KR101859812B1 - 간암 화학 색전술 치료 예후 예측을 위한 바이오마커 및 그 용도 - Google Patents

간암 화학 색전술 치료 예후 예측을 위한 바이오마커 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 간암 진단에 관한 것으로, 특히 간암 화학색전술(TACE) 예후 진단용 바이오마커에 관한 것이다. 본원에 따른 바이오마커는 MRM 기술을 이용하는 것으로, 높은 정확도와 민감도 및 짧은 시간에 다수의 스크리닝이 가능한 화학색전술 예후를 예측할 수 있다.

Description

간암 화학 색전술 치료 예후 예측을 위한 바이오마커 및 그 용도 {Biomarkers to predict TACE treatment efficacy for hepatocellular carcinoma}
본원은 간암 진단에 관한 것으로, 특히 간암 화학색전술(TACE) 예후 진단용 바이오마커에 관한 것이다.
간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 성인 간암에서 가장 흔한 유형으로, 암으로 인한 사망원인 중 세 번째를 차지한다 (Stefaniuk P, et al., 2010, World J Gastroenterol 16: 418-424). HCC는 상당히 진행 되서야 증상이 나타나는 질환으로 이로 인해 적절한 치료시기를 놓치는 경우가 빈번하고, 치료를 하는 경우도 예후가 극히 나쁘다. 특히 수술로 절제가 불가능한 경우는 1년 내 사망하는 심각한 질환으로, 진단방법이 개선이 될 경우, 치료에 있어서는 상당한 개선이 기대된다.
현재 임상에서 간세포암은 간초음파와 같은 영상 검사와 혈청 알파태아단백 (Alpha fetoprotein, AFP)의 검출로 진단된다. 하지만 혈청 AFP는 간세포암이외에 급성 또는 만성 간염과 같은 비간세포암, 또는 양성종양에서도 농도가 증가하기 때문에, 간세포암에 대한 특이성과 민감도가 낮은 편이다. AFP는 전체적으로 약 66%의 민감도와 82%의 특이도를 갖는 것으로 알려져 있어 모든 간암 환자를 진단하는 데에 제한이 있다. 현재 임상에서 간세포암은 영상 검사에서 특이적인 소견을 보이고 혈청 알파태아단백 (Alpha fetoprotein, AFP)이 200 (또는 400) ng/mL 이상으로 상승하는 것으로 진단하고 있다.
간암의 예후는 극히 나쁘고, 치료 가능성은 간질환의 중증도 및 간질환의 간 내부로의 확장에 의해 제한된다. 외과적 절제술 또는 간 이식이 종양 및 기타 중증 간질환에 대한 유일한 치료법이다. 하지만 이러한 치료는 서양 국가들에서 5% 미만의 사례를 나타내는 비-간경병성 환자에게만 적용가능하다. 이러한 상황에서 가장 유망한 두 가지 치료 접근법은 동맥내(intra-arterial) 또는 종양내(intra-tumoral) 대사성 방사선치료 및 리피오돌(Lipiodol)에 의한 동맥 화학색전술(chemoembolization)이다 (Gastrointest Cancer Res. 2011 Jan-Feb; 4(1): 2-8. “Transarterial Chemoembolization With Doxorubicin-Eluting Microspheres for Inoperable Hepatocellular Carcinoma”).
대사성 방사선치료는 다수의 암, 특히 간암의 치유성 또는 일시적인 치료에 널리 사용된다. 간 종양의 대사성 방사선치료는 주로 간동맥을 통해 수행된다. 건강한 간은 간문맥 및 간동맥을 통해 동시에 혈액 및 산소가 공급된다. 그러나, 혈관이 풍부하게 발달된 종양은 본질적으로 간동맥을 통해 공급되며, 한편 공급물의 최대 80%는 건강한 조직에 간문맥을 통해 이루어진다. 대사성 방사선치료의 성능을 향상시키기 위해 동맥 화학색전술이 개발되었다. 이 기술은 색전증을 유발하는 입자와 결합된 화학치료 물질을 함유하는 혼합물을 환자의 간동맥에 주사하여 종양에 대한 혈류를 차단한다. 현재 화학색전술은 반복적인 TACE (Trans Arterial Chemo Embolization)를 시행하고 있으며, 이들 중 일부는 TACE 불응성 (TACE refractoriness) 임에도 불구하고 불필요하게 TACE 를 반복하게 된다. 어떤 환자들이 TACE 불응성 (TACE refractoriness) 해당되는지 명확한 임상적 정의가 없는 상태이다. 또한 반복적인 색전술 이후 다발성 또는 침윤성 간암의 형태로 변하면서 예후가 불량해지는 경우 등 다양한 임상 양상을 보인다.
대한민국 공개특허 2011-0101119호는 간암에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것으로, 간암 진단 마커인 NK4 등의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 간암을 진단 및 예후를 측정할 수 있는 진단 키트 및/또는 이를 이용한 간암의 진단 및 예후 측정 방법을 개시한다. 그러나 이는 간암 여부 판정을위한 마커이다.
따라서 간암 화학색전술 치료예후를 예측할 수 있는 신뢰도 높은 진단 방법이 필요하다.
