在本发明中新发现的易于被葡萄糖修饰的糖基化位点。
7.3体外模型糖尿病肽类生物标志物候选物的筛选标准
分别采用HPLC/ESI-TOF MS和HPLC/ESI-Ion Trap MS进行肽段的定量分析以及肽段的来源和序列鉴定,已检测到大部分肽段具有糖基化 的时间、浓度依赖性,且共鉴定出57个HSA来源的肽段。在上述实验结果中筛选出一些葡萄糖敏感肽段作为糖尿病生物标志物的候选物,筛选标准如下:
①肽段离子在每次质谱检测中均可被稳定的捕捉到,这一标准意味着须同时满足蛋白酶解的稳定性与HPLC-MS检测稳定性,是生物标志物候选物得以被筛选出的最基本的条件;
②肽段离子在HPLC/ESI-TOF MS和HPLC/ESI-Ion Trap MS检测中须同时满足相同的保留时间和质荷比的误差在可接受范围内,其中ΔRt=±0.2min,一级质谱Δm/z=±0.3。这里需要说明的是,其中Ion Trap MS质量分析器的分辨率相对较低,会引起相对较大的m/z误差,在本研究中即使一个肽段离子在两次质谱运行中表现出一定的m/z差异(±0.3),只要其两次色谱行为的保留时间相近(±0.2min),认定是两次HPLC-MS检测到的是同一肽段离子;
③任意样品经过HPLC/ESI-Ion Trap MS分析所得的MS/MS碎裂信息,经MASCOT检索与蛋白数据库进行匹配达到较高的覆盖率;
④肽段离子经MS检测须具有一定强度的质谱信号。如果基于单一蛋白建立的体外模型样品中,一个肽段离子在质谱检测中都无法具有较高信号强度的话,那么在后续临床样品的复杂体系中该离子可能更难以被检测到;
⑤进行筛选的范围首先侧重于表现糖基化修饰具有时间依赖性和浓度依赖性的离子,尤其是在每组间其16O/18O峰面积之比均呈现显著性差异的肽段离子。在实际操作中,还有一些离子仅仅阶段性的(某个葡萄糖浓度或某个孵育时间段)具有组间显著性差异,也应予以考察,以避免遗漏任何可能成为糖尿病肽类生物标志物候选物的离子。
7.4目标肽段在HSA空间结构中的位置
通过建立HSA与不同浓度葡萄糖溶液共同孵育不同时间的体外糖基化模型,证实了HSA与葡萄糖发生糖基化反应不仅具有浓度依赖关系,还具有时间依赖关系以及相应的累积效应,随着葡萄糖浓度的增加、反应时间的延长,糖基化反应逐渐加剧。体外模型筛选出的葡萄糖敏感肽段总结于表5。
表5体外模型筛选出的葡萄糖敏感肽段
表5肽段以及内标肽段在HSA上所处的空间位置如图11所示。从11条葡萄糖敏感肽段(表5)在HSA分子空间结构中的位置可以看出,这些肽段均分布于蛋白表面,或HSA的“口袋”相对外部的位置,认为这就是这些肽段对葡萄糖的进攻尤其敏感的原因所在。
8、目标肽段特异性考察
运用BLAST算法(http://web.expasy.org/blast/)对肽段特异性进行检索,结果表明人体内有多个白蛋白的氨基酸序列与HSA极为相似,有的蛋白与HSA仅仅有1个亮氨酸与异亮氨酸的差异,因此HSA不存在特异性肽段。
血浆中蛋白含量的动态范围非常之大,高丰度蛋白的含量和低丰度的相比可相差10~12个数量级。因此,高丰度蛋白在血浆蛋白中所占比例具有绝对的优势,按丰度排名前10位的蛋白有:人血清白蛋白(HSA)、免疫球蛋白IgG、转铁蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白IgA、α-2巨球蛋白、免疫球蛋白IgM、α-1抗胰蛋白酶、C3补体和载脂蛋白,共占血浆蛋白总量的90%;而前22种高丰度蛋白约占血浆蛋白总量的99%,其余所有低丰度蛋白的总和才占全部血浆蛋白总量的1%。而本发明的模型是基于血浆中丰度最高的蛋白HSA建立的,且已有文献报道人血浆中丰度最高的前137个蛋白,均不是与HSA氨基酸序列相近的其它蛋白(全部为白蛋白)。因此可以认为,血浆样品中一旦检测到与本发明以标准HSA建模测出的相同离子(同时具有相同的质荷比和保留时间),则可以认定是HSA来源的肽段。
本发明在优化了各项条件后,建立了体外模拟糖基化模型,并采用 18O标记技术研究了葡萄糖对HSA的修饰情况。将空白对照组肽段和反 应组肽段分别进行18O标记和16O对照平行处理,1:1混合后进行HPLC-MS检测,首先筛选出3条非常不易被葡萄糖修饰的糖基化不敏感肽段可作为内标肽段候选物,HPLC-MS检测发现这组肽段与葡萄糖浓度和孵育时间的改变基本无关,即反应活性极低,可以用来作为内标肽段。对比各项条件后挑选了肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4,Rt=28.7)作为内标肽段。将内标肽段的单同位素峰面积作为标准,用其它随反应时间延长或葡萄糖溶液浓度变大而下调的肽段单同位素峰面积与之相比,筛选出11条肽段极易被修饰(见表5)的葡萄糖敏感肽段。实验结果表明,这组肽段与葡萄糖发生糖基化反应均具有时间累积效性和浓度依赖性,可作为糖尿病早期诊断的肽类生物标志物。
实施例2在健康人血浆样品中对本发明的11条目标肽段进行验证
1、血浆样品来源与蛋白浓度的测定
12例(男女各6例)健康人血浆样本由北京理工大学医院提供,经检测血浆提供者各项生化指标均正常。
将12例样品等体积混合,涡旋振荡使混合均匀。采用考马斯亮蓝法(Bradford)测定混合样中的蛋白浓度为82.4μg/μL。
2、混合血浆体外糖基化样品的制备
混合血浆体外糖基化样品的制备与标准蛋白体外糖基化样品的制备相似(方法参见实施例1第1项)。将12例混合血浆分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37℃水浴共同孵育10天、20天和30天,使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415。4个葡萄糖浓度分别依据生理葡萄糖浓度(~12.05%糖基化位点覆盖率)、理论50%糖基化位点覆盖率、理论100%糖基化位点覆盖率以及葡萄糖过量5倍而设计。每个浓度和孵育时间下分别制备三个平行样品,以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照。所有溶液事先均经过无菌处理,方法如下:在超净工作台中,使用0.2μm无菌针头式过滤器(PALL,Φ13mm,Supor亲水性聚醚砜膜)过滤除菌,将样品转入经无菌处理的离心管中,密封。且共育过程中,使用对二甲苯作为抑菌剂对溶液进行液封。孵育结束后的样品,经冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中备用。3、血浆样品的胰酶消化
