CN117222893A - 从血液来源的外来体中发现的用于诊断阿尔茨海默病的新生物标志物及使用其诊断阿尔茨海默病的方法 - Google Patents

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CN117222893A CN202180092372.XA CN202180092372A CN117222893A CN 117222893 A CN117222893 A CN 117222893A CN 202180092372 A CN202180092372 A CN 202180092372A CN 117222893 A CN117222893 A CN 117222893A
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Abstract

本发明涉及用于诊断阿尔茨海默病的外来体衍生的新生物标志物、包含该生物标志物的用于诊断阿尔茨海默病的组合物、包括该组合物的用于诊断阿尔茨海默病的试剂盒，以及使用该生物标志物、组合物或试剂盒提供诊断阿尔茨海默氏病的信息的方法。通过使用本发明提供的用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物，可以提高阿尔茨海默病的诊断率，并且可以按照阿尔茨海默病的进展阶段(健康的、MCI和AD)通过细分诊断来提高准确性、敏感性和特异性，由此该生物标志物将广泛用于有效诊断阿尔茨海默病和进一步用于治疗阿尔茨海默病。

Description

从血液来源的外来体中发现的用于诊断阿尔茨海默病的新生 物标志物及使用其诊断阿尔茨海默病的方法
技术领域
本发明涉及从血液来源的外来体(blood-derived exosomes)中发现的用于诊断阿尔茨海默病的新生物标志物以及使用该生物标志物诊断阿尔茨海默氏病的方法。更具体地，本发明涉及用于诊断阿尔茨海默病的外来体衍生的新生物标志物、包含该生物标志物的用于诊断阿尔茨海默病的组合物、包括该组合物的用于诊断阿尔茨海默病的试剂盒，以及使用该生物标志物、组合物或试剂盒提供诊断阿尔茨海默氏病的信息的方法。
背景技术
阿尔茨海默病是一种占痴呆症60％至70％的退行性脑疾病，是老年人中最具代表性的疾病。阿尔茨海默病发生在65岁至74岁人群中的10％，75岁至84岁人群中的19％，85岁及以上人群中的47％，且其发病率(onset rate)每年都在增加，已成为一个主要的社会问题。
现有产品是迄今为止对阿尔茨海默病研究鉴定的淀粉样蛋白β肽、总tau和磷酸化tau蛋白的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，其仅提供所述蛋白质的信息，对诊断没有太大帮助。
阿尔茨海默病诊断试剂盒的领先产品的市场份额和知名度是微不足道的，一种生物标志物对阿尔茨海默病的诊断准确性低，有必要通过形成阿尔茨海默病诊断生物标志物组(biomarker panel)来提高诊断率。
同时，外来体衍生的提取物显示出比一般血浆提取物更清楚的疾病与生物标志物之间的关系，并且可以被高度纯化，正在积极进行从外来体衍生的提取物中发现生物标志物的研究。
发明内容
技术问题
本发明人从更可靠的血液来源的外来体中发现了用于诊断阿尔茨海默病的新生物标志物，并开发了使用该生物标志物提供诊断阿尔茨海默病所需信息的方法。
技术方案
本发明的一个主要目的是提供从血液来源的外来体中发现的用于诊断阿尔茨海默病的新生物标志物。
本发明的另一个目的是提供一种方法，所述方法使用生物标志物、组合物或试剂盒提供诊断阿尔茨海默病所需的信息。
本发明的又一个目的是提供一种用于诊断阿尔茨海默病的组合物，其包含用于测量所述生物标志物的表达水平的试剂。
本发明的另一个目的是提供用于诊断阿尔茨海默病的试剂盒，其包含所述组合物。
本发明的另一个目的是提供一种方法，所述方法使用生物标志物、组合物或试剂盒提供信息以确认阿尔茨海默病的进展阶段。
本发明的另一个目的是提供用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物在制备用于诊断阿尔茨海默病的组合物中的用途。
本发明的另一个目的是提供用于诊断阿尔茨海默病的组合物在诊断阿尔茨海默病中的用途。
有利的效果
本发明提供的用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物可以广泛用于阿尔茨海默病的有效诊断，并进一步用于治疗阿尔茨海默病，因为所述生物标志物不仅可以提高阿尔茨海默病的诊断率，并且可以通过使用所述生物标志物根据阿尔茨海默病的进展阶段(健康的、MCI和AD)进行细分诊断来提高准确性、敏感性和特异性。
附图说明
图1是显示本发明提供的用于提供信息以确认阿尔茨海默病进展阶段的方法的示意图；
图2a和图2b是显示外来体样品蛋白质组学的第一分析和第二分析结果的图表，分为增加标志物和减少标志物；
图3显示了六种生物标志物(MYH9,TSP1,TERA,APOM,APOC3和APOA4)，其增加和减少模式由于第一和第二蛋白质组学分析而大量重叠；
图4a是显示按轻度认知障碍和阿尔茨海默病的顺序增加的趋势的候选物的模式集，其中在健康对照组中表达差异最低；