본원에서는 간암화학색전술(TACE) 예후 진단용 바이오마커를 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 A2GL (Leucine-rich alpha-2-glycoprotein), CO2 (Complement C2), LBP (Lipopolysaccharide-binding protein), C4BPA (C4b-binding protein alpha chain), IPSP (Plasma serine protease inhibitor), AACT (Alpha-1-antichymotrypsin), CO5 (Complement C5), C4BPB (C4b-binding protein beta chain), FCN3 (Ficolin-3), SAMP (Serum amyloid P-component), CRP (C-reactive protein), LG3BP (Galectin-3-binding protein), THBG (Thyroxine-binding globulin), CHLE (Cholinesterase), CO7 (Complement component C7), FETA (Alpha-fetoprotein) 및 ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 간암 화학색전술 치료 예후 예측용 바이오마커 또는 그 용도를 제공한다.
일 구현예에서는 상기와 같은 어느 하나 이상의 바이오마커에 대한 검출 시약을 포함하는, 간암화학색전술 치료 예후 예측용 조성물을 제공한다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 하나 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 예를 들면 CHLE 및 ITIH4; C4BPA, CHLE, CO7, FCN3 및 SAMP; A2GL, SAMP, CO7, CHLE, 및 FCN3의 조합으로 사용될 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본원에 따른 마커는 단백질 및/또는 핵산 수준에서 검출될 수 있으며, 단백질 또는 핵산수준에서의 검출을 위해 당업계의 공지된 방법이 사용될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 간암화학색전술 치료에 대한 예후를 예측하기 위해 인비트로에서 본원에 따른 하나 이상의 마커를 검출하는 방법을 제공한다.
일 구현예에서 이러한 방법은 간암화학색전술 치료에 대한 예후 예측을 위한 정보를 제공하기 위하여, 검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 본원에 따른 하나 이상의 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출결과를 대조군 값과 비교하는 단계; 및 상기 대조군 값과 비교하여, 상기 대상체 유래의 시료의 핵산 또는 단백질의 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질의 존재여부에 변화가 있는 경우, 상기 대상체는 간암화학색전술에 대한 반응이 없을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.
본원에 따른 마커는 조합으로 사용될 수 있으며 예를 들면 HLE 및 ITIH4; C4BPA, CHLE, CO7, FCN3 및 SAMP; A2GL, SAMP, CO7, CHLE, 및 FCN3의 조합을 포함한다.
본원에 따른 마커는 비마커 임상정보와 함께 사용될 수 있으며, 예를 들면 알부민, 프로트롬빈 시간, 크레아틴 농도, 혈소판 개수, ALT 농도, 빌리루빈 농도, 종양 또는 병변의 개수, 종양크기, AFP 농도, 및 PIVKA-II 농도 중 하나 이상을 포함 할 수 있다. 일 구현예에서는 종양 또는 병변의 개수 및 PIVKA-II 농도와 함께 사용될 수 있다.
본원에 따른 바이오마커는 단독 또는 조합 또는 비바이오마커 임상정보와 조합의 사용을 통해 비침습적으로 높은 정확도와 민감도로 신속하게 다수의 스크리닝이 가능한 화학색전술 예후를 예측할 수 있다.
도 1은 본원의 마커 발굴에 사용된 기술인 MRM 기술 모식도를 나타낸다.
도 2a 내지 2e는 MRM 분석에서 차이를 나타낸 대한 단백질에 대한 웨스턴블랏을 수행한 결과, AUC > 0.7 로 검출된 4개 단백질 (A2AP, FINC, ITIH1, ITIH4) 에 대한 결과를 나타내며, 이 중 ITIH1은 2회의 독립적인 시료에 대한 웨스턴블랏 실험에서 높은 AUC (각 1, 0.951)을 나타냈다.
도 3a 및 3b는 본원에 따른 5개의 단백질 마커 패널, 임상정보 패널 및 단백질 마커와 임상정보 패널이 조합으로 이루어진 앙상블 모델 패널을 이용한 AUC 수치를 분석한 결과로, 도 3a는 training set (1차 set)에 적용한 결과이고 도 3b는 validation set (2차 set) 실제 시료에 적용한 결과이다.
도 4는 본원에 따른 앙상블 패널의 TNM (Tumor-nodes-metastasis)에 따른 민감도를 분석한 결과이다.
본원은 TACE 불응성 (TACE refractoriness) 또는 반응성을 판단할 수 있는 바이오마커의 발견을 근거로 한 것이다.
따라서 한 양태에서 본원은 A2GL, CO2, LBP, C4BPA, IPSP, AACT, CO5, C4BPB, FCN3, SAMP, CRP, LG3BP, THBG, CHLE, CO7, FETA, 및 ITIH4 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 간암 화학색전술 치료 예후 예측용 바이오마커 또는 그 용도에 관한 것이다.
일 구현예에서 본원은 A2GL, CO2, LBP, C4BPA, IPSP, AACT, CO5, C4BPB, FCN3, SAMP, CRP, LG3BP, THBG, CHLE, CO7, FETA, 및 ITIH4 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커에 대한 검출 시약을 포함하는, 간암화학색전술 치료 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.
