KR101520614B1 - 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법 - Google Patents

당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101520614B1
KR101520614B1 KR1020130088006A KR20130088006A KR101520614B1 KR 101520614 B1 KR101520614 B1 KR 101520614B1 KR 1020130088006 A KR1020130088006 A KR 1020130088006A KR 20130088006 A KR20130088006 A KR 20130088006A KR 101520614 B1 KR101520614 B1 KR 101520614B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
peptide
cancer
protein
sample
fragment
Prior art date
Application number
KR1020130088006A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150013996A (ko
Inventor
김영수
윤정환
김현수
김경곤
진종화
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020130088006A priority Critical patent/KR101520614B1/ko
Priority to US14/906,799 priority patent/US9938561B2/en
Priority to PCT/KR2014/006479 priority patent/WO2015012533A1/ko
Publication of KR20150013996A publication Critical patent/KR20150013996A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101520614B1 publication Critical patent/KR101520614B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/978—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • G01N2333/98—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본원은 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질에서 탈당화 펩타이드 단편 및 비당화 펩타이드 단편의 비율의 대조군과의 차이에 의한 암 진단 방법을 개시한다. 본원에 따른 단백질의 당화 비율의 검출을 통한 암의 진단 방법은 하나 이상의 기존 마커를 이용하여 높은 특이성 및 민감도로 암을 진단할 수 있으며, 또한 암의 진단을 위한 새로운 마커 발굴에도 용이하게 사용될 수 있다.

