KR101527283B1

KR101527283B1 - 당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 마커 스크리닝 방법 및 간세포암 마커

Info

Publication number: KR101527283B1
Application number: KR1020130095978A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 윤정환; 김현수; 김경곤; 진종화
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-08-13
Filing date: 2013-08-13
Publication date: 2015-06-10
Also published as: WO2015023068A1; EP3035058B1; KR20150020392A; EP3035058A4; EP3035058A1

Abstract

본원은 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질에서 탈당화 펩타이드 단편 및 비당화 펩타이드 단편의 비율을 이용한 암 진단 마커의 스크리닝 방법, 이에 의해 선별된 마커, 및 상기 마커를 이용한 암 진단 또는 예후 분석용 조성물 및 키트를 개시한다. 본원의 방법은 기존 마커보다 정확도 및 특이도가 보다 높은 암관련 마커의 발굴이 가능하다. 또한 이를 통해서 발굴된 바이오마커는 높은 정확도와 민감도로 암의 조기진단, 모니터링 및 질병 정도를 혈액을 이용한 비침습성 검사로 간단하고 유효성 있는 암의 진단 또는 모니터링이 가능하여, 암 조기 발견은 물론 암의 치료 여부 및 치료 경과 확인에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

당단백질의 탈당화 검출을 통한 암 마커 스크리닝 방법 및 간세포암 마커 {Method for screening cancer marker based on de-glycosylation of glycoproteins and marker for HCC}

본원은 탈당화 검출을 이용한 암 마커 스크리닝 방법 및 암 특이적 마커와 관련된 것이다.

암을 포함하여 조기 발견이 질환의 성공적 치료에 중요하거나 고전적 방법으로 진단이 어려운 질병의 경우, 생체 표지자인 바이오마커가 많이 활용되고 있다. 바이오마커로서 핵산 또는 단백질이 주로 사용되고 있으며, 대부분 특정 단백질의 발현 여부, 또는 그 양적 변화에 근거하여 활용되고 있는데, 최근 들어 번역후 단백질 변형단계에서의 변화가 활용되고 있는 추세이며, 그 중 하나가 단백질의 당화 검출이다.

단백질 당화 변화 또는 차이를 구별하기 위한 방법이 개발되고 있다. 예를 들면 당단백질의 당을 가수분해 시켜 얻어진 당(glycan)만을 수집한 후 이를 질량분석기로 분석하여 당 프로파일링을 보는 방법이 있다(Cooke C.L. et al., Anal. Chem., 2007,79:8090-8097). 그러나, 이러한 방법은 프로파일링의 차이를 근거로 대략적으로 정상인과 환자군을 구별할 수 있는 방법이기는 하지만, 정확한 진단을 위해 요구되는 당단백질 자체에 대한 정보, 당화 위치에 대한 정보, 및 당화 이형체에 대한 정보 등은 얻을 수 없는 한계가 있다.

한국공개특허공보 제2012-0125157호는 암의 진행과 관련된 당단백질의 비정상적인 당화(aberrant glycosylation)에 대한 정보를 이용하여 암을 진단하는 방법에 관한 것으로, 암 발생 및 진행에 따른 비정상적으로 당화된 당단백질을 렉틴(lectin)을 이용하여 분리하는 단계 및 렉틴에 의하여 분리된 당단백질의 가수분해로부터 생성된 마커 펩티드를 선별하고 정량하는 단계를 이용한 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암의 진단 방법을 개시하고 있다.

한국공개특허공보 제2010-0120788호는 당단백질의 당화를 이용한 암 진단 방법에 관한 것으로, 암 발생에 관여하는 당단백질의 당화 변화에 따른 영향으로 특정 펩타이드의 가수분해 양상이 특이적으로 변화하는 것을 이용한 암의 진단 방법을 개시하고 있다.

하지만 정상인과 비교하여 암환자 및 암경력자에게서 발생하는 특이적 당화는 정상적 당화와 마찬가지로 아스파라진(asparagine), 트레오닌(threonine) 또는 세린(serine) 등의 잔기에서 일어날 수 있다. 따라서 암과 관련될 수 있는 특이적 구조를 갖는 당화는 정상적인 구조의 당화들과 함께 상기 어느 하나의 당화 자리에 발생할 수 있어, 미세이질성(glycan microheterogeneity)이 발생된다. 이로 인해 암과 관련된 특이적 당화는 어느 하나의 당화 자리에 존재하는 많은 당화 아형(glycan-isoform)들 중의 일부로서 단백질의 총 양에 대하여 적은 양으로 존재하게 되며, 특이적 당화의 정량적 변화를 신뢰성 있게 측정하기 위해서 보다 민감한 방법의 개발이 필요하다.

본원은 단백질 당화 비율의 검출을 통한 암 관련 바이오마커 스크리닝 방법 및 간세포암 마커 및 그 용도를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 N-연결당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단계가 수행된 ?백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및상기 결정된 양을 근거로 상기 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군의 수치와 비교하여, 그 비가 변동한 단백질을 암 마커로 선별하는 단계를 포함하는, 암 검출 또는 진단용 마커의 스크리닝 방법을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 Alpha-2-antiplasmin (SERPINF2), Alpha-2-macroglobulin (A2M), Apolipoprotein B-100 (APOB), Beta-galactosidase (GLB1), Bone morphogenetic protein 1 (BMP1), Corticosteroid-binding globulin (SERPINA6), Complement factor H (CFH), Cholinesterase (BCHE), Clusterin (CLU), Collagen alpha-1(XII) chain (COL12A1), Carboxypeptidase N subunit 2 (CPN2), Versican core protein (VCAN), Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 (ERBB3), Coagulation factor V (F5), Coagulation factor XI (F11), Follistatin-related protein 1 (FSTL1), N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS), G-protein coupled receptor 126 (GPR126), Heparin cofactor 2 (SERPIND1), Hypoxia up-regulated protein 1 (HYOU1), Integrin alpha-2 (ITGA2), Integrin alpha-3 (ITGA3), Integrin alpha-6 (ITGA6), Integrin alpha-M (ITGAM), Integrin beta-2 (ITGB2), Plasma kallikrein (KLKB1), Kinectin (KTN1), Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 (LAMP2), Galectin-3-binding protein (LGALS3BP), Plexin-A1 (PLXNA1), Periostin (POSTN), Inactive tyrosine-protein kinase 7 (PTK7), Roundabout homolog 4 (ROBO4), Tenascin (TNC) 및 Vitronectin (VTN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 검출용 시약을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 또한 상술한 마커로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 핵산 또는 단백질의 수준 또는 존재여부, 또는 상기 각 마커의 당화수준 중 하나 이상을 결정하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 수준 또는 존재 또는 상기 당화수준의 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 검출결과에 변동이 있는 경우, 이를 간세포암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간세포암 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 방법 및 조성물에서 상기 각 마커의 검출은 간세포암 판별의 정확성을 높이기 위해 표 1 또는 표 17-1 내지 17-3에 개시된 탈당화펩타이드의 양, 비당화펩타이드 양 또는 상기 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양의 비 중 하나 이상의 검출을 통해 수행될 수 있다.

단백질 비당화, 당화 비율의 검출을 통한 본원의 암 마커 스크리닝 방법은 기존 마커보다 정확도 및 특이도가 보다 높은 암관련 마커의 발굴이 가능하다. 또한 이를 통해서 발굴된 바이오마커는 높은 정확도와 민감도로 암의 조기진단, 모니터링 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 나아가 본원에 따른 바이오마커는 혈액을 이용한 비침습성 검사로 간단하고 유효성 있는 암의 진단 또는 모니터링이 가능하여, 암 조기 발견은 물론 암의 치료 여부 및 치료 경과 확인에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본원의 일 구현예에 따른 LC-Mass 분석법을 이용한 당화 단편의 분석 원리를 도식적으로 나타낸 것이다. 당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드 부분은 초록색으로 표시하였으며, 당화 아미노산은 적색으로 표시하였다.
도 2는 본원의 일 구현예에서 표준 당화 단백질로 사용된 Invertase-1의 단백질 서열이다.
도 3a 내지 3c는 표준 당화 단백질의 당펩타이드 1 (NPVLAANSTQFR)의 MRM 분석결과로, 3a는 3b 및 3c의 농도에 따른 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 4a 내지 4c는 표준 당화 단백질의 당펩타이드 2 (FATNTTLTK)의 MRM 분석결과로, 4a는 4b 및 4c의 농도에 따른 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5a 내지 5c는 표준 비당화 단백질의 당펩타이드 1 (IEIYSSDDLK)의 MRM 분석결과로, 5a는 5b 및 5c의 농도에 따른 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6a 내지 6c는 표준 비당화 단백질의 당펩타이드 1 (VVDFGK)의 MRM 분석결과로, 6a는 6b 및 6c의 농도에 따른 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 도 3 내지 도 6의 각 표적 펩타이드의 내인성 펩타이드에 대한 MRM 분석 결과에서 수득한 피크 면적을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 인간유래 알파페토단백질 (Alpha fetoprotein, AFP)의 아미노산 서열을 나타내며, 당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드 부분은 초록색으로 표시하였으며, 당화 아미노산은 적색으로 표시하였다.
도 9a 및 9b는 각각 정상 대조군의 집합 시료를 사용한 AFP의 당화 펩타이드 (VNFTEIQ) 및 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQ)에 대한 MRM 분석 결과이다.
도 9c 및 9d는 각각 간암 환자군의 집합 시료를 사용한 AFP의 당화 펩타이드 (VNFTEIQ) 및 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQ)에 대한 MRM 분석 결과이다.
도 10a 및 10b는 각각 정상 대조군의 집합 시료를 사용한 AFP의 비당화 펩타이드 (GYQELLEK) 및 탈당화 펩타이드 (GYQELLEK)에 대한 MRM 분석 결과이다.
도 10c 및 10d는 각각 간암 환자군의 집합 시료를 사용한 AFP의 비당화 펩타이드 (GYQELLEK) 및 탈당화 펩타이드 (GYQELLEK)에 대한 MRM 분석 결과이다.
도 11은 AFP 표적 펩타이드에 대한 간암 환자와 정상인 간의 MRM 분석으로 수득한 피크 면적의 차이를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12는 MRM을 이용한 AFP 표적 펩타이드에 대한 CE 최적화 실험결과를 나타낸다.
도 13a은 내인성 AFP 탈당화 표적 펩타이드(VDFTEIQK)를 MRM으로 분석한 결과이다.
도 13b는 내인성 AFP 비당화 표적 펩타이드(GYQELLEK)를 MRM으로 분석한 결과이다.
도 14는 AFP 표적 펩타이드에 대한 중표지(heavy labelled)된 합성 펩타이드의 정량성을 확인하기 위해, 반응커브의 선형성을 MRM으로 분석한 결과이다.
도 15는 임상시료를 이용하여 AFP 단백질의 당화 펩타이드의 탈당화와 비당화 펩타이드에 대한 MRM 결과를 분석한 것이다.
도 16은 AFP 표적 펩타이드 및 2-펩타이드 (탈당화 및 비당화 펩타이드) 패널의 AUC 값을 비교한 것이다.
도 17a 내지 17z 는 본원의 일 실시예에 따라 발굴된 당단백질 마커 후보군에 대해 표준화된 탈당화 펩타이드 양과 표준화된 비당화 펩타이드 그리고 이에 대한 비를 가지고 AUC 값을 서로 비교한 것이다.
도 18a 내지 18i는 본원의 일 실시예에 따라 발굴된 당단백질 마커 후보군에 대해 표준화된 탈당화 펩타이드 양과 표준화된 비당화 펩타이드 그리고 이에 대한 비를 가지고 AUC 값을 서로 비교한 것이다.
도 19a 내지 19z는 본원의 일 실시예에 따라 발굴된 당단백질 마커 후보군에 대한 정상인 그룹과 간암 환자 그룹 간에 표준화된 탈당화 펩타이드 양과 표준화된 비당화 펩타이드 양을 인터랙트브 플랏(interactive plot) 으로 서로 비교한 것이다.
도 20a 내지 20i는 본원의 일 실시예에 따라 발굴된 당단백질 마커 후보군에 대한 정상인 그룹과 간암 환자 그룹 간에 표준화된 탈당화 펩타이드 양과 표준화된 비당화 펩타이드 양을 인터랙트브 플랏으로 서로 비교한 것이다.