간암의 화학색전술 (Trans-Arterial Chemo Embolization; TACE)은 색전증을 유발하는 입자와 결합된 화학치료 물질을 함유하는 혼합물을 환자의 간동맥에 주사하여 종양에 대한 혈류를 차단하여, 간암을 치료하는 기술이다. 현재 화학색전술은 반복적으로 수행되나, 이들 중 일부는 TACE 불응성 (TACE refractoriness) 임에도 불구하고 불필요하게 TACE를 반복하게 된다. 어떤 환자들이 TACE 불응성 (TACE refractoriness) 해당되는지 명확한 임상적 정의가 없는 상태이다. 또한 반복적인 색전술 이후 다발성 또는 침윤성 간암의 형태로 변하면서 예후가 불량해지는 경우 등 다양한 임상 양상을 보이므로, TACE 치료전에 반응성 여부를 판별하는 것이 중요하다.
본원에 따른 바이오마커는 단독 또는 조합으로 사용되어 간암의 진행단계와 무관하게 TACE의 치료가 필요한 환자에서 TACE에 대하여 반응할지 여부를 판별 할수 있는 것으로 대조군으로는 정상인, TACE 불응자로 판단된 대상체, 또는 간염, 간경화 또는 간암으로 치료 후 완치된 환자 (간경화 유지)가 사용될 수 있으며, 이들 검체와 비교하여 시료 특히 혈액에서의 농도 변화를 나타내는 단백질, 상기 단백질 유래의 폴리펩타이드, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 포함한다.
본원에 따른 바이오마커는 대조군의 시료와 비교하여, A2GL, CO2, LBP, C4BPA, IPSP, AACT, CO5, C4BPB, FCN3, SAMP, CRP, LG3BP, THBG, CHLE, CO7, FETA, 및 ITIH4 의 각 마커에 대하여, TACE 불응성 환자군에서 발현량이 증가되는 단백질은 A2GL, CO2, LBP, C4BPA, AACT, CO5, C4BPB, FETA, SAMP, CRP, LG3BP, THBG, CO7, 및 ITIH4 감소되는 단백질은 IPSP, CHLE, 및 FCN3이다.
이러한 본원에 따른 바이오마커의 단백질 및 핵산 서열은 예를 들면 표 1-1 및 1-2에 기재된 ID로 UniProt DB (www.uniprot.org)에서 검색가능하다.
본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개의 조합으로 사용될 수 있으며, 기존의 마커 예를 들면 AFP, 및/또는 진단방법 예를 들면 간초음파 등과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.
본원에 따른 일 구현예에서는 하나의 마커 A2GL (AUC 0.708), FCN3 (AUC 0.662), SAMP (AUC 0.66), CHLE (AUC 0.636), CO7 (AUC 0.635)가 사용되며, 괄호안은 해당마커의 AUC 수치이다.
본원에 따른 다른 구현예에서 CHLE 및 ITIH4 (AUC 0.726); C4BPA, CHLE, CO7, FCN3 및 SAMP (AUC 0.857); 또는 A2GL, SAMP, CO7, CHLE, 및 FCN3 가 조합으로 사용되며, 높은 AUC 값으로 TACE에 대한 반응성을 예측할 수 있다.
본원에 따른 바이오마커는 TACE에 대한 반응성 예측을 위해 비마커 임상 정보와 함께 사용될 수 있다.
비마커 임상정보는 본원에 따른 바이오마커 이외의 간암의 진단, 및/또는 예후 및/또는 치료효과, 호전여부 및/또는 진행상태 모니터링 및/또는 간기능 검사를위해 임상에서 사용하는 생물학적 시료에서 측정한 정보로 알부민, 프로트롬빈 시간, 크레아틴 농도, 혈소판 개수, ALT (Alanine Aminotransferase) 농도, 빌리루빈 농도, 종양 또는 병변의 개수, 종양크기, AFP (Alpha Feto Protein) 농도, 및 PIVKA-II (Protein Induced by Vitamin K absence/antagonist-II) 농도 중 어느 하나를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다. 상기와 같은 비마커 임상정보를 측정하는 기술은 당업계에 알려진 것으로 예를 들면 BMC Res Notes. 2013 Sep 11;6:365. doi: 10.1186/1756-0500-6-365 “Variable selection methods for developing a biomarker panel for prediction of dengue hemorrhagic fever”, BMC Genomics. 2015 Oct 6;16(1):752. doi: 10.1186/s12864-015-1935-0 “Combined clinical and genomic signatures for the prognosis of early stage non-small cell lung cancer based on gene copy number alterations”를 참고할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서, 본원에 따른 마커는 종양 또는 병변의 개수, AFP 농도 및/또는 PIVKA-II 농도와 함께 사용된다.
본원에 따른 바이오마커는 상기 비마커 임상정보와 함께 사용시, 비마커 임상정보만이 사용되었을 경우와 비교하여 AUC 값이 증가하여, 보다 정확한 예측이 가능하다.
본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 단백질 및/또는 mRNA의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.
본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
이러한 본원에 따른 마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.
다른 구현예에서 본원에 따른 마커의 검출은 마커 단백질 유래의 상응하는 펩타이드가 사용될 수 있으며, 예를 들면 다음과 같다: A2GL: ENQLEVLEVSWLHGLK, A2GL: DLLLPQPDLR, AACT: DEELSCTVVELK, AACT: ADLSGITGAR, C4BPA: YTCLPGYVR, C4BPB: ALLAFQESK, CHLE: IFFPGVSEFGK, CHLE: YLTLNTESTR, CO2: GALISDQWVLTAAHCFR, CO5: NADYSYSVWK, CO5: GGSASTWLTAFALR, CO7: LSGNVLSYTFQVK, CO7: VLFYVDSEK, CRP: ESDTSYVSLK, FCN3: YGIDWASGR, FETA: GYQELLEK, IPSP: AVVEVDESGTR, ITIH4: ILDDLSPR, ITIH4: GPDVLTATVSGK, LBP: ITLPDFTGDLR, LG3BP: ELSEALGQIFDSQR, LG3BP: SDLAVPSELALLK, SAMP: AYSLFSYNTQGR, SAMP: IVLGQEQDSYGGK, THBG: NALALFVLPK, THBG: GWVDLFVPK. 상기 각 펩타이드는 각 아미노산에 해당하는 단문자로 표시되었다.