图4b是在轻度认知障碍中表现出特别增加的趋势的候选物的模式集；
图4c是显示出阿尔茨海默病中特别增加的趋势的候选物的模式集；
图4d是健康对照组中表现出最高表达的候选物的模式集；
图5是总结选择目标肽的转变工艺的示意图；
图6是总结优化靶SIS肽的转变的工艺的示意图；
图7是显示使用最终优化的SIS肽进行MRM分析的结果的图；
图8a是显示通过AuDIT分析来确认和验证AD特异性样品的转变表达差异的结果的图；
图8b是显示通过AuDIT分析来确认和验证MC特异性样品的转变表达差异结果的图。
图9是显示分析训练集中的个体样品的结果的图；
图10显示了通过个体样品分析获得的候选生物标志物1和5的ROC曲线；
图11是显示根据阿尔茨海默病的进展阶段分析三种生物标志物(ITGB3、APOA4和CRP)的表达水平的结果的图；
图12是显示通过夹心ELISA对8个克隆抗体进行配对测试的结果的表；
图13是显示通过夹心ELISA对8个克隆抗体进行配对测试的结果的图；
图14a是显示测量抗原-抗体亲和力的方法的示意图；
图14b显示了测量抗体1对抗原的亲和力的结果；
图14c显示了测量抗体3对抗原的亲和力的结果；
图14d显示了测量抗体6对抗原的亲和力的结果；
图15是显示开发阿尔茨海默病诊断试剂盒并测试试剂盒性能的方法的示意图；
图16是显示阿尔茨海默病诊断试剂盒中包括的生物标志物组合的示意图；
图17是显示当制备以与阿尔茨海默病相关的标志物Tau为模板的试剂盒作为实例时点样生物标志物然后进行测定的工艺的示意图；
图18是显示三种生物标志物的点样顺序的示意图；
图19是显示基于待点样的抗体的浓度差异建立斑点形状的条件的工艺的照片；
图20a是显示寻找APOA4点样条件的实验结果的照片；
图20b显示了在认为是APOA4点样组合物中最合适的条件下对低滴度、中滴度和高滴度样品进行测试的结果；
图21是显示实施ITGB3筛选试验的结果的照片；
图22是显示对CRP标志物进行点样测试的结果的照片和图表；
图23是显示APOA4、CRP和ITGB3的特定点样组合物的图表；
图24是显示在三种标志物点样后用于稳定点样抗体的测试条件的结果的照片；
图25是显示在三种标志物点样后对点样抗体进行封闭试验的结果的照片；
图26是显示在三种标志物的点样后，对点样抗体进行干燥测试的结果的照片；
图27是显示测试样品稀释剂的条件的结果的照片；
图28是显示测试缀合物稀释剂的条件的结果的照片；
图29a是显示对ITGB3进行蛋白质印迹分析的结果的照片和图表；
图29b是显示对APOA4进行蛋白质印迹分析的结果的照片和图表；
图29c是显示对CRP进行蛋白质印迹分析的结果的照片和图表；
图30是显示使用最终构建的试剂盒分析实际样品的结果的照片；
图31是显示ITGB3标志物的相关分析结果的图；和
图32是显示APOA4标志物的相关性分析结果的图。
具体实施方式
为了实现上述目的，本发明的一个实施方案提供了用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物，包括选自APOA4、ITGB3及其组合的蛋白质。
通过本申请人的源技术SG Cap技术，已经开发出一种多生物标志物诊断试剂盒，该试剂盒可以同时检测现有的标志物和新发现的标志物，而不是单一的生物标志物，并且期望现有的单一生物标志物试剂盒所缺乏的诊断的准确性、敏感性和特异性可以增加。在韩国专利号10-1274765、10-0784437和10-1547643中描述了该源技术的内容。
为了开发一种用于客观评估和诊断阿尔茨海默病发病(onset)的方法，本发明人进行了各种研究，以发现血清中的蛋白质中，其表达水平根据阿尔茨海默病的发病而变化的蛋白质标志物。结果，本发明人已经证实APOA4和ITGB3的表达水平根据阿尔茨海默病的发病而变化，并且发现APOA4和ITGB3作为标志物。
本发明的术语“诊断”包括确定受试者对特定疾病或病症的易感性的行为，确定受试者当前是否患有特定疾病或病症的行为，确定患有特定疾病或病症的受试者的预后的行为；或therametrics(例如，监测受试者的状况以提供有关治疗效果的信息的行为)。
在本发明中，可以将阿尔茨海默病的诊断解释为是指客观地确定目标患者中阿尔茨海默病的发病或当阿尔茨海默病出现时阿尔茨海默病的进展阶段的行为。
本发明的术语“APOA4(apolipoprotein A-IV，载脂蛋白A-IV)”是指由APOA4基因表达的一种类型的血浆蛋白，并且可以称为apoA-IV、apoAIV或apoA4。在从该基因表达由396个氨基酸组成的蛋白质后，通过成熟过程表达由376个氨基酸组成的糖蛋白APOA4。在大多数哺乳动物中，已知APOA4在肠中表达并分泌到循环系统中。关于APOA4的特定氨基酸序列或编码该蛋白质的基因的核苷酸序列的信息在诸如NCBI的数据库中报导。例如，将该序列报导为GenBank登录号NP_031494,NM_007468,NM_000482等。
本发明的术语“ITGB3(Integrinβ3，整合素β3)”是指构成细胞表面蛋白之一的整合素的肽，并且已知整合素参与细胞粘附和细胞表面介导的信号转导。关于ITGB3的特定氨基酸序列或编码该蛋白质的基因的核苷酸序列的信息在诸如NCBI的数据库中报导。例如，将该序列报导为GenBank登录号NM_000212,NM_016780,NP_000203,NP_058060等。