胰酶消化方法,参见实施例1第2项优化条件。具体为将冻干后的蛋白样品溶于50mM的NH4HCO3(pH8.3)缓冲液中,向每200μg HSA(经糖基化的HSA与空白对照HSA样品)中加入20μL含8M尿素的10mM DTT(二硫苏糖醇)溶液进行变性,于37℃水浴孵育4h。再加入50 mM IAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团,于黑暗处反应1h。再加入溶于NH4HCO3(pH8.3)缓冲液中的胰蛋白酶,使HSA:胰蛋白酶=50:1(w/w),于37℃水浴孵育20h。
4、血浆样品的18O标记
18O标记方法参见实施例1第3项。具体为将冻干后的肽段样品溶于50mM KH2PO4溶液中后再次冻干备用。继而,向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H2 18O和H2 16O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶=50:1,w/w),在37℃水浴中标记20小时。标记完成后,残余的胰蛋白酶需经灭活处理,将样品在沸水中煮10分钟,再加入5%的甲酸(v/v)。在HPLC-MS进行分析之前,样品需经过高速离心处理(17,000×g,15min),以确保无不溶物进到HPLC-MS分析系统里。
5、HPLC-MS分析
同标准蛋白样品一样,将16O标记的糖基化血浆肽段与18O标记的对照组肽段于进样前进行1:1等体积混合。先采用HPLC/ESI-TOF MS将混合血浆样品进行定量分析,提取离子流找到目标肽段离子16O/18O峰面积之比。在此之后,将相同的样品进样至HPLC/ESI-Ion Trap MS,获得目标肽段的MS/MS碎裂信息,用于MASCOT检索后得到肽段的定性分析结果。用定量、定性结果共同验证体外标准蛋白筛选出的目标肽段。方法参见实施例1第4项的记载。
6、数据处理方法
所用软件和参数设置参见实施例1第5项的方法。
7、结果
7.1血浆蛋白的鉴定
酶解标记后的混合血浆蛋白样品经HPLC/ESI-Ion Trap分离检测,经MASCOT蛋白数据库检索,可得到与库中相匹配的蛋白信息,表6给出得分最高的15种蛋白质。
表6混合血浆样品中匹配上的15种主要蛋白
MASCOT检索与数据库进行匹配,混合血浆样品共检测到175种蛋白,主要的高丰度蛋白都能检测到,例如:白蛋白、免疫球蛋白IgG和转铁蛋白等等,其中人血清白蛋白HSA的得分最高,可与数据库匹配上的肽段覆盖率最高达到83%,这与其在血浆中的丰度最高有关。
7.2血浆样品中内标肽段的验证
肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4,Rt=28.7)在标准蛋白建立的体外糖基化模型中表现出良好的葡萄糖不敏感,其16O/18O峰面积之比不随反应时间的延长以及葡萄糖溶液浓度的增加而改变。需要在实际的糖基化血浆样品中验证该肽段的稳定性,结果如图12所示。
实验结果表明,混合血浆样品中的AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4,Rt=28.7)分别与4种不同浓度的葡萄糖溶液分别共育了10,20和30天后,经ESI-TOF MS检测(不同葡萄糖浓度和孵育时间有3个平行样品,共36个样品;每个样品平行进样2次,共72次进样),该肽段的16O/18O峰面积比例为0.958±0.096,仍然十分接近1,且该肽段离子在质谱中的响应值达到104。血浆样品经MASCOT检索,肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的得分为25,其假阳性结果出现的概率仍然较低,具有较高可信度,可确定该肽段作为内标肽段应用于后续的临床研究。
7.3血浆样品中目标肽段的验证
在HPLC/ESI-TOF MS数据中提取目标肽段和各目标肽段的离子流(EIC),按照图9所示的方法进行计算,得到相对峰面积之比。
7.3.1肽段FKDLGEENFK
肽段FKDLGEENFK(m/z=614.8,Rt=24.1min)是位于HSA上35–44的氨基酸序列。健康人血浆中该肽段被葡萄糖修饰的情况如图13所示。在混合血浆样品的体外模拟中,如图13A所示,在共同孵育的前10 天,肽段离子m/z=614.8在混合血浆被24.9mM与49.8mM葡萄糖溶液修饰的两组中,表现出极显著性差异;在孵育20天后,该离子在24.9mM-49.8mM和49.8mM-249.0mM的两组中分别表现出极显著性差异和显著性差异;在反应经过30天后,离子m/z=614.8仍然可以在24.9mM-49.8mM和49.8mM-249.0mM的两组中分别表现出极显著性差异和显著性差异,这一结果说明肽段FKDLGEENFK具有良好的浓度依赖性。
与此同时,该肽段也表现出较好的时间依赖性,如图13B所示,肽段离子m/z=614.8在与不同浓度的葡萄糖溶液共育时,分别在不同的反应时间段内表现出显著性差异以及极显著性差异。离子m/z=614.8在与内标离子的峰面积之比随反应时间的延长而下降的现象,表现出在血浆样品中,HSA在其半衰期内表现出糖基化修饰的累积效应。
图13C是肽段离子m/z=614.8在不同的3个反应阶段的质谱检测情况,其相应值比标准HSA酶切后在相同条件的响应值低了一个数量级,这3张质谱图依次表明反应体系内的该离子随葡萄糖溶液浓度的增加和反应时间的延长不断的被消耗的趋势。
7.3.2肽段ETYGEMADCCAK
肽段ETYGEMADCCAK(m/z=660.8,Rt=19.8min)是位于HSA上35–44的氨基酸序列。图14是该肽段与6.0mM葡萄糖共同孵育10天的质谱图。
从图14可以看出,在混合血浆体外模型糖基化程度最温和的一组样品经HPLC-MS检测,的确可以捕捉到modify-control的16O-18O质谱峰对。但是这对质谱峰的响应值相当低,也因此会对定量分析造成不准确性。随着糖基化反应程度的加剧,检测情况会进一步恶化。因此,肽段ETYGEMADCCAK(m/z=660.8,Rt=19.8min)不适合被选为糖尿病临床诊断的生物标志物。
7.3.3肽段YLYEIAR
肽段YLYEIAR(m/z=464.3,Rt=22.9min)是位于HSA上162–168的氨基酸序列。健康人血浆中该肽段被葡萄糖修饰的情况如图15所示。在混合血浆样品的体外模拟中,如图15A所示,在共同孵育10、20和30天后,肽段离子m/z=464.3在6.0mM-24.9mM和49.8mM-249.0mM的组间均表现出极显著性差异和显著性差异,说明肽段YLYEIAR具有较好的浓度依赖性。
与此同时,该肽段也表现出较好的时间依赖性,如图15B所示,肽段离子m/z=464.3在与不同浓度的葡萄糖溶液共育时,分别在不同的反 应时间段内表现出显著性差异以及极显著性差异。离子m/z=464.3在与内标离子的峰面积之比随反应时间的延长而下降的现象,表现出在血浆样品中,HSA在其半衰期内表现出糖基化修饰的累积效应。