즉 상술한 바와 같은 각 마커별로 상응하는 펩타이드의 검출을 통해 수행될 수 있다. 하나의 단백질에 대하여 하나 또는 두 개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있다.
이런 측면에서 본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 다양한 방식으로 정량적 또는 정성적 분석을 통해 검출할 수 있는 시약이다.
본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에는 공지된 단백질 또는 핵산을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.
단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합, 질량분석기 또는 항체를 이용한 단백질어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.
또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 방법, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.
이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 마커를 검출할 수 있으며, 이는 검체로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링 (Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.
도 1은 MRM 기술의 모식도로, 특정 peptide의 Q1 m/z 만을 통과시켜서 filter 역할을 수행하는 Quadruple 1 (Q1), Q1 필터를 통과한 precusor ion을 전기적인 에너지에 의해 fragmentation이 일어나 product ion으로 분해 되도록 하는 Quadruple 2 (collision cell), 및 Quadruple 1 (Q1)과 같이 필터 역할을 수행해서 특정 product ion만을 통과시키는 Quadruple 3 (Q3)로 이루어져 있다. Quadruple 3 (Q3)를 통과한 ion은 detector에서 digital signal로 전환되어 peak chromatogram 으로 보여지게 되며, 이 peak의 면적을 분석하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행할 수 있게 된다. 본원의 Multiple reaction monitoring (MRM) 기술은 환자를 진단하고 치료하는 병원 영역으로 도입해서 실제 바이오마커를 이용한 TACE 반응 예측에 사용할 수 있다.
다른 구현예에서는 각 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA와 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용된다.
또 다른 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 3H 또는 125I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.
다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.
이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.
본원의 마커는 또한 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량적 및/또는 정성적으로 검출될 수 있다.
핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다. 또한 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.
상기 핵산 수준에서의 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍을 포함한다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.
본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 검출에 사용되는 구체적 방법에 따라 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.
본원의 조성물은 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.
상술한 바와 같은 다양한 검출시약을 포함하는 본원의 조성물은 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용 키트, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.
일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인식하는 항체가 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT (Point of Care Test) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료에 담그면, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 마커를 검출하는 것이다.
다른 구현예에서는 펩타이드를 근간으로 하는 MRM 키트가 제공되며, MRM 방식에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다. MRM 방법은 특정 단백질을 선택적으로 인식하는 펩타이드를 이용하는 것으로, 온도, 습도 등 환경에 민감한 항체를 이용하는 기존의 방법과 비교하여, 보다 안정적으로 생체시료에서 마커를 검출할 수 있다. 예를 들면 펩타이드는 상술한 바와 같이 기재된 것이 사용될 수 있으며, 하나의 마커에 하나 또는 두 개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 기질의 표면에 검출시약이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 어레이에 부착될 수 있는 검출시약은 예를 들면 한 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.
다른 양태에서 본원은 바이오마커의 검출시약을 포함하는 TACE 반응 예후 예측용 키트 또는 시스템에 관한 것이다. 검출 시약 및 이러한 시약이 사용되는 방법은 상술한 바와 같다. 이러한 본원의 마커를 검출할 수 있는 시약은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커 검출시약을 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다. 또한 키트는 사용안내서를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 간암화학색전술 치료에 대한 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여, 검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 본원에 따른 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계를 포함하는 TACE 반응 예후 예측 바이오마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 추가로 본원에 따른 바이오마커의 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출결과를 대조군 값과 비교하는 단계; 및 상기 대조군 값과 비교하여, 상기 대상체 유래의 시료의 핵산 또는 단백질의 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질의 존재 여부에 변화가 있는 경우, 간암화학색전술에 대한 반응이 없을 것으로 예측하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 따른 방법에서 TACE 반응 예후 예측을 위해 양성 대조군으로 사용될 수 있는 시료는 정상인, TACE 불응자로 판단된 대상체, 간염, 간경화 또는 간암으로 치료 후 완치된 환자 (간경화 유지) 유래의 시료가 사용될 수 있다.
본원에 따른 바이오마커는 대조군의 시료와 비교하여, TACE 불응성 환자군에서 A2GL, CO2, LBP, C4BPA, AACT, CO5, C4BPB, FETA, SAMP, CRP, LG3BP, THBG, CO7, 및 ITIH4 의 발현량은 증기되고, IPSP, CHLE, 및 FCN3는 발현량이 감소된다.
본원에서 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 체액, 특히 전혈, 혈장, 혈청 또는 뇨를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 생물학적 시료는 전혈, 혈청 또는 혈장이 사용된다.
본원에 따른 방법은 앞서 언급한 방법, 또는 검출 시약을 사용하는 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 특히 단백질 또는 핵산 마이크로어레이 분석법, 핵산증폭, 항원-항체 반응, 또는 질량분석 방식으로 실시될 수 있다.