本发明提供的用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物可以进一步包括CRP。
本发明的术语“CRP(C-反应蛋白)”是在人血浆中发现的环状五聚体蛋白，在肝脏中合成，并且由于当人体处于炎症状态时血液中的CRP浓度增加，因此经常用作确定人体是否处于炎症状态的测试工具。关于CRP的特定氨基酸序列或编码该蛋白质的基因的核苷酸序列的信息在诸如NCBI的数据库中报导。例如，将该序列报导为GenBank登录号NM_007768,NP_031794等。
本发明的另一个实施方案提供了一种方法，该方法使用生物标志物、组合物或试剂盒提供诊断阿尔茨海默病所需的信息。
具体地，本发明的用于提供确定阿尔茨海默病发病所需的信息的方法包括(a)定量分析选自APOA4、ITGB3及其组合的标志物蛋白在包括怀疑患有阿尔茨海默病的人在内的受试者的血清样品中的表达水平；和(b)将定量分析的标志物蛋白水平与确定阿尔茨海默病的发病相关联。
本发明的术语“受试者”可以包括但不限于患有或可能患有阿尔茨海默病的哺乳动物，包括小鼠、牲畜、人类等、养殖鱼类等。
在本发明中，本领域技术人员已知的任何方法都可以用于定量分析蛋白质表达水平的步骤。作为具体实例，可以使用PCR、连接酶链反应(LCR)、转录扩增、自主序列复制和基于核酸的序列扩增(NASBA)方法等，但不限于这些方法。此时，根据本发明的用于诊断阿尔茨海默病的标志物蛋白的氨基酸序列或编码该蛋白的基因的核苷酸序列在诸如NCBI的数据库中是已知的，并且本领域技术人员可以使用测量蛋白表达水平所需的适当手段。
各个蛋白质的定量分析水平根据患者的状况而变化，因此仅使用其中一种蛋白质的定量分析水平来确定阿尔茨海默病的发病是不容易的，并且可以组合和分析各个蛋白质的定量分析水平来确定阿尔茨海默病的发病。
作为组合和分析蛋白质的各个定量分析结果的方法的例子，可以采用通过单独或组合使用从血清样品测量的每种蛋白质的定量分析水平来确定阿尔茨海默病的发病的方法。
作为组合和分析蛋白质的各个定量分析结果的方法的另一个例子，可以采用常规的统计分析方法。此时，不特别限定可以使用的统计分析方法，作为示例，可以单独使用或组合使用线性或非线性回归分析方法；线性或非线性分类分析方法；ANOVA；神经网络分析方法；遗传分析方法；支持向量机分析方法(support vector machine analysis method)；层次分析或聚类分析方法；使用决策树的分层算法或核主成分分析方法；马尔科夫毯(Markov Blanket)分析方法；递归特征消除或基于熵的递归特征消除分析方法；前向浮动搜索或后向浮动搜索分析方法等。
可以使用能够自动执行统计方法的计算机算法来执行定量分析结果的组合。
本发明提供的用于提供确定阿尔茨海默病的发病所需的信息的方法可以进一步包括在步骤(a)中定量分析CRP蛋白的表达水平的步骤。
本发明的另一个实施方案提供了一种用于诊断阿尔茨海默病的组合物，其包含用于测量生物标志物的表达水平的试剂。
本发明的术语“用于测量表达水平的试剂”是指能够特异性结合并识别蛋白质或编码该蛋白质的mRNA或扩增miRNA的试剂。其具体实例包括但不限于特异性结合该蛋白质的抗体、特异性结合miRNA的引物或探针，并且本领域技术人员将能够为本发明的目的选择合适的试剂。
可以直接或间接标记该试剂以测量蛋白质或mRNA的表达水平。具体地，配体、珠、放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光剂、化学发光材料、磁性粒子、半抗原、染料等可以用作标记，但标记不限于此。作为具体实例，配体包括生物素、亲和素、链亲和素等，酶包括萤光素酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等，荧光剂包括荧光素、香豆素、罗丹明、藻红蛋白、磺基罗丹明酰氯(得克萨斯红)等，但标记不限于此。大多数已知的标记可以用作这类可检测的标记，并且本领域技术人员将能够根据本发明的目的选择适当的标记。
本发明的术语“抗体”是指能够特异性结合蛋白质或肽分子的抗原位点的蛋白质分子，并且这种抗体可以根据常规方法通过将每个基因克隆到表达载体中以获得由标志物基因编码的蛋白质来制备，并通过常规方法将所获得的蛋白质形成抗体。对抗体的形式没有特别限制，任何具有抗原结合特性的多克隆抗体、单克隆抗体或其部分也包括在本发明的抗体中，并且不仅可以包括所有免疫球蛋白抗体，还可以包括特殊抗体，例如人源化抗体。抗体包括抗体分子的功能片段以及具有两个全长轻链和两个全长重链的完整形式。抗体分子的功能片段是指至少具有抗原结合功能的片段，并且可以包括Fab,F(ab′),F(ab′)2和Fv。
本发明的术语“引物”是具有短的游离3′末端羟基的核苷酸序列，并且是指能够与互补的模板形成碱基对并作为复制模板链的起点的短序列。在本发明中，用于miRNA扩增的引物可以成为单链寡核苷酸，其可以在适当的缓冲液中在适当的温度在适当的条件下(例如，四种不同的核苷三磷酸盐和聚合剂如DNA、RNA聚合酶或逆转录酶)作为模板指导的DNA合成的起点，并且引物的适当长度可以根据使用目的而变化。引物序列不必与该基因的miRNA的多核苷酸或其互补多核苷酸完全互补，并且可以使用任何引物，只要其序列足以互补用于杂交即可。