图15C是肽段离子m/z=464.3在不同的3个反应阶段的质谱检测情况,其相应值比标准HSA酶切后在相同条件的响应值低了一个数量级,这3张质谱图依次表明反应体系内的该离子随葡萄糖溶液浓度的增加和反应时间的延长不断的被消耗的趋势。
7.3.4肽段LDELRDEGK
肽段LDELRDEGK(m/z=537.7,Rt=22.8min)是位于HSA上206–214的氨基酸序列。健康人血浆中该肽段被葡萄糖修饰的情况如图16所示。
在混合血浆样品的体外模拟中,如图16A所示,在共同孵育10、20和30天后,肽段离子m/z=537.7在不同浓度的葡萄糖溶液组间均表现出极显著性差异和显著性差异,说明肽段LDELRDEGK具有良好的浓度依赖性。
与此同时,该肽段也表现出较好的时间依赖性,如图16B所示,肽段离子m/z=537.7在与不同浓度的葡萄糖溶液共育时,分别在不同的反应时间段内表现出显著性差异以及极显著性差异。离子m/z=537.7在与内标离子的峰面积之比随反应时间的延长而下降的现象,表现出在血浆样品中,HSA在其半衰期内表现出糖基化修饰的累积效应。
图16C是肽段离子m/z=537.7在不同的3个反应阶段的质谱检测情况,其相应值比标准HSA酶切后在相同条件的响应值低了一个数量级,这3张质谱图依次表明反应体系内的该离子随葡萄糖溶液浓度的增加和反应时间的延长不断的被消耗的趋势,且该变化趋势较为显著。
7.3.5肽段LSQRFPK
肽段LSQRFPK(m/z=438.2,Rt=31.5min)是位于HSA上243–249的氨基酸序列。健康人血浆中该肽段被葡萄糖修饰的情况如图17所示。
在混合血浆样品的体外模拟中,如图17A所示,肽段LSQRFPK的响应值明显下降,以至于在与249.0mM葡萄糖溶液共育后,质谱无法检测到该肽段离子,类似的现象也发生在较长反应时间下与49.8mM和24.9mM葡萄糖共育的情况,这一现象说明肽段离子可能不适宜作为临床血浆样品的生物标志物,因为该离子太易被葡萄糖修饰,在较为剧烈的糖基化修饰情况下,无法判断具体的修饰程度。在共同孵育的前10天和20天后,肽段离子m/z=438.2在混合血浆被6.0mM与24.9mM葡萄 糖溶液修饰的两组中,表现出极显著性差异。
同时,肽段离子m/z=438.2在检测到范围内,也表现出一定的时间依赖性,如图17B所示。
图17C是肽段离子m/z=438.2在不同的3个反应阶段的质谱检测情况。从图中可以看出,该离子较为易于发生糖基化修饰,随葡萄糖溶液浓度的增加和反应时间的延长,消耗的极为迅速,在30天时已无法在样品中检测到该离子的存在。
7.3.6肽段LVTDLTK
肽段LVTDLTK(m/z=395.2,Rt=19.7min)是位于HSA上258–264的氨基酸序列。健康人血浆中该肽段被葡萄糖修饰的情况如图18所示。
在混合血浆样品的体外模拟中,如图18A所示,在共同孵育10、20和30天后,肽段离子m/z=395.2在不同浓度的葡萄糖溶液组间均表现出极显著性差异和显著性差异,说明肽段LDELRDEGK具有良好的浓度依赖性。
与此同时,该肽段也表现出较好的时间依赖性,如图18B所示,肽段离子m/z=395.2在与不同浓度的葡萄糖溶液共育时,分别在不同的反应时间段内表现出显著性差异以及极显著性差异。离子m/z=395.2在与内标离子的峰面积之比随反应时间的延长而下降的现象,表现出在血浆样品中,HSA在其半衰期内表现出糖基化修饰的累积效应。
图18C是肽段离子m/z=395.2在不同的3个反应阶段的质谱检测情况,其相应值比标准HSA酶切后在相同条件的响应值低了一个数量级,这3张质谱图依次表明反应体系内的该离子随葡萄糖溶液浓度的增加和反应时间的延长不断的被消耗的趋势,且该变化趋势较为显著。
7.3.7肽段DVFLGMFLYEYAR
肽段DVFLGMFLYEYAR(m/z=812.5,Rt=36.3min)是位于HSA上348–360的氨基酸序列。健康人血浆中该肽段被葡萄糖修饰的情况如图19所示。在混合血浆样品的体外模拟中,如图19A所示,在共同孵育10、20和30天后,肽段离子m/z=812.5在不同浓度的葡萄糖溶液组间均表现出极显著性差异和显著性差异,说明肽段DVFLGMFLYEYAR具有良好的浓度依赖性。
与此同时,该肽段也表现出较好的时间依赖性,如图19B所示,肽段离子m/z=812.5在与不同浓度的葡萄糖溶液共育时,分别在不同的反应时间段内表现出显著性差异以及极显著性差异。离子m/z=812.5在与内标离子的峰面积之比随反应时间的延长而下降的现象,表现出在血浆 样品中,HSA在其半衰期内表现出糖基化修饰的累积效应。
图19C是肽段离子m/z=812.5在不同的3个反应阶段的质谱检测情况,其相应值比标准HSA酶切后在相同条件的响应值低了一个数量级,这3张质谱图依次表明反应体系内的该离子随葡萄糖溶液浓度的增加和反应时间的延长不断的被消耗的趋势。
7.3.8肽段RHPDYSVVLLLR
肽段RHPDYSVVLLLR(m/z=490.2,Rt=27.0min)是位于HSA上361–372的氨基酸序列。图20是该肽段与6.0mM葡萄糖共同孵育10天的质谱图。
从图20可以看出,在混合血浆体外模型糖基化程度最温和的一组样品经HPLC-MS检测,的确可以捕捉到modify-control的16O-18O质谱峰对。但是这对质谱峰的响应值相当低,也因此会对定量分析造成不准确性。随着糖基化反应程度的加剧,检测情况会进一步恶化。因此认为,肽段RHPDYSVVLLLR(m/z=490.2,Rt=27.0min)不适合被选为糖尿病临床诊断的生物标志物。
7.3.9肽段CCAAADPHECYAK
肽段CCAAADPHECYAK(m/z=691.8,Rt=25.1min)是位于HSA上384–396的氨基酸序列。图21是该肽段与6.0mM葡萄糖共同孵育10天的质谱图。
从图21所示,在混合血浆样品的体外模拟中,经过HPLC-MS分析,无法捕捉到肽段CCAAADPHECYAK的离子m/z=691.8。其原因理论上有两种可能:1)该位点极易发生糖基化反应,经过10天与葡萄糖溶液共同孵育,就已经完全或者接近糖基化反应的平衡;2)酶切位点识别较为困难,因此在混合血浆样品中没有从HSA上酶切得到该肽段。
选择的葡萄糖溶液中,有最低浓度为生理浓度的6.0mM,这以为HSA在反应中是过量的,而葡萄糖不足。如此还会出现检测不到肽段离子m/z=691.8的情况,认为更有可能是上述两个原因中的第二种。
7.3.10肽段KVPQVSTPTLVEVSR
肽段KVPQVSTPTLVEVSR(m/z=820.5,Rt=31.2min)是位于HSA上438–452的氨基酸序列。健康人血浆中该肽段被葡萄糖修饰的情况如图22所示。