본원의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 포함한다. 인간 대상체는 TACE 치료가 필요한 사람으로 예를 들면 간암, 간세포암이 발병했을 것으로 의심되는 사람, 간염, 간경화 환자 또는 간암으로 치료 후 완치된 환자 (간경화 유지) 를 포함한다. 본원에 따른 바이오마커는 간세포암의 진행단계와 상관없이, TACE의 치료가 필요한 환자에서 반응성 여부를 예측할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 생물학적 시료에서 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인비트로에서 검출하는 방법에 관한 것이며, 생물학적 시료, 바이오마커 검출 방법등은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 방법은 상기와 같은 본원에 따른 하나 이상의 바이오마커의 검출 이외의 비마커 임상정보를 추가로 포함할 수 있다. 비마커 임상정보와 관련되서는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
상술한 본원에 따른 방법을 사용하여 두 개 이상을 포함하는 마커의 조합을 사용하는 경우 프로파일, 즉 시료 중 마커 단백질 발현과 관련된 정량적 정보를 포함하는 데이터세트가 생성될 수 있다.
마커를 이용하여 프로파일을 수득한 후에, 참조군 또는 대조군과의 결과 비교를 통해 대상체의 시료의 TACE 반응성 여부를 판별한다. 대조군 또는 참조군으로는 음성 대조군 및 양성 대조군은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 정상인 유래의 시료, 간세포암으로 판정 후 치료를 받은 환자 유래의 시료가 대조군 또는 참조군으로 사용되어, 수득 된 프로파일의 비교에 사용된다.
대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교, 또는 U.S. 특허 6,308,170 및 6,228,575에 기재된 것을 참조할 수 있다.
본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득 된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 예로는 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Ben-Dor et al (2007, J. Comput. Biol. 7: 559-83), Nguyen et al (2002, Bioinformatics 18:39-50), Wang et al (2003, BMC Bioinformatics 4:60), Liu et al (2001, Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform.12:14-23), Yeang et al (2001, Bioinformatics 17 Suppl 1:S316-22) 및 Xiong (2000, Biotechniques 29(6):1264-8, 1270) 등을 포함하는 문헌을 참조할 수 있다.
또한 본원의 마커를 통하여 검출된 결과가 TACE 반응 예측에 유의한 것으로 판정하기 위해 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일 구현예에서는 logic regression 방법이 사용되며, Ruczinski, 2003, Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512를 참조할 수 있다. 상기 방법은 클래시파이어가 바이너리 트리로 제시되는 CART 방법과 유사하나, 각 노드는 CART에 의해 생성되는 "and" 연산자와 비교하여 보다 일반적인, 특성과 관련된 불린(Boolean) 연산자가 사용된다. 다른 분석 방법의 예로는 nearest shrunken centroids (Tibshirani. 2002 PNAS. 99:6567-72), random forests (Breiman. 2001. Machine Learning 45:5-32 및 MART (Hastie. 2001. The Elements of Statistical Learning, Springer)을 들 수 있다.
일 구현예에서, 통계처리를 통해 TACE 반응 또는 불응 여부를 예측하기 위해 대상체 시료와 대조군 간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 원 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다.
이러한 통계적 분석 방법은 바이오마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 임상 시료 수집
마커 후보군 선정을 위해 간암 데이터 베이스 (LiverAtlas) 내의 간암 특이적 단백질 및 질병 연관도가 높은 단백질들을 선정하여 혈액 내 관측 가능성을 확인하기 위하여 이전 연구에서 사용된 간암 환자 60명의 집합시료를 사용하였다. 시료는 TACE 시술 직전에 채혈하였다. mRECIST (modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) 기준으로 TACE 시술 후 6개월 경과 시점에서의 간암 병변 크기를 기준으로 반응 여부를 판단하였다. 간암 병변이 모두 사라진 complete response (CR)은 Good responder group으로 선정하였으며, 그 외 partial response (PR), stable disease (SD), progressive disease (PD) 환자는 Poor responder group 으로 구분하였다. 제1 시료군은 각 군당 10명씩 선정하여 비교분석하였으며, 여기서 차이를 보인 단백질들에 대해서 제2 세트 군 당 50명, 그리고 제3 세트 군당 40명의 TACE 시술 환자를 사용하여 검증하였다. 이때 제2 시료 중 일부를 사용하여 웨스턴블랏을 이용하여 항체 검증을 진행하였다.
실시예 1-1 혈청 시료 수집
임상 시료 샘플링을 위해 BD Vacutainer serum separation tube (BD, USA) 를 이용하여 채혈하였다. (Silica clot activator, 10 mL, 16 X 100 mm, Product number #367820) 채혈된 혈액에 Phenylmethyl Sufonyl Fluoride (PMSF)를 최종 1.0 mM 되도록 첨가 하였다. 10회 정도 시험관을 뒤집는 방식으로 섞은 후 3000 rpm 에서 10 min 간 원심분리 (4℃ 유지) 하였다. 원심분리 후 상층액(색깔 관찰 후, Hemolysis 된 reddish sample 은 사용불가)을 수득하고, 1.5 mL 튜브에 100 μL 씩 분주하였다. 분주된 각 시료 군에 해당하는 code 로 기입 (예: NC-01, MC-01, PD-01…)하여, -80℃에 사용시까지 보관하였다. 상기 절차는 모두 얼음위에서 실시하였으며 채혈 후 1시간 이내에 모두 종료하였다.