본원은 후번역 변형과정에서 발생하는 당화의 양적인 변화를 확인하여, 암과 같은 질환을 진단할 수 있음을 물론, 이를 이용하여 암과 관련된 마커를 규명할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

한 양태에서 본원은 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질을 탈당화시키는 단계: 상기 탈당화 단계가 수행된 ?백질을 단편화하는 단계; 상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및 상기 결정된 양을 근거로 상기 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군에서 결정된 또는 대조군의 수치와 비교하여, 그 비가 변동한 단백질을 암 마커로 선별하는 단계를 포함하는, 암 검출 또는 진단용 마커의 스크리닝 방법에 관한 것이다

본원에서 용어 암과 관련된 마커 또는 바이오마커(또는 바이오표지자) 또는 암 마커(또는 표지자) 또는 암 바이오마커란 암이 발생한 조직 또는 세포를 정상 세포 또는 적절한 암치료를 받은 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다.

본원에 따른 방법에서 대조군에서 결정된 수치는 후술하는 대조군 시료를 사용하여 본 방법과 동시에 또는 미리 결정된 값일 수 있다.

본원의 방법은 후번역 변형과정에서 발생하는 당화의 양적인 변화를 이용한 암 마커 선별에 관한 것으로, 특정 암과 관련되어 당화에 양적 변화가 있는 단백질이 마커로서 작용할 수 있다.

대부분의 단백질은 활성을 위해 번역 후 변형과정 (post translational modification (PTM))을 거친다. PTM 중 당화 (glycosylation)는 단백질 접힘, 이동 및 반감기는 물론 세포-세포 상호작용 및 항원성에도 중요한 역할을 한다. 당화는 글라이케이션화를 제외하고는 효소가 관여하는 반응으로 단백질에 당(sugar)를 추가하여 글라이칸 사슬을 형성한다.

당화는 N-linked, O-linked, C-mannosylation 및 GPI (glycophosphatidyl-inositol) 앵커 부착의 4 종류가 존재하며, 일 구현예에서 본원은 N-연결 당화에 관한 것이다.

N-연결당화는 미리 형성된 글라이켄을 아스파라진(Asn) 잔기에 부착하는 것으로 이는 번역과 동시에 발생하여 단백질 접힘에 영향을 끼친다. N-연결 당화는 특정 펩타이드 모티브에서 발생하여, 펩타이드 서열 모티브는 Asn-Xxx-Ser/Thr((N-X-S/T) 또는 Asn-Xxx-Cys (N-X-C)를 포함하며, 여기에서 Xxx는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 본원의 방법에 사용되는 단백질은 상기 모티브 전부 또는 일부가 당화되어 있는 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질로서, 질환 예를 들면 암의 발병 또는 진행 정도에 따라 단백질 자체의 발현량 및/또는 단백질의 당화정도가 증가하면 특정 형태의 당 예를 들면 푸코스가 결합된다.

당화 분석에 사용되는 시료는 피검체 또는 정상 대조군 유래의 N-연결 당화 모티브를 갖는 단백질 또는 이를 포함하는 시료이다. 피검체는 암의 발생이 의심되는 대상체, 암 발병 여부에 대한 진단이 필요한 대상체, 암 발병 후 치료 중인 대상체, 암으로 진단 후 치료된 대상체, 및 암이 발생한 대상체 등의 암의 진단을 필요로 하는 대상체를 포함하는 것이다. 대조군은 암이 발생한 적이 없거나 완치된 대상체의 시료를 포함한다. 대상체는 포유동물, 특히 인간을 포함한다.

본원에 따른 시료 또는 암시료는 단백질을 포함하는 시료는 물론 이러한 시료로부터 추출된 단백질을 모두 포함하는 것이다. 본원에서 시료는 질환, 특히 암의 발병 또는 진행 상태와 관련된 정보를 포함할 수 있는 단백질을 포함하는, 생물체로부터 얻을 수 있는 시료로서, 생체조직, 생체조직의 배양을 통해 수득한 세포주 또는 배양액, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 뇌척수액, 난포액, 모유 및 췌장액 등을 포함할 수 있다. 특히 암의 발병 및 진행등과 관련된 당단백질은 세포외 배지로 분비 또는 방출되기 때문에 특히 다양한 암 세포주의 배양 배지 및 피검체의 혈액 등은 이러한 암 정보를 포함하는 당단백질의 검출에 적합할 수 있다. 혈액의 경우는, 혈액에 존재하는 구성 성분 단백질들 사이의 농도변화가 매우 크기 때문에, 고농도 단백질 제거용 컬럼, 예를 들어, MARS(Multiple Affinity Removal System) 등을 사용하여 전처리를 수행할 수 있으나 표적 단백질의 민감도 및 재현성에 문제가 없다면 생략될 수도 있다.

특히, 당단백질의 당화는 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 단당류가 신호전달에 의해 세포막 안으로 들어가 당전이 효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 N-acetylglucosaminyltransferase)에 의해 필요한 단백질의 당화가 이루어지고 이러한 당단백질은 세포막 외에 위치하여 필요한 역할을 수행한다. 세포막 표면에 존재하는 많은 당단백질의 경우 암유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령을 받으면 비정상적 당화가 발생한다. 다양한 암의 발생에 암유전자의 비정상적인 신호전달로 인해 당전이효소와 당분해효소의 비정상적인 작용이 관련이 있음이 알려져 있다(Kim, Y. J., et al., Glycoconj. J., 1997, 14, 569-576., Hakomori, S., Adv. Cancer Res.,1989, 52, 257-331., Hakomori, S., Cancer Res., 1996, 56, 5309-5318).

따라서 본원에 따른 방법은 당화가 암의 발생, 진행과 관련 있는 다양한 암, 예를 들면 혈액암, 간암, 위암, 대장암, 폐암, 자궁암, 유방암, 전립선암, 갑상선암 및 췌장암을 포함하는 암으로부터 각각의 암과 관련된 암에서, 이를 특이적으로 검출 또는 진단할 수 있는 마커의 발굴에 사용될 수 있다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)(예컨대, 트랜지션성 암 상태의 동정, 암의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에 따른 방법은 당화 모티브의 탈당화 (de-glycosylation) 양과 비당화 모티브 (non-glycosylation)의 양 및 이에 대한 비를 계산하여, 이를 정상대조군과 비교하여, 이에 변동, 즉 감소 또는 증가가 있는 경우, 이를 암의 마커로 선별할 수 있다. 정량은 후술하는 방법을 통하여 수행될 수 있으며, 액체크로마토그래피와 같은 방법을 사용할 경우, 상기 비는 탈당화 단편에 대한 피크 면적 값과 비당화 단편에 대한 피크 면적 값을 각각 구한 다음, 이를 내부표준 펩타이드 (Internal standard peptide) 의 피크 면적 값으로 나누어 노말라이즈한 다음, 이 값을 이용하여 단편의 비 값 즉 적정화된 탈당화 단편 피크면적/적정화된 비당화 단편 피크 면적을 결정할 수 있다.

따라서, 당화 모티브의 탈당화 및 단편화가 수행되며, 이를 위해 다양한 탈당화 효소가 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 PNGase-F (Peptide N Glycosidase F)가 사용된다. 단편화는 분석의 용이성을 위해 전장 단백질은 작은 단편, 예를 들면 6-24 개 정도의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 형성하는 것으로, 이를 위한 다양한 가수분해효소가 사용될 수 있다. 단백질을 펩타이드 조각으로 가수분해시키기 위해서는 라이신과 알지닌의 아마이드(amide) 결합을 절단하는 트립신을 예로 들 수 있으나 그외 목적에 따라 라이신 자리만 절단하는 라이신-C, 알지닌 자리만 절단하는 알지닌-C, 아스파라진 자리를 절단하는 아스파르트산 N 등의 효소를 선택적으로 사용할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 트립신이 사용된다.

본원에 사용되는 비당화 모티브는 당화 모티브와 동일한 단백질 내의 당화되지 않는 펩타이드 서열로서 NxS/T 모티브를 포함하지 않는 펩타이드 중에서 변형 될 가능성이 있는 시스테인 또는 메티오닌을 포함하지 않는 길이의 펩타이드로 검출하는 방법에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면 질량분석기로 검출하는 경우, 질량범위가 약 15-1400m/z 이기 때문에 아미노산의 평균 분자량과 전하 그리고 특이성을 갖기 위한 최소 서열 갯수를 고려하면 약 6개 내지 24개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로 선별될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

본 방법의 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질은 암이 발생한 조직 또는 세포 또는 혈액을 포함한 체액 유래, 또는 정상 대조군 또는 적절한 암치료를 받은 대조군 유래로, 이러한 당화 단백질은 기존의 당단백질 중에서 스크리닝 될 수 있다.

본원의 방법에서 N-연결 당화 모티브 및 상기 N-연결 당화 모티브 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 서열은 소정의 당화 단백질 군으로부터 선택되는 상기 각 펩타이드 단편에 특이적인 서열을 가지며, 이를 통해 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비에 변동이 있는 단백질을 규명할 수 있으며, 이를 단백질 시료가 유래된 암의 특이적 마커로서 선별할 수 있다. 본원에 따르 소정의 당화 단백질 군은 기존에 공지된 것으로서 예를 들면 Plasma Proteome Database (PPD)(http://www.plasmaproteomedatabase.org/) 또는 http://www.uniprot.org/ 등에서 입수 할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 PPD가 사용되며, PPD 상에서 N-당화의 보존서열인 NxS/T 모티브를 포함하고, 이러한 모티브 상에서 N-당화가 된다고 알려져 있는 당단백질을 선별한다.

본원에 따른 탈당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드의 정량과 탈당화/비당화 펩타이드의 비율의 차이는 정상인과 암환자 또는 암우려환자 유래의 피검체에서 민감도가 높은 검출 방법이 사용되는 것이 바람직하다. 검출을 위해 혈장의 90% 이상을 차지하는 알부민(albumin), 이뮤노글로블린 G(lgG), 이뮤노글로블린 A(lgA), 트랜스페린 (transferrin), 합토글로빈(haptoglobin), 피브리노겐 (Fibrinogen) 등을 제거하거나 또는 아세톤 침전(acetone precipitation)이나 분획분자량(MWCO, molecular weight cut-off)법을 이용하여, 당단백질만 모으는 과정에서 사용된 많은 염들을 제거하고 단백질만 농축하는 단백질 정제과정을 거칠 수도 있다. 본원에서, N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편은 NxS/T 또는 NxC 모티브의 아스파라진이 아스파르트산으로 변화된 AspXxxSer/Thr 또는 AspXxxCys으로 검출된다. 즉, N-연결 당화 모티브에서 탈당화 검출시 검출대상이 되는 펩타이드 단편은 AspXxxSer/Thr 또는 AspXxxCys이다.