在混合血浆样品的体外模拟中,如图22A所示,在共同孵育10、20和30天后,肽段离子m/z=820.5在不同浓度的葡萄糖溶液组间均表现出极显著性差异和显著性差异,说明肽段KVPQVSTPTLVEVSR具有良 好的浓度依赖性。
与此同时,该肽段也表现出较好的时间依赖性,如图22B所示,肽段离子m/z=820.5在与不同浓度的葡萄糖溶液共育时,分别在不同的反应时间段内表现出显著性差异以及极显著性差异。离子m/z=820.5在与内标离子的峰面积之比随反应时间的延长而下降的现象,表现出在血浆样品中,HSA在其半衰期内表现出糖基化修饰的累积效应。
图22C是肽段离子m/z=820.5在不同的3个反应阶段的质谱检测情况,其相应值比标准HSA酶切后在相同条件的响应值低了一个数量级,这3张质谱图依次表明反应体系内的该离子随葡萄糖溶液浓度的增加和反应时间的延长不断的被消耗的趋势。
7.3.11肽段CCTESLVNR
肽段CCTESLVNR(m/z=512.8,Rt=22.2min)是位于HSA上500–508的氨基酸序列。图23是该肽段与6.0mM葡萄糖共同孵育10天的质谱图。
从图23可以看出,在混合血浆体外模型糖基化程度最温和的一组样品经HPLC-MS检测,的确可以捕捉到modify-control的16O-18O质谱峰对。但是这对质谱峰的响应值相当低,目标肽段离子的信噪比较小,因此会对定量分析造成不准确性。此外从图中可以看出,质谱峰对的峰形欠佳,且随着糖基化反应程度的加剧,峰形状况会进一步恶化。因此认为,肽段CCTESLVNR(m/z=512.8,Rt=22.2min)不适合被选为糖尿病临床诊断的生物标志物。
7.4小结
通过将12例临床健康人血浆等体积混合后与葡萄糖的体外模拟糖基化,酶解,18O标记后进行HPLC/ESI-TOF MS检测。首先通过16O/18O峰面积之比再次验证了所选择的内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4,Rt=28.7min)在混合血浆样品中仍然不易被葡萄糖修饰,较为适宜作为内标肽段用以衡量其它肽段被葡萄糖修饰的程度。其次,再次验证了体外标准蛋白模拟糖基化过程,葡萄糖对蛋白的修饰具有浓度依赖性和时间依赖性,以及修饰的累积效应这一系列变化规律。最后,通过混合血浆中目标肽段与内标肽段的峰面积之比验证了有6个离子可能成为潜在的生物标志物用于早期的糖尿病诊断(见表7)。
表7混合血浆体外模型筛选出有待临床样品验证的HSA肽段
实施例3多肽标志物用于临床样品糖尿病检测的验证与应用
通过实施例2,本发明已经通过标准HSA体外糖基化模型筛选出11条目标肽段。继而,通过采用健康人血浆样品在相同的体外模型条件下的对上述目标肽段进行了初步验证,淘汰了其中5条在血浆复杂样品中无法实现检测的肽段。接下来,需要用较为大量健康人、2型糖尿病患者以及糖耐量低减人群的实际临床样品对筛选出的6条有可能成为糖尿病肽类生物标志物进行进一步的验证。实验流程如图24所示。
从实验流程图可以看出,从样品被收集到检测获得目标肽段与内标肽段峰面积之比需要酶解和HPLC-MS检测两个主要的实验步骤。
1、临床样本的收集
收集人血浆样品进行临床实验。根据统计学要求对本试验所需样本量进行估计,预估公式为:n=(U1-α/δ)2×P×(1-P)
其中,检验的显著性水平α为0.05,显著性水平相应的U值1.96,样本率p和总体率P的最大容许误差取0.10。P表示目标占总体的比例期望值,计算同时考虑脱落等影响,最终本次研究共入选389例,由北京理工大学医院提供。实验参与者被分为三组:糖尿病组73例,糖耐量低减组63例和糖耐量正常组253例。
通过排除了实验样品中的1型糖尿病病例,妊娠糖尿病病例,乙肝病例以及其他干扰病例以控制实验疾病组病例为2型糖尿病患者。本实验符合医学伦理学要求。
2、临床血浆样本的预处理
各取2μL于EP管,经冷冻干燥后储存于-80℃冰箱中备用。
3、临床血浆样本胰酶消化
胰酶消化方法参见实施例2第3项的方法进行。
4、HPLC-MS测定和数据处理
先采用HPLC/ESI-TOF MS将酶解后的临床血浆样品进行定量分析(参数设置参见实施例1第4.1项),提取离子流找到目标肽段离子。在此之后,将相同的样品进样至HPLC/ESI-Ion Trap MS(参数设置参见实施例1第4.2项),获得目标肽段的MS/MS碎裂信息,用于MASCOT检 索后得到肽段的定性分析结果。用定量、定性结果共同验证体外标准蛋白筛选出的目标肽段。数据处理方法参见实施例1第5项的方法。
5、结果与讨论
5.1血浆蛋白的鉴定
酶解后的临床血浆蛋白样品经HPLC/ESI-Ion Trap分离检测,经MASCOT蛋白数据库检索,可得到与库中相匹配的蛋白信息,其结果与混合血浆样品相似,参见表6。
5.2临床实验样本提供者基本信息
国际上通用的糖尿病诊断方法是测定病人空腹血糖浓度,一般空腹血糖浓度>7.0mmol/L即可诊断为糖尿病。本发明在获得北京理工大学在职人员体检数据后,为了减少医师的主观偏倚,实行盲法,随机抽取实验所需样本。按照国际上对糖尿病的诊断标准,将空腹血浆血糖浓度≥7.1mmol/L定为病例组,血糖浓度>6.1mmol/L且≤7.0mmol/L定为糖耐量低减组,血糖浓度≤6.0mmol/L定为正常组。区别于国际通用诊断方法,应用肽段水平作为糖尿病的诊断指标。对肽段水平的变化规律进行研究,从而在临床诊断中,可以预测糖尿病发展趋势。
最终确定实验三个分组分别为:2型糖尿病组(Type2Diabetes Mellitus,T2DM:73例),糖耐量低减组(Impaired glucose tolerance,IGT:63例)和糖耐量正常组(Normal glucose tolerance,NGT:253例),共389例实验参与者的血液样品。
5.3临床样品验证结果
使用实施例1建立的标准HSA建立模拟糖基化体外筛选模型后,筛选出6条葡萄糖敏感肽段(表7),并在健康人血浆中得到了验证。接下来需要将这一结果应用到实际临床样本中进行验证。通过HPLC/ESI-TOFMS定量分析,获得有可能成为生物标志物的目标肽段与内标肽段的单同位素峰面积,得到二者的比值。需要考察样本提供者的血糖与其血浆中目标肽段被修饰程度的关系,以及目标肽段与内标肽段峰面积的比值是否在不同年龄段的样本提供者组间存在显著差异,从而有望成为预警糖尿病发生以及可作为糖尿病早期诊断的血浆肽类生物标志物。
以内标肽段离子m/z=977.4为例,其峰面积信息的获得过程如图25所示。每例血浆样品经酶解后,采用HPLC/ESI-TOF MS进行检测,得到的总离子流图(图25A),对其进行提取离子流m/z=977~978获得EIC图(图25B)。图25C为保留时间28.6-29.0min区间内的质谱,放大横坐标找到m/z=977.4(图25D),积分获得峰面积。下面详细阐述各个目标 肽段在临床样品验证中的实验结果。
