KR101832039B1

KR101832039B1 - 간암 표적치료제 반응 예측용 바이오마커 및 그 용도

Info

Publication number: KR101832039B1
Application number: KR1020150174914A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 윤정환; 김현수; 여인준
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2015-12-09
Publication date: 2018-04-04
Also published as: KR20160072041A

Abstract

본원은 소라페닙 약물에 순응하는 환자와 불응하는 환자를 높은 변별력으로 구분해 낼 수 있는 마커 또는 마커의 조합 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 마커는 혈액을 이용한 비침습성 검사로 간단하게 소라페닙에 대한 순응 여부를 판단할 수 있어, 이에 근거한 개인별 맞춤형 약물 투여가 가능하여 약물 부작용을 줄이는 것은 물론, 비용 절감 측면에서도 많은 장점이 있다.

Description

간암 표적치료제 반응 예측용 바이오마커 및 그 용도 {Biomarker to predict target drug efficacy for hepatocellular carcinoma and its use}

간암의 표적치료제에 대한 환자의 반응을 예측할 수 있는 기술과 관련된 것이다.

간암은 예후가 좋지 않은 암 중 하나로 전 세계적으로 암에 의한 사망률이 5위에 속한다. 특히 간염바이러스 보유율이 높은 우리나라를 포함한 아시아권에서는 높은 발생 빈도와 암 발생대비 2위의 사망률을 나타내고 있다.

하지만 간암은 상당히 진행 되서야 증상이 나타나는 질환으로 이로 인해 적절한 치료시기를 놓치는 경우가 빈번하고, 치료를 하는 경우도 예후가 극히 나쁘다. 특히 수술로 절제가 불가능한 경우는 1년 내 사망하는 심각한 질환으로, 이러한 임상적 현실을 고려할 때 암의 조기 진단 및 예후를 예측할 수 있는 기술은 암 치료의 가장 현실적 대안이고 차세대 간암 진료의 가이드라인이다.

특히 간암은 간염바이러스나 알코올, 간경화와 같은 위험인자를 가지고 있는 환자에게서 호발하는 것으로 알려져있고 조기진단 마커를 이용하여 고위험군에 대한 선별적 감시 검사(surveillance)를 시행할 대상이 명확하다. 실제로, 6개월 간격으로 시행하는 조기진단은 간암 환자의 생존율 증대 (사망률 37% 감소)하는 것으로 나타났다.

하지만 조기진단을 위한 노력에도 불구하고, 우리나라 전체 간암 환자의 60% 이상은 진행 병기(advanced stage) 에서 진단된다. 이러한 환자들은 수술이나 고주파 열치료와 같은 근치적 치료의 대상이 되지 못하므로 항암 화학 요법을 근간으로 하는 치료 대상이다.

지금까지는 효과적인 전신 항암 화학 요법은 거의 전무한 실정이었으나, 최근 경구용 항암 표적 치료제인 소라페닙(sorafenib)의 치료 효과가 항암 화학 요법 제제 중 최초로 임상 3상 무작위 대조군 연구를 통해 입증된 후로, 진행성 간암의 초기 치료로 인정되었다.

하지만 이러한 소라페닙은 종양 크기가 감소하는 비율이 3.3%에 불과하고 생존 기간의 증가가 약 2-3개월에 머물러서 가격 대비 효과가 크지 않다는 한계가 있으나, 진행성 간암에서 소라페닙의 사용 증가가 예상되고, 국내에서도 이미 간암 환자의 최소 5% 이상에서 소라페닙이 사용되고 있는 것으로 추정된다 (10만명 당 1.6명 이상/년). 특히 최근 개정된 소라페닙의 의료 급여 기준에 따르면 투여 조건을 모두 만족하는 대상에서 (stage III 이상, Child-Pugh class A, ECOG ECOG : Eastern Cooperative Oncology Group performance status 0-2) 소라페닙 전체 약값의 95%를 의료 급여로 지원하게 되어, 경제적 진입 장벽이 낮아져 향후 소라페닙의 사용량이 급증하게 될 가능성이 매우 높다. 하지만 소라페닙 사용 문제는 투약 효과에 비하여 과도하게 비싼 약값으로 인하여 (비급여시 300만원/월), 건강보험 재정에 큰 부담이 될 것이 분명하여 효과를 볼 수 있는 환자에의 선별적 치료가 필요하다. 특히 소라페닙은 다양한 신호 전달 경로에 작용하므로 소라페닙의 약물반응 효과를 예측할 수 있는 마커의 개발이 시급하다.

일본 공개 특허공보 2011-103821호는 소라페닙에 반응하는 유전자 규명에 관한 것으로, 디하이드로피리미딘 데하이드로게나제 (dihydropyrimidine dehydrogenase), CD247 유전자 등의 다형성 검출을 통해 반응을 예측하는 방법을 개시하고 있다.

하지만 국내뿐 아니라, 해외에서 현재 소라페닙 약물 반응 예측과 관련된 분자 진단 시장은 거의 전무한 실정이므로, 효율적으로 소라페닙 약물반응 효과를 예측할 수 있는 바이오마커의 개발이 필요하다.

본원은 간암의 표적 치료제인 소라페닙에 대한 환자의 반응을 예측할 수 있는 바이오마커를 제공하고자 한다.

C163A, C1QB, CIQC, CATB, CD5L, CH3L1, CO7, FA11, FBLN1, FBLN3, FCG3A, FSTL1, GPX3, IGHG1, IGHG3, IGJ, ISLR, LG3BP, LUM, NRP1, QSOX1, SHBG, SODE 및 THBG로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커의 검출시약을 포함하는, 소라페닙 반응 예측용 조성물을 제공한다.

다른 양태에서 본원은 소라페닙 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 소라페닙의 투여가 필요한 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 C163A, C1QB, CIQC, CATB, CD5L, CH3L1, CO7, FA11, FBLN1, FBLN3, FCG3A, FSTL1, GPX3, IGHG1, IGHG3, IGJ, ISLR, LG3BP, LUM, NRP1, QSOX1, SHBG, SODE 및 THBG로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 농도를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 농도 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 농도에 변화가 있는 경우, 상기 대상체를 소라페닙 순응군으로 판정하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 소라페닙 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 마커는 단독 또는 조합으로 사용되어 혈액시료를 이용하여 검출이 가능하며, 소라페닙 순응환자와 불응환자에서 차별적으로 발현되어, 화학요법이 필요한 간암 환자의 개인 맞춤형 약물 처방을 가능하게 한다.

본원에 따른 바이오마커는 소라페닙 약물에 순응하는 환자와 불응하는 환자를 높은 변별력으로 구분해 낼 수 있어 소라페닙의 투여가 필요한 환자의 개인 맞춤형 약물사용이 가능하게 한다. 아울러 본원에 따른 마커는 다양한 신호 전달 경로에 작용하므로 본원에 개시된 다중 마커의 조합을 사용할 경우, 보다 효율적인 예후 예측에 기여할 수 있어 약물 부작용을 줄이는 것은 물론, 의료 보험 재정의 건전화에 크게 기여할 수 있다.