본원의 방법에서 정량은 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다. 피검체로부터 단백질을 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링 (Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 표지 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 다른 구현예에서는 액체크로마토그래피 질량 분석법이 사용된다. 또한 상기 액체크로마토그래피 질량 분석법의 데이터는 단백질이나 펩타이드에 대한 표지 없이 질량분석기의 정확한 분자량 값과 액체크로마토그래피에서 펩타이드들이 분리되는 머무름 시간의 재현성을 기초로 분석하는 Selected Ion Monitoring (SIM) 또는 MRM이 이용될 수 있으며, 본원에 따른 일 구현예에서는 MRM이 사용된다. MRM 분석을 위해 peptide/transition 값을 모니터링해서 수행될 수 있다.

MRM은 표지 없이 상대적으로 정량분석하거나, 동위원소로 치환된 펩타이드 표준물(stable isotope labeled peptide standard)을 질량분석 전에 주입하여 절대 정량 분석하는 두 가지 형태가 사용 가능하다. 다중반응탐색법을 활용한 보다 효율적인 정량분석을 위해 TIQAM(targeted identification for quantitative analysis by MRM)과 같은 데이터베이스 및 프로그램을 활용하여 후보 단백질에만 검출되는 유일한 펩타이드의 선택과 해당 펩타이드에 대한 MRM 트랜지션의 생성과 검증을 이용하는 방법이 사용될 수 있다(Anderson L, et al., Mol. Cell Proteomics. 2006, 5: 573-588).

본 발명의 일 실시예에 따르면, 질환이 의심되는 환자 또는 질환이 발병한 환자의 혈액을 수득하여 혈액 중 해당 단백질의 당화/탈당화 여부를 LC/MS(액체 크로마토그래피/질량 분석기, Liquid Chromatography/Mass Spectrometer) 방법을 수행하여 각 환자의 시료로부터 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 대조군과 비교하여 암마커의 선별에 사용될 수 있다.

그 예로 정상 대조군에서 정상범위의 임계값 (cutoff) (증가하는 경우에는 상한치 / 감소하는 경우에는 하한치)을 결정하여, 암 시료 유래의 단백질의 당화/탈당화 측정값이 임계값보다 변동한 경우, 즉 증가 또는 감소한 경우 암 마커로 선별할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 혈액 시료를 대상으로 하이드라자이드 또는 렉틴 컬럼을 기반으로 혈액 내 당단백질을 농축한 다음, 트립신으로 처리하여 비당화 펩타이드를 회수하고, 이후에 PNGase-F를 처리해서 탈당화 펩타이드를 회수해서 이들을 모두 LC-MS/MS 분석을 통해 혈액 내에 포함된 당단백질을 규명한다.

본원에 따른 방법은 하나의 시료에 대하여 여러 단백질에 대한 탈당화 비당화를 동시 또는 개별적으로 검출할 수 있다. 예를 들면 탈당화 펩타이드 및 비당화 펩타이드를 포함하여 일회에 최대 1000 여개 정도의 펩타이드 분석이 가능하며, 이는 500 개에 해당하는 당단백질의 검출이 가능한 것이다.

다른 양태에서 간세포암 마커에 관한 것이다. 본원에 따른 간세포암 마커는 Alpha-2-antiplasmin (SERPINF2), Alpha-2-macroglobulin (A2M), Apolipoprotein B-100 (APOB), Beta-galactosidase (GLB1), Bone morphogenetic protein 1 (BMP1), Corticosteroid-binding globulin (SERPINA6), Complement factor H (CFH), Cholinesterase (BCHE), Clusterin (CLU), Collagen alpha-1(XII) chain (COL12A1), Carboxypeptidase N subunit 2 (CPN2), Versican core protein (VCAN), Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 (ERBB3), Coagulation factor V (F5), Coagulation factor XI (F11), Follistatin-related protein 1 (FSTL1), N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS), G-protein coupled receptor 126 (GPR126), Heparin cofactor 2 (SERPIND1), Hypoxia up-regulated protein 1 (HYOU1), Integrin alpha-2 (ITGA2), Integrin alpha-3 (ITGA3), Integrin alpha-6 (ITGA6), Integrin alpha-M (ITGAM), Integrin beta-2 (ITGB2), Plasma kallikrein (KLKB1), Kinectin (KTN1), Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 (LAMP2), Galectin-3-binding protein (LGALS3BP), Plexin-A1 (PLXNA1), Periostin (POSTN), Inactive tyrosine-protein kinase 7 (PTK7), Roundabout homolog 4 (ROBO4), Tenascin (TNC) 및 Vitronectin (VTN)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상, 특히 두 개 이상의 마커이다.

다른 양태에서 본원은 본원에 따른 간세포암 마커의 검출시약을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

본원의 일 구현예에서는 간세포암 진단 마커로서, 간세포암 조직이나 혈액에서단백질 발현이 변동 즉 증가 및 감소하거나 당화되는 정도가 변동 즉 증가 및 감소하는 AFP, Alpha-2-antiplasmin (SERPINF2), Alpha-2-macroglobulin (A2M), Apolipoprotein B-100 (APOB), Beta-galactosidase (GLB1), Bone morphogenetic protein 1 (BMP1), Corticosteroid-binding globulin (SERPINA6), Complement factor H (CFH), Cholinesterase (BCHE), Clusterin (CLU), Collagen alpha-1(XII) chain (COL12A1), Carboxypeptidase N subunit 2 (CPN2), Versican core protein (VCAN), Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 (ERBB3), Coagulation factor V (F5), Coagulation factor XI (F11), Alpha-fetoprotein (AFP), Follistatin-related protein 1 (FSTL1), N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS), G-protein coupled receptor 126 (GPR126), Heparin cofactor 2 (SERPIND1), Hypoxia up-regulated protein 1 (HYOU1), Integrin alpha-2 (ITGA2), Integrin alpha-3 (ITGA3), Integrin alpha-6 (ITGA6), Integrin alpha-M (ITGAM), Integrin beta-2 (ITGB2), Plasma kallikrein (KLKB1), Kinectin (KTN1), Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 (LAMP2), Galectin-3-binding protein (LGALS3BP), Plexin-A1 (PLXNA1), Periostin (POSTN), Inactive tyrosine-protein kinase 7 (PTK7), Roundabout homolog 4 (ROBO4), Tenascin (TNC) 및 Vitronectin (VTN)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이다.

본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개 또는 그 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 예를 들면 간초음파 등과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있다. 질환 별 패널 등을 만들어 사용할 경우, 암의 진단에 있어, 정확성 (특이도와 민감도)을 높일 수 있다.

본원에서 간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 간암의 일종으로 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 대상성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 환자에서 발생하는 간조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양을 일컫는 것이다. HCC는 섬유성 스트로마가 없어 출혈과 세포괴사가 발생하며, 간문맥 시스템으로의 혈관침윤이 일어나며, 심한 경우 간파열 및 복강내혈액삼출로 이어질 수 있다.

본원에서 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 간세포암 마커의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 뇨, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 간세포암이 발생한 또는 발생이 의심되는 또는 발생가능성이 있는 생물체에서 수득한 간조직/세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법 및 검출에 이용되는 시약은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 당화 및/또는 비당화 정도의 검출, mRNA 및/또는 단백질의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

일 구현예에서 본원의 간세포암 진단용 마커는 이의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것이다. 단백질을 활성, 기능 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질 수준(level)에서 특이적으로 상호작용하는 제제를 사용하여 검출될 수 있다.

다른 구현예에서 본원의 간세포암 진단용 마커는 각 마커의 당화 특징에 기반을 둔 것이다. 각 마커는 각 마커의 당화 펩타이드의 탈당화 정도 및 비당화 펩타이드의 정량을 통해 검출될 수 있다.

이런 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 각 바이오 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열의 단편, 또는 상기 핵산서열에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 또는 상기 각 마커에 포함된 탈당화 또는 비당화 펩타이드 분석용 시약을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물 또는 키트를 제공한다.

간세포암 진단을 위한 본원에 따른 마커의 정량적, 정성적 분석에는 공지된 핵산 및 단백질을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 또는 항체와 같은 단백질 어레이 또는 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템, 핵산 전사 및 증폭 시스템, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합 및 유세포 분석기를 통한 검출, 또는 질량분석기 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

본원 일 구현예에 따르면 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 마커, 특히 각 마커의 탈당화 및/또는 비당화 펩타이드의 단편의 양을 검출할 수 있으며, 각 마커의 탈당화 및 비당화펩타이드는 각 마커에 특이적인 것으로 이에 관하여 전술한 바와 같으며, 후술하는 표 1을 참조할 수 있다. 예를 들면 검체로부터 단백질을 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링 (Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 표지 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 각 마커는 표 17-1 내지 17-3에 개시된 탈당화 및 비당화펩타이드를 포함하며, 본원에 조성물에 포함되는 시약을 이용한 검출은 탈당화펩타이드의 양, 비당화펩타이드 양 또는 상기 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양 중 하나 이상의 검출을 통해 수행될 수 있다. 본원에서 비당화 펩타이드 양의 검출은 해당 당단백질의 발현량을 나타낼 수 있고, 탈당화 펩타이드 양은 해당 당단백질의 당화 정도를 나타낼 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 정상인 대조군과 간암 환자군의 마커를 3가지 형태로 (비당화 펩타이드, 당화 펩타이드, 당화펩타이드/비당화 펩타이드 비율) 검출하여 판별 능력이 우수한 검출방법으로 수행될 수 있다.

예를 들면 특정 단백질 발현량이 그룹 간 (정상인, 간암 환자) 차이를 많이 보인다면, 단백질 발현량 자체(비당화 펩타이드)를 단독으로 사용할 수 있으며, 당화된 정도(탈당화 펩타이드)가 차이가 더 크거나 당화된 정도와 당단백질 발현량의 비(탈당화 펩타이드/비당화 펩타이드)가 차이가 더 크다면 단백질 발현량과 무관하게 당화된 정도를 검출방법으로 사용하거나 또는 단백질 발현량과 함께 사용할 수 있다.

예를 들어, SERPINF2 단백질의 경우, 비당화 펩타이드 (AUC=0.796) 의 경우 간암 환자에서 감소하고, 탈당화 펩타이드 (AUC=0.799) 또한 간암 환자에서 감소하지만, 비당화 펩타이드/당화 펩타이드 비(AUC=0.501)의 경우 차이가 없으며, 이 경우에는 탈당화 펩타이드나 비당화 펩타이드에 대해서만 검출을 수행한다.

APOB 단백질의 경우, 비당화 펩타이드(AUC=0.707)는 간암 환자에서 증가하지만, 탈당화 펩타이드(AUC=0.526)는 차이가 없으며, 이 경우 비당화 펩타이드 단독으로 사용해서 마커로 사용할 수 있지만, 탈당화 펩타이드와 비당화 펩타이드의 비(AUC=0.781)로 구분할 경우 더 높은 분별 능력이 있기 때문에, 이 경우에는 탈당화 펩타이드/비당화 펩타이드의 비를 계산해서 정상인과 간암환자를 구분할 수 있다.