本发明的术语“探针”是指能够特异性结合miRNA的标记核酸片段或肽。作为具体实例，探针可以构建为寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针、RNA探针、寡核苷酸肽探针或多肽探针的形式。
本发明的另一个实施方案提供了一种用于诊断阿尔茨海默病的试剂盒，包括用于测量生物标志物的表达水平的定量装置。
本发明的诊断试剂盒中包括的定量装置可以测量标志物蛋白的表达水平。作为具体实例，试剂盒可以是RT-PCR试剂盒或ELISA试剂盒，但不限于此，只要可以测量miRNA或蛋白质的表达水平即可。
在这种情况下，RT-PCR试剂盒可以是包括实施RT-PCR所需的必需元件的试剂盒。例如，RT-PCR试剂盒除了包括对该基因特异的每种引物外，还可以包括试管或其他合适的容器、反应缓冲液(具有各种pH和镁浓度)、脱氧核苷酸(dNTP)、二脱氧核苷酸(ddNTP)、酶如Taq聚合酶和逆转录酶、DNA酶、RNA酶抑制剂、DEPC水、无菌水等。还可以包括对用作定量对照的基因特异的引物对。
本发明的另一个实施方案提供了一种方法，所述方法使用生物标志物、组合物或试剂盒提供信息以确认阿尔茨海默病的进展阶段。
具体地，本发明的用于提供信息以确认阿尔茨海默病的进展阶段的方法包括(a)定量分析选自APOA4、ITGB3及其组合的标志物蛋白在包括怀疑患有阿尔茨海默病的人在内的受试者的血清样品中的表达水平；和(b)将定量分析的标志物蛋白水平与确定阿尔茨海默病的发病相关联。
在该方法中，“受试者”、“蛋白质表达水平的定量分析”、“定量分析结果的组合”等如上所述。
本发明提供的用于提供信息以确认阿尔茨海默病的进展阶段的方法可以进一步包括在步骤(a)中定量分析CRP蛋白的表达水平的步骤。
在本发明提供的用于提供信息以确认阿尔茨海默病的进展阶段的方法中，阿尔茨海默病的进展阶段是健康对照(HC)-轻度认知障碍(MCI)-阿尔茨海默病(AD)，其可以随着严重程度的增加而分阶段诊断。例如，作为MCI特异性标志物的APOA4可以用于分别诊断HC、AD和MCI，且ITGB3可以用于分别诊断HC和AD(图1)。
图1是显示本发明提供的用于提供信息以确认阿尔茨海默病进展阶段的方法的示意图。
本发明的又一个实施方案提供了用于诊断阿尔茨海默病的生物标志物的用途，用于制备诊断阿尔茨海默病的组合物或试剂盒。
本发明的另一个实施方案提供了用于诊断阿尔茨海默病的组合物或试剂盒的用途，用于诊断阿尔茨海默病。
实施本发明的模式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例旨在说明本发明，并且本发明的范围不限于这些实施例。
实施例1：生物标志物的筛选
为了寻找预测阿尔茨海默病的候选生物标志物，从健康对照组、轻度认知障碍患者组和阿尔茨海默病患者组的血液中提取外来体(exosomes)，并通过蛋白质组学对相同的样品进行第一分析和第二分析。然后，对于第一和第二分析中的每一个分析，在健康对照组、轻度认知障碍患者组和阿尔茨海默病患者组中选择50个具有显著蛋白质增加和减少的生物标志物作为第一分析和第二分析的结果。最后，总结了在第一分析和第二分析中具有显著重叠的增加和减少类型的生物标志物(图2a、图2b和图3)。
图2a和2b是显示外来体样品蛋白质组学的第一分析和第二分析结果的图表，分为增加标志物和减少标志物；图3显示六种生物标志物(MYH9,TSP1,TERA,APOM,APOC3和APOA4)，其增加和减少类型作为第一和第二蛋白质组学分析的结果有大量重叠。
实施例2：实施例1中选择的生物标志物与阿尔茨海默病相关性的验证
为了发现通过实施例1获得的用于阿尔茨海默病早期诊断的生物标志物，从阿尔茨海默病(AD)、轻度认知障碍(MCI)和健康的人的血浆样品中提取外来体，这些血浆样品获自瑞士(Universitéde Genève,Neurix)，并进行研究以发现和验证用于预测阿尔茨海默病和轻度认知障碍的生物标志物。
实施例2-1：生物标志物验证前通过模式对所选的候选蛋白的表达进行分类
通过比较阿尔茨海默病和轻度认知障碍患者组之间所选的候选蛋白的表达差异，建立了总共四种表达模式(图4a至4d)。
图4a是显示按轻度认知障碍和阿尔茨海默病的顺序增加的趋势的候选物的模式集(pattern set)，其中在健康对照组中表达差异最低；图4b是在轻度认知障碍中表现出特别增加的趋势的候选物的模式集；图4c是显示出阿尔茨海默病中特别增加的趋势的候选物的模式集；图4d是健康对照组中表现出最高表达的候选物的模式集。
实施例2-2：选择代表性目标肽和转变(transition)用于候选生物标志物的MRM验证
为了对预测阿尔茨海默病和轻度认知障碍的所选候选生物标志物进行MRM验证，选择了可以特异性代表每种蛋白质的目标肽。为了检测效率，排除含有6至20个氨基酸并且含有未被蛋白质翻译后修饰或胰蛋白酶片段化的序列的肽。在MRM分析中，根据实验室中使用的仪器安捷伦(Agilent)，作为表示定量值的前体离子(Q1)和产物离子(Q3)的组合的转变也被设定在50m/z至1350m/z的范围内，并且每一肽选择至少三个转变(图5)。