도 1은 바이오마커 발굴 및 분석에 사용된 MRM 분석 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 혈액 내인성(endogenous) 펩타이드와 합성 펩타이드의 동시-용출(coelution) 여부를 나타낸 것이다.
도 3은 혈액 내인성 펩타이드와 합성 펩타이드의 Q3 강도 패턴을 나타낸다.
도 4는 혈액 내인성 펩타이드 수준 확인방법을 나타낸다.
도 5는 혈액 내인성 펩타이드 수준 측정 후 그 결과를 다이내믹 레인지(dynamic range) 분포로 나타낸 것이다.
도 6은 소량 및 다량(low and high abundance) 타겟에 대한 혈액 내 농도를 나타낸 것이다.
도 7은 SIS 펩타이드 주입 농도 결정 방식을 모식도로 나타낸 것이다.
도 8은 약물반응 시료 구성의 모식도를 나타낸다.
도 9는 다중 펩타이드 마커 패널 구축 결과(소라페닙 치료전의 순응군 대 불응군)를 나타낸다.
도 10은 약물반응 예후 예측 마커 검증을 위한 웨스턴 블랏팅 분석 결과를 나타낸 것으로 (a)단백질-01. C1QC(complement C1q subcomponent subunit C), (b)단백질-02. CD5L(CD5L antigen-like), (c)단백질-03. CO7(Complement component)
도 11은 약물반응 예후 예측 마커 검증을 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 것으로 (a)단백질-01. CD5L(CD5L antigen-like), (b)단백질-02. IGHG1(Ig gamma-1 C region), (C)단백질-03. IGHG3(Ig gamma-3 C region), (d)단백질-04. IgJ(Immunoglobulin J chain), 및 (e)단백질-05. LG3BP(Galectin-3-binding protein)이다.
도 12는 다중 단백질 마커 패널 구축 결과 (소라페닙 치료 전의 순응군 대 불응군)를 나타낸다.

본원에서는 MRM 기술을 이용하여, 정상인 간암환자, 소라페닙 순응군 환자를 대상으로 차별적으로 발현되는 단백질/펩타이드를 순차적으로 스크리닝하고 검증하여, 그룹 간에 유의적 차이를 나타내어 소라페닙에 대한 순응 여부를 판단하는 바이오마커로 유용한 단백질/펩타이드 발견을 근거로 한 것이다.

한 양태에서 본원은 C163A (Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M130), C1QB (Complement C1q subcomponent subunit B), CIQC (Complement C1q subcomponent subunit C), CATB (Cathepsin B), CD5L (CD5 antigen-like), CH3L1 (Chitinase-3-like protein 1), CO7 (Complement component C7), FA11 (Coagulation factor XI), FBLN1 (Fibulin-1), FBLN3 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1), FCG3A (Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A), FSTL1 (Follistatin-related protein 1), GPX3 (Glutathione peroxidase 3), IGHG1 (Ig gamma-1 chain C region), IGHG3 (Ig gamma-3 chain C region), IGJ (Immunoglobulin J chain), ISLR (Immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein), LG3BP (Galectin-3-binding protein), LUM (Lumican), NRP1 (Neuropilin-1), QSOX1 (Sulfhydryl oxidase 1), SHBG (Sex hormone-binding globulin), SODE (Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn]) 및 THBG (Thyroxine-binding globulin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 검출시약을 포함하는, 소라페닙 반응 예측용 조성물에 관한 것이다.

소라페닙 (Sorafenib) {4-[[4-chloro-3-(trifluoromethyl)phenyl]carbamoylamino]phenoxy]-N-methyl-pyridine-2 arboxamide}은 Bayer와 Onyx Pharmaceutical에서 개발되어 상품명 Nexavar로 판매되는 제품으로, 카이나제 억제제 기반의 약물로 간세포암 및 방사선요오드 요법에 불응하는 진행된 갑상선암의 치료에 사용된다.

본원에서 간암 또는 간세포암(Hepatocellular carcinoma, HCC)은 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 대사성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 환자에서 발생하는 간조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양을 일컫는 것으로, 간세포암종 진료 가이드라인(대한간암학회, 국립암센터 발행, pp17-19, 2014)에 따르면 stage I, II, III, IV A 및 IV B로 나눌 수 있다.

본원에 따른 마커는 소라페닙의 치료가 필요한 간암 환자가 소라페닙에 반응하는지 여부를 예측하는데 사용될 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 간암의 병기와 상관없이 종양의 외과적 절제 전 또는 후에, 또는 종양의 외과적 수술이 없는 경우에도 종양 조직의 축소 또는 제거, 종양세포의 제거를 위해 소라페닙의 투여가 필요한 환자의 이 약물에 대한 반응여부 예측에 사용될 수 있다.

간암은 조기진단을 위한 노력에도 불구하고 우리나라 전체 간암 환자의 60% 이상은 진행 병기 (stage III 이상) 에서 진단되는데, 이 환자들은 수술이나 고주파 열치료와 같은 근치적 치료의 대상이 되지 못하므로 항암 화학 요법을 근간으로 치료를 하게 된다. 최근까지 효과적인 전신 항암 화학 요법은 거의 전무한 실정이었으나 최근 경구용 항암 표적 치료제인 소라페닙(sorafenib)의 치료 효과가 항암 화학 요법 제제 중 최초로 3상 무작위 대조군 연구를 통해 입증된 이후로 간암 환자에서 사용되어 왔다.

이런 측면에서 본원에 따른 다른 구현예에서 소라페닙은 수술이나 고주파 열치료와 같은 근치적 치료의 대상이 되지 못하는 항암요법이 필요한 투여가 필요한 대상체, 예를 들면 간암 병기 III기 이상의 환자의 소라페닙 약물에 대한 반응을 예측하는데 사용될 수 있다.

본원에서 소라페닙 대한 반응 평가 기준은, 처음 소라페닙 약물 투여를 시작해서 PD(progressive disease)나 부작용으로 약제를 중단하게 되는 시점 중에 보였던 가장 좋은 반응을 기준 (BOR, best overall survival)으로 삼았으며, 이는 mRECIST (modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) 가이드라인을 따랐다. mRECIST는 치료 전과 비교하여 직경이 가장 큰 종양(tumor diameter)의 합의 변화를 가지고 반응 여부를 4가지 그룹으로 나눈다. 종양이 완전히 제거되는 경우를 CR(complete response), 치료 전에 비하여 최소 30% 이상 감소한 경우를 PR(partial response), 20% 증가 ~ 30% 감소인 경우를 PR(partial response), 그리고 최소 20% 이상 증가한 경우를 PD(progressive disease)로 정의하고, 본원에서는 CR, SD, PR를 약물 순응군으로, PD를 약물 불응(또는 불능)군으로 정의한다.

본원에서 용어 바이오마커란 소라페닙에 대한 불응군과 순응군을 치료 전에 구분할 수 있는 마커로서, 불응군과 순응군에서 농도 변화를 나타내는 단백질, 상기 단백질 유래의 폴리펩타이드, 상기 단백질을 코딩하는 유전자 또는 그 단편을 포함한다.

본원에 따른 바이오마커는 불응군과 같은 대조군의 시료와 비교하여 순응군 혈액에서 그 양이 증가한 것으로, 그 단백질 또는 핵산 서열은 예를 들면 표 3-1 및 3-2에 기재된 ID로 UniProt DB (www.uniprot.org)에서 검색가능하다.

본원에 따른 일 구현예에서는 특히 단독으로 높은 AUC 값을 갖는 CD5L, IGHG1, IGHG3, IGJ, LG3BP, 및 QSOX1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커가 사용되며, 상기 마커는 본원에 실시예에 기재된 바와 같은 일차 및 이차 시료군 모두에서 높은 AUC 값으로 대조군과 비교하여 차별적 발현을 나타냈다.