실시예 1-2 혈청 단백질 소거
혈액 내에 저농도로 존재하는 마커의 발굴을 위해 고농도로 존재하는 6종 (albumin, IgG, IgA, haptoglobin, transferrin, alpha-1-antitrypsin)의 단백질을 제거하는 소거과정을 수행하였다. 상기 6개의 고농도 단백질 제거를 통해서, 혈액 중 총 단백질 중 질량기준으로 85% 정도가 제거 되고, 나머지 15% 단백질 질량에 해당되는 단백질만 남게 되어 이를 분석에 사용하였다.
실시예 1-3 혈청 단백질 펩타이드화 과정
소거 과정 후 얻어진 혈청 시료는 농축 (w/ 3K filter)한 다음, BCA (Bicinchoninic acid) assay 방식으로 단백질 농도를 정량하였다. 100μg 혈청 시료를 취한 다음, 최종 농도 6M urea/20mM DTT 처리 (Tris pH 8.0) 한 다음, 37℃에서 60분 동안 반응을 진행하였다. 최종 농도 50mM IAA 처리 한 다음, 상온에서 30분 동안 반응을 진행하였다. Urea의 농도가 0.6M 이하가 되도록 100mM Tris pH 8.0 처리하였으며, 트립신과 혈청 농도 비율이 1:50 이 되도록 트립신을 처리 후, 37℃에서 16시간 동안 반응을 진행하였다. 이어 포름산 용액을 최종농도 5% 가 되도록 처리한 다음, 탈염 과정을 시행하였다.
실시예 1-4 혈청 단백질 탈염
OASIS 컬럼을 60% ACN / 0.1% formic acid 1mL 로 3번 흘려줘서 활성화하였다. 이어 OASIS 컬럼에 0.1% 포름산 1mL을 5회 흘려주어 평형화를 수행하였다. 이어 실시예 1-3에서 준비한 펩타이드를 시료를 로딩하고, 0.1% 포름산 1mL를 5회 흘려줘서 세척하였다. 40% ACN/0.1% 포름산 1mL과 60% ACN/0.1% 포름산 1mL로 처리해서 펩타이드를 용출하였다. 1시간 이상 -70℃ 에서 냉동한 후, speed-vac 으로 건조하였다. 건조된 펩타이드 시료는 Sol A buffer (3% ACN / 0.1% formic acid) 50 μL 에 녹인 다음, 15,000 rpm 에서 60 min 동안 원심분리 하고, 이 중에서 40μl 만 바이알에 옮겨서 분석을 수행하였다.
실시예 2 타겟 후보군 선정
기존 임상 연구등에서 현재 간암 마커로 사용되는 AFP, PIVKA-II (protein induced by vitamin K absence or antagonist-II) 등을 이용하여 치료 예후 예측을 하기 위한 연구가 진행 중이다. 이를 기반으로 본원은 현재 간 질환과 관련된, 가장 포괄적인 정보를 제공하는 LiverAtlas database 를 이용하여 간 또는 간암 특이적인 단백질 및 간 관련 질병 연관 단백질 등을 치료 예후 마커 후보군으로 선정하였다. LiverAtlas database 상에서 간 질병 또는 간암과 관련성이 높다고 알려진 단백질은 총 27,568개인데, 이 중에서 혈액 내에서 검출 가능한 단백질만을 선정하기 위해, 혈액 내로 분비되거나 분비될 가능성이 있는 단백질 (Uniprot database 기준) 만을 선별한 결과, 총 948개 단백질이 선정되었다. 최종질량 분석 장비로 검출이 가능한 단백질만을 선정하기 위해서 4개의 서로 다른 peptide MS/MS library source (NIST Ion-Trap, NIST Q-TOF, ISB human plasma, Home made library)를 이용해서 peptide MS/MS data 가 존재하는 단백질만을 선정한 결과, 총 572개 단백질이 최종 선정되었다.
실시예 3 검출 가능한 타겟 후보군 선정
실제, 질량분석 장비로 검출이 가능한 타겟 만을 선정하기 위해서 간암 환자 60명의 시료를 합한 시료를 대상으로, MRM(multiple reaction monitoring) 분석을 통해 신호가 제대로 검출되는 펩타이드 만을 측정하였다. 측정된 결과값을 mProphet software 를 사용하여 분석하였으며, FDR 0.1% cut-off 기준으로 63개의 단백질이 검출 가능한 것으로 확인 되었고 추가적으로 manual selection 을 통하여 41개의 단백질을 추가 선정하였다. 총 104개 단백질, 이로부터 유래된 총 175개 펩타이드를 타겟 후보군으로 선정하여 JPT (USA)사를 통하여 정제되지 않은 정제되지 않은 중표지 펩타이드를 합성하였다.
실시예 4 정량 가능성 검증
선정된 104개 단백질, 175개 펩타이드를 대상으로 재현성 있게 검출 가능하며, interference signal 에 영향이 없는지 확인하기 위하여 집합시료를 가지고 합성된 펩타이드 50-fmol 과 함께 주입하여 AuDIT 분석 (Mol Cell Proteomics. 2014 Apr;13(4):1137-49. doi: 10.1074/mcp.M113.034660. Epub 2014 Feb 11. “Simplified and efficient quantification of low-abundance proteins at very high multiplex via targeted mass spectrometry”, Methods. 2013 Jun 15;61(3):299-303. doi: 10.1016/j.ymeth.2013.05.008. Epub 2013 May 23. “Detection and correction of interference in SRM analysis”) 을 진행하였다.