图5是总结选择目标肽的转变工艺的示意图。
实施例2-3:SIS肽转变(peptide transition)优化工艺
通过参考在线文库(SRMAtlas，国家癌症研究所癌症临床蛋白质组学，PeptideAtlas)，为每个靶蛋白选择至少三个目标肽。优先合成和构建SIS肽，其具有与目标肽相同的序列，但用同位素(13C和15N)标记赖氨酸和精氨酸的碳和氮。此后，分析SIS肽，并进行转变优化(图6)。
图6是总结优化靶SIS肽的转变的工艺的示意图。
将通过SIS肽优化的转变掺入样品中，合并，用于各对照组、轻度认知障碍组和阿尔茨海默病组，同时进行MRM分析。通过同时分析SIS肽和合并的样品，可以确定准确的洗脱时间和标准化绝对定量。通过应用AuDIT(不准确和不精确转变的自动检测)程序的分析再现性(变异系数，CV<20％)和统计参考值(p值<0.05)，在定量期间将检测到的转变再验证为可靠的转变(图7)。
图7是显示使用最终优化的SIS肽进行MRM分析的结果的图。
作为AuDIT分析的结果，选择了对应于215个肽的1572个转变作为个体样品验证的最终候选。
实施例2-4：试剂盒开发中使用的最终生物标志物的选择和患者样品中最终生物标志物的验证
为了提高个体样品验证的可靠性，通过将所有样品分为两个独立的队列(训练集和测试集)来进行分析。基于训练集的个体样品分析结果，利用多项式回归分析和C统计量(C-statistic)对阿尔茨海默病、轻度认知障碍和健康对照组进行分析，并将结果作为生物标志物选择的基础，并在考虑以下几个其他因素的情况下选择最终的生物标志物。
目前，作为分析一些个体样品的结果，证实了一些候选物在各个疾病组和健康对照组之间显示出显著的表达差异(图8a和8b)。
图8a是显示通过AuDIT分析来确认和验证AD特异性样品的转变表达差异(transition expression difference)的结果的图，图8b是显示通过AuDIT分析来确认和验证MC特异性样品的转变表达差异结果的图。
通过接受者操作特征(ROC)曲线检查AUC值来验证候选生物标志物，并选择AUC值为0.7或更大的候选生物标志物，这是评估标准。此后，通过分析测试集中的个体样品，将通过训练集验证的候选物再验证为阿尔茨海默病特异性生物标志物(图9)。
图9是显示分析训练集中的个体样品的结果的图。
基于分析个体样品的结果，决定将MCI特异的候选生物标志物5(APOA)用作诊断试剂盒中的生物标志物。即使对于属于同一组的APOA生物标志物，MS/MS结果也是不同的，并且证实了特别地APOA4是MCI特异的(图10)。
图10显示了通过个体样品分析获得的候选生物标志物1和5的ROC曲线。
在AD特异的候选生物标志物1(ITGB3)的情况下，ROC值为0.71，并且决定该候选生物标志物1将与APOA4一起用于诊断试剂盒中。选择AD特异的标志物为可用于阿尔茨海默病的诊断，因为其表达水平随着疾病从健康对照组向MCI组和AD组的恶化而逐渐增加。
最后，在相同的孔中也点样了CRP生物标志物。CRP由于窄的差距而未能通过ROC值，所述ROC值是选择生物标志物的内部标准，但当后来积累更多数据时，考虑到该生物标志物具有参与炎性应答的特性，并且在文献中是与阿尔茨海默病相关的标志物，试图发现阿尔茨海默病与该生物标志物之间的显著相关性。
实施例2-5：外来体蛋白质组学分析的结果
当检索阿尔茨海默病生物标志物时，分别从处于健康对照、轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)阶段的患者的血液中提取的外来体(16个HC、9个MCI和17个AD)被汇集用于相同的疾病阶段，以制备每个疾病阶段的三个汇集样品，并对以上鉴定的三种生物标志物(ITGB3、APOA4和CRP)进行蛋白质组学分析(图11)。
图11是显示根据阿尔茨海默病的进展阶段分析三种生物标志物(ITGB3、APOA4和CRP)的表达水平的结果的图。
如图11所示，由于三种生物标志物的表达水平对于阿尔茨海默病的每个进展阶段显示出不同的模式，因此分析出可以通过三种生物标志物的表达水平模式来诊断阿尔茨海默病的进展阶段。
实施例3：通过夹心ELISA开发八种针对经验证生物标志物的抗体并选择抗体对
为了使用选定的MCI特异性生物标志物APOA4进行诊断，首先构建了抗体。没有构建针对ITGB3和CRP这两种APOA4以外的生物标志物的抗体，而是使用商业采购的抗体来开发。
实施例3-1：针对已验证生物标志物的八种抗体的开发
将APOA4抗原注射到小鼠中以诱导免疫反应，由此构建杂交瘤以构建总共五种克隆抗体，并且使用山羊以相同的方式构建三种克隆抗体。为了方便起见，将8个克隆的抗体任意命名为抗体1至抗体8，然后通过ELISA方法与APOA4抗原反应以进行配对测试。
通过夹心ELISA对上述构建的8种抗体进行配对测试，并且分别使用捕捉抗体和检测抗体对构建的8个抗体进行测试(图12和图13)。
图12是显示通过夹心ELISA对8个克隆抗体进行配对测试的结果的图，且图13是显示进行配对试验结果的图。