Description

당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법 {Method for diagnosing cancer based on de-glycosylation of glycoproteins}
본원은 당단백질을 이용한 암 진단 기술 분야 및 간암의 진단 또는 검출 방법 및 이와 관련된 바이오마커에 관한 것이다.
암을 포함하여 조기 발견이 질환의 성공적 치료에 중요하거나 고전적 방법으로 진단이 어려운 질병의 경우, 생체 표지자인 바이오마커가 많이 활용되고 있다. 바이오마커로서 핵산 또는 단백질이 주로 사용되고 있으며, 대부분 특정 단백질의 발현 여부, 또는 그 양적 변화에 근거하여 활용되고 있는데, 최근 들어 번역후 단백질 변형단계에서의 변화가 활용되고 있는 추세이며, 그 중 하나가 단백질의 당화 검출이다.
단백질 당화 변화 또는 차이를 구별하기 위한 방법이 개발되고 있다. 예를 들면 당단백질의 당을 가수분해 시켜 얻어진 당(glycan)만을 수집한 후 이를 질량분석기로 분석하여 당 프로파일링을 보는 방법이 있다(Cooke C.L. et al., Anal. Chem., 2007,79:8090-8097). 그러나, 이러한 방법은 프로파일링의 차이를 근거로 대략적으로 정상인과 환자군을 구별할 수 있는 방법이기는 하지만, 정확한 진단을 위해 요구되는 당단백질 자체에 대한 정보, 당화 위치에 대한 정보, 및 당화 이형체에 대한 정보 등은 얻을 수 없는 한계가 있다.
한국공개특허공보 제2012-0125157호는 암의 진행과 관련된 당단백질의 비정상적인 당화(aberrant glycosylation)에 대한 정보를 이용하여 암을 진단하는 방법에 관한 것으로, 암 발생 및 진행에 따른 비정상적으로 당화된 당단백질을 렉틴(lectin)을 이용하여 분리하는 단계 및 렉틴에 의하여 분리된 당단백질의 가수분해로부터 생성된 마커 펩티드를 선별하고 정량하는 단계를 이용한 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암의 진단 방법을 개시하고 있다.
한국공개특허공보 제2010-0120788호는 당단백질의 당화를 이용한 암 진단 방법에 관한 것으로, 암 발생에 관여하는 당단백질의 당화 변화에 따른 영향으로 특정 펩타이드의 가수분해 양상이 특이적으로 변화하는 것을 이용한 암의 진단 방법을 개시하고 있다.
하지만 정상인과 비교하여 암환자 및 암경력자에게서 발생하는 특이적 당화는 정상적 당화와 마찬가지로 아스파라진(asparagine), 트레오닌(threonine) 또는 세린(serine) 등의 잔기에서 일어날 수 있다. 따라서 암과 관련될수 있는 특이적 구조를 갖는 당화는 정상적인 구조의 당화들과 함께 상기 어느 하나의 당화 자리에 발생할 수 있어, 미세이질성(glycan microheterogeneity)이 발생된다. 이로 인해 암과 관련된 특이적 당화는 어느 하나의 당화 자리에 존재하는 많은 당화 아형(glycan-isoform)들 중의 일부로서 단백질의 총 양에 대하여 적은 양으로 존재하게 되며, 특이적 당화의 정량적 변화를 신뢰성 있게 측정하기 위해서 보다 민감한 방법의 개발이 필요하다.
본원은 정확도와 민감도가 높은 간편하고 비침습적인 방법으로 검출이 가능한 암 진단 마커, 단백질 당화 비율의 검출을 통한 암 진단 및 암관련 바이오마커 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 암진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 피검체 유래의 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 갖는 단백질을 포함하는 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 포함된 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단계를 거친 단백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및 상기 시료에서 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군에서 결정된 수치와 비교하여, 상기 피검체 유래 시료에서 그 비가 변동한 경우를 상기 피검체가 암에 걸릴 위험성이 높거나 암이 발병한 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 암과 관련된 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서 본원은 또한 피검체 유래의 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 갖는 단백질을 포함하는 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 포함된 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단계를 거친 단백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및 상기 시료에서 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군에서 결정된 수치와 비교하여, 상기 피검체 유래 시료에서 그 비가 변동한 경우를 상기 피검체가 암에 걸릴 위험성이 높거나 암이 발병한 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 암 진단 방법을 제공한다.
또다른 양태에서 본원은 또한 암 시료를 평가하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, 피검체 유래의 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 갖는 단백질을 포함하는 암시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 포함된 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단계를 거친 단백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및 상기 시료에서 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군에서 결정된 수치와 비교하여, 상기 피검체 유래 시료에서 그 비가 변동한 경우를 상기 암 시료를 암에 걸릴 위험성이 높거나 암이 발병한 것으로 판단하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 특히 인비트로에서 수행되어, 암 진단 및/또는 예후 측정 및/또는 경과관찰과 판단 및 치료방법 결정등을 위해 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 대조군에서 결정된 수치는 정상 대조군 시료를 사용하여 본 방법과 동시에 또는 미리 결정된 값일 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서, 상기 N-연결 당화 모티브는 AsnXxxSer/Thr 또는 AsnXxxCys이며, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화 검출시 검출대상이 되는 펩타이드 단편은 AspXxxSer/Thr 또는 AspXxxCys이다.
본원에 따른 당단백질의 탈당화는 효소 이용을 포함한 다양한 방법에 수행될 수 있으며, 이로 제한하는 것은 아니나, 예를 들면 탈당화는 PNGase-F 처리에 의해 수행될 수 있다. 또한 본원에 따른 단백질의 단편화는 공지된 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 트립신, 라이신-C 또는 알지닌-C 또는 아스파르트산 N을 이용하여 수행될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 방법은 당화가 암의 발생 및/또는 진행과 관련된 다양한 암에 적용될 수 있으며, 예를 들면 혈액암, 간암, 위암, 대장암, 폐암, 자궁암, 유방암, 전립선암, 갑상선암 및 췌장암을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원의 방법이 사용될 수 있는 NxS/T 모티브를 포함하는 단백질이 포함된 시료는 암과 정상군 유래의 단백질읠 당화차이를 구분할 수 있는 시료로, 예를 들면 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 뇌척수액, 난포액, 모유 및 췌장액을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니며, 하나 이상의 시료가 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 펩타이드의 정량은 질량분석법 (Mass spectrometry)을 이용하여 수행될 수 있으며, 예를 들면 이러한 질량분석법은 액체크로마토그래피 질량분석법 (Liquid chromatography spectrometry, LC-MS )을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 액체크로마토그래피 질량분석법의 데이터는 Selected Ion Monitoring (SIM) 또는 Multiple reaction monitoring (MRM)을 이용하여 수득될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서 MRM을 이용한 정량은 후술하는 바와 같은 m/z 값 및 최적화 충돌 에너지 값을 모니터링하여 수행된다.
본원에 따른 방법을 이용하여 검출되는 NxS/T 모티브를 포함하는 단백질은 기존에 특정 질환과 관련하여 공지된 단백질일 수 있으며, 일 구현예에서는 간암의 마커로 알려진 AFP (alpha feto protein)이고, 이 경우 탈당화 펩타이드는 VDFTEIQ이고, 비당화 펩타이드는 GYQELLEK일 수 있다.
다른 구현예에서 본원에 따른 방법을 이용하여 검출되는 NxS/T 모티브를 포함하는 단백질을 포함하는 피검체는 간암 유래, 예를 들면 간암 환자의 혈액시료이며, N-연결 당화 모티브에서 탈당화 펩타이드 단편은 후술하는 표 1에 기재된 단백질 중 하나 이상의 유래이고, 상기 각 단백질의 탈당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드는 표 1에 기재된 것일 수 있으나, 정량 방법, 정량 분석의 구체적 조건 등에 맞추어, 적절하게 변경될 수 있으며, 이도 본원에 포함된다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원의 방법에 사용되는 키트로서, 상기 키트는 NxST 모티브를 포함하는 단백질을 탈당화시키는 효소, 상기 단백질을 단편화하는 효소 및 상기 탈당화 펩타이드 단편 및 비당화 펩타이드 단편의 정량에 사용되는 시약을 포함하는, 암 진단 또는 예후 판단용키트를 제공한다.
본원의 단백질의 당화 비율의 검출을 통한 암의 진단 방법은 하나 이상의 기존 마커를 이용하여 높은 특이성 및 민감도로 암의 조기진단, 모니터링 및 질병 진행 정도를 유의하게 예측 또는 파악할 수 있으며, 또한 암의 진단을 위한 새로운 마커 발굴에도 용이하게 사용될 수 있다. 특히 모세관 액체크로마토그래피에 트리플쿼드루플 (Triple quardrupole (QQQ))이 결합된 방식을 이용한 MRM LC-MS 방법은 총 분석시간이 10-15분으로 매우 짧아 재현성이 보장되므로, 단시간에 여러 명의 환자에 대한 간암 여부를 진단이 가능한 매우 효율적인 방법이다.
또한 혈액 내에 당화 되어 있는 다른 단백질에 적용 분석할 경우, 기존 마커보다 정확도 및 특이도가 보다 높은 진단 마커를 추가로 발굴할 수 있다. 이를 통해서 발굴된 바이오마커는 높은 정확도와 민감도로 간암의 조기진단, 모니터링 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 또한 본원에 따른 바이오마커는 혈액을 이용한 비침습성 검사로 간단하고 유효성 있는 암의 진단 또는 모니터링이 가능하여, 암 조기 발견은 물론 암의 치료 여부 및 치료 경과 확인에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 LC-Mass 분석법을 이용한 당화 단편의 분석 원리를 도식적으로 나타낸 것이다. 당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드 부분은 초록색으로 표시하였으며, 당화 아미노산은 적색으로 표시하였다.
도 2는 본원의 일 구현예에서 표준 당화 단백질로 사용된 Invertase-1의 단백질 서열이다.
도 3a 내지 3c는 표준 당화 단백질의 당펩타이드 1 (NPVLAANSTQFR)의 MRM 분석결과로, 3a는 3b 및 3c의 농도에 따른 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a 내지 4c는 표준 당화 단백질의 당펩타이드 2 (FATNTTLTK)의 MRM 분석결과로, 4a는 4b 및 4c의 농도에 따른 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5c는 표준 비당화 단백질의 당펩타이드 1 (IEIYSSDDLK)의 MRM 분석결과로, 5a는 5b 및 5c의 농도에 따른 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c는 표준 비당화 단백질의 당펩타이드 1 (VVDFGK)의 MRM 분석결과로, 6a는 6b 및 6c의 농도에 따른 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 도 3 내지 도 6의 각 표적 펩타이드의 내인성 펩타이드에 대한 MRM 분석 결과에서 수득한 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 인간유래 알파페토단백질 (Alpha fetoprotein, AFP)의 아미노산 서열을 나타내며, 당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드 부분은 초록색으로 표시하였으며, 당화 아미노산은 적색으로 표시하였다.
도 9a 및 9b는 각각 정상 대조군의 집합 시료를 사용한 AFP의 당화 펩타이드 (VNFTEIQ) 및 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQ)에 대한 MRM 분석 결과이다.
도 9c 및 9d는 각각 간암 환자군의 집합 시료를 사용한 AFP의 당화 펩타이드 (VNFTEIQ) 및 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQ)에 대한 MRM 분석 결과이다.
도 10a 및 10b는 각각 정상 대조군의 집합 시료를 사용한 AFP의 비당화 펩타이드 (GYQELLEK) 및 탈당화 펩타이드 (GYQELLEK)에 대한 MRM 분석 결과이다.
도 10c 및 10d는 각각 간암 환자군의 집합 시료를 사용한 AFP의 비당화 펩타이드 (GYQELLEK) 및 탈당화 펩타이드 (GYQELLEK)에 대한 MRM 분석 결과이다.
도 11은 AFP 표적 펩타이드에 대한 간암 환자와 정상인 간의 MRM 분석으로 수득한 피크 면적의 차이를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 MRM을 이용한 AFP 표적 펩타이드에 대한 CE 최적화 실험결과를 나타낸다.
도 13a은 내인성 AFP 탈당화 표적 펩타이드(VDFTEIQK)를 MRM으로 분석한 결과이다.
도 13b는 내인성 AFP 비당화 표적 펩타이드(GYQELLEK)를 MRM으로 분석한 결과이다.
도 14는 AFP 표적 펩타이드에 대한 중표지(heavy labelled)된 합성 펩타이드의 정량성을 확인하기 위해, 반응커브의 선형성을 MRM으로 분석한 결과이다.
도 15는 임상시료를 이용하여 AFP 단백질의 당화 펩타이드의 탈당화와 비당화 펩타이드에 대한 MRM 결과를 분석한 것이다.
도 16은 AFP 표적 펩타이드 및 2-펩타이드 (탈당화 및 비당화 펩타이드) 패널의 AUC 값을 비교한 것이다.
도 17a 내지 17z 는 당단백질 마커 후보군을 추가로 발굴하기 위해서 선정된 단백질에 대해 표준화된 탈당화 펩타이드 양과 표준화된 비당화 펩타이드 그리고 이에 대한 비를 가지고 AUC 값을 서로 비교한 것이다.
도 18a 내지 18i는 당단백질 마커 후보군을 추가로 발굴하기 위해서 선정된 단백질에 대해 표준화된 탈당화 펩타이드 양과 표준화된 비당화 펩타이드 그리고 이에 대한 비를 가지고 AUC 값을 서로 비교한 것이다.
본원은 후번역 변형과정에서 발생하는 당화의 양적인 변화를 확인하여, 암과 같은 질환을 진단할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
한 양태에서 본원은 암 진단, 암의 진행상태 또는 경과, 예후 판단을 위한 정보를 제공하기 위하여, 피검체의, N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 갖는 단백질을 포함하는 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 포함된 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단계를 거친 단백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및 상기 시료에서 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 정상 대조군과 비교하여, 상기 피검체 유래 시료에서 그 비가 변동한 경우를 상기 피검체가 암에 걸릴 위험성이 높거나 암이 발병한 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 암과 관련된 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
또다른 양태에서 본원은 또한 암 시료를 평가하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은, 피검체 유래의 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 갖는 단백질을 포함하는 암시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 포함된 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단계를 거친 단백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및 상기 시료에서 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군에서 결정된 수치와 비교하여, 상기 피검체 유래 시료에서 그 비가 변동한 경우를 상기 암 시료를 암에 걸릴 위험성이 높거나 암이 발병한 것으로 판단하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 특히 인비트로에서 수행되어, 암 진단 및/또는 예후 측정 및/또는 경과관찰과 판단 및 치료방법 결정등을 위해 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법에서 대조군에서 결정된 수치는 후술하는 대조군 시료를 사용하여 본 방법과 동시에 또는 미리 결정된 값일 수 있다.
대부분의 단백질은 활성을 위해 번역 후 변형과정 (post translational modification (PTM))을 거친다. PTM 중 당화 (glycosylation)는 단백질 접힘, 이동 및 반감기는 물론 세포-세포 상호작용 및 항원성에도 중요한 역할을 한다. 당화는 글라이케이션화를 제외하고는 효소가 관여하는 반응으로 단백질에 당(sugar)를 추가하여 글라이칸 사슬을 형성한다.
당화는 N-linked, O-linked, C-mannosylation 및 GPI (glycophosphatidyl-inositol) 앵커 부착의 4 종류가 존재하며, 일 구현예에서 본원은 N-연결 당화에 관한 것이다.
N-연결당화는 미리 형성된 글라이켄을 아스파라진(Asn) 잔기에 부착하는 것으로 이는 번역과 동시에 발생하여 단백질 접힘에 영향을 끼친다. N-연결 당화는 특정 펩타이드 모티브에서 발생하여, 펩타이드 서열 모티브는 Asn-Xxx-Ser/Thr((N-X-S/T) 또는 Asn-Xxx-Cys (N-X-C)를 포함하며, 여기에서 Xxx는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 본원의 시료에 포함된 단백질은 상기 모티브 전부 또는 일부가 당화되어 있는 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질로서, 질환 예를 들면 암의 발병 또는 진행 정도에 따라 단백질 자체의 발현량 및/또는 단백질의 당화정도가 증가하면 특정 형태의 당 예를 들면 푸코스가 결합된다.
당화 분석에 사용되는 시료는 피검체 또는 정상 대조군 유래의 N-연결 당화 모티브를 갖는 단백질을 포함하는 시료이다. 피검체는 암의 발생이 의심되는 대상체, 암 발병 여부에 대한 진단이 필요한 대상체, 암 발병 후 치료 중인 대상체, 암으로 진단 후 치료된 대상체, 및 암이 발생한 대상체 등의 암의 진단을 필요로 하는 대상체를 포함하는 것이다. 대조군은 암이 발생한 적이 없거나 완치된 대상체의 시료를 포함한다. 대상체는 포유동물, 특히 인간을 포함한다.
본원에 따른 시료 또는 암시료는 단백질을 포함하는 시료는 물론 이러한 시료로부터 추출된 단백질을 모두 포함하는 것이다. 본원에서 시료는 질환, 특히 암의 발병 또는 진행 상태와 관련된 정보를 포함할 수 있는 단백질을 포함하는, 생물체로부터 얻을 수 있는 시료로서, 생체조직, 생체조직의 배양을 통해 수득한 세포주 또는 배양액, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 뇌척수액, 난포액, 모유 및 췌장액 등을 포함할 수 있다. 특히 암의 발병 및 진행등과 관련된 당단백질은 세포외 배지로 분비 또는 방출되기 때문에 특히 다양한 암 세포주의 배양 배지 및 피검체의 혈액 등은 이러한 암 정보를 포함하는 당단백질의 검출에 적합할 수 있다. 혈액의 경우는, 혈액에 존재하는 구성 성분 단백질들 사이의 농도변화가 매우 크기 때문에, 고농도 단백질 제거용 컬럼, 예를 들어, MARS(Multiple Affinity Removal System) 등을 사용하여 전처리를 수행할 수 있으나 표적 단백질의 민감도 및 재현성에 문제가 없다면 생략될 수도 있다.