즉 정상인에 비해 간암 환자에서 특정 단백질의 발현량은 증가하지만, 당화되는 정도는 반대로 감소할 수 있고, 또한 정상인에 비해 간암 환자에서 특정 단백질 발현량이 감소되지만 당화되는 정도는 증가할 수 있기 때문에, 단백질 발현량은 비당화 펩타이드로, 당화되는 정도는 탈당화 펩타이드로 확인할 수 있으며, 경향성이 반전되는 것을 탈당화 펩타이드/비당화 펩타이드 비로 계산해서 분별력을 향상시킬 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서, 본원에 따른 마커 중 SERPINF2, SERPINA6, CLU, COL12A1, ERBB3, F11, FSTL1, ITGA2, KLKB1, LAMP2, LGALS3BP, PLXNA1은 탈당화펩타이드의 양으로 검출되고, 상기 마커 중 AM2, GLB1, BMP1, BCHE, GNS, GPR126, SERPIND1, ITGA6, ITGAM, ITGB2, KTN1, PTK7, ROBO4 및 VTN은 비당화펩타이드의 양으로 검출되고, 상기 마커 중 APOB, CFH, CPN2, VCAN, F5, HYOU1, ITGA3, POSTN 및 TNC는 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양의 비로 검출될 수 있다.

다른 구현예에서는 각 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA와 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용된다.

또 다른 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

기타 다른 면역 반응 기반의 방법의 사용될 수 있으며 다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

다른 구현예에서는 본원의 각 마커는 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 정량적 및/또는 정성적 검출을 통해 간세포암의 진단 또는 예후 측정에 사용될 수 있다. 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 RNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다.

상기 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로, 예를 들면 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍를 포함한다. "프라이머" 또는 "프로브"는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성 한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 간세포암 마커를 포함하는 마커의 검출시약을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트 또는 시스템에 관한 것이다. 검출 시약 및 이러한 시약이 사용되는 방법은 상술한 바와 같다. 이러한 본원의 마커를 검출할 수 있는 시약은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커 검출시약을 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다.

일 구현예에서 검출시약은 본원에 따른 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 항체로, 혈청 중의 단백질의 정량 및/또는 정성 평가가 가능하다. 다른 일 구현예에서, 이러한 항체는 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다.

다른 구현예에서, 검출시약은 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 기질의 표면에 검출시약이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 어레이에 부착될 수 있는 검출시약은 예를 들면 한 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.

검출시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다.

형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

본원의 키트는 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.

상기 다양한 검출시약을 포함할 수 있는 본원의 키트는 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 질량분석 및 MRM 분석용, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인식하는 항체가 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료에 답그면, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 마커를 검출하는 것이다.

다른 구현예에서는 질량분석 및 MRM 키트가 제공되며, MRM을 이용한 질량분석법에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다. MRM 방법은 특정 단백질을 선택적으로 인식하는 펩타이드를 이용하는 것으로, 온도, 습도 등 환경에 민감한 항체를 이용하는 기존의 방법과 비교하여, 보다 안정적으로 생체시료에서 마커를 검출할 수 있다.

또한 본원의 키트는 본원에 따른 바이오 마커의 사용법에 관한 안내서를 포함할 수 있다.

또다른 양태에서 본원은 간세포암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체의 생물학적 시료로부터 AFP, SERPINF2, A2M, APOB, GLB1, BMP1, SERPINA6, CFH, BCHE, CLU, COL12A1, CPN2, VCAN, ERBB3, F5, F11, AFP, FSTL1, GNS, GPR126, SERPIND1, HYOU1, ITGA2, ITGA3, ITGA6, ITGAM, ITGB2, KLKB1, KTN1, LAMP2, LGALS3BP, PLXNA1, POSTN, PTK7, ROBO4, TNC 및 VTN으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 핵산 또는 단백질 수준, 핵산 또는 단백질의 존재여부, 또는 상기 하나 이상의 마커의 탈당화 및 비당화 펩타이드의 양을 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 수준 또는 존재 또는 상기 탈당화 및 비당화 펩타이드 양의 비에 대한 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 검출결과에 변동이 있는 경우, 이를 간세포암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간세포암 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 방법에 사용되는 생물학적 시료, 대조군 또는 참조군, 바이오마커 검출 방법 및 이에 사용되는 시약 및 판정을 위한 데이터 분석 방법은 앞서 설명한 바와 같다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 각 마커는 표 1 또는 표 17-1 내지 17-3에 개시된 탈당화 및 비당화펩타이드를 포함하며, 상기 검출은 상기 탈당화펩타이드의 양, 상기 비당화펩타이드 양 또는 상기 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양의 비 중 하나 이상의 검출을 통해 수행될 수 있다. 본원의 마커 중 SERPINF2, SERPINA6, CLU, COL12A1, ERBB3, F11, FSTL1, ITGA2, KLKB1, LAMP2, LGALS3BP, PLXNA1은 탈당화펩타이드의 양으로 검출되고, 상기 마커 중 AM2, GLB1, BMP1, BCHE, GNS, GPR126, SERPIND1, ITGA6, ITGAM, ITGB2, KTN1, PTK7, ROBO4 및 VTN은 비당화펩타이드의 양으로 검출되고, 상기 마커 중 APOB, CFH, CPN2, VCAN, F5, HYOU1, ITGA3, POSTN 및 TNC는 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양의 비로 검출될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 상기 각 마커의 탈당화 펩타이드 및 상기 비당화 펩타이드의 양은 MRM을 이용한 액체크로마토그래피 질량분석법으로 측정된다. 상기 탈당화 펩타이드는 비당화펩타이드에 관하여는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있으며, 또한 본원에 따른 각 마커의 당화 및 비당화 펩타이드는 하기 표 1과 같다. 본원에 따른 일구현예에서는 본원의 하나 이상의 마커에 대하여, 표 1에 기재된 바와 같은 당화펩타이드의 탈당화 및 비당화 펩타이드의 양을 예를 들면 MRM을 이용한 액체크로마토그래피 질량분석법을 결정한 후, 이의 비를 구하여, 대조군과 비교하여 변동이 있는 경우, 간세포암으로 판정할 수 있다.

[표 1]

본원의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 포함한다. 인간 대상체는 HCC가 발병했을 것으로 의심되는 사람, 의심되지 않는 사람으로 HCC 진단여부가 필요한 사람을 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 간질환 관련 증상 예를 들면 복부통증, 비대간, 복수, 황달, 근육쇠약, 간염 (예를 들면 HCV 감염), 또는 식도 정맥류 등과 같은 대상체가 HCC 여부를 결정하기 위한 다른 증상을 가진 대상체에게 수행될 수 있다. 다른 구현예에서는 외관상으로는 정상으로 HCC 증상을 나타내지 않는 대상체이다.

다른 구현예에서, 대상체는 혈장 AFP 농도가 낮거나 또는 정상일 수 있어, AFP를 기준으로는 HCC로 진단되지 않을 수도 있는 사람이다. 이러한 경우, AFP의 혈청 농도는 약 0 μg/l (비검출) 내지 20 μg/l, e.g., 0 μg/l (비검출) 내지 5 μg/l, 5 μg/l 내지 10 μg/l, 10 μg/l 내지 15 μg/l, 또는 15 μg/l 내지 20 μg/l 일 수 있다.

상술한 방법을 사용하여 두 개 이상을 포함하는 마커의 조합을 사용하는 경우 프로파일, 즉 시료 중 마커 단백질 발현과 관련된 정량적 정보를 포함하는 데이터세트가 생성될 수 있다.

마커를 이용하여 프로파일을 수득한 후에, 참조군 또는 대조군과의 결과 비교를 통해 대상체의 시료의 간세포암 여부를 판별한다. 대조군 또는 참조군으로는 음성 대조군으로 정상 시료, 또는 간세포암에 걸린 후 치료된 환자 유래의 시료, 양성대조군으로 본원에 따른 마커 이외에 방법으로 간세포암으로 판정된 환자 유래의 시료, 간경화 환자 유래의 시료, 간염 유래 환자의 시료일 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 정상인 유래의 시료, 간세포암으로 판정후 치료를 받은 환자 유래의 시료가 대조군 또는 참조군으로 사용되어, 수득된 프로파일의 비교에 사용된다.

대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교, 또는 U.S. 특허 6,308,170 및 6,228,575에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 예로는 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Ben-Dor et al (2007, J. Comput. Biol. 7: 559-83), Nguyen et al (2002, Bioinformatics 18:39-50), Wang et al (2003, BMC Bioinformatics 4:60), Liu et al (2001, Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform.12:14-23), Yeang et al (2001, Bioinformatics 17 Suppl 1:S316-22) 및 Xiong (2000, Biotechniques 29(6):1264-8, 1270) 등을 포함하는 문헌을 참조할 수 있다.

또한 본원의 마커를 통하여 검출된 결과가 간세포암 판별에 유의한 것으로 판정하기 위해 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일 구현예에서는 logic regression 방법이 사용되며, Ruczinski, 2003, Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512를 참조할 수 있다. 상기 방법은 클래시파이어가 바이너리 트리로 제시되는 CART 방법과 유사하나, 각 노드는 CART에 의해 생성되는 "and" 연산자와 비교하여 보다 일반적인, 특성과 관련된 불린(Boolean) 연산자가 사용된다. 다른 분석 방법의 예로는 nearest shrunken centroids (Tibshirani. 2002 PNAS. 99:6567-72), random forests (Breiman. 2001. Machine Learning 45:5-32 및 MART (Hastie. 2001. The Elements of Statistical Learning, Springer)을 들 수 있다.

일 구현예에서, 통계처리를 통해 HCC로 진단하기 위해 시험물질과 대조군간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 원 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다.

이러한 통계적 분석 방법은 바이오마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.

본원에 따른 방법은 HCC가 심각성 정도를 판단하는데 사용될 수 있다. 예를 들면 양성대조군 및 음성대조군의 프로파일과 비교하여, 경증 HCC, 중간정도 HCC 또는 중증 HCC로 평가될 수 있다. 나아가 일정 HCC 집단에 대한 마커 프로파일 분석을 수행하여, 프로파일 결과를 근거로 일정 기준에 따라 분류할 수 있다. 이런 방식으로 조기발견을 통해 자기공명영상(MRI)와 같은 고가의 검사를 하지 않을 수도 있다.