본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개의 조합으로 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및/또는 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현에에서 본원에 따른 마커의 조합은 상술한 바와 같은 높은 AUC 값을 갖는 CD5L, IGHG1, IGHG3, IGJ, LG3BP 및 QSOX1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나와 C163A, C1QB, CIQC, CATB, CH3L1, CO7, FA11, FBLN1, FBLN3, FCG3A, FSTL1, GPX3, IGHG1, ISLR, LUM, NRP1, SHBG, SODE 및 THBG로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커의 조합을 포함한다.

다른 구현예에서는 CD5L, IGHG1, IGHG3, IGJ, LG3BP 및 QSOX1; FBLN1, LG3BP, CO7, 및 CD5L; 또는 LG3BP, IGHG1, IGHG3, CD5L 및 IgJ의 조합으로 사용된다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 단백질 및/또는 mRNA의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

이러한 본원에 따른 마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다.

일 구현예에서 본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.

다른 구현예에서 본원에 따른 마커의 검출은 각 마커 단백질 유래의 펩타이드 예를 들면 표 3-1 및 3-2에 기재된 각 마커별로 상응하는 펩타이드를 검출하여 정량하는 본원에 기재된 MRM과 같은 질량분석 방법을 통해 수행될 수 있으며, 하나의 단백질에 대하여 하나 또는 두 개 이상의 펩타이드가 사용될 수 있다. 이러한 MRM 분석에 사용될 수 있는 펩타이드는 항체 분석에서 항체가 인식하는 항원과 일치하지 않을 수도 있으며, 펩타이드를 이용한 검출과 항체 분석은 서로 상호 보완적으로 사용될 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 다양한 방식으로 정량적 또는 정성적 분석을 통해 검출할 수 있는 시약이다.

본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에는 공지된 단백질 또는 핵산을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합, 질량분석 또는 항체를 이용한 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 방법, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 마커를 검출할 수 있으며, 이는 검체로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링(Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.

다른 구현예에서는 각 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA와 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용된다.

또 다른 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동(Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

본원의 마커는 또한 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량적 및/또는 정성적으로 검출될 수 있다.

핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다. 또한 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.

상기 핵산 수준에서의 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍를 포함한다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR(중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

본원에 따른 조성물에 포함되는 검출시약은 검출에 사용되는 구체적 방법에 따라 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

본원의 조성물은 추가로 분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 완충액, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.

상술한 바와 같은 다양한 검출시약을 포함하는 본원의 조성물은 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용 키트, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인식하는 항체가 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT (Point of Care Test) 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료에 담그면, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 마커를 검출하는 것이다.

다른 구현예에서는 펩타이드 검출 및/또는 정량을 근간으로 하는 MRM 키트가 제공되며, MRM 방식에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다. MRM 방법은 특정 단백질을 선택적으로 인식하는 펩타이드를 이용하는 것으로, 온도, 습도 등 환경에 민감한 항체를 이용하는 기존의 방법과 비교하여, 보다 안정적으로 생체시료에서 마커를 검출할 수 있다. 예를 들면 펩타이드는 본원 표 3-1 및 3-2에 기재된 것이 사용될 수 있으며, 하나의 마커에 하나 또는 두 개이상의 펩타이드가 사용될 수 있다. 예를 들면 각 단백질 마커에 해당하는 펩타이드(단문자 아미노산으로 표시)는 Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M130 (C163A) - LVDGVTECSGR; Complement C1q subcomponent subunit B (C1QB)-IAFSATR, LEQGENVFLQATDK; Complement C1q subcomponent subunit C (C1QC)- FQSVFTVTR, TNQVNSGGVLLR 등과 같다.

다른 구현예에서, 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 기질의 표면에 검출시약이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 어레이에 부착될 수 있는 검출시약은 예를 들면 한 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 바이오 마커의 검출시약을 포함하는 소라페닙 반응 예측용 키트 또는 시스템에 관한 것이다. 검출 시약 및 이러한 시약이 사용되는 방법은 상술한 바와 같다. 이러한 본원의 마커를 검출할 수 있는 시약은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커 검출시약을 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다. 또한 키트는 사용안내서를 추가로 포함할 수 있다.

또다른 양태에서 본원은 소라페닙 반응 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 소라페닙의 투여 또는 치료가 필요한 대상체 유래의 생물학적 시료로부터 C163A, C1QB, CIQC, CATB, CD5L, CH3L1, CO7, FA11, FBLN1, FBLN3, FCG3A, FSTL1, GPX3, IGHG1, IGHG3, IGJ, ISLR, LG3BP, LUM, NRP1, QSOX1, SHBG, SODE 및 THBG로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 농도 또는 발현량을 검출하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 소라페닙 반응 예측 마커를 검출하는 방법에 관한 것이다.

이러한 본원은 방법은 추가로 상기 핵산 또는 단백질의 농도 또는 발현량 검출 결과를 대조군 시료의 상응하는 바이오 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 농도의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 이용하여 소라페닙에 대한 반응 또는 불응 여부를 판단하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 일 구현예에서 대조군 시료는 기존에 소라페닙을 투여하였으나 치료효과가 없는 불응군 환자 유래의 시료이다.

본원에 따른 일 구현에서는 본원에 따른 마커의 발현량이 대조군 (불응군)과 비교하여 증가한 경우, 대상체를 소라페닙 순응군으로 판단한다.

본원의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 포함한다. 인간 대상체는 간암으로 인해 소라페닙으로 치료가 필요하거나 필요할 것으로 예상되는, 필요한 것으로 판단된 사람을 포함한다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 방법은 간암 환자 중 수술이나 고주파 열치료와 같은 근치적 치료의 대상이 되지 못하여 항암 화학 요법을 근간으로 치료해야 되는 환자 (진행 병기 - stage III 이상)에 사용되나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 방법에 사용되는 생물학적 시료는 전혈, 혈청 또는 혈장이 사용된다.

본원에서 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 체액, 특히 전혈, 혈장, 혈청 또는 뇨를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본 방법에 사용되는 바이오마커 검출 방법 및 이에 사용되는 시약 및 판정을 위한 데이터 분석 방법은 앞서 설명한 것 및 후술하는 것을 참고할 수 있다. 일 구현예에서 본원에 따른 방법은 특히 단백질 또는 핵산 마이크로어레이 분석법, 핵산증폭, 항원-항체 반응, 또는 MRM을 포함하는 질량분석 방식으로 실시될 수 있다.

본원에 따른 방법에 사용되는 마커, 또는 마커의 조합은 앞서 기재한 바를 참고할 수 있다.

본원에 따른 방법을 사용하여 두 개 이상을 포함하는 마커의 조합을 사용하는 경우 프로파일, 즉 시료 중 마커 단백질 발현과 관련된 정량적 정보를 포함하는 데이터세트가 생성될 수 있다. 마커를 이용하여 프로파일을 수득한 후에, 참조군 또는 대조군과의 결과 비교를 통해 대상체의 시료의 순응 여부를 판별한다. 대조군 또는 참조군으로는 앞서 기재한 바를 참고할 수 있다.

대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교, 또는 U.S. 특허 6,308,170 및 6,228,575에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 예로는 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Ben-Dor et al (2007, J. Comput. Biol. 7: 559-83), Nguyen et al (2002, Bioinformatics 18:39-50), Wang et al (2003, BMC Bioinformatics 4:60), Liu et al (2001, Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform.12:14-23), Yeang et al (2001, Bioinformatics 17 Suppl 1:S316-22) 및 Xiong (2000, Biotechniques 29(6):1264-8, 1270) 등을 포함하는 문헌을 참조할 수 있다.