5.3.1肽段FKDLGEENFK
肽段FKDLGEENFK(m/z=614.8,Rt=24.1min)与内标肽段离子峰面积之比在T2DM、IGT和NGT三组中的情况如图26所示。
肽段FKDLGEENFK是一个可以在每一例临床血浆样品中可被HPLC-MS稳定检测到的肽段。图26显示了该肽段在糖耐量糖耐量正常、糖耐量低减以及2型糖尿病患者的不同组别中的表现。肽段FKDLGEENFK在三个组别中,从比值到动态范围均表现出十分显著的差异,t检验也验证了这一结果,即肽段FKDLGEENFK与内标肽段峰面积之比在T2DM-IGT和IGT-NGT组间均显示出极显著性差异(p<<0.01),在T2DM-NGT组间的亦然。
这意味在糖尿病患者在患病初期,外周血中HSA所属肽段FKDLGEENFK的位点就被葡萄糖进攻,且修饰位点对葡萄糖十分敏感,修饰的结果非常显著。这说明该肽段有可能成为潜在的糖尿病早期诊断的生物标志物之一。图26显示肽段FKDLGEENFK(m/z=614.8)与内标肽段离子(m/z=977.4)峰面积之比,若比值在0.012-0.026之间,则有较大的罹患糖尿病的风险;若比值在0.034-0.121之间,则有潜在的罹患糖尿病的风险;若比值在0.115-0.330之间,则说明罹患糖尿病的风险较小。5.3.2肽段YLYEIAR
肽段YLYEIAR(m/z=464.3,Rt=22.9min)与内标肽段离子峰面积之比在T2DM、IGT和NGT三组中的情况如图27所示。
肽段YLYEIAR是一个可以在每一例临床血浆样品中可被HPLC-MS稳定检测到的肽段。图27显示了该肽段在糖耐量正常人(健康人群)、糖耐量低减以及2型糖尿病患者的不同组别中的情况。肽段YLYEIAR在正常人体内的动态范围最宽,基本集中在0.3~0.8左右;在疾病组中次之,基本集中于0.4~0.7;在糖耐量低减组中动态范围最窄,集中于0.4~0.5,有意思的是IGT组中的中位数和上四分位非常接近,说明有不少例样品测得的结果落在这一区间内。峰面积之比的中位数在三个组中比较接近,综合来看,三个组别中肽段YLYEIAR的含量差异不大。
经过t检验可以得知,肽段YLYEIAR与内标肽段峰面积之比在T2DM-IGT和IGT-NGT组间均无显著性差异,p值分别为0.15和0.06。就目前389例临床血浆样品检测的结果看,肽段YLYEIAR无法表征出在正常人与2型糖尿病患者或者糖耐量低减人群中的差异,或许进一步扩大样品量会使t检验的结果有所改变。
5.3.3肽段LDELRDEGK
肽段LDELRDEGK(m/z=537.7,Rt=22.8min)与内标肽段离子峰面积之比在T2DM、IGT和NGT三组中的情况如图28所示。
肽段LDELRDEGK是一个可以在每一例临床血浆样品中可被HPLC-MS稳定检测到的肽段。图28显示了该肽段在糖耐量正常人(健康人群)、糖耐量低减以及2型糖尿病患者的不同组别中的表现。肽段LDELRDEGK在三个组别中,最大值和最小值的间距基本相同。然而,该肽段在健康人血浆中的上下四分位的间距最大,在IGT组居中,而相对而言在2型糖尿病患者体内较窄。就中位数而言,糖耐量低减组略低于健康人组,但2型糖尿病患者组则明显低于其它两个组,其峰面积与内标离子的峰面积的比值集中在0.2左右。需要指出的是,在T2DM组中出现了1例极端值(比值=0.61),需要在今后的研究中,考察其重复性。若不可重复,则有可能是实验中的随机误差产生的。
经t检验可以得知,肽段LDELRDEGK与内标肽段峰面积之比在T2DM-IGT和T2DM-NGT组间均显示出极显著性差异(p<0.01),而在IGT-NGT组间无显著性差异。这意味在糖尿病患者在患病初期,血液中HSA所属肽段LDELRDEGK的位点被葡萄糖进攻并不十分明显,但是会在病情进一步发展被确诊为糖尿病时出现显著性变化,说明该肽段有可能成为潜在的糖尿病诊断的生物标志物之一。图28显示肽段LDELRDEGK(m/z=537.7)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)峰面积之比,若比值在0.075-0.609之间,则有较大的罹患糖尿病的风险。
5.3.4肽段LVTDLTK
肽段LVTDLTK(m/z=395.2,Rt=19.7min)与内标肽段离子峰面积之比在T2DM、IGT和NGT三组中的情况如图29所示。肽段LVTDLTK的响应值较高,比内标肽段离子高一个数量级,在定量分析具有更加准确、可靠的优势,如图2-32所示。但问题是该肽段在糖耐量正常人、糖耐量低减以及2型糖尿病患者的不同组别中不表现出含量的差异性。因此在临床上对于糖尿病的早期预警没有意义。
5.3.5肽段DVFLGMFLYEYAR
肽段DVFLGMFLYEYAR(m/z=812.5,Rt=36.3min)在部分酶解后的正常人血浆样品中能有峰出现,但是在绝大多数样品包括糖耐量低减组、2型糖尿病患者组,以及一部分正常人血浆中均难以实现HPLC-MS的检测,也因此不可能作为糖尿病生物标志物用于临床诊断。图30所示 为一例T2DM血浆样品,经酶解后对于肽段离子m/z=812.5的检测情况,在m/z812-817范围内没有质谱峰出现。
5.3.6肽段KVPQVSTPTLVEVSR
肽段KVPQVSTPTLVEVSR(m/z=820.5,Rt=31.2min)与内标肽段离子峰面积之比在T2DM、IGT和NGT三组中的情况如图31所示。
肽段KVPQVSTPTLVEVSR是一个可以在每一例临床血浆样品中可被HPLC-MS稳定检测到的肽段。图31显示了该肽段在糖耐量糖耐量正常、糖耐量低减以及2型糖尿病患者的不同组别中的情况。肽段KVPQVSTPTLVEVSR在三个组别中,从比值到动态范围均表现出十分显著的差异,t检验也验证了这一结果,即肽段KVPQVSTPTLVEVSR与内标肽段峰面积之比在T2DM-IGT和IGT-NGT组间均显示出极显著性差异(p<<0.01),在T2DM-NGT组间的亦然(p<<0.01)。
这意味在糖尿病患者在患病初期,外周血中HSA所属肽段KVPQVSTPTLVEVSR的位点就被葡萄糖进攻,且修饰位点对葡萄糖十分敏感;当病情从糖耐量低减的状态进一步发展为正确诊糖尿病的过程中,糖基化对于该肽段修饰结果依然十分显著。这说明该肽段有可能成为潜在的糖尿病早期诊断的生物标志物之一。图31显示,KVPQVSTPTLVEVSR(m/z=820.5)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)的比值中,若比值在0.010-0.031之间,则有较大的罹患糖尿病的风险;若比值在0.021-0.100之间,则有潜在的罹患糖尿病的风险;若比值在0.070-0.289之间,则说明罹患糖尿病的风险较小。