다른 구현예에서, 본 방법은 특정 기간 동안 예를 들어 1년에 걸쳐 수차례 수행될 수 있으며, 발현 패턴의 변화 추이 모니터링에 사용될 수 있다. 마커의 종류에 따라 발현의 증가 또는 감소를 HCC의 상태와 연관지을 수 있다. 동일 대상체에 대한 종전의 검사수치 또는 대조군의 수치와 비교하여, HCC 발병, 진행, 악화 등의 판단에 사용될 수 있다. 시간의 경과에 따른 HCC 마커의 변화를 근거로 간세포암 또는 중증 간세포암으로의 진행을 막기 위한 예방적 조치를 취할 수 있다. HCC의 확진을 위해, 바이오마커는 보조 수단으로 사용될 수 있으며, 다른 진단 방법 예를 들면 AFP 테스트, 초음파, 컴퓨터단층촬영 (computerized axial tomography (CT scan)) 또는 자기공명영상(magnetic resonance imaging (MRI)) 검사와 함께 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 표준 당단백질을 이용한 탈당화/비당화 펩타이드 분석

MRM 기술을 이용한 당화 펩타이드 및 탈당화 펩타이드의 정량을 통해 마커 발굴 및 질환 진단의 가능성을 확인하기 위해 표준 당단백질을 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

도 1에 나타난 바와 같이 질량분석법의 하나인 Triple quadrupole 을 이용한 MRM 기술은, 특정 펩타이드의 양을 상대 및 절대 정량 할 수 있는 기술로써, 특정 펩타이드의 Q1 m/z (질량/전하량)만을 통과시켜서 필터 역할을 수행하는 Quadruple 1 (Q1) 과 Q1 을 통과한 펩타이드를 전기적인 에너지에 의해 단편화가 일어나도록 만들어 주는 Quadruple 2 (collision cell), 그리고 Quadruple 1 (Q1) 에서처럼 필터 역할을 수행해서 특정 단편화 이온만을 통과시키는 Quadruple 3 (Q3) 로 이루어져 있다. Q3 까지 통과된 이온은 검출기에서 피크의 크로마토그램으로 나타난다. 이 피크의 면적을 분석하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행할 수 있게 된다. 당화 펩타이드의 경우, 당화사슬(Glycan) 에 의해 본래 펩타이드가 갖고 있는 질량(mass) 값에서 변화가 일어나기 때문에, 해당 펩타이드에 대한 m/z 값으로 Q1 필터를 통과하지 못하게 된다. 이로 인해 Q2 collision cell 안으로 진입하지 못하므로 검출되지 않는다. 반면에, 탈당화 효소 예를 들면 PNGase-F를 처리한 탈당화된 펩타이드의 경우, N-glycosylation site (NxS/T)에서 PNGase-F 에 의해 글라이켄이 떨어져 나가면서 아스파라진 (Asparagine, N)이 아스파르트산 (Aspartic acid ,D)으로 바뀌게 되는 탈아미드화 (N → D)가 발생되는데, 이러한 원리를 이용하여 탈아미드화된 형태의 펩타이드 서열로 분석할 경우 탈당화 펩타이드를 검출할 수 있다.

실시예 1-1 표준 당단백질의 선정

표준 단백질의 경우 특정 NxS/T motif 에 당화 되어 있는 상태로 정제된 후, 동결건조 상태로 시중에서 구입할 수 있는 단백질 중에서 이론적인 트랜지션 (Q1/Q3) 선정 시, NxS/T 모티브를 포함 하는 당화 펩타이드와 NxS/T 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드가 모두 skyline 프로그램상에서 예측가능한 트랜지션으로 잡히는 것을 실험에 사용하였다.

본 실시예에서는 이스트 유래인 Invertase-1 단백질을 표준단백질로 사용하였으며, 그 서열 및 분석에 이용 된 서열 (초록색 표시)은 도 2에 개시된 바와 같다. 표준 당화 펩타이드 1 및 2는 각각 NPVLAANSTQFR 및 FATNTTLTK 이며, 상기 각 펩타이드가 탈당화시 아스파라진이 아스파르트산으로 전환되어 각각 NPVLAADSTQFR 및 FATDTTLTK이 된다. 표준 비당화 펩타이드 1 및 2는 각각 IEIYSSDDLK 및 VVDFGK이다.

실시예 1-2 표준 당단백질의 이론적 트랜지션 (Q1/Q2) 선정

해당 표준 당단백질에 대한 본래의 서열 정보(native form)와 NxS/T motif 자리에서 N을 D로 바꾼 변경된 서열 정보(conversion form) 를 각각 skyline (https://brendanx-uw1.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view) program 에 도입해서 이론적인 트랜지션 값을 선정하였다. 이때, 분석에 이용된 펩타이드와 동일한 서열을 갖지만, 펩타이드의 C-말단에 존재하는 알지닌 (Arg, R)과 라이신 (Lys, K) 의 탄소(¹²C), 질소(¹⁴N) 가 ¹³C, ¹⁵N 으로 표지된 중표지 (heavy-labeled) 합성 펩타이드를 이용해서, 해당 펩타이드가 실제 검출하고자 하는 펩타이드에서 유래된 것인지 검증하였다.

즉, 중표지 합성 펩타이드와 내인성 펩타이드는 펩타이드 서열이 서로 같기 때문에, 소수성이 서로 동일해서, LC-컬럼(C18) 상에서 동일한 머무름시간 (retention time) 에 용출되므로 이를 통해서 확인할 수 있다.

트랜지션 (Q1/Q3) 선정결과, 원 서열 (native sequence)과 변경서열 (conversion sequence) 간에는 Q1 값이 0.49 Da, Q3 값이 0.98 Da 차이나는 것을 확인했고, 내인성 펩타이드와 중표지 합성 펩타이드 간에는 Q1 값이 4.00 Da (5.00 Da), Q3 값은 8.01 Da (10.01 Da) 차이나는 것을 확인했으며, 트랜지션 분석 결과는 아래 표 2와 같다.

[표 2]

실시예 1-3 표준 당단백질에 대한 MRM 분석

1-3-1 표준 당단백질 시료 준비

표준 당단백질 100μg 에 최종 농도 6M urea/20mM DTT(dithiothreitol)로 처리 (Tris pH 8.0) 하여 다음, 37℃에서 60분 동안 정치하여 환원과정을 수행하였다. 이어 최종 농도가 50mM이 되도록 IAA (iodoacetamide)를 처리 한 다음, 상온에서 30분 동안 정치하여 알킬화를 수행하였다. 이어 Urea 의 최종농도가 0.6M 이하가 되도록 100mM Tris pH 8.0으로 희석하였다. 이어 탈당화 펩타이드는 PNGase-F (Peptide N Glycosidase) (NEW ENGLAND BioLabs Inc. P0704L)를 2μl(500,000 units/ml)로 처리하고, 당화 시료는 대조군으로 물 2μl로 처리 후, 37℃에서 16시간 동안 정치하였다. 이어 트립신과 상기 펩타이드 시료의 농도 비율이 1:50 이 되도록 트립신으로 처리 후, 37℃에서 12시간 동안 정치하였다. 이어 포름산 용액을 최종농도 5%가 되도록 처리하였다. 이어 다음과 같이 OASIS cartridge (Waters)를 제조자의 방법대로 사용해서 탈염화를 수행하였다. 탈염화 펩타이드를 Sol A 완충액 (97% D.W, 3% ACN, 0.1% formic acid) 에 녹인 다음, 15,000rpm에서 60 min 동안 원심분리 한 다음, MRM 분석 시행하였다.

1-3-2 MRM분석 시료 준비

정량성을 확인하기 위해, 표적 펩타이드에 대한 중표지 합성 펩타이드의 선형성을 확인하는 실험을 다음과 같이 진행했다. 실험 방법은 중표지 합성 펩타이드를 0, 4, 13, 40, 120, 370 fmol 농도로 일련 희석한 다음에, 여기에 표준 당화단백질에 해당되는 표적단백질 370nmol 을 일정하게 넣어서 분석을 진행했다. 당화 표준 당단백질 시료에는 본래의 서열 정보 (N-form, Asn을 포함)를 갖고 있는 중표지 합성 펩타이드를 연속희석하여 분석을 수행하였으며, 탈당화 표준 당단백질시료에는 변경된 서열 정보 (D-form, Asn 대신에 Asp 아미노산)를 갖고 있는 중표지 합성 펩타이드를 연속희석하여 분석을 수행하였으며, 모든 분석은 3회 반복 분석하였다.

1-3-3 MRM 분석 조건

액체 크로마토그래피 (Liquid chromatography (LC)) 는 Agilent 사의 1260 capillary LC system 을 사용하였고, 펩타이드 분리를 위해서 Capillary RR 0.3 x 150, 3.5μm (Cat.N 5064-8261) 컬럼을 사용하였다. 펩타이드 시료는 5.0 μl를 트랩 컬럼을 거치지 않고 분석컬럼으로 바로 주입되는 직접 방법으로 주입하였으며, 유속은 20L/min 으로 사용하였다. Column을 SolA (97% Distilled Water, 3% acetonitrile, 0.1% formic acid)로 10 분간 평형화 한 후 SolB (3% Distilled Water, 97% acetonitrile, 0.1% formic acid)로 45min 간, 5%에서 60%까지, 5분간 85%의 농도구배를 통해 펩타이드를 용출하였다.

질량분석은 Agilent technology 사의 6490-Triple quadrupole(QQQ) 장비를 이용하여 선정 단백질의 트랜지션에 대해 MRM mode 로 모니터링하였다. 가스온도는 200℃, 가스유속운 14L/min 으로 사용하였으며, 분무는 20psi, 쉬쓰 가스 온도는 250℃, 쉬쓰 가스 유속은 11L/min 으로 사용하였다. 모세관 및 노즐 전압은 각각 3000V 로 사용하였다.

Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3 (Q3)에서의 해상도(0.7Da) unit 으로 설정하였으며, unscheduled MRM 방식으로 dwell time 은 총 주기가 2 sec 정도가 되도록 설정해서, 모든 표적 펩타이드에 대해서 분석을 한 다음, 용출되는 머무름시간(retention time) 을 선정하였고, 이를 근거로 window size 3 min으로 계획된 (scheduled) MRM 으로 3번 반복 분석을 진행하였다.

1-3-4 MRM 분석 결과

표준 당단백질에 대한 MRM 분석 결과는 도 3 내지 도 7에 기재되어 있다.

도 3 및 4와 아래 표 3-1과 3-2 및 표 4-1과 4-2는 당화 펩타이드 1 및 2 각각에 PNGase-F 를 처리해서 만든 탈당화 시료와 물 (대조군)로 처리한 당화 시료를 대상으로 당화 펩타이드인 NPVLAANSTQFR (당화 펩타이드 1) / FATNTTLTK (당화 펩타이드 2)에 대해 분석을 진행한 결과이다. 탈당화 시료에 변경 서열 정보로 합성된 중표지 펩타이드 (D-form) 를 연속희석하여 분석한 결과, 표준 당단백질로부터 유래한 내인성 펩타이드와 중표지 합성 펩타이드가 동일한 시간에 함께 용출 되는 것을 확인하였고, 5개의 프러덕트 이온 타입의 강도 또한 동일하게 확인되었으며, 중표지 합성 펩타이드의 선형성 (R^2=0.9959, 0.9994) 또한 확인되었다. 시료에 본래의 서열 정보로 합성된 중표지 펩타이드 (N-form) 를 연속희석하여 분석한 결과, 표준 당단백질로부터 유래한 내인성 펩타이드의 경우, 당화에 의해서 질량 값이 이동되기 때문에 관측되지 않았고, 중표지 합성 펩타이드만이 확인되었으며, 선형성(R^=0.9971, 0.9958) 또한 확인 되었다.

[표 3-1]

[표 3-2]

[표 4-1]

[표 4-2]

도 5 및 6과 하기 표 5-1과 5-2 및 표 6-1과 6-2는 PNGase-F 를 처리해서 만든 탈당화 시료와 물(대조군)을 처리한 비당화 펩타이드인 IEIYSSDDLK / VVDFGK 에 대한 분석결과이다.