또한 본원의 마커를 통하여 검출된 결과가 순응여부 판단에 유의한 것으로 판정하기 위해 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일 구현예에서는 logic regression 방법이 사용되며, Ruczinski, 2003, Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512를 참조할 수 있다. 상기 방법은 클래시파이어가 바이너리 트리로 제시되는 CART 방법과 유사하나, 각 노드는 CART에 의해 생성되는 "and" 연산자와 비교하여 보다 일반적인, 특성과 관련된 불린(Boolean) 연산자가 사용된다. 다른 분석 방법의 예로는 nearest shrunken centroids (Tibshirani. 2002 PNAS. 99:6567-72), random forests (Breiman. 2001. Machine Learning 45:5-32 및 MART (Hastie. 2001. The Elements of Statistical Learning, Springer)을 들 수 있다.

일 구현예에서, 통계처리를 통해 순응여부를 판단하기 위해 시험물질과 대조군간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 원 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다.

이러한 통계적 분석 방법은 바이오마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실 시 예

실시예 1. 본원에 사용된 임상 시료 정보

본 실험은 서울대학교의 의학연구윤리심의위원회의 허가된 프로토콜에 따라 수행되었으며, 각 환자로부터 충분한 설명에 근거한 서면동의를 수득하였으며, 임상정보는 다음과 같다.

마커 후보군 선정을 위해 정상인과 간암 환자의 통합(pooling) 시료에서 발현차이를 보이는 단백질 후보군 선정을 위해, 정상인 60명 (남/여=41/19) 과 간암 환자 60명 (남/여=42/18) 의 시료를 가지고 초기 연구를 진행했다. 시료는 BOR (Best Overall Survival)기준으로 처음 소라페닙 약물치료를 시작해서 진행 상태(Progressive disease = PD)나 부작용(S/E)으로 약제를 중단하게 되는 시점 중에 보였던 가장 좋은 치료 반응을 기준으로 치료 반응이 소실(Clearance=CR)과 부분 관해(Partial response=PR) 그리고 안정 상태(Stable disease=SD) 인 경우를 모두 약물반응 순응군으로 진행 상태(Progressive disease=PD)인 경우를 약물반응 불응군으로 지정했다. 이를 통해서, 1차 시료군은 21명의 소라페닙 약물반응 순응군 (CR-2명, PR-3명, SD-16명)과 44명의 소라페닙 약물반응 불응군 (PD-44명)의 치료 전/후의 페어(pair) 시료를 사용했고, 2차 시료군은 20명의 소라페닙 약물반응 순응군 (CR-2명, PR-2명, SD-16명)과 31명의 소라페닙 약물반응 불응군 (PD-44명) 의 치료 전/후의 페어(pair) 시료를 사용했다.

실시예 2. 표적 후보군 선정을 위한 데이터 마이닝

타겟의 후보군은 다음과 같이 선정하였다. 현재 간 질환과 관련된, 가장 포괄적 자원(comprehensive resource)인 LiverAtlas 데이타베이스를 이용해서, 소라페닙 약물반응 단백질 마커 후보군을 확보했다. LiverAtlas 데이타베이스 상에서 간질환과 관련 있다고 알려진 단백질은 총 50,265개인데, 이 중에서 혈액 내에서 검출 가능한 단백질만을 선정하기 위해, 혈액 내로 분비되거나 분비될 가능성이 있는 단백질 Uniprot database 기준) 만을 선별한 결과, 총 1,683개 단백질이 선정 되었다. 최종, 질량 분석 장비로 검출이 가능한 단백질만을 선정하기 위해서 4개의 서로 다른 펩타이드 MS/MS 라이브러리 소스(NIST Ion-Trap, NIST Q-TOF, ISB human plasma, Home made library) 를 이용해서 펩타이드 MS/MS 데이타가 존재하는 단백질만을 선정한 결과, 총 960개 단백질이 최종 선정되었다. 이어 검출 가능한 타겟 후보군 선정은 다음과 같이 수행하였다. 실제 질량분석 장비로 검출이 가능한 타겟 만을 선정하기 위해서, 정상 그룹 60명, HCC 그룹 60명을 통합한 시료를 대상으로, MRM 분석을 통해 시그널이 제대로 검출되는 펩타이드 만을 선정한 결과, 최종 537개 단백질, 1316개 펩타이드가 선정되었다.

실시예 3. MRM 분석을 통한 타켓 마커 후보군 도출

실시예 3-1. 혈청 시료 준비

실험에 사용한 혈청 시료는 다음과 같이 준비하였다. BD Vacutainer 혈청 분리관(serum separation tube)(BD, USA)을 이용하여 채혈하였다(Silica clot activator, 10 mL, 16 X 100 mm ; Product number = #367820). 채혈된 혈액에 페닐메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)를 최종 1.0 mM 되도록 첨가하였다. 10번 정도 인버팅 믹싱(inverting mix)을 한 후, 3000 rpm 에서 10분간 원심분리(4℃ 유지)하여 상층액을 수집하였다(색깔 관찰 후, 용혈된 붉은색 샘플은 사용하지 않았다).

1.5 mL 에?도르프 튜브에 100 μL 씩 분주하였고, 분주 즉시 얼음에 두었고, 튜브에 라벨링하였다 (라벨링할 때 시료군에 해당하는 코드 기입하였다(예: NC-01, MC-01, PD-01등). 그후 -80℃에 즉시 보관하였다. 상기 절차는 얼음에서 실시하며 채혈 후 1시간 이내에 모두 종료하였다.

실시예 3-2. 혈청 단백질 감손(depletion) 처리

혈액 내에 저농도로 존재하는 마커 발굴을 위해 우선 혈액 내에 고량(high-abundant)으로 존재하는 단백질 6종 (albumin, IgG, IgA, haptoglobin, transferrin, alpha-1-antitrypsin)을 제거하는 감손 과정을 실시하였다. 6개의 다량 단백질 제거를 통해서, 혈액 내에는 총 단백질 매스(mass)의 85% 정도가 제거 되고, 나머지 15% 단백질 매스에 해당되는 단백질만 남게 되어 이를 분석에 사용하였다. 감손은 MARS (Multiple affinity removal system)(Agilent, USA) 을 제조사의 방법대로 이용하여 혈액에서 양이 가장 많은 6개의 단백질은 컬럼에 결합시켜 제거하고, 결합하지 않은, 소량으로 존재하는 단백질은 용출시켜 분석에 사용하였다.

실시예 3-3. 혈청 단백질의 펩타이드화

상기 감손 과정 후 얻어진 혈청 시료는 농축 (w/ 3K filter)한 다음, BCA (Bicinchoninic acid) 분석 방식으로 단백질 농도를 정량하였다. 100㎍ 혈청 시료를 취한 다음, 최종 농도 6M 유레아/20mM DTT로 처리 (Tris pH 8.0)한 다음, 37℃에서 60분 동안 인큐베이션을 진행하였다. 최종 농도 50 mM IAA 처리 한 다음, 상온에서 30분 동안 인큐베이션을 진행하였다. 유레아의 농도가 0.6M 이하가 되도록 100 mM Tris pH 8.0 처리하였다. 트립신과 혈청 농도 비율이 1:50 이 되도록 트립신 처리 후, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션을 진행하였다. 포름산 용액을 최종농도 5% 가 되도록 처리한 다음, 하기 탈염 과정을 시행하였다.