5.4糖尿病肽类生物标志物候选物在HSA空间结构上的位置
通过对389例临床样品进行HPLC-MS检测,发现有3个HSA来源的肽段FKDLGEENFK、LDELRDEGK和KVPQVSTPTLVEVSR,其峰面积与内标肽段峰面积之比在糖耐量正常、糖耐量低减以及2型糖尿病组别中存在(极)显著性差异。这样的一组肽段,有希望在今后大量临床实践后,单独或者相互佐证作为早期糖尿病或糖尿病的诊断指标。3个潜在的糖尿病生物标志物肽段以及内标肽段在HSA上所处的空间位置如图32所示。图32为这组肽段在HSA上的空间位置,如图所示基本位于蛋白易于被小分子进攻的位置,这与预期相吻合。
5.5小结
本发明经过389例临床血浆样品的验证,确认一组目标肽段FKDLGEENFK、LDELRDEGK和KVPQVSTPTLVEVSR可以在任意样 品中实现HPLC-MS检测。其中肽段FKDLGEENFK和KVPQVSTPTLVEVSR的水平在T2DM-IGT、IGT-NGT以及T2DM-NGT组间都具有极显著性差异;而肽段LDELRDEGK也在T2DM-IGT和T2DM-NGT组间显示出显著性差异。实验结果表明,上述3条肽段可作为生物标志物,用于糖尿病的早期临床诊断。
根据本发明筛选得到的内部多肽和3个对葡糖糖敏感的多肽标志物,可以用于诊断早期糖尿病,包括以下步骤:(1)采集血液以及获得血浆;(2)将血浆样本按照进行酶切,酶切条件为:向每2μL血浆样品中加入0.20μL含8M尿素的10mM DTT溶液进行变性,于37℃水浴孵育4h,再加入50mM IAA溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团,于黑暗处反应1h,再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶,使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1,于37℃水浴孵育8~20h;(3)HPLC-ESI-TOF MS检测多肽样品;(4)读取生物标志物肽段(FKDLGEENFK、LDELRDEGK和/或KVPQVSTPTLVEVSR)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的质谱峰面积,分别计算生物标志物肽段和内标肽段质谱峰面积的比值;(5)考察比值所处的范围,判断糖尿病发生的风险程度,对早期糖尿病进行诊断:若肽段FKDLGEENFK(m/z=614.8)与内标肽段离子(m/z=977.4)峰面积之比在0.012-0.026之间,则有样品来源的宿主有较大的罹患糖尿病的风险;若比值在0.034-0.121之间,则有潜在的罹患糖尿病的风险;若比值在0.115-0.330之间,则说明宿主罹患糖尿病的风险较小;或
若LDELRDEGK(m/z=537.7)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)峰面积之比值在0.075-0.609之间,则样品来源的宿主有较大的罹患糖尿病的风险;或
若KVPQVSTPTLVEVSR(m/z=820.5)与内标肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)的比值中,若比值在0.010-0.031之间,则有较大的罹患糖尿病的风险;若比值在0.021-0.100之间,则有潜在的罹患糖尿病的风险;若比值在0.070-0.289之间,则说明样品来源的宿主罹患糖尿病的风险较小。
Claims (10)
1.一种用于早期糖尿病诊断的内标多肽,其特征在于,其来源于人血清白蛋白,具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的内标多肽在制备早期糖尿病诊断试剂盒中的应用。
3.一种筛选权利要求1所述内标多肽的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)体外糖基化样品的制备,将无菌HSA于50mM pH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液,分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37℃水浴共同孵育10、20和30天,使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照;
(2)胰酶消化,蛋白样品溶于50mM pH8.3的NH4HCO3缓冲液中,向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的10mM DTT溶液进行变性,于37℃水浴孵育4h,再加入50mM IAA溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团,于黑暗处反应1h,再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶,使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1,于37℃水浴孵育8~20h;
(3)18O标记,将冻干后的肽段样品溶于50~150mM pH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后冻干备用;向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H2 18O和H2 16O溶解的胰蛋白酶,HSA:胰蛋白酶质量比=1~125:1,在37℃水浴中标记8~24小时;
(4)HPLC/ESI-TOF MS方法对样品进行定量分析和用HPLC/ESI-Ion Trap MS方法对样品进行定性分析;