특히, 당단백질의 당화는 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 단당류가 신호전달에 의해 세포막 안으로 들어가 당전이 효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 N-acetylglucosaminyltransferase)에 의해 필요한 단백질의 당화가 이루어지고 이러한 당단백질은 세포막 외에 위치하여 필요한 역할을 수행한다. 세포막 표면에 존재하는 많은 당단백질의 경우 암유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령을 받으면 비정상적 당화가 발생한다. 다양한 암의 발생에 암유전자의 비정상적인 신호전달로 인해 당전이효소와 당분해효소의 비정상적인 작용이 관련이 있음이 알려져 있다(Kim, Y. J., et al., Glycoconj. J., 1997, 14, 569-576., Hakomori, S., Adv. Cancer Res.,1989, 52, 257-331., Hakomori, S., Cancer Res., 1996, 56, 5309-5318).
따라서 본원에 따른 방법은 당화가 암의 발생, 진행과 관련 있는 다양한 암, 예를 들면 혈액암, 간암, 위암, 대장암, 폐암, 자궁암, 유방암, 전립선암, 갑상선암 및 췌장암을 포함하는 암의 진단에 사용될 수 있다. 본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)(예컨대, 트랜지션성 암 상태의 동정, 암의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본원에 따른 방법은 당화 모티브의 탈당화 (de-glycosylation) 양과 비당화 모티브 (non-glycosylation)의 양 및 이에 대한 비를 계산하여, 이를 정상대조군과 비교하여, 이에 변동, 즉 감소 또는 증가가 있는 경우, 이를 암의 진단, 검출, 진행정도 판별, 예후 판별에 사용된다. 정량은 후술하는 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 액체크로마토그래피와 같은 방법을 사용할 경우, 상기 비는 탈당화 단편에 대한 피크 면적 값과 비당화 단편에 대한 피크 면적 값을 각각 구한 다음, 이를 내부표준 펩타이드 (Internal standard peptide) 의 피크 면적 값으로 나누어 노말라이즈한 다음, 이 값을 이용하여 단편의 비 값 즉 노말라이즈된 탈당화 단편 피크면적/노말라이즈된 비당화 단편 피크 면적을 결정할 수 있다.
따라서, 당화 모티브의 탈당화 및 단편화가 수행되며, 이를 위해 다양한 탈당화 효소가 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 PNGase-F (Peptide N Glycosidase F)가 사용된다. 단편화는 분석의 용이성을 위해 전장 단백질은 작은 단편, 예를 들면 6-24 개 정도의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 형성하는 것으로, 이를 위한 다양한 가수분해효소가 사용될 수 있다. 단백질을 펩타이드 조각으로 가수분해시키기 위해서는 라이신과 알지닌의 아마이드(amide) 결합을 절단하는 트립신을 예로 들 수 있으나 그외 목적에 따라 라이신 자리만 절단하는 라이신-C, 알지닌 자리만 절단하는 알지닌-C, 아스파라진 자리를 절단하는 아스파르트산 N 등의 효소를 선택적으로 사용할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 트립신이 사용된다.
본원에 사용되는 비당화 모티브는 당화 모티브와 동일한 단백질 내의 당화되지 않는 펩타이드 서열로서 NxS/T 모티브를 포함하지 않는 펩타이드 중에서 변형 될 가능성이 있는 시스테인 또는 메티오닌을 포함하지 않는 길이의 펩타이드로 검출하는 방법에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 질량분석기로 검출하는 경우, 질량범위가 약 15-1400m/z 이기 때문에 아미노산의 평균 분자량과 전하 그리고 특이성을 갖기 위한 최서 서열갯수를 고려하면 약 6개 내지 24개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 선별될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서 당화 모티브는 간암 표지자로서 작용할 수 있는, AFP, SERPINF2, A2M, APOB, GLB1, BMP1, SERPINA6, CFH, BCHE, CLU, COL12A1, CPN2, VCAN, ERBB3, F5, F11, AFP, FSTL1, GNS, GPR126, SERPIND1, HYOU1, ITGA2, ITGA3, ITGA6, ITGAM, ITGB2, KLKB1, KTN1, LAMP2, LGALS3BP, PLXNA1, POSTN, PTK7, ROBO4, TNC, 또는 VTN의 VDFTEIQ 단백질 유래이고, 상기 각 단백질의 탈당화 및 비당화 펩타이드는 하기 표 1와 같다.
표지자 탈당화 펩타이드 비당화 펩타이드
AFP VDFTEIQ GYQELLEK
SERPINF2 NPDPSAPR LGNQEPGGQTALK
A2M VSDQTLSLFFTVLQDVPVR AIGYLNTGYQR
FEVQVTVPK
IAQWQSFQLEGGLK
NEDSLVFVQTDK
VSVQLEASPAFLAVPVEK
APOB FEVDSPVYDATWSASLK LSLESLTSYFSIESSTK
GLB1 NNVITLDITGK VNYGAYINDFK
BMP1 IILDFTSLDLYR GIFLDTIVPK
SERPINA6 AQLLQGLGFDLTER ITQDAQLK
WSAGLTSSQVDLYIPK
CFH SPDVIDGSPISQK SSIDIENGFISESQYTYALK
BCHE WSDIWDATK AILQSGSFNAPWAVTSLYEAR
IFFPGVSEFGK
YLTLNTESTR
CLU LADLTQGEDQYYL ASSIIDELFQDR
EIQNAVNGVK
COL12A1 NVQVYDPTPNSLDVR ITEVTSEGFR
VQISLVQYSR
VYDPSTSTLNVR
CPN2 AFGSNPDLTK LELLSLSK
VCAN VVAEDITQTSR LLASDAGLYR
TDGQVSGEAIK
ERBB3 NLDVTSLGFR LAEVPDLLEK
F5 TWDQSIALR ASEFLGYWEPR
F11 LSSDGSPTK VVSGFSLK
FSTL1 GSDYSEILDK LSFQEFLK
GNS YYDYTLSINGK AFQNVFAPR
GPR126 SLSSSSIGSDSTYLTSK ISVVIQNILR
VILPQTSDAYQVSVAK
SERPIND1 DFVDASSK EYYFAEAQIADFSDPAFISK
NYNLVESLK
SVNDLYIQK
TLEAQLTPR
HYOU1 VFGSQDLTTVK
VIDETWAWK		 DEPGEQVELK
ITGA2 YFFDVSDEAALLEK FGIAVLGYLNR
ITGA3 DITIVTGAPR TVEDVGSPLK
ITGA6 LWDSTFLEEYSK LPNAGTQVR
ITGAM EFDVTVTVR ILVVITDGEK
ITGB2 LTDNSNQFQTEVGK ALNEITESGR
KLKB1 GVNFDVSK DSVTGTLPK
IAYGTQGSSGYSLR
YSPGGTPTAIK
KTN1 TEDSSLTK LQTLVSEQPNK
LAMP2 VQPFDVTQGK GILTVDELLAIR
LGALS3BP ALGFEDATQALGR ELSEALGQIFDSQR
SDLAVPSELALLK
YSSDYFQAPSDYR
PLXNA1 YDYTEDPTILR LSLPWLLNK
POSTN EVDDTLLVNELK IIDGVPVEITEK
PTK7 SADASFNIK SSLQPITTLGK
ROBO4 DLSQSPGAVPQALVAWR GPDSNVLLLR
TNC LLETVEYDISGAER APTAQVESFR
VTN DGSLFAFR DVWGIEGPIDAAFTR
FEDGVLDPDYPR
본원에 따른 탈당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드의 정량과 탈당화/비당화 펩타이드의 비율의 차이는 정상인과 암환자 또는 암우려환자 유래의 피검체에서 민감도가 높은 검출 방법이 사용되는 것이 바람직하다. 검출을 위해 혈장의 90% 이상을 차지하는 알부민(albumin), 이뮤노글로블린 G(lgG), 이뮤노글로블린 A(lgA), 트랜스페린 (transferrin), 합토글로빈(haptoglobin), 피브리노겐 (Fibrinogen) 등을 제거하거나 또는 아세톤 침전(acetone precipitation)이나 분획분자량(MWCO, molecular weight cut-off)법을 이용하여, 당단백질만 모으는 과정에서 사용된 많은 염들을 제거하고 단백질만 농축하는 단백질 정제과정을 거칠 수도 있다. 본원에서, N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편은 NxS/T 또는 NxC 모티브의 아스파라진이 아스파르트산으로 변화된 AspXxxSer/Thr 또는 AspXxxCys으로 검출된다. 즉, N-연결 당화 모티브에서 탈당화 검출시 검출대상이 되는 펩타이드 단편은 AspXxxSer/Thr 또는 AspXxxCys이다.
본원의 방법에서 정량은 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다. 피검체로부터 단백질을 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링 (Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 표지 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.
본원에 따른 다른 구현예에서는 액체크로마토그래피 질량 분석법이 사용된다. 또한 상기 액체크로마토그래피 질량 분석법의 데이터는 단백질이나 펩타이드에 대한 표지 없이 질량분석기의 정확한 분자량 값과 액체크로마토그래피에서 펩타이드들이 분리되는 머무름 시간의 재현성을 기초로 분석하는 Selected Ion Monitoring (SIM) 또는 MRM이 이용될 수 있으며, 본원에 따른 일 구현예에서는 MRM이 사용된다. MRM 분석을 위해 peptide/transition 값을 모니터링해서 수행될 수 있다.
MRM은 표지 없이 상대적으로 정량분석하거나, 동위원소로 치환된 펩타이드 표준물(stable isotope labeled peptide standard)을 질량분석 전에 주입하여 절대 정량 분석하는 두 가지 형태가 사용 가능하다. 다중반응탐색법을 활용한 보다 효율적인 정량분석을 위해 TIQAM(targeted identification for quantitative analysis by MRM)과 같은 데이터베이스 및 프로그램을 활용하여 후보 단백질에만 검출되는 유일한 펩타이드의 선택과 해당 펩타이드에 대한 MRM 트랜지션의 생성과 검증을 이용하는 방법이 사용될 수 있다(Anderson L, et al., Mol. Cell Proteomics. 2006, 5: 573-588).
본 발명의 일 실시예에 따르면, 질환이 의심되는 환자 또는 질환이 발병한 환자의 혈액을 수득하여 혈액 중 해당 단백질의 당화/탈당화 여부를 LC/MS(액체 크로마토그래피/질량 분석기, Liquid Chromatography/Mass Spectrometer) 방법을 수행하여 각 환자의 시료로부터 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 대조군과 비교하여 진단 및/또는 예후 측정에 사용될 수 있다.
그 예로 정상 대조군에서 해당 마커의 정상범위의 임계값 (cutoff) (증가하는 경우에는 상한치 / 감소하는 경우에는 하한치)을 결정하여, 질환이 의심되는 환자의 경우 해당 단백질의 당화/탈당화 측정값이 임계값보다 변동한 경우, 즉 증가 또는 감소한 경우 환자로 진단할 수 있으며, 임계값 보다 증가 또는 감소여부 및 이를 근거로 한 진단은 다양한 요소, 예를 들면 질환의 종류, 특징, 피검체의 종류, 환자의 성별, 나이, 분석방법 및/또는 장비 등에 따라 다양할 수 있으며, 당업자라면 이러한 사항을 고려하여 적절한 값을 정할 수 있을 것이다. 또한 환자에서 치료 후 해당 측정값이 정상 범위 내로 회복되는 지를 확인하여 치료 성과에 대한 판정 및 추적 관찰이 가능하다. 이러한 본원에 따른 진단방법은 단독으로 또는 공지된 방법과 함께 사용될 수 있다.
본원에 따른 방법은 하나의 시료에 대하여 여러 단백질에 대한 탈당화 비당화를 동시 또는 개별적으로 검출할 수 있다. 예를 들면 탈당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드를 포함하여 일회에 최대 1000 여개 정도의 펩타이드 분석이 가능하며, 이는 500 개에 해당하는 당단백질의 검출이 가능한 것이다. 여러 개의 단백질에 대하여 탈당화여부를 검출한 경우, 이를 다 조합하여 질환 별 패널 등을 만들어 사용할 경우, 암의 진단에 있어, 정확성 (특이도와 민감도)을 높일 수 있다.
다른 양태에서 본원에 따른 방법은 또한 피검체의 당화된 여러 종류의 당단백질에 적용 분석할 경우, 기존의 암 마커와 비교하여 정확도 및 특이도가 보다 높은 암 마커의 스크리닝에 사용될 수 있다.
본원에서 용어 암과 관련된 마커 또는 바이오마커(또는 바이오표지자) 또는 암 마커(또는 표지자) 또는 암 바이오마커란 암이 발생한 조직 또는 세포를 정상 세포 또는 적절한 암치료를 받은 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본원의 일 구현예에서는 간세포암 진단 마커로서, 간세포암 조직이나 혈액에서 당단백질 발현이 증가 및 감소하거나 당질화 되는 정도가 증가 및 감소하는 AFP, Alpha-2-antiplasmin (SERPINF2), Alpha-2-macroglobulin (A2M), Apolipoprotein B-100 (APOB), Beta-galactosidase (GLB1), Bone morphogenetic protein 1 (BMP1), Corticosteroid-binding globulin (SERPINA6), Complement factor H (CFH), Cholinesterase (BCHE), Clusterin (CLU), Collagen alpha-1(XII) chain (COL12A1), Carboxypeptidase N subunit 2 (CPN2), Versican core protein (VCAN), Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 (ERBB3), Coagulation factor V (F5), Coagulation factor XI (F11), Alpha-fetoprotein (AFP), Follistatin-related protein 1 (FSTL1), N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS), G-protein coupled receptor 126 (GPR126), Heparin cofactor 2 (SERPIND1), Hypoxia up-regulated protein 1 (HYOU1), Integrin alpha-2 (ITGA2), Integrin alpha-3 (ITGA3), Integrin alpha-6 (ITGA6), Integrin alpha-M (ITGAM), Integrin beta-2 (ITGB2), Plasma kallikrein (KLKB1), Kinectin (KTN1), Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 (LAMP2), Galectin-3-binding protein (LGALS3BP), Plexin-A1 (PLXNA1), Periostin (POSTN), Inactive tyrosine-protein kinase 7 (PTK7), Roundabout homolog 4 (ROBO4), Tenascin (TNC), Vitronectin (VTN) 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이다.
본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개 또는 그 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 예 예를 들면 간초음파 등과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 암 진단용 마커의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 일 실시예에서 본 방법은 대조군 및 시험군 유래의 전부 또는 일부가 당화되어 있는 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질을 제공하는 단계로, 상기 대조군은 암이 발생하지 않은 정상 시료 유래이고, 상기 시험군은 암 유래의 시료인, 단계; 상기 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화 의해 생성된 탈당화 펩타이드 단편 및 비당화 펩타이드 단편을 정량하는 단계; 및 상기 탈당화 단편의 양과 비당화 단편의 비를 상기 대조군과 대비하여, 상기 비에 변동이 있는 경우 이를 상기 암 진단의 마커로 선별하는 단계를 포함하는, 암 진단용 마커의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 방법의 구성에 관하여는 앞서 기재한 설명을 참조할 수 있다.
본 방법의 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질은 암이 발생한 조직 또는 세포 또는 혈액을 포함한 체액 유래, 또는 정상 대조군 또는 적절한 암치료를 받은 대조군 유래로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 변동, 즉 증가 또는 감소 양상을 보이는 당화 단백질을 포함한다. 이러한 당화 단백질은 기존의 당단백질 중에서 스크리닝 될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 상술한 본원에 따른 방법에 사용되는 키트로서, 상기 키트는 NxST 모티브를 포함하는 단백질 또는 이를 포함하는 시료를 탈당화시키는 효소, 상기 단백질을 단편화하는 효소 및 상기 탈당화 펩타이드 단편 및 비당화 펩타이드 단편을 정량에 사용되는 시약을 포함한다. 본원에 따른 키트에 포함되는 각 구성 및 용도는 앞서 기술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 표준 당단백질을 이용한 탈당화 / 비당화 펩타이드 분석
MRM 기술을 이용한 당화 펩타이드 및 탈당화 펩타이드의 정량을 통해 마커 발굴 및 질환 진단의 가능성을 확인하기 위해 표준 당단백질을 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
도 1에 나타난 바와 같이 질량분석법의 하나인 Triple quadrupole 을 이용한 MRM 기술은, 특정 펩타이드의 양을 상대 및 절대 정량 할 수 있는 기술로써, 특정 펩타이드의 Q1 m/z (질량/전하량)만을 통과시켜서 필터 역할을 수행하는 Quadruple 1 (Q1) 과 Q1 을 통과한 펩타이드를 전기적인 에너지에 의해 단편화가 일어나도록 만들어 주는 Quadruple 2 (collision cell), 그리고 Quadruple 1 (Q1) 에서처럼 필터 역할을 수행해서 특정 단편화 이온만을 통과시키는 Quadruple 3 (Q3) 로 이루어져 있다. Q3 까지 통과된 이온은 검출기에서 피크의 크로마토그램으로 나타난다. 이 피크의 면적을 분석하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행할 수 있게 된다. 당화 펩타이드의 경우, 당화사슬(Glycan) 에 의해 본래 펩타이드가 갖고 있는 질량(mass) 값에서 변화가 일어나기 때문에, 해당 펩타이드에 대한 m/z 값으로 Q1 필터를 통과하지 못하게 된다. 이로 인해 Q2 collision cell 안으로 진입하지 못하므로 검출되지 않는다. 반면에, 탈당화 효소 예를 들면 PNGase-F를 처리한 탈당화된 펩타이드의 경우, N-glycosylation site (NxS/T)에서 PNGase-F 에 의해 글라이켄이 떨어져 나가면서 아스파라진 (Asparagine, N)이 아스파르트산 (Aspartic acid ,D)으로 바뀌게 되는 탈아미드화 (N → D)가 발생되는데, 이러한 원리를 이용하여 탈아미드화된 형태의 펩타이드 서열로 분석할 경우 탈당화 펩타이드를 검출할 수 있다.
실시예 1-1 표준 당단백질의 선정
표준 단백질의 경우 특정 NxS/T motif 에 당화 되어 있는 상태로 정제된 후, 동결건조 상태로 시중에서 구입할 수 있는 단백질 중에서 이론적인 트랜지션 (Q1/Q3) 선정 시, NxS/T 모티브를 포함 하는 당화 펩타이드와 NxS/T 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드가 모두 skyline 프로그램상에서 예측가능한 트랜지션으로 잡히는 것을 실험에 사용하였다.
본 실시예에서는 이스트 유래인 Invertase-1 단백질을 표준단백질로 사용하였으며, 그 서열 및 분석에 이용 된 서열 (초록색 표시)은 도 2에 개시된 바와 같다. 표준 당화 펩타이드 1 및 2는 각각 NPVLAANSTQFR 및 FATNTTLTK 이며, 상기 각 펩타이드가 탈당화시 아스파라진이 아스파르트산으로 전환되어 각각 NPVLAADSTQFR 및 FATDTTLTK이 된다. 표준 비당화 펩타이드 1 및 2는 각각 IEIYSSDDLK 및 VVDFGK이다.
실시예 1-2 표준 당단백질의 이론적 트랜지션 ( Q1 / Q2 ) 선정
해당 표준 당단백질에 대한 본래의 서열 정보(native form)와 NxS/T motif 자리에서 N을 D로 바꾼 변경된 서열 정보(conversion form) 를 각각 skyline (https://brendanx-uw1.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view) program 에 도입해서 이론적인 트랜지션 값을 선정하였다. 이때, 분석에 이용된 펩타이드와 동일한 서열을 갖지만, 펩타이드의 C-말단에 존재하는 알지닌 (Arg, R)과 라이신 (Lys, K) 의 탄소(12C), 질소(14N) 가 13C, 15N 으로 표지된 중표지 (heavy-labeled) 합성 펩타이드를 이용해서, 해당 펩타이드가 실제 검출하고자 하는 펩타이드에서 유래된 것인지 검증하였다.
즉, 중표지 합성 펩타이드와 내인성 펩타이드는 펩타이드 서열이 서로 같기 때문에, 소수성이 서로 동일해서, LC-컬럼(C18) 상에서 동일한 머무름시간 (retention time) 에 용출되므로 이를 통해서 확인할 수 있다.
트랜지션 (Q1/Q3) 선정결과, 원 서열 (native sequence)과 변경서열 (conversion sequence) 간에는 Q1 값이 0.49 Da, Q3 값이 0.98 Da 차이나는 것을 확인했고, 내인성 펩타이드와 중표지 합성 펩타이드 간에는 Q1 값이 4.00 Da (5.00 Da), Q3 값은 8.01 Da (10.01 Da) 차이나는 것을 확인했으며, 트랜지션 분석 결과는 아래 표 2와 같다.
[표 2]
Figure 112013067373396-pat00001