실시예 3-4. 혈청 단백질의 탈염

OASIS 컬럼(Waters, USA)에 60% ACN / 0.1% 포름산 1mL를 3번 흘려줘서 활성화를 시행하였다. OASIS 컬럼에 0.1% 포름산 1mL를 5번 흘려줘서 평형화(equilibration)를 시행하였다. 펩타이드 시료를 넣어주고, 0.1% 포름산 1mL로 5번 흘려줘서 세척하였다. 40% ACN / 0.1% 포름산 1mL와 60% ACN / 0.1% 포름산 1mL 처리해서 펩타이드를 용출(elution)시켰다. 1시간 이상 -70℃에서 얼린 다음, Speed-vac으로 건조시켰다. 건조된 펩타이드 시료는 Sol A 버퍼(3% ACN / 0.1% formic acid) 50㎕에 녹인 다음, 15,000 rpm 에서 60 min 동안 원심분리 하고, 이 중에서 40㎕ 만 바이알에 옮겨서 분석을 시행하였다.

실시예 3- 5. MRM 분석

MRM 분석을 위해 실시예 2에서와 같이 선정된 537개 단백질, 1316개 펩타이드를 대상으로 재현성 있게 검출(Technical reproducibility)이 가능하고, 소라페닙 순응 및 불응 군간에 차이를 나타내는 타겟을 선정하기 위해서, 1차 스크리닝 단계에서 정상인 60명과 간암환자 60명의 시료를 사용하였고, 1차 시료로 소라페닙 약물에 순응하는 환자군 21쌍 (치료 전/후), 불응하는 환자군 44쌍 (치료 전/후) 시료를 사용했으며, 2차 시료로 소라페닙 약물에 순응하는 환자군 20-pair, 불능 하는 환자군 31-pair 시료를 하여, 해당 환자가 소라페닙 약물에 순응할지 불능할지 구분 가능한 단백질 마커 24개를 최종 확인했다. 세트 당 3번씩 MRM으로 반복 분석을 진행했다.

MRM 분석은 각 표적 단백질에 대하여, Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline)을 사용하여 MRM 분석용 펩타이드 및 단편 이온을 선별하였다. Skyline은 MRM 방법 개발 및 분석용의 오픈 소스 소프트웨어이다 (Stergachis AB, et al., 2011, Nat Methods 8: 1041-1043).

요약하면, 전장의 단백질 서열을 FASTA 포맷으로 Skyline에 입력한 후, 이를 펩타이드로 디자인하여 산물 이온 리스트를 생성하였고, 이를 MRM으로 모니터링하였다. 트랜지션 선택에 사용된 펩타이드 필터 조건은 다음과 같다: 펩타이드 최대 길이는 30, 최소 길이는 6개 아미노산으로, 반복되는 알지닌(Arg, R) 또는 라이신(Lys, K)은 포함시키지 않았다. 메티오닌(Met, M)도 펩타이드에 포함되면, 변형가능성으로 인해 제거하였다. 프롤린이 알지닌 또는 라이신 다음에 오는 경우도 사용하지 않았으며, 히스티딘(His, H)이 포함되는 경우에는 전하가 변경되지만 사용되었다.

이러한 조건을 만족하는 펩타이드를 Q1 트랜지션으로 사용하였다. 쿼드러플(Quadruple) 1 (Q1) 은 특정 Q1 m/z 만을 통과시킬 수 있는 필터 역할을 수행하였다. Q1 필터를 통과한 전구 이온(precursor ion)은 쿼드러플(Quadruple) 2 (collision cell)에서 전기적인 에너지에 의해 단편화(fragmentation)가 일어나 생성 이온(product ion)으로 분해되었다. 이 생성 이온은 쿼드러플 1 (Q1)에서처럼 필터 역할을 수행하는 쿼드러플 3 (Q3)을 통해 특정 생성 이온만이 통과될 수 있다. 쿼드러플 3 (Q3)을 통과한 이온은 검출기(detector)에서 디지털 시그널로 전환되어 피크 크로마토그램으로 보여지게 되며, 이 피크의 면적을 분석하여 상대 및 절대 정량 분석을 수행하였다. 이러한 정보를 포함하는 파일을 MRM 분석을 위해 Analyst (AB SCIEX, USA)에 입력한 후 nonscheduled MRM 방법으로 분석하였다. MRM 결과는 wiff 및 wiff.scan 파일로 생성되었으며, 이를 mzWiff를 사용하여 mzXML 포맷으로 변환하여 MRM 데이터 처리를 위해 Skyline에 입력하여, MRM 트랜지션의 피크 강도를 구하였다. 도 1은 그 과정을 도식적으로 나타낸 것이다.

정량성 확보를 목적으로 농도를 이미 알고 있는 특정 펩타이드를 사용해서 모든 MRM 분석 시, 해당 펩타이드의 피크 면적 값으로 표준화하는 작업을 거치게 되는데, 여기에 해당되는 펩타이드를 내부 표준 펩타이드라 하는데 이는 안정한 동위원소가 포함된 아미노산을 갖고 있는 펩타이드이다. 본 연구에서는 인간 프로테옴에서는 존재하지 않는 E.coli 유래인 beta-갈락토시다아제(lacZ)의 heavy-labeled 펩타이드인 LNVENPK를 이용해서 모든 시료 분석 시, 5-fmol의 동일한 내부 표준 펩타이드를 주입해서, MRM 분석으로부터 나온 모든 타겟 펩타이드의 피크 면적 값을 해당 내부 표준 펩타이드의 피크 면적 값으로 표준화하는 작업을 거쳤다.

상기와 같이 반정량(Semi-quantitative) MRM 분석을 통해서, 질량 분석 장비(MRM-technique)를 통해서 재현성있게 검출이 가능한 단백질/펩타이드 만을 선정하기 위해 세트 당 3번 반복 분석한 다음, 두 그룹 중에서 적어도 한쪽 그룹에서 %CV 값이 20 이내인 타겟 만을 선정한 결과, 재현성 있는 타겟으로 347개 단백질, 754개 펩타이드가 선정되었다.

이어 재현성 있게 검출되는 타겟 대상으로 정상 그룹과 HCC 그룹 간 발현 차이를 보이는 타겟을 선정하기 위해서 그룹 간 p-value 및 fold-change level을 확인했다. 재현성있는(Reproducible) 타겟(347-단백질, 754-peptides)을 대상으로 정규성 검정(Normality test, Shaipro-Wilk)을 통해서 정규분포를 따르는 경우 (p-value > 0.05)는 모수 방법인 독립적 T-test 로, 정규분포를 따르지 않는 경우 (p-value ≤ 0.05) 는 비모수 방법인 Mann-Whitney test 로 분석을 진행했다. 독립적 T-test의 경우, 등분산성 검정 (Levenes test)을 통해 등분산성을 따르는 경우 (p-value > 0.05)와 따르지 않는 경우 (p-value ≤ 0.05)로 나눠서 p-value 값을 확인했고, 이를 통해서 독립적 T-test와 Mann-Whitney test로 정상 그룹과 HCC 그룹 간에 유의적인 차이 (p-value ≤ 0.05)를 보이는 타겟 단백질/ 펩타이드임을 확인했다.

여기에 더하여, 정상 그룹과 HCC 그룹 간 fold-change 수준이 1.5-fold 이상으로 증가 또는 감소의 패턴을 보이는 단백질 마커 후보군을 추가로 선정하였다. 이를 통해서, 정상 그룹과 HCC 그룹 간 p-value 0.05 이하인 단백질은 195개, 펩타이드는 443개로 확인되었고, 1.5 fold-change 이상인 단백질은 191개, 펩타이드는 389개로 확인 되었으며, 이를 통해서 최종 227개 단백질과 492개 펩타이드가 타겟 후보군으로 선정되었다.