AuDIT 분석을 통하여 175개 펩타이드 중 162개 펩타이드에 대해서 3개 이상의 transition 이 interference signal 영향 없이 재현성있게 검출되는 것을 확인하였다. 검출된 162개 펩타이드에 대하여 calibration curve를 작성하였으며, 이를 통하여 89개 단백질, 147개 펩타이드가 실제 혈액 내 존재하는 범위까지 정량 가능함을 확인하였다.
실시예 5 소규모 시료를 이용한 단백질 마커 도출
치료 예후 마커 발굴을 위한 프리스크리닝(prescreening)을 위해 정량성을 확보한 89개 단백질에 대하여 1차 세트 (각 group 당 10명)를 이용하여 개별 시료 MRM 분석을 진행하였다. 모든 시료들은 3회 반복 분석되었으며, 분석된 결과는 MSstats 통계 프로그램으로 증감 및 유의적인 차이 등을 확인 하였다.
Fold-change > 1.1 또는 < 0.9 이며, adjust p-value가 0.01 이하로 검출 된 61개 단백질 (uniprot ID : IPSP, CHLE, PROZ, FCN3, APOA4, LCAT, PGRP2, IBP3, A2AP, ALS, APOC3, CXCL7, FINC, KLKB1, KAIN, PON1, MBL2, IGF2, RET4, C1QB, ANT3, APOA1, C1QC, FETUA, APOF, ITIH1, BTD, ZA2G, THRB, A2MG, APOL1, ITIH2, CPN2, PVR, CFAH, AACT, APOC1, ITIH4, IGHG3, APOE, IC1, LG3BP, CO2, CO5, C4BPB, CO7, ITIH3, FETA, C4BPA, CO4A, A2GL, SEPP1, IGJ, LBP, FHR2, SAMP, THBG, FIBG, FIBA, FIBB, CRP)을 1차 마커로 확인 하였다(표 1-1 및 1-2).
[표 1-1]
Figure 112016021864103-pat00001
[표 1-2]
Figure 112016021864103-pat00002
실시예 6 항체 검증을 통한 마커 검증
소규모 MRM 분석에서 도출 된 마커 중 일부에 대해서 항체를 사용하여 MRM 결과를 검증하였다. MRM 분석에서 차이를 보인 단백질 ITIH4, C7, A2AP, C1QC, ITIH1, FINC 및 차이를 보이지 않은 2개 단백질 (QSOX1, ZPI)에 대해서 각 group 당 12명씩 웨스턴블랏을 수행하였다. 상기 단백질 중 AUC > 0.7 로 검출 된 단백질은 A2AP, FINC, ITIH1, 및 ITIH4 이였으며, 결과는 도 2a 내지 2e에 있다. 이 중 ITIH1 은 2번의 독립적인 시료에 대한 웨스턴블랏 실험에서 높은 AUC (각 1.000, 0.951) 을 보였다. 서로 다른 실험을 통하여 검증된 4개 단백질은 마커로 사용 가능성이 높음을 확인하였으며, MRM 분석이 기존의 널리 사용되는 항체 분석결과와 상관관계가 있음을 확인하였다.
실시예 7 트레이닝 세트 (100명)를 이용한 마커 도출
각 group 당 50명 (총 180명)의 시료에 대하여 트레이닝 세트로 2회 반복 분석을 진행하였다. 분석 된 시료는 진단 방법의 효율성 판단 목적으로 ROC curve를 이용한 AUC 값으로 확인하였으며 10-fold cross validation 으로 신뢰구간을 확보하였다. 트레이닝 세트 분석을 통해, 표 2에 나타낸 것과 같이 ROC curve의 AUC값이 0.6 이상의 값으로 도출 된 단백질 17개 (uniprot ID : A2GL, CO2, LBP, C4BPA, IPSP, AACT, CO5, C4BPB, FCN3, SAMP, CRP, LG3BP, THBG, CHLE, CO7, FETA, ITIH4)를 확인하였다.
[표 2]
Figure 112016021864103-pat00003
실시예 8 기존 임상 정보를 활용한 치료 예후 예측 인자 확인 (Training set)
기존 임상 정보로부터 Odd ratio를 이용한 발병 또는 치료 예후에 관한 위험률을 확인하였다. 표 3과 같이 TACE 시술 전 종양 개수 (No. of lesions) 와 PIVKA-II의 수치 (Pre-TACE PIVKA-II)에 대해서, 수치가 높을수록 치료 예후가 좋지 않은 것을 확인할 수 있었다.
[표 3]
Figure 112016021864103-pat00004
위의 임상정보에서 종양 개수 (No. of lesions)와 PIVKA-II의 수치 (Pre-TACE PIVKA-II)에 대해서, 수치가 높을수록 예후가 좋지 않은 것으로 나타났다.