如图12和图13所示，选择了两对认为适合作为诊断试剂盒中使用的对((捕捉抗体1、检测抗体6)、(捕捉抗体3、检测抗体6))。
实施例3-2：使用夹心ELISA和抗体对选择的亲和力测量
测定作为配对测试的结果而选择的抗体1、抗体3和抗体6对抗原的亲和力(图14a)。此时，用于亲和力测量的抗原是构建抗体时使用的抗原。测量三种抗体中每一种的抗原-抗体亲和力(抗体1-抗体6、抗体3-抗体6)。采用直接ELISA法作为基本检测方法。通过引起抗原和抗体之间的竞争结合的实验(竞争结合测定法)来测量亲和力。通过绘制Klotz图来确定在抗原-抗体竞争结合实验中使用的检测抗体的量。
使确定量的检测抗体和连续稀释的抗原反应，然后将所得物分配到抗原包被的孔中，并在450nm处测量荧光。
使用Sigma绘图软件绘制测量的OD值，以测量解离常数Kd值，其为抗原-抗体亲和力。
图14a是显示测量抗原-抗体亲和力的方法的示意图。
实施例3-2-1：抗体1对抗原的亲和力的测量
通过自我评估进行抗体1对抗原的亲和力的测试(图14b)。
图14b显示了测量抗体1对抗原的亲和力的结果。
如图14b所示，使用Sigma绘图软件获得的解离常数Kd值为11.38nM，证实其比作为评价标准的1nM的亲和力低约10倍或更多倍，并且发现抗体1不适合用于试剂盒开发。
实施例3-2-2：抗体3对抗原的亲和力的测量
通过自我评估进行抗体3对抗原的亲和力的测试(图14c)。
图14c显示了测量抗体3对抗原的亲和力的结果。
如图14c所示，使用Sigma绘图软件获得的解离常数Kd值为0.2035nM，证实其比作为评价标准的1nM的亲和力高约5倍或更多倍，并且发现抗体3适合用于试剂盒开发。
实施例3-2-3：抗体6对抗原的亲和力的测量
通过自我评估进行抗体6对抗原的亲和力的测试(图14d)。
图14d显示了测量抗体6对抗原的亲和力的结果。
如图14d所示，使用Sigma绘图软件获得的解离常数Kd值为0.2755nM，证实其比作为评价标准的1nM的亲和力高约4倍或更多倍，并且发现抗体6适合用于试剂盒开发。
基于亲和力测量的结果，分别使用抗体3和抗体6作为捕捉抗体和检测抗体来开发诊断试剂盒。
实施例4：阿尔茨海默病诊断试剂盒的开发
实施例4-1：诊断试剂盒概述
从试剂盒构建到性能测试的每个步骤可以分为三个主要步骤，分别是抗体点样工艺、点样抗体稳定工艺和测定反应工艺。由于每个步骤中的pH和抗体浓度等条件影响试剂盒的性能，因此可以说试剂盒开发的关键是寻找这些条件并选择最佳条件(图15)。
图15是显示开发阿尔茨海默病诊断试剂盒并测试试剂盒性能的方法的示意图。
已经确定，通过利用我们公司的技术优势，使用两种或更多种生物标志物的诊断试剂盒在结果的可靠性和准确性方面比仅用一种新的生物标志物构建阿尔茨海默病诊断试剂盒更有利，从而可以进行多重诊断。
将最终诊断试剂盒的开发目标设定为使用总共三种不同的生物标志物进行多重诊断，并且这三种生物标志物的配置是MCI特异的APOA4、AD特异的ITGB3、以及CRP，这预计在进一步的临床试验中是显著的(图16)。
图16是显示阿尔茨海默病诊断试剂盒中包括的生物标志物组合的示意图。
实施例4-2：生物标志物的点样
使用抗体3进行点样工作，该抗体在实施例3-2中的通过溶胶-凝胶法(sol-gelmethod)测定的亲和力分析结果中显示出优越的亲和力，这是PCL股份有限公司的核心技术。
对于该点样工艺，将捕捉抗体点样在板孔的底部，然后将抗原和检测抗体通过夹心ELISA法反应，并且通过在532nm处扫描来测量信号值(图17)。
图17是显示当制备以与阿尔茨海默病相关的标志物Tau为模板的试剂盒作为实例时点样生物标志物然后进行测定的工艺的示意图。
在使用实际样品之前，使用抗体构建时使用的购买抗原对测定法中使用的抗原进行测定，并且这是为了在随后建立溶胶-凝胶点样工艺时，用大量实际样品更准确地验证实际患者样品。
首先，基于作为MCI特异的生物标志物的APOA4标志物搜索点样组合物，并且当建立了APOA4标志物的组合物时，然后用ITGB3点样APOA4标志物，并且最后将包括CRP的所有三种标志物一起点样以完成试剂盒构建(图18)。
图18是显示三种生物标志物的点样顺序的示意图。
特别地，在APOA4的情况下，在试剂盒构建中使用构建所基于的抗体，并且不是将新构建的抗体而是将商业获得的抗体用作APOA4以外的标志物ITGB3和CRP的点样和反应性抗体。对这两种标志物的抗体也进行了筛选，以选择合适的抗体，并使用所选择的抗体。
将捕捉抗体与溶胶-凝胶混合，并根据本申请人预先建立的与溶胶-凝胶的组合物有关的方案进行点样，结果，观察到斑点缩小的现象。根据经验推断，这种现象主要是由捕捉抗体的浓度过低引起的，并且进行了从现有捕捉抗体的0.5mg/mL浓度到1mg/mL的浓度，并且在相同的溶胶-凝胶组成下再次进行点样以改善斑点缩小(图19)。
图19是显示基于待点样的抗体的浓度差异建立斑点形状的条件的工艺的照片。
根据图19的结果，将捕捉抗体的浓度设置为1mg/mL，以反映使用抗体的各种组合物和溶胶-凝胶点样的后续实验中的结果。
在捕捉抗体和溶胶-凝胶在APOA4标志物的各种组成下的点样实验期间，发现组合物(CBS-3)具有略高的信号值(图20a和图20b)。