선정된 227개 단백질, 492개 펩타이드가 전체 인간 프로테옴 상에서 특이(unique) 펩타이드인지 여부를 확인하기 위해 NCBI의 BlastP search program 을 이용해서 unique 펩타이드 여부를 확인했다. 이를 통해서, unique 하지 않은 37개 펩타이드에 해당되는 15개 단백질이 제외되었고, 최종 정상 그룹과 HCC 그룹 간에 유의적인 차이를 보이면서 unique 펩타이드인 타겟 후보군으로 216개 단백질, 460개 펩타이드가 최종 선정되었다.

실시예 4. 타겟 후보군 마커의 혈액 내인성 펩타이드 여부 확인

실시예 3에서 선정된 단백질 및 펩타이드가 실세 혈액내에 존재하는지 여부를 다음과 같이 확인하였다.

이를 위해 216개 단백질에 해당되는 SIS (stable-isotope labeled standard) 펩타이드를 가지고 정상 그룹 60명, HCC 그룹 60명을 함께 통합(pooling)한 시료를 이용해서, 선정된 펩타이드가 실제 혈액 내에 존재하는 펩타이드가 맞는지 여부를 재확인했다. SIS 펩타이드는 펩타이드 C-말단의 라이신(Lys, K)이나 아르기닌Arg, R) 아미노산에 있는 ¹²C 와 ¹⁴N를 ¹³C 와 ¹⁵N로 치환한 펩타이드이다. 이는 혈액 내에 존재하는 펩타이드(endogenous peptide)와는 질량 값이 차이가 나지만, 동일한 서열을 갖기 때문에, 펩타이드 소수성(hydrophobicity)이 동일하므로, 크로마토그램 상에서 혈액 내 펩타이드와 동일한 시간(RT)에 용출(elution)된다(도 2 참조).

MRM 분석 시, 복합(Complex) 혈액 시료에서 타겟 펩타이드 이외의 다른 펩타이드에 의해서 시그널 간섭(interference) 현상을 보이는지 확인하기 위해서, SIS 펩타이드와 혈액 내 펩타이드의 생성 이온(Q3) 강도 패턴(intensity pattern)을 확인했다(도 3).

시그널 간섭현상 여부를 판단하기 위해서, AuDIT (Automated detection of inaccurate and imprecise transitions) 프로그램을 이용해서, 혈액 내 펩타이드 와 SIS 펩타이드의 상대적인 생성이온 강도를 비교하고(P-value threshold : 0.05), 혈액 내 펩타이드와 SIS 펩타이드의 피크 면적 값이 반복 측정 시 일정하게 검출되는지 여부(CV threshold : 0.2)를 확인했다.

이를 통해서, 시그널 간섭현상이 없이 정량 가능한 혈액 내 타겟 단백질/펩타이드로 최종적으로 123-단백질, 231-펩타이드가 선정되었다.

실시예 5. 혈액 내인성 펩타이드의 수준 확인

실시예 4에서와 같이 정량 가능한 혈액 내인성 타겟 (123-단백질protein, 231-펩타이드)을 대상으로 혈액 내에 존재하는 농도 수준(Endogenous level)을 확인했다. 정상 그룹 60명, HCC 그룹 60명을 모두 통합한 시료 10 μg 에 231-SIS 펩타이드 혼합물을 3-포인트(20nM, 200nM, 2000nM)로 순차적으로 희석한 것을 서로 섞은 시료를, MRM 분석해서 혈액 내 펩타이드에 대한 시그널과 이에 상보적인 합성 (SIS) 펩타이드의 시그널을 함께 확인했다.

간섭현상(Interference)이 존재하지 않는 생성 이온(Q3) 만을 대상으로 혈액 내 펩타이드의 피크 면적 값과 이와 상보적인 SIS 펩타이드(3-points)에 대한 피크 면적 값을 각각 구해서 상대적인 비율(ratio)을 계산하고, 여기에, 주입한 SIS-펩타이드 양을 곱해서 타겟 펩타이드에 대한 혈액 내 수준을 최종 확인했다(도 4).

231개 펩타이드에 대해 혈액 내 수준을 확인한 결과, 혈액(serum) 내에서 가장 낮은 농도로 확인된 단백질은 ISLR (Immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein)이고, 농도는 0.15-fmol/μg인 것으로 확인되었으며, 가장 높은 농도로 확인된 단백질은 A2MG (Alpha 2 macroglobulin)이며, 농도는 5.57-pmol/μg인 것으로 확인되었다 (Dynamic range : 3.7×10^4 order)(도 5).

혈액 내 레벨 측정 결과, 혈액 내 레벨이 20-fmol/㎍이하인 것으로 측정된 소량(Low-abundance) 타겟은 34-단백질, 36-펩타이드인 것으로 확인되었고, 20-fmol/㎍과 2000-fmol/㎍ 사이로 측정된 중간량(Middle-abundance) 타겟은 93-단백질, 174-펩타이드인 것으로 측정되었으며, 2000-fmol/㎍ 이상으로 측정된 다량(High-abundance) 타겟은 11-단백질, 22-펩타이드인 것으로 확인되었다(도 6).

실시예 6. 실제 개별 시료 적용을 통한 간암 조기진단 마커 후보군 도출

검증된 혈액 내인성 펩타이드를 대상으로 이에 상보적인 SIS 펩타이드 주입 농도를 결정했다. 소량(low abundance) 타겟(혈액 내 수준 < 20-fmol/㎍)의 경우, 모두 일괄적으로 20-fmol의 SIS-펩타이드를 주입했고, 중간량(Middle-abundance) 타겟 (20-fmol/μg < 혈액 내 수준 < 2000-fmol/μg)의 경우, 혈액 내 펩타이드 양과 동일하게 SIS 펩타이드 양을 주입했으며, 다량(High-abundance) 타겟(혈액 내 수준 > 2000-fmol/μg)의 경우, 모두 일괄적으로 2000-fmol 양의 SIS-펩타이드를 주입했다.

혈액 내 수준이 가장 낮게 측정된 ISLR 단백질의 경우, 20-fmol의 SIS-펩타이드를 주입할 경우, 혈액 내 수준에 비해 최대 13배 만큼 높은 양으로 주입했고, 혈액 내 수준이 가장 높게 측정된 A2MG 단백질의 경우, 2000-fmol의 SIS-펩타이드를 주입할 경우, 혈액 내 수준에 비해 최대 1/28 배 만큼 희석된 낮은 양으로 주입했다(도 7).

약물반응 평가 기준을 치료 반응(Treatment Response)으로 할때, 마지막으로 가면 궁극적으로 소수의 CR, PR 또는 SD(약물 부작용으로 중단한 경우)로 되고 대부분은 PD로 구별되므로, 최종 반응(Final Response)은 약제 효과 판단에 전혀 도움이 되지 않는다. 따라서 처음 화학요법을 시작해서 PD 나 S/E(Side Effect)으로 약제를 중단하게 되는 시점 중에 보였던 가장 좋은 반응(Best Overall Survival, BOR)을 기준으로, mRECIST (Modified Response Evaluation Criteria in Solid Tumors) 평가 척도를 기반으로 하여 2개의 그룹으로 구분해서 선별하였다.