실시예 1-3 표준 당단백질에 대한 MRM 분석
1-3-1 표준 당단백질 시료 준비
표준 당단백질 100μg 에 최종 농도 6M urea/20mM DTT(dithiothreitol)로 처리 (Tris pH 8.0) 하여 다음, 37℃에서 60분 동안 정치하여 환원과정을 수행하였다. 이어 최종 농도가 50mM이 되도록 IAA (iodoacetamide)를 처리 한 다음, 상온에서 30분 동안 정치하여 알킬화를 수행하였다. 이어 Urea 의 최종농도가 0.6M 이하가 되도록 100mM Tris pH 8.0으로 희석하였다. 이어 탈당화 펩타이드는 PNGase-F (Peptide N Glycosidase) (NEW ENGLAND BioLabs Inc. P0704L)를 2μl(500,000 units/ml)로 처리하고, 당화 시료는 대조군으로 물 2μl로 처리 후, 37℃에서 16시간 동안 정치하였다. 이어 트립신과 상기 펩타이드 시료의 농도 비율이 1:50 이 되도록 트립신으로 처리 후, 37℃에서 12시간 동안 정치하였다. 이어 포름산 용액을 최종농도 5%가 되도록 처리하였다. 이어 다음과 같이 OASIS cartridge (Waters)를 제조자의 방법대로 사용해서 탈염화를 수행하였다. 탈염화 펩타이드를 Sol A 완충액 (97% D.W, 3% ACN, 0.1% formic acid) 에 녹인 다음, 15,000rpm에서 60 min 동안 원심분리 한 다음, MRM 분석 시행하였다.
1-3-2 MRM 분석 시료 준비
정량성을 확인하기 위해, 표적 펩타이드에 대한 중표지 합성 펩타이드의 선형성을 확인하는 실험을 다음과 같이 진행했다. 실험 방법은 중표지 합성 펩타이드를 0, 4, 13, 40, 120, 370 fmol 농도로 일련 희석한 다음에, 여기에 표준 당화단백질에 해당되는 표적단백질 370nmol 을 일정하게 넣어서 분석을 진행했다. 당화 표준 당단백질 시료에는 본래의 서열 정보 (N-form, Asn을 포함)를 갖고 있는 중표지 합성 펩타이드를 연속희석하여 분석을 수행하였으며, 탈당화 표준 당단백질시료에는 변경된 서열 정보 (D-form, Asn 대신에 Asp 아미노산)를 갖고 있는 중표지 합성 펩타이드를 연속희석하여 분석을 수행하였으며, 모든 분석은 3회 반복 분석하였다.
1-3-3 MRM 분석 조건
액체 크로마토그래피 (Liquid chromatography (LC)) 는 Agilent 사의 1260 capillary LC system 을 사용하였고, 펩타이드 분리를 위해서 Capillary RR 0.3 x 150, 3.5μm (Cat.N 5064-8261) 컬럼을 사용하였다. 펩타이드 시료는 5.0 μl를 트랩 컬럼을 거치지 않고 분석컬럼으로 바로 주입되는 직접 방법으로 주입하였으며, 유속은 20L/min 으로 사용하였다. Column을 SolA (97% Distilled Water, 3% acetonitrile, 0.1% formic acid)로 10 분간 평형화 한 후 SolB (3% Distilled Water, 97% acetonitrile, 0.1% formic acid)로 45min 간, 5%에서 60%까지, 5분간 85%의 농도구배를 통해 펩타이드를 용출하였다.
질량분석 (Mass spectrometry)은 Agilent technology 사의 6490-Triple quadrupole(QQQ) 장비를 이용하여 선정 단백질의 트랜지션에 대해 MRM mode 로 모니터링하였다. 가스온도는 200℃, gas flow는 14L/min 으로 사용하였으며, nebulizer 는 20psi, sheath gas temperature 는 250℃, sheath gas flow 는 11L/min 으로 사용하였다. 모세관 및 노즐 전압은 각각 3000V 로 사용하였다.
Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3 (Q3)에서의 해상도(0.7Da) unit 으로 설정하였으며, unscheduled MRM 방식으로 dwell time 은 총 주기가 2 sec 정도가 되도록 설정해서, 모든 표적 펩타이드에 대해서 분석을 한 다음, 용출되는 머무름시간(retention time) 을 선정하였고, 이를 근거로 window size 3 min으로 계획된 (scheduled) MRM 으로 3번 반복 분석을 진행하였다.
1-3-4 MRM 분석 결과
표준 당단백질에 대한 MRM 분석 결과는 도 3 내지 도 7에 기재되어 있다.
도 3 및 4와 아래 표 3-1과 3-2 및 표 4-1과 4-2는 당화 펩타이드 1 및 2 각각에 PNGase-F 를 처리해서 만든 탈당화 시료와 물 (대조군)로 처리한 당화 시료를 대상으로 당화 펩타이드인 NPVLAANSTQFR (당화 펩타이드 1) / FATNTTLTK (당화 펩타이드 2)에 대해 분석을 진행한 결과이다. 탈당화 시료에 변경 서열 정보로 합성된 중표지 펩타이드 (D-form) 를 연속희석하여 분석한 결과, 표준 당단백질로부터 유래한 내인성 펩타이드와 중표지 합성 펩타이드가 동일한 시간에 함께 용출 되는 것을 확인하였고, 5개의 프러덕트 이온 타입의 강도 또한 동일하게 확인되었으며, 중표지 합성 펩타이드의 선형성 (R^2=0.9959, 0.9994) 또한 확인되었다. 시료에 본래의 서열 정보로 합성된 중표지 펩타이드 (N-form) 를 연속희석하여 분석한 결과, 표준 당단백질로부터 유래한 내인성 펩타이드의 경우, 당화에 의해서 질량 값이 이동되기 때문에 관측되지 않았고, 중표지 합성 펩타이드만이 확인되었으며, 선형성(R^=0.9971, 0.9958) 또한 확인 되었다.
[표 3-1]
Figure 112013067373396-pat00002
[표 3-2]
Figure 112013067373396-pat00003
[표 4-1]
Figure 112013067373396-pat00004
[표 4-2]
Figure 112013067373396-pat00005
도 5 및 6과 하기 표 5-1과 5-2 및 표 6-1과 6-2는 PNGase-F 를 처리해서 만든 탈당화 시료와 물(대조군)을 처리한 비당화 펩타이드인 IEIYSSDDLK / VVDFGK 에 대한 분석결과이다.
탈당화 시료 및 당화 시료에 중표지 펩타이드를 연속희석하여 분석한 결과, 표준 당단백질로부터 유래한 내인성 펩타이드와 중표지 펩타이드가 동일한 시간에 함께 용출되었으며, 5개의 프러덕트 이온 타입의 강도 또한 동일한 것으로 나타났다. 중표지 합성 펩타이드의 선형성 (R^2=0.9993, 0.9994 / R^2=0.9981, 0.9997) 또한 확인되었다. 나아가 내인성 펩타이드의 경우, PNGase-F 를 처리한 탈당화 시료와 비교하여 강도가 낮은 것으로 나타났다.
[표 5-1]
Figure 112013067373396-pat00006
[표 5-2]
Figure 112013067373396-pat00007
[표 6-1]
Figure 112013067373396-pat00008
[표 6-2]
Figure 112013067373396-pat00009
표준 당단백질을 이용한 실험 결과를 종합하면, 도 7에 나타난 바와 같이 탈당화 펩타이드를 변경된 서열 (D-form)으로 분석할 경우는 검출되지만, 당화 펩타이드를 원래의 서열인 N-form으로 분석할 경우, 당화(glycan)에 의해서 질량 값이 바뀌기 때문에 검출되지 않는 것을 확인하였다. 이는 당화 펩타이드가 당단백질의 정량을 위해 이용될 수 있음을 나타내는 것이다. 당화 되어 있지 않는 비당화 펩타이드의 경우 PNGase-F를 처리한 탈당화 시료가 당화 시료에 비해서 피크 강도가 증가함을 확인하였다. 이는 PNGase-F에 의해서 글라이켄이 펩타이드에서 제거되기 때문에, 이로 인해 글라이켄에 의한 입체성방해 (steric hindrance)가 사라져 이후에 트립신이 표적 펩타이드에 작용하는데 접근이 용이해지기 때문인 것으로 판단된다.
실시예 2 간암 시료에서 MRM 을 이용한 당화 분석
실시예 2-1 임상시료 정보
본 실시예는 서울대학교의 의학연구윤리심의위원회의 허가된 프로토콜에 따라 수행되었으며, 각 환자로부터 충분한 설명에 근거한 서면동의를 수득하였으며, 임상정보는 다음과 같다.
본 실시예에서 사용된 시료는 정상인 60명, 간암 환자 60명이었다. 간암은 본래 여성에 비해 남성에서 발생 가능성이 높다는 사실을 근거로 남성의 비율이 여성의 비율 보다 높도록 간암 시료를 선정했다. 또한, 간암의 주된 원인은 환자별로 크게 바이러스성(HBV, HCV)과 알콜성으로 나눌 수 있지만, 최근에 아시아와 아프리카에서 간암 원인에 대해 조사한 결과, 가장 높은 간암 발생 원인을 차지하고 있는 HBV에 의해 간암이 발생되는 경우의 시료만을 선별했고, 해당 임상시료 정보는 아래와 표 7과 같다.
[표 7]
Figure 112013067373396-pat00010