图20a是显示寻找APOA4点样条件的实验结果的照片，且图20b显示了在认为是APOA4点样组合物中最合适的条件下对低滴度、中滴度和高滴度样品进行测试的结果。
实施例4-3:ITGB3点样试验
在ITGB3标志物的情况下，根据我们公司已建立的方案，对10至12种点样组合物进行筛选测试，并通过此，选择了认为是显著的组合物。结果，可以从未添加任何成分的CBS组合物获得显著的信号值，并将其选择为点样条件(图21)。
图21是显示实施ITGB3筛选试验的结果的照片。
实施例4-4:CRP点样试验
在CRP标志物的情况下，使用我们公司作为方案建立的点样组合物进行点样，如筛选ITGB3标志物的情形。作为仅在该组合物上进行筛选测试的结果，在两种组合物：R-1组合物和R-1-1上获得了显著的信号值，其中溶胶-凝胶的比率很低。然而，在R-1-1的情况下，称为Sol3的粘性大的物质包括在组合物的原料中，因此认为在未来试剂盒的大规模生产过程中在工艺或质量控制方面会有困难，并且最终选择了R-1组合物(图22)。
图22是显示对CRP标志物进行点样测试的结果的照片和图表。
由此建立了APOA4、CRP和ITGB3的点样组合物(图23)。
图23是显示APOA4、CRP和ITGB3的特定点样组合物的图表。
此后，进行点样抗体老化测试、阻断测试和干燥测试，它们是稳定点样抗体的工艺。
实施例4-4-1：点样抗体老化测试
在POA4、ITGB3和CRP全部点样之后，测试老化步骤的条件，该老化步骤是帮助斑点稳定点样的步骤(图24)。大致而言，老化条件测试是在具有约60％的高湿度的生产室和具有约9％的低湿度的干燥器的两个条件以及2小时和过夜这两个时间条件下进行的。
图24是显示在三种标志物点样后用于稳定点样抗体的测试条件的结果的照片。
如图24所示，证实了当在干燥器中进行老化时信号值高，并且斑点的形状在2小时的条件下比在过夜的条件下更稳定；结果，在干燥器、室温作为老化地点的条件下，在2小时的老化时间下，斑点的稳定性得到改善，并将该条件确定为老化条件。
实施例4-4-2：点样抗体封闭试验
确定老化条件后，进行封闭缓冲液试验，这是一种旨在消除非特异性反应的工艺。用总共三种缓冲液进行封闭缓冲液测试，包括我们现有方案中使用的缓冲液(BSA 1％，山羊血清0.1％，吐温20 1g，叠氮钠2g)和StabiliBlock稳定剂SG01和ST01(图25)。
图25是显示在三种标志物点样后对点样抗体进行封闭试验的结果的照片。
如图25所示，确认了当用ST01进行封闭时，在信号值和斑点稳定性方面获得了最有利的信号。
实施例4-4-3：干燥条件测试
在封闭工艺之后，为了干燥孔，在两个湿度条件和两个时间条件下进行了测试。通过设置湿度为60％的生产室和湿度为9％的干燥器的两个条件以及2小时和过夜这两个时间条件来进行测试(图26)。
图26是显示在三种标志物的点样后，对点样抗体进行干燥测试的结果的照片。
如图26所示，干燥条件之间的信号值差异不大，但考虑到在除干燥器和过夜条件之外的条件下孔未完全干燥的事实，确定干燥器和过夜条件为最终的干燥条件。
实施例4-5：诊断试剂盒最终测定法的标准化测试
诊断试剂盒的测定工艺标准是根据我们公司制定的方案设定的，并且在此基础上，通过修改条件如样品稀释剂和缀合物稀释剂来选择最佳的测定条件。
实施例4-5-1：样品稀释剂条件测试
在测定时，对要与样品一起分配的稀释剂进行了条件测试(图27)。
图27是显示测试样品稀释剂的条件的结果的照片。
如图27所示，通过将样品与样品稀释剂的比例设定为1:4并将分配的总体积设定为100μL来进行反应，结果，当使用含有山羊血清的样品稀释剂时，获得了最改善的结果。
实施例4-5-2：缀合物稀释剂的条件测试
在与样品反应后的第二反应中，对待分配的缀合物稀释剂进行了条件测试(图28)。
图28是显示测试缀合物稀释剂的条件的结果的照片。
结果，如图28所示，证实了当使用添加了BSA的缓冲液进行反应时，所有标志物的信号值都增加。
实施例4-5-3：诊断试剂盒最终测定法的标准化信息
根据实施例的结果，最终确认的诊断试剂盒的最终测定法的标准化信息如下：
i.老化信息
1.室温干燥器2小时
ii.封闭信息
1.室温1小时
iii.干燥信息
1.室温干燥器过夜
iv.运行信息
1.所用设备：振摇器(Shaker)
2.测定法方案
[表1]
/>
v.分析信息
1.拍摄设备：Sensovation设备
实施例4-6：最终的试剂盒构建和实际的样品测试
根据点样条件在一个孔中点样三种标志物，并使用HC、MCI和AD的实际样品进行试剂盒性能测试。在从380名患者提取的样品中，对每个疾病阶段合并三到四个样品。最后，总共设置了69个样品，HC组、MCI组和AD组各23个样品。
实施例4-6-1：外来体蛋白质印迹分析结果
为了验证生物标志物APOA4、CRP和ITGB3，通过蛋白质印迹分析测试了大量外来体样品(每个阶段23个样品，共69个样品)。此时，考虑到蛋白质印迹的凝胶之间的差异，在不进行实验的情况下，通过收集每个疾病阶段的患者来任意设置样品的顺序(图29a、图29b和图29c)。
图29a是显示对ITGB3进行蛋白质印迹分析的结果的照片和图表，图29b是显示对APOA4进行蛋白质印迹分析的结果的照片和图表，且图29c是显示对CRP进行蛋白质印迹分析的结果的照片和图表。