실시예 9 Training set 에 대한 MRM 결과 및 임상 정보로부터 마커 패널 확립
Logistic regression을 활용한 training set에서의 MRM 결과와 임상 정보에 대한 가장 효과적인 마커 패널을 확립하였다. 그 결과 도 3a에 나타난 바와 같이 단백질 마커 (MRM 결과)는 A2GL, SAMP, CO7, CHLE, FCN3의 5개 조합으로부터 AUC 0.825로 도출되었다. 임상 정보 마커 패널의 경우 종양 개수 (No. of lesions), PIVKA-II의 수치, AFP의 수치에 대한 조합으로부터 AUC 0.737로 도출 되었다. MRM 마커와 임상정보 패널의 조합으로 이루어진 앙상블 모델 패널은 AUC 0.881의 높은 분별력을 보였다.
실시예 10 Validation set (80명)으로부터 마커 패널 검증
Training set으로부터 도출된 단백질 및 임상 마커 패널에 대해서 그룹당 40명씩 총 80명에 대하여 예후 예측 분별력을 확인하였다. 그 결과를 도 3b에 나타난 바와 같이 단백질 마커 패널의 경우 AUC 0.743으로 도출되었으며, 임상 정보 패널은 AUC 0.737로 도출되었다. 두 모델의 조합인 앙상블 모델 (A2GL, SAMP, CO7, CHLE, FCN3, 종양 개수, PIVKA-II의 수치, AFP의 수치)은 AUC 0.813으로 높은 예후 예측률을 보임을 확인 할 수 있었다.
실시예 11 TNM stage에 따른 마커 패널 효과 검증
발굴한 앙상블 모델 패널이 종양의 진행 정도에 따른 민감도를 보이지 않음을 확인하기 위하여 TNM stage (National Comprehensive Cancer Network. NCCN Hepatobiliary Cancers Clinical Practice Guidelines in Oncology Version 1.2016. Available at http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/hepatobiliary.pdf)에 따른 예후 결과를 통계적 분석으로 확인하였다. 그 결과 도 4에 기재된 바와 같이 TNM stage IV의 경우 시료수가 적어 통계적 유의성을 검증할 수 없었으나, 그 외 TNM stage I, II, 및 III에서는 각 그룹당 유의적인 차이를 보임을 확인할 수 있었다. 또한 그룹 내의 차이를 보기 위하여 Kuskall-Walis 통계분석을 수행하였으며, Good 그룹에서는 TNM stage 간의 차이를 보이지 않음을 확인하였다. Poor 그룹의 경우 stage I와 II, III, and IV 에서의 차이를 보였으나, 그 외의 stage에서는 차이를 보이지 않았다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (10)

  1. A2GL (Leucine-rich alpha-2-glycoprotein), CO2 (Complement C2), LBP (Lipopolysaccharide-binding protein), C4BPA (C4b-binding protein alpha chain), IPSP (Plasma serine protease inhibitor), AACT (Alpha-1-antichymotrypsin), CO5 (Complement C5), C4BPB (C4b-binding protein beta chain), FCN3 (Ficolin-3), SAMP (Serum amyloid P-component), CRP (C-reactive protein), LG3BP (Galectin-3-binding protein), THBG (Thyroxine-binding globulin), CHLE (Cholinesterase), CO7 (Complement component C7), 및 ITIH4 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커에 대한 검출 시약을 포함하는, 간암화학색전술 치료 예후 예측용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 바이오마커는 A2GL; FCN3; SAMP; CHLE; CO7; CHLE 및 ITIH4; C4BPA, CHLE, CO7, FCN3 및 SAMP; A2GL, SAMP, CO7, CHLE, 및 FCN3인, 간암화학색전술 치료 예후 예측용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출 시약은 상기 바이오마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 간암화학색전술 치료 예후 예측용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 바이오마커의 단백질 수준 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, MRM 분석 또는 단백질 마이크로어레이용 시약인, 간암화학색전술 치료 예후 예측용 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서,
    상기 바이오마커의 핵산 수준 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 간암화학색전술 치료 예후 예측용 조성물.
  6. 간암화학색전술 치료에 대한 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여,
    검사 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 제 1 항에 따른 하나 이상의 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부 및/또는 농도를 검출하는 단계;
    상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 존재에 대한 검출결과를 대조군 값과 비교하는 단계; 및
    상기 대조군 값과 비교하여, 상기 대상체 유래의 시료의 핵산 또는 단백질의 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질의 존재 여부에 변화가 있는 경우, 상기 대상체는 간암화학색전술에 대한 반응이 없을 것으로 예측하는 단계를 포함하는, 간암화학색전술 치료에 대한 예후를 예측하기 위한 정보를 제공하기 위하여 바이오마커를 검출하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 바이오마커는 A2GL; FCN3; SAMP; CHLE; CO7; CHLE 및 ITIH4; C4BPA, CHLE, CO7, FCN3 및 SAMP; A2GL, SAMP, CO7, CHLE, 및 FCN3인, 사용되는 것인, 방법.
  8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    상기 비교하는 단계는 비마커 임상 정보를 추가로 사용하는 것인, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 비마커 임상정보는 알부민, 프로트롬빈 시간, 크레아틴 농도, 혈소판 개수, ALT 농도, 빌리루빈 농도, 종양 또는 병변의 개수, 종양크기, AFP 농도, 및 PIVKA-II 농도 중 어느 하나를 포함하는 것인, 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 비마커 임상정보는 종양 또는 병변의 개수 및 PIVKA-II 농도인, 방법.
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