실시예 2-2 임상시료 분석에 사용된 당화 단백질 선정
간암마커로 알려진 alpha-fetoprotein (AFP) 단백질의 경우, 당단백질로서 특정 NxS/T 모티브에 당화가 되는 펩타이드 서열은 VNFTEIQ 이다. 상기 NxS/T 모티브를 포함 하면서 당화가 발생하는 펩타이드와 NxS/T 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드가 모두 skyline 프로그램을 이용하여 예측가능한 트랜지션을 확인하였다 (하기 실시예 2-3 참조). 해당 AFP 단백질에 대한 전체 서열 ? 분석에 이용 된 서열(초록색 표시)은 도 8에 기재하였다.
나아가 상기와 동일한 시료를 사용하여 간암 특이적인 당단백질 마커 후보군을 추가로 발굴하기 위해서 Plasma Proteome Database (PPD)상에서 N-당화의 보존서열인 NxS/T 모티브를 포함하고, 이러한 모티브 상에서 N-당화가 된다고 알려져 있는 당단백질 495개를 선별하였고, 기존 NxS/T 모티브를 포함 하면서 당화가 발생하는 펩타이드와 NxS/T 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드가 모두 skyline 프로그램을 이용하여 트랜지션을 확인하였다. 이를 통해서 비당화 펩타이드에 해당되는 경우는 406개의 단백질, 1637개의 펩타이드, 9821개의 트랜지션(Q1/Q3) 으로 선정되었으며, 당화 펩타이드에 해당되는 경우는 240개의 단백질, 363개의 펩타이드, 4111개의 트랜지션(Q1/Q3) 로 선정되었다.
실시예 2-3 AFP 단백질을 포함한 간암 유래 당단백질의 이론적 트랜지션 ( Q1 / Q2 ) 선정
실시예 1의 표준 당단백질과 마찬가지로, AFP 단백질의 본래 서열 정보(native form)와 NxS/T 모티브에서 N을 D로 바꾼 변경된 서열 정보(conversion form)을 각각 skyline program 에 도입해서 이론적인 트랜지션 (in silico prediction) 값을 선정했다. 트랜지션 (Q1/Q3) 선정결과, 본래 서열과 변경서열 간에는 Q1 값이 0.49 Da, Q3 값이 0.98 Da 차이나는 것을 확인하였고, 결과는 아래 표 8과 같고, 실시예 2-2의 다른 간암 유래 당단백질 또한 동일한 방식으로 선정되었다.
[표 8]
Figure 112013067373396-pat00011