(5)数据分析与内标肽段的选择,Agilent公司Mass Hunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ESI-TOF MS的数据特征,提取参数:保留时间8.00-45.00min;质荷比m/z300-1800;信噪比阈值S/N5;谱峰数目1000×1000;选中肽同位素分布;PeakPair软件被用于挑选相应肽段的16O/18O峰对,并计算出16O/18O峰面积的比值用于肽段的定量分析,若16O/18O峰面积的比值小于1,则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗,该肽段拥有易被修饰的糖基化位点,经过糖基化过程,生成了带有糖链修饰的新肽段;若16O/18O峰面积的比值等于1,则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗,不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点;在TOF MS数据中,发现1个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK,m/z=977.4,Rt=28.7min均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到,质谱信号达到105,肽段的16O/18O峰面积比例最接近1,且SD值最小0.961±0.077,选择该肽段为内标肽段。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(3)还包括在标记完成后,残余的胰蛋白酶需经灭活处理,将样品在沸水中煮10分钟,再按照体积比加入5%的甲酸。
5.如权利要求3所述的方法,其特征在于,步骤(3)中标记体系尿素浓度控制在2M以下。
6.如权利要求3所述的方法,其特征在于,在HPLC/ESI-TOF MS分析之前,样品需经过离心处理,离心条件为17,000×g,15min。
7.一种与权利要求1所述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物,其特征在于,其来源于人血清白蛋白,具有SEQ IDNO.2所述的氨基酸序列。
8.一种与权利要求1所述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物,其特征在于,其来源于人血清白蛋白,具有SEQ IDNO.5所述的氨基酸序列。
9.一种与权利要求1所述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物,其特征在于,其来源于人血清白蛋白,具有SEQ IDNO.11所述的氨基酸序列。
10.一种体外模型筛选糖尿病多肽标志物的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)体外糖基化样品的制备,将无菌HSA于50mM pH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液,分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37℃水浴共同孵育10、20和30天,使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照;
(2)胰酶消化,将蛋白样品溶于50mM pH8.3的NH4HCO3缓冲液中,向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的10mM DTT溶液进行变性,于37℃水浴孵育4h,再加入50mM IAA溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团,于黑暗处反应1h,再加入溶于pH8.3的NH4HCO3缓冲液中的胰蛋白酶,使HSA:胰蛋白酶的质量比=10~125:1,于37℃水浴孵育8~20h;
(3)18O标记,将冻干后的肽段样品溶于50~150mM pH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次冻干备用;向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H2 18O和H2 16O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶质量比=1~125:1,在37℃水浴中标记8~24小时;
(4)HPLC/ESI-TOF MS方法对样品进行定量分析,和用HPLC/ESI-Ion Trap MS方法对样品进行定性分析;
(5)数据分析与内标肽段的选择,Agilent公司Mass Hunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ESI-TOF MS的数据特征,提取参数:保留时间8.00-45.00min;质荷比m/z300-1800;信噪比阈值S/N5;谱峰数目1000×1000;选中肽同位素分布;PeakPair软件被用于挑选相应肽段的16O/18O峰对,并计算出16O/18O峰面积的比值用于肽段的定量分析,若16O/18O峰面积的比值小于1,则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗,该肽段拥有易被修饰的糖基化位点,经过糖基化过程,生成了带有糖链修饰的新肽段;若16O/18O峰面积的比值等于1,则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗,不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点;在TOF MS数据中,发现1个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK,m/z=977.4,Rt=28.7均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到,质谱信号达到105,肽段的16O/18O峰面积比例最接近1,且SD值最小0.961±0.077,选择该肽段为内标肽段;
(6)分别考察浓度为6.0mM、24.9mM、49.8mM以及249.0mM的葡萄糖溶液,在不同孵育时间10天、20天和30天下HSA糖基化修饰的浓度依赖性,以内标肽段的单同位素峰面积为标准,用其他3反应时间延长或葡萄糖溶液浓度变大而下调的肽段单同位素峰面积之比,选择具有质谱信号强度、肽段离子在每次质谱检测中均可被稳定的捕捉到,且在HPLC/ESI-TOF MS和HPLC/ESI-Ion Trap MS检测中同时满足相同的保留时间和质荷比的误差在可接受范围内,其中ΔRt=±0.2min,一级质谱Δm/z=±0.3,侧重于表现糖基化修饰具有时间依赖性和浓度依赖性的离子,筛选得到易被修饰的葡萄糖敏感肽段。
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---|---|