약물 치료 후, 종양이 완전히 사라진 그룹(CR, Complete response)을 약물반응 순응군(Responders)으로 선정하였고, 그 외 종양의 크기가 30% 이상 줄어든 그룹(PR, Partial response), 변화가 거의 없는 그룹(SD, Stable disease) 그리고 20% 이상 증가한 그룹(PD, Progressive disease) 등 3개의 그룹을 모아 약물반응 불응군 (Non-Responders) 으로 선정하였다.

최종 검증된 타겟 후보군(123개 단백질, 231 펩타이드)을 대상으로 조기진단 목적으로 1차 시료로 소라페닙 치료를 받은 간암 환자 65-Paired (치료 전/후) 시료를 사용했고(표 1), 이는 약물반응 순응 그룹 21-paired 시료와 약물반응 불응 그룹 44-Paired 시료로 구성되고, 차 시료는 51-Paired 시료를 사용했고(표 2), 이는 약물반응 순응 그룹 20-paired 시료와 약물반응 불응 그룹 31-Paired 시료를 이용해서 마커를 도출하였다.

실험자가 환자 군을 확인할 수 없도록 블라인딩 후 MRM 분석 순서는 무작위로 하여 분석하였으며, 분석은 시료 당 3번씩 반복 분석했다. 이를 통해서 얻어진 타겟 펩타이드에 대한 피크 면적 값을 혈액 내 펩타이드의 피크 면적 값을 이와 상보적인 SIS 펩타이드의 피크 면적 값으로 표준화(normalization) 한 다음, IBM SPSS statistics (version 21.0) 및 GraphPad (version 6.00)을 통해서 분석을 진행했다.

[표 1] 약물반응 예후 예측 마커 선정을 위하여 사용된 임상 시료 정보(1차 시료)

[표 2] 약물반응 예후 예측 마커 선정을 위하여 사용된 임상 시료 정보(2차 시료)

실시예 7. 소라페닙 반응 여부를 예측하는 단일 마커 도출

간암 표적 치료제인 소라페닙 약물의 경우, 진행성 간암의 초기 치료제로서 유용하지만, 종양 크기가 감소하는 비율이 5% 미만이고, 생존 기간의 증가가 3개월 미만에 머물러서 가격 대비 효과가 크지 않다는 한계가 있다. 소라페닙 약물반응 예후의 예측을 통해, 낭비되는 의료비를 절감하기 위하여 소라페닙 치료 전, 약물반응 순응 환자 그룹과 약물반응 불응 환자 그룹간 발현 차이를 보이는 타겟을 우선순위로 두고 분석을 진행했다. 도 8에 모식도를 나타내었다.

1차 분석(Training set) 결과, 소라페닙 치료 전, 순응 환자군과 불응 환자군 간 진단력이 높은 (AUC-value ≥ 0.700) 타겟은 32-단백질, 44-펩타이드로 확인되었다. 2차 분석(Test set) 한 결과, 소라페닙 치료 전, 순응 환자군과 불응 환자군 간 진단력이 높은 (AUC-value ≥ 0.700) 차이를 보이는 타겟은 46-단백질, 7-펩타이드로 확인되었다.

1차 분석(Training set) 결과와 2차 분석(Test set) 결과에서 공통적으로, 소라페닙 치료 전 순응군과 불응군간 유의적인 차이 (P-value ≤ 0.05) 를 보이고, 진단력이 높은 (AUC-velue ≥ 0.700) Target 은 24개 단백질, 40개 펩타이드로 최종 확인하였다 (표 3-1, 3-2).

표 3-1, 3-2에서 두 군 (control vs. case) 비교 시, 적색은 AUC 값이 0.7 이상 차이를 보이면서, case 군에서 발현량이 증가되는 것. 파란색은 AUC 값이 0.7 이상 차이를 보이면서, case 군에서 발현량이 감소되는 것. 검은색은 두 군 간 차이가 AUC 값 0.7 이하인 것을 나타낸다.

[표 3-1] 약물반응 개별시료 분석 후 AUC 값 0.700 이상 타겟 목록

[표 3-2] 약물반응 개별시료 분석 후 AUC 값 0.700 이상 타겟 목록

실시예 8. 소라페닙 반응 예측용 다중 마커 도출

1차 분석(Training set) 결과와 2차 분석(Test set) 결과에서 소라페닙 치료 전, 순응 환자군과 불응 환자군에서 공통적으로 높은 진단력을 보인 24개 단백질, 40개 펩타이드를 대상으로 다변량 분석(Multi-variate Analysis, MA)을 통해 다중 단백질 마커 패널 구축 및 비교를 진행했다.

통계 분석법 중 하나인 로지스틱 회귀법을 이용하여 하나의 패널로 결합하는 분석을 수행한 결과, 소라페닙 치료 전, 약물반응 순응군과 불응군 간 비교 시 5개의 펩타이드 패널(FBLN1 + LG3BP + CO7 + CO7 + CD5L)이 가장 높은 진단력을 보이는 조합으로 확인되었다.

소라페닙 치료 전, 약물반응 순응군과 불응군 간 비교 시 상기 5개의 펩타이드 패널의 AUC 값은 0.980으로 확인되었고, 상기 5개의 펩타이드 패널을 통해 전체 41명 소라페닙 치료 순응군 중에서 37명을 순응군(Accracy 90.2%)으로, 75명 소라페닙 치료 불응군 중에서 71명을 불응군(Accuracy 94.7%)으로 진단할 수 있으므로, 5-펩타이드(4-단백질) 마커 패널을 이용한 진단 정확도는 93.1%로 확인되었다(도 9). 상기 4-단백질(5-펩타이드)에 나머지 20-단백질(35-펩타이드)을 추가할 경우, AUC 0.980 이상 되는 단백질 조합을 무수히 만드는 것이 가능함을 확인하였다.

실시예 9. 간암 약물반응 예후를 예측하는 마커에 대한 항체를 이용한 추가 검증

본원에 따른 마커는 단백질 수준에서 검출될 수 있으며, 단백질 수준에서의 검출방법은 본 실시예에서 사용한 MRM 분석 및 항체를 사용한 분석을 들 수 있으며, 한 가지 즉 MRM 분석만으로도 본원에 따른 목적하는 결과를 얻을 수 있거나, 또는 재확인을 위해 두 가지 방법을 모두 사용할 수도 있다.

간암 소라페닙 예후 예측 목적으로 MRM 분석(Peptide Level)으로 검증된 24-단백질 중에서 상위 AUC 값을 갖는 7개의 단백질을 대상으로 웨스턴 블랏팅(Protein Level) 을 진행했다 (표 4).

항체는 전체 단백질(whole protein) 중 일부 잔기로 구성되는 항원을 인식하기 때문에, 항체 선정 기준은 MRM으로 분석한 펩타이드 부분이 항체 면역원 부분에 포함(또는 가능하면 근접)되도록 하였고, 혈장/혈청에 대한 웨스턴 블랏팅 결과가 있는 것, 그리고 단일클론 항원이 존재하는 것을 우선으로 선정했으며, 사용된 항체는 표 3-1 및 표 3-2에 기재된 바와 같고, 항체는 Santa Cruz Biotechnology, USA에서 구입하였다.