실시예 2-4 집합 ( pooled ) 임상시료 준비 및 MRM 분석
정상 대조군 60명 중 20명씩의 집합 시료, HCC 환자 60명 중 20명씩의 집합 시료로 각각 3 그룹을 형성한 후, 혈청 내에 존재하는 주 단백질 6 종류 (알부민(albumin), 이뮤노글로블린 G (lgG), 이뮤노글로블린 A(lgA), 트랜스페린 (transferrin), 합토글로빈(haptoglobin), 알파-1-안티트립신 (alpha-1-antitrypsin) 를 MARS (multiple affinity removal system, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Part #5185?5984)를 제조자의 방법대로 사용하여 제거하였다.
이어 혈청 단백질을 농축 후(Amicon, 3K), BCA (bicinchoninic acid (BCA) assay, Sigma-Aldrich)분석 키트를 제조자의 방법대로 사용하여 정량한 후 100ug 의 양만을 취한 다음, 실시예 1의 표준 당단백질과 동일하게 물(대조군) 처리후 트립신 처리하거나 또는 PNGase-F 를 처리해서 탈당화 후 트립신으로 처리하여 분석을 진행하였다.
데이터의 질적 확인 및 분석 장비의 안정성 확인을 위해 내부 표준 펩타이드로 알지닌의 C와 N에 중표지된 펩타이드를 사용하였다. 사용된 펩타이드 서열은 LNVENPK로 사람 혈청에는 존재하지 않는 대장균 유래로, 각 분석 당 5 fmol의 농도로 사용되었다.
그룹당 총 3회 반복 분석을 했고, 이를 통해서 얻어진 자료는 skyline software 에 도입 된 다음, 각 펩타이드 트랜지션의 면적으로 환산되었다. 각 MRM 분석에 대한 AFP 표적 펩타이드에 대한 피크 면적 값은 내부 표준 펩타이드의 피크 값으로 표준화(normalization) 되어서 분석 되었다.
실시예 2-5 집합 임상시료에 대한 MRM 분석 결과
2-5-1 AFP 펩타이드 ( GYQELLEK / VDFTEIQ ) 및 간암 유래 당단백질 마커 후보군 발굴을 위한 분석 결과
물(대조군)만 처리한 당화 시료와 PNGase-F를 처리해서 만든 탈당화 시료를 대상으로 당화 펩타이드인 VNFTEIQ (VDFTEIQ)에 대해 분석을 진행한 결과는 도 9a 내지 9d에 기재되어 있다. 집합 정상 대조군 시료를 대상으로, 당화 시료는 본래의 서열 정보 (VNFTEIQ)로, 탈당화 시료는 변경된 서열 정보 (VDFTEIQ) 로 분석한 결과, 모두 검출 되지 않았다.
반면, HCC 그룹의 경우, 당화 시료는 본래의 서열 정보 (VNFTEIQ)로, 탈당화 시료는 변경된 서열 정보(VDFTEIQ)로 분석한 결과, 탈당화 시료를 변경된 서열 정보로 분석한 경우에서만 검출이 되었다. 즉, 대조군 시료에 비해 HCC 시료에서는 AFP 단백질의 발현량이 증가되어 질량분석기로 검출 될 수 있는 범위 안으로 들어오게 되지만, 당화 시료의 경우 당화에 의해서 질량 값이 변화되기 때문에 검출되지 않고, 탈당화 시료의 경우에서만 검출되었다.
물 (대조군)을 처리한 당화 시료와 PNGase-F를 처리해서 만든 탈당화 시료를 대상으로 비당화 펩타이드인 GYQELLEK 에 대해 분석을 진행한 결과는 도 10a 내지 10d에 기재되어 있다. 집합 정상 대조군 시료를 대상으로, 당화 시료와 탈당화 시료를 분석한 결과, 모두 검출되지 않았다. 집합 HCC 시료를 대상으로, 당화 시료와 탈당화 시료를 분석한 결과, 모두 검출 되었다. 즉, 대조군 시료에 비해 HCC 시료에서는 AFP 단백질의 발현량이 증가되어 질량분석기로 검출 될 수 있는 범위 안으로 들어오게 되어서 검출된 것으로 판단된다.
종합하면, 집합 정상 대조군 60명과 HCC 60명의 혈청 시료에 PNGase-F / 트립신을 처리해서 수득한 탈당화 시료를 대상으로 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQK) 와 비당화 펩타이드 (GYQELLEK)를 함께 분석한 결과, 하기 표 9 및 10과 도 11에 나타난 바와 같이 VDFTEIQK 펩타이드로 분석하는 경우, HCC 그룹과 정상 대조군 간에 27.3-배의 차이가 나지만, GYQELLEK 펩타이드로 분석하는 경우에는 5.3-배의 차이만을 나타냈다. 이는 본원의 방법을 이용한 당화 분석이 단백질 발현량 분석과 비교하여 양적인 차이가 월등히 높은 것을 나타낸다.
[표 9]
Figure 112013067373396-pat00012
[표 10]
Figure 112013067373396-pat00013
AFP 이외에 당단백질 마커 후보군 추가 발굴을 위해 분석한 결과, 비당화 펩타이드는 354개의 단백질, 1000개의 펩타이드가 검출되었고, 탈당화 펩타이드는 145개의 단백질, 182개의 펩타이드가 검출되었다. 이의 검출에 사용된 탈당화 펩타이드 및 당화 펩타이드는 하기 표 16에 기재된 바와 같다.
실시예 3 개별시료에 대한 MRM 분석
실시예 3-1 개별 임상시료 준비 및 MRM 분석
정상 대조군 60명, HCC 그룹 60명에 대한 개별 시료를 준비하는 조건 및 MRM 분석 조건은 실시예 2와 동일하게 수행되었다.
분석된 데이터의 표준화 과정(normalization)을 위해서 탈당화 펩타이드의 중표지 합성 펩타이드는 7.3 fmol 로 비당화 펩타이드의 중표지 합성 펩타이드는 10.3 fmol 양으로 모든 개별 시료에 넣어서 분석을 진행하였다.
모든 개별 시료는 1회 분석을 수행하였으며, 그 결과는 skyline 프로그램에 도입 된 다음, 펩타이드 트랜지션의 면적 값으로 환산되었다. AFP 표적 펩타이드에 대한 피크 면적 값은 각각의 중표지 합성 펩타이드의 피크 면적 값으로 표준화 되어서 분석 되었다.
AFP에 추가하여 간암 유래 당단백질 마커 후보군 추가 발굴 위한 대상은 집합 임상시료 상으로 Signal to noise(S/N) 값이 3배 이상, 동일한 머무름 시간에서 3개 이상의 product ion 이 유입되는 것으로 검출이 확인된 단백질 및 펩타이드 만을 가지고 분석을 진행하였다.
실시예 3-2 AFP 표적 펩타이드 및 충돌 에너지 최적화
본 실시예는 표적 펩타이드의 검출되는 정도를 향상시키기 위해 충돌 에너지 최적화 실험을 진행한 것이다.
표적 펩타이드의 트랜지션 (Q1/Q3) 선정 결과, 내인성 펩타이드와 중표지 합성 펩타이드 간에는 Q1 값이 4.00 Da (5.00 Da), Q3 값은 8.01 Da (10.01 Da) 차이나는 것을 확인했다.
AFP의 중표지 합성 펩타이드의 최적화된(optimized) 충돌 에너지 (collision energy (CE))값을 선정하기 위해서 default CE 값에서 앞뒤로 2 unit 으로 총 11 points 의 CE 값으로 각각 3회식 반복 분석을 해서 피크 면적 값이 가장 높게 측정되는 CE 값을 확인했으며, 결과는 도 12 및 표 11에 기재되어 있다. 표 11은 AFP 표적 펩타이드(endo/heavy)에 대한 mass 값 (m/z) 값 및 최적화된 CE 값을 나타낸다.
[표 11]
Figure 112013067373396-pat00014