탈당화 시료 및 당화 시료에 중표지 펩타이드를 연속희석하여 분석한 결과, 표준 당단백질로부터 유래한 내인성 펩타이드와 중표지 펩타이드가 동일한 시간에 함께 용출되었으며, 5개의 프러덕트 이온 타입의 강도 또한 동일한 것으로 나타났다. 중표지 합성 펩타이드의 선형성 (R^2=0.9993, 0.9994 / R^2=0.9981, 0.9997) 또한 확인되었다. 나아가 내인성 펩타이드의 경우, PNGase-F 를 처리한 탈당화 시료와 비교하여 강도가 낮은 것으로 나타났다.

[표 5-1]

[표 5-2]

[표 6-1]

[표 6-2]

표준 당단백질을 이용한 실험 결과를 종합하면, 도 7에 나타난 바와 같이 탈당화 펩타이드를 변경된 서열 (D-form)으로 분석할 경우는 검출되지만, 당화 펩타이드를 원래의 서열인 N-form으로 분석할 경우, 당화(glycan)에 의해서 질량 값이 바뀌기 때문에 검출되지 않는 것을 확인하였다. 이는 당화 펩타이드가 당단백질의 정량을 위해 이용될 수 있음을 나타내는 것이다. 당화 되어 있지 않는 비당화 펩타이드의 경우 PNGase-F를 처리한 탈당화 시료가 당화 시료에 비해서 피크 강도가 증가함을 확인하였다. 이는 PNGase-F에 의해서 글라이켄이 펩타이드에서 제거되기 때문에, 이로 인해 글라이켄에 의한 입체성방해 (steric hindrance)가 사라져 이후에 트립신이 표적 펩타이드에 작용하는데 접근이 용이해지기 때문인 것으로 판단된다.

실시예 2 간암 시료에서 MRM을 이용한 당화 분석

실시예 2-1 임상시료 정보

본 실시예는 서울대학교의 의학연구윤리심의위원회의 허가된 프로토콜에 따라 수행되었으며, 각 환자로부터 충분한 설명에 근거한 서면동의를 수득하였으며, 임상정보는 다음과 같다.

본 실시예에서 사용된 시료는 정상인 60명, 간암 환자 60명이었다. 간암은 본래 여성에 비해 남성에서 발생 가능성이 높다는 사실을 근거로 남성의 비율이 여성의 비율 보다 높도록 간암 시료를 선정했다. 또한, 간암의 주된 원인은 환자별로 크게 바이러스성(HBV, HCV)과 알콜성으로 나눌 수 있지만, 최근에 아시아와 아프리카에서 간암 원인에 대해 조사한 결과, 가장 높은 간암 발생 원인을 차지하고 있는 HBV에 의해 간암이 발생되는 경우의 시료만을 선별했고, 해당 임상시료 정보는 아래와 표 7과 같다.

[표 7]

실시예 2-2 임상시료를 이용한 마커 선별

간암마커로 알려진 alpha-fetoprotein (AFP) 단백질의 경우, 당단백질로서 특정 NxS/T 모티브에 당화가 되는 펩타이드 서열은 VNFTEIQ 이다. 상기 NxS/T 모티브를 포함 하면서 당화가 발생하는 펩타이드와 NxS/T 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드가 모두 skyline 프로그램을 이용하여 예측가능한 트랜지션을 확인하였다 (하기 실시예 2-3 참조). 해당 AFP 단백질에 대한 전체 서열 분석에 이용 된 서열(초록색 표시)은 도 8에 기재하였다.

나아가 상기와 동일한 시료를 사용하여 간암 특이적인 당단백질 마커 후보군을 추가로 발굴하기 위해서 Plasma Proteome Database (PPD)상에서 N-당화의 보존서열인 NxS/T 모티브를 포함하고, 이러한 모티브 상에서 N-당화가 된다고 알려져 있는 당단백질 495개를 선별하였고, 기존 NxS/T 모티브를 포함 하면서 당화가 발생하는 펩타이드와 NxS/T 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드가 모두 skyline 프로그램을 이용하여 트랜지션을 확인하였다. 이를 통해서 비당화 펩타이드에 해당되는 경우는 406개의 단백질, 1637개의 펩타이드, 9821개의 트랜지션(Q1/Q3) 으로 선정되었으며, 당화 펩타이드에 해당되는 경우는 240개의 단백질, 363개의 펩타이드, 4111개의 트랜지션(Q1/Q3) 로 선정되었다.

실시예 2-3 AFP 단백질을 포함한 간암 유래 당단백질의 이론적 트랜지션(Q1/Q2) 선정

실시예 1의 표준 당단백질과 마찬가지로, AFP 단백질의 본래 서열 정보(native form)와 NxS/T 모티브에서 N을 D로 바꾼 변경된 서열 정보(conversion form)을 각각 skyline program 에 도입해서 이론적인 트랜지션 (in silico prediction) 값을 선정했다. 트랜지션 (Q1/Q3) 선정결과, 본래 서열과 변경서열 간에는 Q1 값이 0.49 Da, Q3 값이 0.98 Da 차이나는 것을 확인하였고, 결과는 아래 표 8과 같고, 실시예 2-2의 다른 간암 유래 당단백질 또한 동일한 방식으로 선정되었다.

[표 8]

실시예 2-4 집합 (pooled) 임상시료 준비 및 MRM 분석

정상 대조군 60명 중 20명씩의 집합 시료, HCC 환자 60명 중 20명씩의 집합 시료로 각각 3 그룹을 형성한 후, 혈청 내에 존재하는 주 단백질 6 종류 (알부민(albumin), 이뮤노글로블린 G (lgG), 이뮤노글로블린 A(lgA), 트랜스페린 (transferrin), 합토글로빈(haptoglobin), 알파-1-안티트립신 (alpha-1-antitrypsin) 를 MARS (multiple affinity removal system, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Part #5185-5984)를 제조자의 방법대로 사용하여 제거하였다.

이어 혈청 단백질을 농축 후(Amicon, 3K), BCA (bicinchoninic acid (BCA) assay, Sigma-Aldrich)분석 키트를 제조자의 방법대로 사용하여 정량한 후 100μg 의 양만을 취한 다음, 실시예 1의 표준 당단백질과 동일하게 물(대조군) 처리후 트립신 처리하거나 또는 PNGase-F 를 처리해서 탈당화 후 트립신으로 처리하여 분석을 진행하였다.

데이터의 질적 확인 및 분석 장비의 안정성 확인을 위해 내부 표준 펩타이드로 알지닌의 C와 N에 중표지된 펩타이드를 사용하였다. 사용된 펩타이드 서열은 LNVENPK로 사람 혈청에는 존재하지 않는 대장균 유래로, 각 분석 당 5 fmol의 농도로 사용되었다.

그룹당 총 3회 반복 분석을 했고, 이를 통해서 얻어진 자료는 skyline software 에 도입 된 다음, 각 펩타이드 트랜지션의 면적으로 환산되었다. 각 MRM 분석에 대한 AFP 표적 펩타이드에 대한 피크 면적 값은 내부 표준 펩타이드의 피크 값으로 표준화(normalization) 되서 분석 되었다.

실시예 2-5 집합 임상시료에 대한 MRM 분석 결과

2-5-1 AFP 펩타이드 (GYQELLEK / VDFTEIQ) 및 간암 유래 당단백질 마커 후보군 발굴을 위한 분석 결과

물(대조군)만 처리한 당화 시료와 PNGase-F를 처리해서 만든 탈당화 시료를 대상으로 당화 펩타이드인 VNFTEIQ (VDFTEIQ)에 대해 분석을 진행한 결과는 도 9a 내지 9d에 기재되어 있다. 집합 정상 대조군 시료를 대상으로, 당화 시료는 본래의 서열 정보 (VNFTEIQ)로, 탈당화 시료는 변경된 서열 정보 (VDFTEIQ) 로 분석한 결과, 모두 검출 되지 않았다.

반면, HCC 그룹의 경우, 당화 시료는 본래의 서열 정보 (VNFTEIQ)로, 탈당화 시료는 변경된 서열 정보(VDFTEIQ)로 분석한 결과, 탈당화 시료를 변경된 서열 정보로 분석한 경우에서만 검출이 되었다. 즉, 대조군 시료에 비해 HCC 시료에서는 AFP 단백질의 발현량이 증가되어 질량분석기로 검출 될 수 있는 범위 안으로 들어오게 되지만, 당화 시료의 경우 당화에 의해서 질량 값이 변화되기 때문에 검출되지 않고, 탈당화 시료의 경우에서만 검출되었다.

물 (대조군)을 처리한 당화 시료와 PNGase-F를 처리해서 만든 탈당화 시료를 대상으로 비당화 펩타이드인 GYQELLEK 에 대해 분석을 진행한 결과는 도 10a 내지 10d에 기재되어 있다. 집합 정상 대조군 시료를 대상으로, 당화 시료와 탈당화 시료를 분석한 결과, 모두 검출되지 않았다. 집합 HCC 시료를 대상으로, 당화 시료와 탈당화 시료를 분석한 결과, 모두 검출 되었다. 즉, 대조군 시료에 비해 HCC 시료에서는 AFP 단백질의 발현량이 증가되어 질량분석기로 검출 될 수 있는 범위 안으로 들어오게 되어서 검출된 것으로 판단된다.

종합하면, 집합 정상 대조군 60명과 HCC 60명의 혈청 시료에 PNGase-F / 트립신을 처리해서 수득한 탈당화 시료를 대상으로 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQK) 와 비당화 펩타이드 (GYQELLEK)를 함께 분석한 결과, 하기 표 9 및 10과 도 11에 나타난 바와 같이 VDFTEIQK 펩타이드로 분석하는 경우, HCC 그룹과 정상 대조군 간에 27.3-배의 차이가 나지만, GYQELLEK 펩타이드로 분석하는 경우에는 5.3-배의 차이만을 나타냈다. 이는 본원의 방법을 이용한 당화 분석이 단백질 발현량 분석과 비교하여 양적인 차이가 월등히 높은 것을 나타낸다.

[표 9]

[표 10]

AFP 이외에 당단백질 마커 후보군 추가 발굴을 위해 분석한 결과, 비당화 펩타이드는 354개의 단백질, 1000개의 펩타이드가 검출되었고, 탈당화 펩타이드는 145개의 단백질, 182개의 펩타이드가 검출되었다. 이의 검출에 사용된 탈당화 펩타이드 및 당화 펩타이드는 하기 표 16에 기재된 바와 같다.

실시예 3 개별시료에 대한 MRM 분석

실시예 3-1 개별 임상시료 준비 및 MRM 분석

정상 대조군 60명, HCC 그룹 60명에 대한 개별 시료를 준비하는 조건 및 MRM 분석 조건은 실시예 2와 동일하게 수행되었다.

분석된 데이터의 적정화(normalization)를 위해서 탈당화 펩타이드의 중표지 합성 펩타이드는 7.3 fmol 로 비당화 펩타이드의 중표지 합성 펩타이드는 10.3 fmol 양으로 모든 개별 시료에 넣어서 분석을 진행하였다.

모든 개별 시료는 1회 분석을 수행하였으며, 그 결과는 skyline 프로그램에 도입 된 다음, 펩타이드 트랜지션의 면적 값으로 환산되었다. AFP 표적 펩타이드에 대한 피크 면적 값은 각각의 중표지 합성 펩타이드의 피크 면적 값으로 표준화 되어서 분석 되었다.