CN (1) | CN103897035A (zh) |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106442833A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-22 | 广西医科大学 | 一种非同位素标记肽段加入法结合mrm的蛋白质定量方法 |
CN106770866A (zh) * | 2015-12-17 | 2017-05-31 | 中国医科大学 | 可实现人血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法 |
CN106979982A (zh) * | 2016-01-19 | 2017-07-25 | 上海市第六人民医院 | 一种用于糖尿病风险预测、治疗评价的方法及试剂盒 |
CN109073658A (zh) * | 2016-04-14 | 2018-12-21 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于测定体液样品中的靶分析物的浓度的方法 |
CN110286153A (zh) * | 2019-05-25 | 2019-09-27 | 江苏食品药品职业技术学院 | 一种基于同位素示踪法检测多肽药物的方法 |
CN112924688A (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 多肽组合标志物在糖尿病诊断中的用途及其试剂盒和方法 |
CN112924690A (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 用于预警和/或诊断糖尿病的血清多肽组合标志物及检测试剂盒和方法 |
CN113030305A (zh) * | 2021-03-02 | 2021-06-25 | 北京蛋白质组研究中心 | 一种健康人群n-糖肽生理丰度范围的构建方法及其应用 |
CN113061157A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-02 | 浙江理工大学 | 一种蚕丝蛋白质组学的蛋白质提取与富集方法 |
CN113214386A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-08-06 | 北京理工大学 | 一种多肽标志物及其应用 |
CN115097038A (zh) * | 2022-06-22 | 2022-09-23 | 山东国仓健生物科技有限公司 | 与大豆抗疫霉病相关的代谢产物的筛选鉴定方法及应用 |
CN116153392A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-05-23 | 西湖欧米(杭州)生物科技有限公司 | 一种自动化靶向蛋白质组学定性定量分析方法 |
-
2014
- 2014-03-12 CN CN201410090215.7A patent/CN103897035A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MEI ZHANG, ET AL.: "A New Strategy for Early Diagnosis of Type 2 Diabetes by Standard-Free, Label-Free LC-MS/MS Quantification of Glycated Peptides. Diabetes", 《DIABETES》 * |
Cited By (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106770866A (zh) * | 2015-12-17 | 2017-05-31 | 中国医科大学 | 可实现人血清白蛋白鉴定及绝对定量的试剂盒及测定方法 |
CN106979982A (zh) * | 2016-01-19 | 2017-07-25 | 上海市第六人民医院 | 一种用于糖尿病风险预测、治疗评价的方法及试剂盒 |
CN106979982B (zh) * | 2016-01-19 | 2021-01-05 | 上海市第六人民医院 | 一种用于糖尿病风险预测、治疗评价的方法及试剂盒 |
CN109073658B (zh) * | 2016-04-14 | 2021-07-09 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于测定体液样品中的靶分析物的浓度的方法 |
CN109073658A (zh) * | 2016-04-14 | 2018-12-21 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 用于测定体液样品中的靶分析物的浓度的方法 |
CN106442833A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-22 | 广西医科大学 | 一种非同位素标记肽段加入法结合mrm的蛋白质定量方法 |
CN110286153A (zh) * | 2019-05-25 | 2019-09-27 | 江苏食品药品职业技术学院 | 一种基于同位素示踪法检测多肽药物的方法 |
CN112924688A (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 多肽组合标志物在糖尿病诊断中的用途及其试剂盒和方法 |
CN112924690A (zh) * | 2019-12-06 | 2021-06-08 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 用于预警和/或诊断糖尿病的血清多肽组合标志物及检测试剂盒和方法 |
CN113030305A (zh) * | 2021-03-02 | 2021-06-25 | 北京蛋白质组研究中心 | 一种健康人群n-糖肽生理丰度范围的构建方法及其应用 |
CN113030305B (zh) * | 2021-03-02 | 2023-02-07 | 北京蛋白质组研究中心 | 一种健康人群n-糖肽生理丰度范围的构建方法及其应用 |
CN113214386A (zh) * | 2021-03-26 | 2021-08-06 | 北京理工大学 | 一种多肽标志物及其应用 |
CN113061157A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-02 | 浙江理工大学 | 一种蚕丝蛋白质组学的蛋白质提取与富集方法 |
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