웨스턴 블랏팅을 수행하기 위하여 4개 그룹 (약물반응 순응군 및 불응군에 대한 치료 전/후) 당 12명의 시료를 선별했으며, 이는 1차와 2차 MRM 분석에서 사용한 시료를 대상으로 무작위 선별을 통해, 간암 약물반응 예후 예측 마커 발굴을 위한 단백질 수준의 검증(Protein Level Validation)을 진행했다. 선별된 모든 군에 대한 통합된 시료를 통해 측정된 O.D 강도로 표준화(Normalization) 해서 SDS-PAGE 겔 간 편차(Variation) 보정을 진행했다. 대조군으로는 베타엑틴과 트렌스페린에 대한 mouse monoclonal 항체를 사용하였다.

결과는 도 10에 기재되어 있다. 이러한 결과는 본원에 따른 마커는 다양한 단백질 분석 방법을 통해 분석이 가능함을 나타낸다.

[표 4] 간암 약물반응 예후 예측 마커 항체 정보 목록

이어 소라페닙 예후 예측 목적으로 MRM 분석(Peptide Level)으로 검증된 24-단백질 중에서 그룹 간 구분력이 가장 높은 타겟 단백질 7종에 대해 실제 임상 영역(병원)에 곧바로 적용/이용하기 위한 목적으로 ELISA 분석 (Protein Level, Native form) 을 추가 진행했다. ELISA 분석을 수행하기 위하여 2-그룹 (소라페닙 치료 전,약물반응 순응군 및 불응군) 당 40명의 시료를 선별했으며, 1차와 2차 MRM 분석에 사용한 시료를 대상으로 무작위 선별을 통해, 최종 약물 반응 예측마커 발굴을 위한 단백질 수준 검증(Protein Level Validation)(Native Form)을 진행했다.

해당 ELISA 타겟 7종에 대한 ELISA 분석 결과, MRM 분석과 발현양상이 일치하는 타겟은 5종 (CD5L, IGHG1, IGHG3, IgJ 및 LG3BP)으로 확인되었고, 이 중에서 AUC 0.700 이상은 3종 [IGHG3(0.704), CD5L(0.764), 및 IgJ(0.779)]으로 최종 확인되었다(도 11).

실시예 10. 약물반응 예후 예측 ELISA 결과, 다중 마커 검증

단백질이 아닌 펩타이드를 측정하여 MRM 으로 정량 시 마커로 이용가능하다.

ELISA 분석 결과, MRM 분석과 발현양상이 일치하는 타겟 5종 (CD5L, IGHG1, IGHG3, IgJ and LG3BP)을 대상으로 다변량 분석(Multi-variate Analysis, MA)을 수행하여 이를 통해 다중 단백질 마커 패널을 구축하고 비교하였다.

통계 분석법 중 하나인 로지스틱 회귀법을 이용하여 하나의 패널로 결합하는 분석을 수행한 결과, 5개의 단백질 패널 구축시 AUC 값은 0.811로 확인되었고, 이는 전체 40명 소라페닙 치료 순응군 중에서 29명을 순응군 (Accracy 72.5%)으로, 40명 소라페닙 치료 불응군 중에서 28명을 불응군 (Accuracy 70.0%)으로 진단할 수 있으므로, 5-단백질 마커 패널을 이용한 진단 정확도는 71.25%인 것으로 확인되었다(도 12).

Claims

C163A (Scavenger receptor cysteine-rich type 1 protein M130), C1QB (Complement C1q subcomponent subunit B), CIQC (Complement C1q subcomponent subunit C), CATB (Cathepsin B), CD5L (CD5 antigen-like), CH3L1 (Chitinase-3-like protein 1), CO7 (Complement component C7), FA11 (Coagulation factor XI), FBLN1 (Fibulin-1), FBLN3 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1), FCG3A (Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A), FSTL1 (Follistatin-related protein 1), GPX3 (Glutathione peroxidase 3), IGHG1 (Ig gamma-1 chain C region), IGHG3 (Ig gamma-3 chain C region), IGJ (Immunoglobulin J chain), ISLR (Immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat protein), LG3BP (Galectin-3-binding protein), LUM (Lumican), QSOX1 (Sulfhydryl oxidase 1), SHBG (Sex hormone-binding globulin), SODE (Extracellular superoxide dismutase [Cu-Zn]) 및 THBG (Thyroxine-binding globulin)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 검출시약을 포함하는, 간세포암 표적치료제로서 소라페닙에 대한 반응 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 마커는 CD5L, IGHG1, IGHG3, IGJ, LG3BP 및 QSOX1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 간세포암 표적치료제로서 소라페닙에 대한 반응 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 마커는 CD5L, IGHG1, IGHG3, IGJ, LG3BP 및 QSOX1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나; 및 C163A, C1QB, CIQC, CATB, CH3L1, CO7, FA11, FBLN1, FBLN3, FCG3A, FSTL1, GPX3, IGHG1, ISLR, LUM, SHBG, SODE 및 THBG로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 마커의 조합인, 간세포암 표적치료제로서 소라페닙에 대한 반응 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 하나 이상의 마커는 CD5L, IGHG1, IGHG3, IGJ, LG3BP 및 QSOX1;
FBLN1, LG3BP, CO7 및 CD5L; 또는
LG3BP, IGHG1, IGHG3, CD5L 및 IGJ인, 간세포암 표적치료제로서 소라페닙에 대한 반응 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 검출 시약은 상기 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 간세포암 표적치료제로서 소라페닙에 대한 반응 예측용 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 단백질 수준의 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약이고,
상기 핵산 수준의 검출 시약은 핵산증폭반응, 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏용 시약인, 소라페닙 반응 예측용 조성물.
제 6 항에 있어서,
상기 단백질 수준의 검출 시약은 상기 마커의 단백질 전장 또는 그 단편을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics), 수용체, 리간드를 포함하고,
상기 핵산 수준 검출 시약은 상기 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열 및 상기 상보적인 서열의 단편을 특이적으로 인식하는 프라이머, 또는 프로브, 또는 프라이머 및 프로브를 포함하는, 소라페닙 반응 예측용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물은 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용, 마이크로어레이용, 핵산증폭용, 또는 면역분석용인, 소라페닙 반응 예측용 조성물.
제 8 항에 있어서,
상기 조성물은 MRM 분석용이며, 상기 MRM 분석에 사용되는 각 마커의 펩타이드는 하기 표 기재된 것인, 소라페닙 반응 예측용 조성물.
간세포암 환자의 소라페닙 약물 반응 예측에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
소라페닙의 투여가 필요한 간세포암 환자 유래의 생물학적 시료로부터 C163A, C1QB, CIQC, CATB, CD5L, CH3L1, CO7, FA11, FBLN1, FBLN3, FCG3A, FSTL1, GPX3, IGHG1, IGHG3, IGJ, ISLR, LG3BP, LUM, QSOX1, SHBG, SODE 및 THBG로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 바이오마커의 핵산 및/또는 단백질의 농도를 검출하는 단계;
상기 핵산 또는 단백질의 농도 검출 결과를 대조군 시료의 상응하는 마커의 결과와 비교하는 단계; 및
상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 농도에 변화가 있는 경우, 상기 대상체를 소라페닙 순응군으로 판정하는 단계를 포함하는, 인비트로에서 소라페닙 마커를 검출하는 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 전혈, 혈청 또는 혈장인, 인비트로에서 소라페닙 마커를 검출하는 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 바이오마커는 CD5L, IGHG1, IGHG3, IGJ, LG3BP 및 QSOX1으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 검출하는 단계는 단백질 또는 핵산 마이크로어레이 분석법, 핵산증폭, 항원-항체 반응, 또는 질량분석 방식으로 수행되는, 방법.