AFP에 추가하여 간암 유래 당단백질 마커 후보군 추가 발굴 위한 대상은 집합 임상시료 상으로 Signal to noise(S/N) 값이 3배 이상, 동일한 머무름 시간에서 3개 이상의 product ion 이 유입되는 것으로 검출이 확인된 단백질 및 펩타이드 만을 가지고 분석을 진행하였다.

실시예 3-2 AFP 표적 펩타이드 및 충돌 에너지 최적화

본 실시예는 표적 펩타이드의 검출되는 정도를 향상시키기 위해 충돌 에너지 최적화 실험을 진행한 것이다.

표적 펩타이드의 트랜지션 (Q1/Q3) 선정 결과, 내인성 펩타이드와 중표지 합성 펩타이드 간에는 Q1 값이 4.00 Da (5.00 Da), Q3 값은 8.01 Da (10.01 Da) 차이나는 것을 확인했다.

AFP의 중표지 합성 펩타이드의 최적화된(optimized) 충돌 에너지 (collision energy (CE))값을 선정하기 위해서 default CE 값에서 앞뒤로 2 unit 으로 총 11 points 의 CE 값으로 각각 3회식 반복 분석을 해서 피크 면적 값이 가장 높게 측정되는 CE 값을 확인했으며, 결과는 도 12 및 표 11에 기재되어 있다. 표 11은 AFP 표적 펩타이드(endo/heavy)에 대한 mass 값 (m/z) 값 및 최적화된 CE 값을 나타낸다.

[표 11]

실시예 3-3 내인성 AFP 표적 펩타이드 확인

AFP 표적 펩타이드 (De-glycopeptide, Non-glycopeptide)와 동일한 서열을 갖지만, 펩타이드의 C-말단에 존재하는 알지닌 (Arg, R)과 라이신(Lys, K)의 탄소(¹²C), 질소(¹⁴N)가 ¹³C, ¹⁵N으로 표지된 중표지 합성 펩타이드를 이용해서, 해당 펩타이드가 실제 혈청 내에 존재하는 내인성 펩타이드가 맞는지 검증하였다.

즉, 중표지 합성 펩타이드와 내인성 펩타이드는 서열이 같기 때문에, 소수성이 서로 동일해서, LC- column(C18) 상에서 동일한 머무름시간에 용출되는 원리를 이용한 것이다.

PNGase-F/트립신을 처리하여 수득한 탈당화 시료를 대상으로 탈당화 펩타이드인 VDFTEIQK와 비당화 펩타이드인 GYQELLEK를 중표지 합성 펩타이드와 함께 분석한 결과, 혈청 시료로부터 유래한 내인성 펩타이드와 중표지 합성 펩타이드가 동일한 시간에 함께 용출되었으며 프러덕트 이온 타입의 강도 또한 동일한 것으로 나타났으며, 결과는 도 13a 및 13b에 기재되어 있다.

실시예 3-4 중표지 합성 펩타이드의 반응곡선

AFP 표적 펩타이드에 대한 중표지 합성 펩타이드의 정량성을 확인하기 위해서, 반응곡선의 선형성을 확인하는 실험을 다음과 같이 진행하였다. 탈당화 펩타이드(VDFTEIQK) 의 중표지 합성 펩타이드는 0, 0.8, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100 fmol 농도로 연속희석하였고 비당화 펩타이드 (GYQELLEK)의 중표지 합성 펩타이드는 0, 1.6, 3.1, 6.3, 12.5, 25, 50, 100, 200 fmol 농도로 연속희석하였으며, 여기에 매트릭스로 집합 혈청 시료 5μg 을 모두 일정하게 넣어서 분석을 진행하였다.

모든 분석은 각 농도마다 3회 반복 분석을 진행하였으며, 분석 결과 2개의 중표지 합성 펩타이드 모두 선형성 (R^2=0.995, 0.992)이 확인되었으며, 결과는 도 14 및 표 12에 기재되어 있다.

[표 12]

실시예 4 임상결과와 MRM 데이터 간의 연관성 확인

실시예 4-1 검출 여부에 따른 분류-1 (정상 대조군)

실시예 3에 기술된 바와 같이 정상 대조군 60명을 대상으로 MRM 분석을 수행한 결과, 표 13-1 내지 13-3에 나타난 바와 같이 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQK)는 60명 중 2명 (3.3%) 이 검출되었고, 비당화 펩타이드 (GYQELLEK)는 60명 중 7명 (11.7%) 이 검출 되었다. 이를 근거로 간암환자가 아닌 정상인을 정상인으로 구분할 수 있는 능력인 특이성(specificity)은 탈당화 펩타이드의 경우 96.7%, 비당화 펩타이드의 경우 88.3% 로 확인되었다.

[표 13-1]

[표 13-2]

[표 13-3]

실시예 4-2 검출 여부에 따른 분류-2 (HCC 그룹)

실시예 3에 기술된 바와 같이 HCC 60명을 대상으로 MRM 분석한 결과, 표 14-1 내지 14-3에 나타난 바와 같이 탈당화 펩타이드 (VDFTEIQK)는 60명 중 39명 (65.0%)이 검출되었고, 비당화 펩타이드 (GYQELLEK) 는 60명 중 32명 (53.3%)이 검출되었다. 이를 근거로 간암환자를 간암환자로 구분할 수 있는 능력인 민감도(sensitivity)는 탈당화 펩타이드의 경우 65.0%, 비당화 펩타이드의 경우 53.3%인 것으로 나타났다.

[표 14-1]

[표 14-2]

[표 14-3]

실시예 4-3 임상결과와 MRM 결과의 연관성

HCC 60명을 대상으로 병원 임상에서 사용되는 AFP 진단 키트 (Bioland; NanoSign AFP, 나노엔텍; AFP 정량키트) 를 제조자의 방법대로 사용해서 AFP 단백질 농도를 측정하였다 (임상결과). 이를 실시예 3에서 수득한 AFP 펩타이드를 MRM 기술로 측정한 결과(MRM data)와 서로 연관성이 있는지 여부를 확인한 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 AFP 단백질의 탈당화 펩타이드(VDFTEIQK)의 경우에는 R^2 값이 0.8368, 비당화 펩타이드(GYQELLEK)의 경우에는 R^2 값이 0.8868 로 확인되었고, 이는 AFP 단백질에 대한 임상결과와 MRM data 는 서로 양적인 상관관계가 있음을 나타내는 것이다.

나아가 진단 방법의 효율성을 판단하기 위해서 정상 대조군 60명, HCC 60명을 대상으로 ROC (Receiver-Operating Characteristic) 곡선을 작성하여 AUC (Area Under Curve) 값을 확인한 결과, 비당화 펩타이드(GYQELLEK)의 경우 AUC 값이 0.734 로 확인 되었지만, 탈당화 펩타이드(VDFTEIQK)의 경우에는 0.811인 것으로 나타났다.

이는 AFP 단백질로부터 기인된 2개의 비당화 및 탈당화 펩타이드 조합으로 logistic regression 모형을 이용하여 하나의 패널로 결합하는 분석을 수행한 결과, 정상인 60명 중 58명을 정상인으로 분류할 수 있지만, 2명을 간암 환자로 분류하였고, 간암 환자 60명 중 41명을 간암 환자로 분류할 수 있지만, 19명을 정상인으로 분류하여 정확도는 82.50 % 로 확인 되었다. 즉 하기 표 14에 나타난 바와 같이 비당화 펩타이드, 탈당화 펩타이드 그리고 상기 두 종류 펩타이드 패널로 AUC 값을 비교한 결과, 2-펩타이드 패널이 각각의 단일 펩타이드에 비해 정상인과 간암 환자를 구분하는 변별력(AUC=0.852) 이 크다는 것을 최종 확인하였다.

이는 PNGase-F/트립신이 처리된 환자의 혈액시료를 대상으로 AFP 단백질의 비당화 펩타이드 (GYQELLEK) 와 탈당화 펩타이드(VDFTEIQK)를 동시에 모니터링 함으로써 높은 정확도로 정상인과 간암 환자를 구분할 수 있음을 나타내는 것이다.

[표 15]

실시예 5 AFP 이외에 당단백질 마커 추가 발굴을 위해 MRM 분석 결과

실시예 2-5 에서 선별된 비당화 펩타이드에 해당되는 354개의 단백질, 1000개의 펩타이드와 탈당화 펩타이드에 해당되는 145개의 단백질, 182개의 펩타이드를 개별시료에 적용해서 군 간 차이를 보이는 단백질을 최종 표적 단백질 마커로 선정하였다.

분석 순서는 정상인 시료 1번, 간암 시료 1번, 정상인 시료 2번, 간암 시료 2번 순서로 각각 1번씩 교차로 분석을 진행했으며, 이를 통해서 얻어진 자료는 상술한 바와 같은 Skyline software 에 도입한 다음, MedCalc (version 12.2) 통계 프로그램을 통해서 분석했다. 이를 통해서 군 간 (정상인, 간암 환자)차이를 보이는 단백질 35개가 선정되었다: Alpha-2-antiplasmin (SERPINF2), Alpha-2-macroglobulin (A2M), Apolipoprotein B-100 (APOB), Beta-galactosidase (GLB1), Bone morphogenetic protein 1 (BMP1), Corticosteroid-binding globulin (SERPINA6), Complement factor H (CFH), Cholinesterase (BCHE), Clusterin (CLU), Collagen alpha-1(XII) chain (COL12A1), Carboxypeptidase N subunit 2 (CPN2), Versican core protein (VCAN), Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 (ERBB3), Coagulation factor V (F5), Coagulation factor XI (F11), Follistatin-related protein 1 (FSTL1), N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS), G-protein coupled receptor 126 (GPR126), Heparin cofactor 2 (SERPIND1), Hypoxia up-regulated protein 1 (HYOU1), Integrin alpha-2 (ITGA2), Integrin alpha-3 (ITGA3), Integrin alpha-6 (ITGA6), Integrin alpha-M (ITGAM), Integrin beta-2 (ITGB2), Plasma kallikrein (KLKB1), Kinectin (KTN1), Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 (LAMP2), Galectin-3-binding protein (LGALS3BP), Plexin-A1 (PLXNA1), Periostin (POSTN), Inactive tyrosine-protein kinase 7 (PTK7), Roundabout homolog 4 (ROBO4), Tenascin (TNC), 및 Vitronectin (VTN)

최종 표적 단백질 35개에 대해서 ROC 커브를 확인했다. ROC 커브는 민감도와 특이도가 서로 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면상에 표현한 것인데, ROC 커브 아래의 면적에 해당하는 AUC (area under curve) 값이 클수록 좋은 진단 방법이다. 해당 표적 단백질 35개에 대한 AUC 값은 하기 표 16-1 내지 16-3과 같고, ROC 커브 및 상호작용 플랏 그림은 모두 MedCalc (version 12.2) 통계 프로그램으로 작성하였으며, 도 17a 내지 도 17z와 도 18a 내지 도 18i에 기재되어 있다.

[표 16-1]

[표 16-2]

[표 16-3]

실시예 5 간세포암 마커의 정량 분석

간암 진단 방법의 효율성을 판단하기 위한 목적으로, 상기 실시예 4에서와 같이 발굴된 당단백질 마커 후보군에 대한 정상인 그룹과 간암 환자 그룹 간에 표준화된 탈당화 펩타이드 양과 표준화된 비당화 펩타이드 양을 인터랙트브 플랏(interactive plot)을 이용하여 비교하였다.