실시예 3-3 내인성 AFP 표적 펩타이드 확인
AFP 표적 펩타이드 (De-glycopeptide, Non-glycopeptide)와 동일한 서열을 갖지만, 펩타이드의 C-말단에 존재하는 알지닌 (Arg, R)과 라이신(Lys, K)의 탄소(12C), 질소(14N)가 13C, 15N으로 표지된 중표지 합성 펩타이드를 이용해서, 해당 펩타이드가 실제 혈청 내에 존재하는 내인성 펩타이드가 맞는지 검증하였다.
즉, 중표지 합성 펩타이드와 내인성 펩타이드는 서열이 같기 때문에, 소수성이 서로 동일해서, LC- column(C18) 상에서 동일한 머무름시간에 용출되는 원리를 이용한 것이다.
PNGase-F/트립신을 처리하여 수득한 탈당화 시료를 대상으로 탈당화 펩타이드인 VDFTEIQK와 비당화 펩타이드인 GYQELLEK를 중표지 합성 펩타이드와 함께 분석한 결과, 혈청 시료로부터 유래한 내인성 펩타이드와 중표지 합성 펩타이드가 동일한 시간에 함께 용출되었으며 프러덕트 이온 타입의 강도 또한 동일한 것으로 나타났으며, 결과는 도 13a 및 13b에 기재되어 있다.
실시예 3-4 중표지 합성 펩타이드의 반응곡선
AFP 표적 펩타이드에 대한 중표지 합성 펩타이드의 정량성을 확인하기 위해서, 반응곡선의 선형성을 확인하는 실험을 다음과 같이 진행하였다. 탈당화 펩타이드(VDFTEIQK) 의 중표지 합성 펩타이드는 0, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100 fmol 농도로 연속희석하였고 비당화 펩타이드 (GYQELLEK)의 중표지 합성 펩타이드는 0, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200 fmol 농도로 연속희석하였으며, 여기에 매트릭스로 집합 혈청 시료 5ug 을 모두 일정하게 넣어서 분석을 진행하였다.
모든 분석은 각 농도마다 3회 반복 분석을 진행하였으며, 분석 결과 2개의 중표지 합성 펩타이드 모두 선형성 (R^2=0.995, 0.992)이 확인되었으며, 결과는 도 14 및 표 12에 기재되어 있다.
[표 12]
Figure 112013067373396-pat00015
실시예 4 임상결과와 MRM 데이터 간의 연관성 확인
실시예 4-1 검출 여부에 따른 분류-1 (정상 대조군)
실시예 3에 기술된 바와 같이 정상 대조군 60명을 대상으로 MRM 분석을 수행한 결과, 표 13-1 내지 13-3에 나타난 바와 같이 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQK)는 60명 중 2명 (3.3%) 이 검출되었고, 비당화 펩타이드 (GYQELLEK)는 60명 중 7명 (11.7%) 이 검출 되었다. 이를 근거로 간암환자가 아닌 정상인을 정상인으로 구분할 수 있는 능력인 특이성(specificity)은 탈당화 펩타이드의 경우 96.7%, 비당화 펩타이드의 경우 88.3% 로 확인되었다.
[표 13-1]
Figure 112013067373396-pat00016
[표 13-2]
Figure 112013067373396-pat00017
[표 13-3]
Figure 112013067373396-pat00018

실시예 4-2 검출 여부에 따른 분류-2 ( HCC 그룹)
실시예 3에 기술된 바와 같이 HCC 60명을 대상으로 MRM 분석한 결과, 표 14-1 내지 14-3에 나타난 바와 같이 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQK)는 60명 중 39명 (65.0%)이 검출되었고, 비당화 펩타이드 (GYQELLEK) 는 60명 중 32명 (53.3%)이 검출되었다. 이를 근거로 간암환자를 간암환자로 구분할 수 있는 능력인 민감도(sensitivity)는 탈당화 펩타이드의 경우 65.0%, 비당화 펩타이드의 경우 53.3%인 것으로 나타났다.
[표 14-1]
Figure 112013067373396-pat00019
[표 14-2]
Figure 112013067373396-pat00020
[표 14-3]
Figure 112013067373396-pat00021

실시예 4-3 임상결과와 MRM 결과의 연관성
HCC 60명을 대상으로 병원 임상에서 사용되는 AFP 진단 키트 (Bioland; NanoSign AFP, 나노엔텍; AFP 정량키트) 를 제조자의 방법대로 사용해서 AFP 단백질 농도를 측정하였다 (임상결과). 이를 실시예 3에서 수득한 AFP 펩타이드를 MRM 기술로 측정한 결과(MRM data)와 서로 연관성이 있는지 여부를 확인한 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 AFP 단백질의 탈당화 펩타이드(VDFTEIQK)의 경우에는 R^2 값이 0.8368, 비당화 펩타이드(GYQELLEK)의 경우에는 R^2 값이 0.8868 로 확인되었고, 이는 AFP 단백질에 대한 임상결과와 MRM data 는 서로 양적인 상관관계가 있음을 나타내는 것이다.
나아가 진단 방법의 효율성을 판단하기 위해서 정상 대조군 60명, HCC 60명을 대상으로 ROC (Receiver-Operating Characteristic) 곡선을 작성하여 AUC (Area Under Curve) 값을 확인한 결과, 비당화 펩타이드(GYQELLEK)의 경우 AUC 값이 0.734 로 확인 되었지만, 탈당화 펩타이드(VDFTEIQK)의 경우에는 0.811인 것으로 나타났다.
이는 AFP 단백질로부터 기인된 2개의 비당화 및 탈당화 펩타이드 조합으로 logistic regression 모형을 이용하여 하나의 패널로 결합하는 분석을 수행한 결과, 정상인 60명 중 58명을 정상인으로 분류할 수 있지만, 2명을 간암 환자로 분류하였고, 간암 환자 60명 중 41명을 간암 환자로 분류할 수 있지만, 19명을 정상인으로 분류하여 정확도는 82.50 % 로 확인 되었다. 즉 하기 표 15에 나타난 바와 같이 비당화 펩타이드, 탈당화 펩타이드 그리고 상기 두 종류 펩타이드 패널로 AUC 값을 비교한 결과, 2-펩타이드 패널이 각각의 단일 펩타이드에 비해 정상인과 간암 환자를 구분하는 변별력(AUC=0.852) 이 크다는 것을 최종 확인하였다.
이는 PNGase-F/트립신이 처리된 환자의 혈액시료를 대상으로 AFP 단백질의 비당화 펩타이드 (GYQELLEK) 와 탈당화 펩타이드(VDFTEIQK)를 동시에 모니터링 함으로써 높은 정확도로 정상인과 간암 환자를 구분할 수 있음을 나타내는 것이다.
[표 15]
Figure 112013067373396-pat00022

실시예 5 AFP 이외에 당단백질 마커 추가 발굴을 위해 MRM 분석 결과
실시예 2-5 에서 선별된 비당화 펩타이드에 해당되는 354개의 단백질, 1000개의 펩타이드와 탈당화 펩타이드에 해당되는 145개의 단백질, 182개의 펩타이드를 개별시료에 적용해서 군 간 차이를 보이는 단백질을 최종 표적 단백질 마커로 선정하였다.
분석 순서는 정상인 시료 1번, 간암 시료 1번, 정상인 시료 2번, 간암 시료 2번 순서로 각각 1번씩 교차로 분석을 진행했으며, 이를 통해서 얻어진 자료는 상술한 바와 같은 Skyline software 에 도입한 다음, MedCalc (version 12.2) 통계 프로그램을 통해서 분석했다. 이를 통해서 군 간 (정상인, 간암 환자)차이를 보이는 단백질 35개가 선정되었다: Alpha-2-antiplasmin (SERPINF2), Alpha-2-macroglobulin (A2M), Apolipoprotein B-100 (APOB), Beta-galactosidase (GLB1), Bone morphogenetic protein 1 (BMP1), Corticosteroid-binding globulin (SERPINA6), Complement factor H (CFH), Cholinesterase (BCHE), Clusterin (CLU), Collagen alpha-1(XII) chain (COL12A1), Carboxypeptidase N subunit 2 (CPN2), Versican core protein (VCAN), Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 (ERBB3), Coagulation factor V (F5), Coagulation factor XI (F11), Follistatin-related protein 1 (FSTL1), N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS), G-protein coupled receptor 126 (GPR126), Heparin cofactor 2 (SERPIND1), Hypoxia up-regulated protein 1 (HYOU1), Integrin alpha-2 (ITGA2), Integrin alpha-3 (ITGA3), Integrin alpha-6 (ITGA6), Integrin alpha-M (ITGAM), Integrin beta-2 (ITGB2), Plasma kallikrein (KLKB1), Kinectin (KTN1), Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 (LAMP2), Galectin-3-binding protein (LGALS3BP), Plexin-A1 (PLXNA1), Periostin (POSTN), Inactive tyrosine-protein kinase 7 (PTK7), Roundabout homolog 4 (ROBO4), Tenascin (TNC), Vitronectin (VTN)
최종 표적 단백질 35개에 대해서 ROC 커브를 확인했다. ROC 커브는 민감도와 특이도가 서로 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면상에 표현한 것인데, ROC 커브 아래의 면적에 해당하는 AUC (area under curve) 값이 클수록 좋은 진단 방법이다. 해당 표적 단백질 35개에 대한 AUC 값은 하기 표 16-1 및 16-2과 같고, ROC 커브 및 상호작용 플랏 그림은 모두 MedCalc (version 12.2) 통계 프로그램으로 작성하였다.
[표 16-1]
Figure 112013067373396-pat00023
[표 16-2]
Figure 112013067373396-pat00024
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (16)