如图29a、图29b和图29c所示，WB结果与ITGB3和APOA4情况下的蛋白质组学结果相对应，但难以通过WB分析CRP，因此在最终结论中附上了这些结果，但将其排除在相关性分析之外。
实施例4-6-2：最终的试剂盒构建后的实际样品分析的结果
通过将从与蛋白质印迹分析实验中相同的患者获得的69个血浆样品与构建的试剂盒反应来获得结果(图30)。
图30是显示使用最终构建的试剂盒分析实际样品的结果的照片。
实施例4-6-3：实际样品分析结果与WB分析结果之间的相关性
比较并分析在实施例4-6-2中获得的数据与蛋白质印迹强度之间的相关性(图31和图32)。
首先，图31是显示ITGB3标志物的相关分析结果的图。
如图31所示，在ITGB3标志物的情况下，在所有的蛋白质组学分析结果、蛋白质印迹分析结果和通过构建的试剂盒的分析结果中，证实了随着疾病从HC发展到MCI和AD，该蛋白质表达水平也趋于增加，并且相关系数(R2)也为80％或更大。
接下来，图32是显示APOA4标志物的相关性分析结果的图。
如图32所示，证实了APOA4标志物在MCI阶段具有非常高的表达水平，但在AD阶段倾向于再次降低。
在MCI阶段立即诊断疾病是重要的，因为诊断试剂盒的目标是阿尔茨海默病的早期诊断，并且当患者达到AD阶段时，不使用诊断试剂盒就可以清楚地知道患者患有阿尔茨海默病。
证实了APOA4标志物在MCI阶段的样品中显示出由所构建的诊断试剂盒的分析结果与蛋白质印迹之间约88％的相关系数(R2)。
最后，在CRP标志物的情况下，难以在蛋白质印迹分析中确定定量值，但从蛋白质组学分析的结果和文献信息可以看出，CRP的表达水平在MCI阶段降低，并且已经分析出希望利用CRP标志物作为辅助的指示标志物。
基于以上描述，本领域技术人员将理解，在不改变其技术精神或基本特征的情况下，本公开可以以不同的具体形式来实现。因此，应该理解，上述实施方案不是限制性的，而是在所有方面进行说明。本公开的范围由所附的权利要求而不是由权利要求之前的描述来限定，因此，落入权利要求的范围和界限或这些范围和界限的等价物中的所有改变和修改都旨在被权利要求所包含。

Claims (12)

1.用于诊断阿尔茨海默病的标志物组合物，其包含选自APOA4、ITGB3及其组合的蛋白质作为标志物。
2.用于提供确定阿尔茨海默病发病所需的信息的方法，该方法包括
(a)定量分析选自APOA4、ITGB3及其组合的标志物蛋白在包括怀疑患有阿尔茨海默病的人在内的受试者的血清样品中的表达水平；和
(b)将定量分析的标志物蛋白水平与确定阿尔茨海默病的发病相关联。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述关联步骤通过组合每种标志物蛋白的定量分析结果来进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述定量分析结果的组合是使用选自以下的分析方法实施的：线性或非线性回归分析方法；线性或非线性分类分析方法；ANOVA；神经网络分析方法；遗传分析方法；支持向量机分析方法；层次分析或聚类分析方法；使用决策树的分层算法或核主成分分析方法；马尔科夫毯分析方法；递归特征消除或基于熵的递归特征消除分析方法；前向浮动搜索或后向浮动搜索分析方法；以及它们的组合。
5.根据权利要求3所述的方法，其中使用计算机算法执行定量分析结果的组合。
6.用于确定阿尔茨海默病的发病的组合物，包含用于测量选自APOA4、ITGB3及其组合的标志物蛋白的表达水平的试剂。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述试剂是能够特异性结合所述标志物蛋白或所述标志物蛋白的mRNA的抗体、引物或探针。
8.用于确定阿尔茨海默病的发病的试剂盒，包含用于测量选自APOA4、ITGB3及其组合的一种或多种蛋白质的表达水平的定量装置。
9.用于提供信息以确认阿尔茨海默病的进展阶段的方法，该方法包括：
(a)定量分析选自APOA4、ITGB3及其组合的标志物蛋白在包括怀疑患有阿尔茨海默病的人在内的受试者的血清样品中的表达水平；和
(b)将定量分析的标志物蛋白水平与确定阿尔茨海默病的发病相关联。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述关联步骤通过组合每种标志物蛋白的定量分析结果来进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述定量分析结果的组合是使用选自以下的分析方法实施的：线性或非线性回归分析方法；线性或非线性分类分析方法；ANOVA；神经网络分析方法；遗传分析方法；支持向量机分析方法；层次分析或聚类分析方法；使用决策树的分层算法或核主成分分析方法；马尔科夫毯分析方法；递归特征消除或基于熵的递归特征消除分析方法；前向浮动搜索或后向浮动搜索分析方法；以及它们的组合。
12.根据权利要求10所述的方法，其中使用计算机算法执行定量分析结果的组合。
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