탈당화 펩타이드 양과 표준화된 비당화 펩타이드 양은 Liquid chromatography (LC) 는 Agilent 사의 1260 capillary LC system 을 사용하였고, 펩타이드 분리를 위해 Capillary RR 0.3 x 150, 3.5um (Cat.N 5064-8261) column 을 사용하였다.

펩타이드 시료는 5.0μl 를 트랩 컬럼을 거치지 않고 분석용 컬럼으로 바로주입이 되는 직접 방법으로 주입하였으며, 유속은 20L/min 으로 사용하였다. 컬럼은 SolA (97% 증류수, 3 vol% 아세토니트릴, 0.1 vol% 포름산)으로 10 분간 평형화 한 후 SolB (3% D증류수, 97% 아세토니트릴, 0.1% 포름산)로 45min 간, 5%에서 60%까지, 5분간 85%의 농도구배를 통해 펩타이드를 용출하였다.

질량 분석은 Agilent technology 사의 6490-Triple quadrupole(QQQ) 장비를 사용하였으며, 선정 단백질의 트랜지션은 MRM mode 로 모니터링하였다. 가스온도는200℃, 가스 유속은 14L/min 으로 사용하였으며, 분무기는 20psi, 쉬쓰(sheath) 가스 온도는 250℃, 쉬쓰 가스 유속은 11L/min 으로 사용하였다. 모세관 및 노즐 전압은 각각 3000V 로 사용하였다.

Quadruple 1(Q1)과 Quadruple 3 (Q3)에서의 해상도는 (0.7Da) unit 으로 설정하였으며, unscheduled MRM 방식으로 dwell time 은 총 주기가 2 sec 정도가 되도록 설정해서, 모든 표적 펩타이드에 대해서 분석을 한 다음, 용출되는 retention time 을 선정하였고, 이를 근거로 window size 3min 으로 scheduled MRM 으로 3번 반복 분석을 진행하였다.

모든 개별 시료는 1회 분석을 수행하였으며 이를 통해서 얻어진 자료는 skyline software 에 도입 된 다음, 펩타이드의 트랜지션 면적 값으로 환산되었다. 각각의 표적 펩타이드는 내부 표준 펩타이드의 피크 면적으로 적정화 (normalization) 되어서 분석 되었다.

결과는 도 19a 내지 19z 및 도 20a 내지 20d에 기재되어 있다. 정상군과 HCC 군간 유의적인 차이(p-value < 0.05)를 보이는 표적 단백질에 대해서 ROC curve 및 Interactive plot 을 확인했고, 개별 시료 분석 결과, 정상군과 HCC 군 간에 유의적인 차이 (p-value<0.05) 를 보이면서, AUC 값 0.7 이상인 당단백질 35개를 확인할 수 있었고, 여기에 해당되는 탈당화 펩타이드는 36개, 비당화 펩타이드는 56개로 확인되었다.

분석된 펩타이드의 간세포암 시료에서 발현량 증감여부는 다음 표 17-1 내지 17-3과 같다.

하기 표에서 붉은색으로 기재된 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드는 탈당화 펩타이드이고, 그 외는 비당화펩타이드를 나타낸다.

[표 17-1]

[표 17-2]

[표 17-3]

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질을 탈당화시키는 단계:
상기 탈당화 단계가 수행된 단백질을 단편화하는 단계;
상기 탈당화 및 단편화에 의해 생성된 펩타이드에 대하여, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양을 결정하는 단계; 및
상기 결정된 양을 근거로 상기 탈당화 단편에 대한 비당화 단편의 비를 결정하고, 이를 대조군의 수치와 비교하여, 그 비가 변동한 단백질을 암 마커로 선별하는 단계를 포함하는, 암 검출 또는 진단용 마커의 스크리닝 방법.
제 1 항에 있어서 상기 N-연결 당화 모티브는 AsnXxxSer, AsnXxxThr 또는 AsnXxxCys인, 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화는 Asn 잔기에서 발생되며, 그 결과가 생성된 펩타이드 단편은 AspXxxSer, AspXxxThr 또는 AspXxxCys인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 N-연결 당화 모티브 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 서열은 상기 각 펩타이드 단편에 특이적인 것으로, 소정의 당화 단백질 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 탈당화는 PNGase-F 처리에 의해 수행되는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단편화는 트립신, 라이신-C 또는 알지닌-C 또는 아스파르트산 N을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 N-연결 당화 (N-linked glycosylation) 모티브를 포함하는 단백질은 이를 포함하는 시료로 제공되며, 상기 시료는 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 소변, 뇌척수액, 난포액, 모유 및 췌장액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 N-연결 당화 모티브에서 탈당화가 된 펩타이드 단편의 양 및 상기 N-연결 당화 모티브를 포함하지 않는 비당화 펩타이드 단편의 양은 질량분석법 (Mass spectrometry)을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
제 8 항에 있어서, 상기 질량분석법은 액체크로마토그래피 질량분석법 (Liquid chromatography spectrometry, LC-MS) 인, 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피 질량분석법의 데이터는 SIM (Selected Ion Monitoring) 또는 MRM (Multiple reaction monitoring)을 이용하여 수득되는 것인, 방법.
Plexin-A1 (PLXNA1), Plasma kallikrein (KLKB1) 또는 Apolipoprotein B-100 (APOB) 중 하나 이상의 마커의 당화 검출용 시약을 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물.
제 11 항에 있어서,
상기 조성물은 하기 마커로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커의 당화 검출용 시약을 추가로 포함하는 것인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물: Alpha-2-antiplasmin (SERPINF2), Alpha-2-macroglobulin (A2M), Beta-galactosidase (GLB1), Bone morphogenetic protein 1 (BMP1), Corticosteroid-binding globulin (SERPINA6), Complement factor H (CFH), Cholinesterase (BCHE), Clusterin (CLU), Collagen alpha-1(XII) chain (COL12A1), Carboxypeptidase N subunit 2 (CPN2), Versican core protein (VCAN), Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 (ERBB3), Coagulation factor V (F5), Coagulation factor XI (F11), Follistatin-related protein 1 (FSTL1), N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS), G-protein coupled receptor 126 (GPR126), Heparin cofactor 2 (SERPIND1), Hypoxia up-regulated protein 1 (HYOU1), Integrin alpha-2 (ITGA2), Integrin alpha-3 (ITGA3), Integrin alpha-6 (ITGA6), Integrin alpha-M (ITGAM), Integrin beta-2 (ITGB2), Kinectin (KTN1), Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 (LAMP2), Galectin-3-binding protein (LGALS3BP), Periostin (POSTN), Inactive tyrosine-protein kinase 7 (PTK7), Roundabout homolog 4 (ROBO4), Tenascin (TNC) 및 Vitronectin (VTN).
삭제
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 각 마커의 당화 검출용 시약은 상기 각 마커의 탈당화 및 비당화 펩타이드의 질량분석에 사용되는 시약인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 각 마커는 표 17-1 내지 17-3에 개시된 탈당화 및 비당화펩타이드를 포함하며, 상기 검출은 상기 탈당화펩타이드의 양, 상기 비당화펩타이드 양 또는 상기 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양의 비 중 하나 이상의 검출인 것인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물.
제 15 항에 있어서,
상기 마커 중 SERPINF2, SERPINA6, CLU, COL12A1, ERBB3, F11, FSTL1, ITGA2, KLKB1, LAMP2, LGALS3BP, PLXNA1은 탈당화펩타이드의 양으로 검출되고,
상기 마커 중 AM2, GLB1, BMP1, BCHE, GNS, GPR126, SERPIND1, ITGA6, ITGAM, ITGB2, KTN1, PTK7, ROBO4 및 VTN은 비당화펩타이드의 양으로 검출되고,
상기 마커 중 APOB, CFH, CPN2, VCAN, F5, HYOU1, ITGA3, POSTN 및 TNC는 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양의 비로 검출되는 것인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
상기 조성물은 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, 질량분석 및 MRM 분석용, 마이크로어레이용, 또는 면역분석용인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물.
간세포암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체의 생물학적 시료로부터 Plexin-A1 (PLXNA1), Plasma kallikrein (KLKB1) 또는 Apolipoprotein B-100 (APOB) 중 하나 이상의 마커의 당화수준을 결정하는 단계;
상기 당화수준의 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 검출결과에 변동이 있는 경우, 이를 간세포암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간세포암 마커를 검출하는 방법.
제 18 항에 있어서,
상기 방법은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커의 당화수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법: Alpha-2-antiplasmin (SERPINF2), Alpha-2-macroglobulin (A2M), Beta-galactosidase (GLB1), Bone morphogenetic protein 1 (BMP1), Corticosteroid-binding globulin (SERPINA6), Complement factor H (CFH), Cholinesterase (BCHE), Clusterin (CLU), Collagen alpha-1(XII) chain (COL12A1), Carboxypeptidase N subunit 2 (CPN2), Versican core protein (VCAN), Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 (ERBB3), Coagulation factor V (F5), Coagulation factor XI (F11), Follistatin-related protein 1 (FSTL1), N-acetylglucosamine-6-sulfatase (GNS), G-protein coupled receptor 126 (GPR126), Heparin cofactor 2 (SERPIND1), Hypoxia up-regulated protein 1 (HYOU1), Integrin alpha-2 (ITGA2), Integrin alpha-3 (ITGA3), Integrin alpha-6 (ITGA6), Integrin alpha-M (ITGAM), Integrin beta-2 (ITGB2), Kinectin (KTN1), Lysosome-associated membrane glycoprotein 2 (LAMP2), Galectin-3-binding protein (LGALS3BP), Periostin (POSTN), Inactive tyrosine-protein kinase 7 (PTK7), Roundabout homolog 4 (ROBO4), Tenascin (TNC) 및 Vitronectin (VTN).
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 각 마커는 표 17-1 내지 17-3에 개시된 탈당화 및 비당화펩타이드를 포함하며, 상기 검출은 상기 탈당화펩타이드의 양, 상기 비당화펩타이드 양 또는 상기 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양의 비 중 하나 이상의 검출인 것인, 간세포암 마커를 검출하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 마커 중 SERPINF2, SERPINA6, CLU, COL12A1, ERBB3, F11, FSTL1, ITGA2, KLKB1, LAMP2, LGALS3BP, PLXNA1은 탈당화펩타이드의 양으로 검출되고, 상기 마커 중 AM2, GLB1, BMP1, BCHE, GNS, GPR126, SERPIND1, ITGA6, ITGAM, ITGB2, KTN1, PTK7, ROBO4 및 VTN은 비당화펩타이드의 양으로 검출되고, 상기 마커 중 APOB, CFH, CPN2, VCAN, F5, HYOU1, ITGA3, POSTN 및 TNC는 탈당화 펩타이드 대 비당화펩타이드 양의 비로 검출되는 것인, 간세포암 마커를 검출하는 방법.
제 20 항에 있어서, 상기 탈당화 펩타이드 또는 상기 비당화 펩타이드의 양은 MRM (Multiple Reaction Monitoring)을 이용한 액체크로마토그래피 질량분석법으로 측정되는 것인, 간세포암 마커를 검출하는 방법.