  1. 암 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    피검체 유래의, N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 갖는 단백질을 포함하는 시료를 제공하는 단계;
    상기 시료에 포함된 단백질을 탈당화시키는 단계:
    상기 탈당화 단계를 거친 단백질을 단편화하는 단계;
    상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및
    상기 시료에서 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군 유래의 수치와 비교하여, 그 비가 변동한 경우 이를 상기 피검체의 암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 암 마커를 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서 상기 N-연결 당화 모티브는 AsnXxxSer, AsnXxxThr 또는 AsnXxxCys인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화는 Asn 잔기에서 발생되며, 그 결과가 생성된 펩타이드 단편은 AspXxxSer, AspXxxThr 또는 AspXxxCys인, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 탈당화는 PNGase-F 처리에 의해 수행되는 것인, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단편화는 트립신, 라이신-C 또는 알지닌-C 또는 아스파르트산 N 에 의해 수행되는 것인, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 암은 혈액암, 간암, 위암, 대장암, 폐암, 자궁암, 유방암, 전립선암, 갑상선암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 시료는 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 뇌척수액, 난포액, 모유 및 췌장액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 정량은 질량분석법 (Mass spectrometry)을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 질량분석법은 액체크로마토그래피 질량분석법 (Liquid chromatography spectrometry, LC-MS ) 인, 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피 질량분석법의 데이터는 SIM (Selected Ion Monitoring) 또는 MRM (Multiple reaction monitoring)을 이용하여 수득되는 것인, 방법.
  11. 제 2 항에 있어서, 상기 NxS/T 모티브를 포함하는 단백질은 AFP (alpha feto protein)이고, 상기 탈당화 펩타이드는 VDFTEIQ이고, 상기 비당화 펩타이드는 GYQELLEK인, 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 탈당화 펩타이드 및 상기 비당화 펩타이드의 정량은 Multiple Reaction Monitoring (MRM)를 이용한 액체크로마토그래피 질량분석법으로 수행되는 것인, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 MRM을 이용한 정량은 하기 표와 같은 m/z 값 및 최적화 충돌 에너지 값을 모니터링하여 수행되는 것인, 방법.
    Figure 112013067373396-pat00025
  14. 제 1 항 내지 제 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암은 간암이고,
    상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편은 AFP, SERPINF2, A2M, APOB, GLB1, BMP1, SERPINA6, CFH, BCHE, CLU, COL12A1, CPN2, VCAN, ERBB3, F5, F11, AFP, FSTL1, GNS, GPR126, SERPIND1, HYOU1, ITGA2, ITGA3, ITGA6, ITGAM, ITGB2, KLKB1, KTN1, LAMP2, LGALS3BP, PLXNA1, POSTN, PTK7, ROBO4, TNC, 또는 VTN 단백질 중 하나 이상의 유래이고,
    상기 각 단백질의 탈당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드는 표 1에 기재된 것인, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용되는 키트로서, 상기 키트는 NxST 모티브를 포함하는 단백질을 탈당화시키는 효소, 상기 단백질을 단편화하는 효소 및 상기 탈당화 펩타이드 단편 및 비당화 펩타이드 단편의 정량에 사용되는 시약을 포함하는, 암 진단 또는 예후 판단용키트.
  16. 피검체 유래의 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 갖는 단백질을 포함하는 암시료를 제공하는 단계; 상기 시료에 포함된 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단계를 거친 단백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및 상기 시료에서 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군에서 결정된 수치와 비교하여, 상기 피검체 유래 시료에서 그 비가 변동한 경우 이를 상기 피검체의 암의 진단 또는 예후와 연관시키는 단계를 포함하는, 인비트로에서의 암시료 평가 방법.
KR1020130088006A 2013-07-25 2013-07-25 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법 KR101520614B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130088006A KR101520614B1 (ko) 2013-07-25 2013-07-25 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법
US14/906,799 US9938561B2 (en) 2013-07-25 2014-07-17 Method for diagnosing cancer through detection of deglycosylation of glycoprotein
PCT/KR2014/006479 WO2015012533A1 (ko) 2013-07-25 2014-07-17 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130088006A KR101520614B1 (ko) 2013-07-25 2013-07-25 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150013996A KR20150013996A (ko) 2015-02-06
KR101520614B1 true KR101520614B1 (ko) 2015-05-19

Family

ID=52393516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130088006A KR101520614B1 (ko) 2013-07-25 2013-07-25 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9938561B2 (ko)
KR (1) KR101520614B1 (ko)
WO (1) WO2015012533A1 (ko)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101966139B1 (ko) * 2017-04-20 2019-04-08 한국기초과학지원연구원 α-태아단백질 유래 당펩티드의 질량분석을 이용한 간암의 진단방법
KR102091636B1 (ko) * 2018-08-24 2020-03-20 충남대학교산학협력단 N-당사슬 이성질체의 상대정량을 이용한 질병 스크리닝 방법
CN110993092B (zh) * 2019-10-15 2024-06-18 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院 Ngfp诊断指标的获取方法和高危hcc预测模型的构建方法
BR112022009803A2 (pt) * 2019-11-20 2022-08-16 Corbion Biotech Inc Variantes de sacarose invertase
KR102100158B1 (ko) * 2020-03-06 2020-04-14 충남대학교산학협력단 N-당사슬 크로마토그램 피크의 상대정량에 의한 질병 스크리닝 방법
CN113791222B (zh) * 2021-09-17 2024-04-19 南华大学 一种d-核糖快速诱导的人肌红蛋白非酶糖基化位点的鉴定方法
US20230104536A1 (en) * 2021-09-30 2023-04-06 Venn Biosciences Corporation Systems and methods for glycopeptide concentration determination, normalized abundance determination, and lc/ms run sample preparation
WO2024015942A1 (en) * 2022-07-13 2024-01-18 Anagram Therapeutics, Inc. Methods and compositions for treating congenital sucrase-isomaltase deficiency

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070048300A1 (en) * 2003-08-22 2007-03-01 Biogen Idec Ma Inc. Antibodies having altered effector function and methods for making the same
KR20100120788A (ko) * 2009-05-07 2010-11-17 한국기초과학지원연구원 당단백질의 당쇄화를 이용한 암 진단 방법
KR20120125157A (ko) * 2011-05-06 2012-11-14 한국기초과학지원연구원 렉틴을 이용한 암 진단 방법
US20130101549A1 (en) * 2010-04-26 2013-04-25 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070269895A1 (en) * 2002-06-03 2007-11-22 The Institute For Systems Biology Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
US7622273B2 (en) * 2005-05-11 2009-11-24 Gibbs Bernard F Method for chemical and enzymatic treatment of posttranslationally modified proteins bound to a protein chip
CN106604930B (zh) * 2014-05-30 2021-10-29 新英格兰生物实验室公司 去糖基化试剂和方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070048300A1 (en) * 2003-08-22 2007-03-01 Biogen Idec Ma Inc. Antibodies having altered effector function and methods for making the same
KR20100120788A (ko) * 2009-05-07 2010-11-17 한국기초과학지원연구원 당단백질의 당쇄화를 이용한 암 진단 방법
US20130101549A1 (en) * 2010-04-26 2013-04-25 Biogen Idec Ma Inc. Light targeting molecules and uses thereof
KR20120125157A (ko) * 2011-05-06 2012-11-14 한국기초과학지원연구원 렉틴을 이용한 암 진단 방법

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015012533A1 (ko) 2015-01-29
KR20150013996A (ko) 2015-02-06
US9938561B2 (en) 2018-04-10
US20160168618A1 (en) 2016-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101520614B1 (ko) 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 진단 방법
US9796761B2 (en) Glycan markers as measure of disease state of hepatic diseases
KR101077275B1 (ko) 당단백질의 당쇄화를 이용한 암 진단 방법
JP5358952B2 (ja) 膵臓癌マーカーおよび膵臓癌の検査方法
Zhang et al. N-linked glycan changes of serum haptoglobin β chain in liver disease patients
KR20180123978A (ko) 간암 고위험군의 간암 발병 모니터링 또는 진단용 바이오마커 및 그 용도
KR101219519B1 (ko) 렉틴을 이용한 암 진단 방법
KR101484969B1 (ko) Ｎ-당쇄화된 당펩타이드를 이용한 암 진단방법
US8568993B2 (en) Detection of glycopeptides and glycoproteins for medical diagnostics
WO2006034427A2 (en) Diagnosis of fetal aneuploidy
AU2003249692A1 (en) Methods for quantitative proteome analysis of glycoproteins
KR101559101B1 (ko) 혈액유래 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법
Ma et al. A precise approach in large scale core-fucosylated glycoprotein identification with low-and high-normalized collision energy
Zhang et al. Quantification of N-glycosylation site occupancy status based on labeling/label-free strategies with LC-MS/MS
KR20150062915A (ko) 혈액 당단백질을 이용하는 암 마커 및 이를 이용하는 암 진단방법
KR101527283B1 (ko) 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 마커 스크리닝 방법 및 간세포암 마커
KR101207797B1 (ko) 다중렉틴을 이용한 체액 유래 단백질 동정 방법 및 이 방법에 의하여 탐지된 간암 바이오마커
CA3042585A1 (en) Mass spectrometry-based methods for the detection of circulating histones h3 and h2b in plasma from sepsis or septic shock (ss) patients
KR101219516B1 (ko) 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법
KR101143891B1 (ko) 단백질의 비정상적인 당쇄화를 이용하는 암진단 마커
KR101100809B1 (ko) 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법
CN114729937A (zh) 辅助诊断大肠癌的方法、试剂盒及生物标志物
KR101712368B1 (ko) 당단백질의 전분자량 측정을 통한 당사슬 모니터링에 의한 고민감도 암 진단마커 분석방법
Lang An LC-MS/MS-based approach for analysis of site-specific core-fucosylation of low-concentrated glycoproteins in human serum using the biomarker prostate-specific antigen (PSA) as example
Sun et al. Quantitative Methods for N-Glycosite Containing Peptides in N-Glycoproteomics

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180425

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190429

Year of fee payment: 5