KR101520615B1

KR101520615B1 - 간암 진단용 바이오 마커

Info

Publication number: KR101520615B1
Application number: KR1020130029626A
Authority: KR
Inventors: 김영수; 윤정환; 김현수; 진종화
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-03-20
Filing date: 2013-03-20
Publication date: 2015-05-18
Also published as: EP2977760A1; EP2977760A4; WO2014148780A1; EP2977760B1; KR20140115490A

Abstract

본원은 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 간암 진단 또는 예후 측정용 간암 바이오마커, 이를 포함하는 간암 진단 또는 예후 측정 키트, 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 따른 바이오마커는 높은 정확도와 민감도로 간세포암의 조기진단, 모니터링 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 또한 혈액 또는 뇨 등을 이용한 비침습성 검사로 간단하고 유효성 있는 간암 진단 또는 모니터링이 가능하여, 예를 들면 POCT (point of care testing) 개발을 통한 가정 및 일반 의원에서의 간암 조기 발견에 매우 유용할 것이다.

Description

간암 진단용 바이오 마커 {Markers for diagnosis of liver cancer}

본원은 간암의 진단 또는 검출과 관련된 바이오마커에 관한 것이다.

간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 성인 간암에서 가장 흔한 유형으로, 암으로 인한 사망원인 중 세 번째를 차지한다 (Stefaniuk P, et al., 2010, World J Gastroenterol 16: 418-424). HCC는 상당히 진행 되서야 증상이 나타나는 질환으로 이로 인해 적절한 치료시기를 놓치는 경우가 빈번하고, 치료를 하는 경우도 예후가 극히 나쁘다. 특히 수술로 절제가 불가능한 경우는 1년 내 사망하는 심각한 질환으로, 진단방법이 개선이 될 경우, 치료에 있어서는 상당한 개선이 기대된다.

현재 임상에서 간세포암은 간초음파와 같은 영상 검사와 혈청 알파태아단백 (Alpha fetoprotein, AFP)의 검출로 진단된다. 하지만 혈청 AFP는 간세포암이외에 급성 또는 만선 간염과 같은 비간세포암, 또는 양성종양에서도 농도가 증가하기 때문에, 간세포암에 대한 특이성과 민감도가 낮은 편이다. AFP는 전체적으로 약 66%의 민감도와 82%의 특이도를 갖는 것으로 알려져 있어 모든 간암 환자를 진단하는 데에 제한이 있다. 현재 임상에서 간세포암은 영상 검사에서 특이적인 소견을 보이고 혈청 알파태아단백 (Alpha fetoprotein, AFP)이 200 (또는 400) ng/mL 이상으로 상승하는 것으로 진단하고 있다.

정상인에서 간암을 정확하게 발견해 낼 수 있는 바이오마커 검사는 아직까지 개발되지 못했으며, 고위험군에서 비침습적인 조기 간암 진단을 위하여 사용하고 있는 검사 방법이 혈청 알파태아단백 검사이다. AFP는 개발 당시 민감도와 특이도를 모두 양호한 수준으로 달성할 수 있는 기준값이 20 ng/mL로 제시되었으나, 이 경우 민감도가 60%에 지나지 않으며 현재 국제 학회의 간암 진단 가이드라인에 따라 200 ng/mL를 기준으로 간암을 진단할 경우 특이도는 상승하지만 민감도가 22%에 불과하다. 기존의 연구 결과, AFP는 전체적으로 약 66%의 민감도와 82%의 특이도를 갖는 것으로 알려져 있어 모든 간암 환자를 진단하는 데에 제한이 있다.

미국 공개특허공보 제2010/0304372호는 간암 진단 방법 및 조성물에 관한 것으로, BASF1, SPINT2, APC, CCND2, CFTR, RASSF1 및 SRD5A2 유전자에 CpG 섬을 검출하여 간암을 진단하는 방법을 개시한다.

대한민국 특허 제1161789호는 간암에 대한 신규 바이오마커 및 그 용도에 관한 것으로, NK4 단백질 등의 검출을 통한 간암 진단 또는 예후 분석용 마커를 개시한다.

그 외 진단 기준으로 확립되어 있지는 않으나 간암 진단에 도움이 되는 혈청 마커로는 Descarboxyprothrombin(DCP), Prothrombin Induced by Vitamin K Absence II (PIVKA-II), 글리코실화 AFP 대 총 AFP (L3 fraction) 분포, alpha fucosidase, glypican 3, HSP-70 등이 있다. 그러나 각각은 예후 인자로서 의미를 가지는 것이 대부분이고, 단독으로 사용하였을 때 정확도가 낮아 아직 선별 검사로 사용되지 못하고 있다.

따라서 특이성과 민감도가 향상된 개별검사의 한계점을 극복할 수 있는 마커 또는 다중 마커의 개발이 시급하다.

본원에서는 정확도와 민감도가 높은 간편하고 비침습적인 방법으로 검출이 가능한 간암 진단 마커를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 간세포암 진단 또는 예후 분석용 바이오마커를 제공한다.

본원에 따른 마커는 민감도, 특이도, 및 검출의 편리성 등을 고려하여 하나 이상의 조합으로 사용될 수 있거나 또는 기존의 확립된 마커, 예를 들면 AFP와 조합으로 사용될 수 있다. 일 구현예에서 본원의 마커는 ANLN 및 FLNB; BASP1 및 PABPC1; BASP1, PABPC1, 및 CAPN1; BASP1, PABPC1, CAPN1 및 ANLN; BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN 및 C4A; BASP, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A 및 MTHFD1; BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1 및 ACADVL; 또는 BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1, ACADVL 및 FLNB의 조합을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본원에 따른 마커는 핵산 또는 단백질 수준 (농도) 및/또는 핵산 및/또는 단백질의 존재 여부에 대한 검출로 간세포암의 진단 또는 예후 측정에 사용될 수 있다.

이에 본원에 따른 바이오 마커는 이의 검출시약을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트 또는 조성물로 제공될 수 있다.

분석용 키트는 다양한 검출방법을 사용하여 시료 중의 바이오마커를 분석할 수 있다. 일 구현예에서는 ELISA 분석, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석, MRM 분석, 마이크로어레이, 유전자증폭, 또는 면역분석 등과 같은 분석이 사용된다.

또한 구체적 검출 방법에 따라 다양한 검출시약을 포함할 수 있으며, 예를 들면 핵산 및/또는 단백질 수준(농도)의 검출 시약, 및/또는 핵산 및/또는 단백질 존재여부 검출 시약을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 따른 바이오 마커의 핵산서열 (바이오마커를 코딩하는 유전자), 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열의 단편, 또는 상기 핵산서열에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다. 다른 구현예에서는 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약을 포함한다. 또 다른 구현예에서는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 아비머, 펩티도모방체, 수용체, 리간드 또는 보조인자인를 포함한다. 또 다른 구현예에서는 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약을 포함한다. 또 다른 구현예에서는 본원에 따른 각 마커에 특이적인, 프라미어 쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브를 포함한다.

다른 양태에서 본원은 간세포암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체의 생물학적 시료로부터 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 핵산 또는 단백질 수준, 또는 핵산 또는 단백질의 존재여부를 검출하는 단계; 상기 핵산 또는 단백질의 수준 또는 존재에 대한 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 수준의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 간세포암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간세포암 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본원에 따른 마커에서 ACADVL, ANLN, MTHFD1, FLNB는 대조군과 비교하여 간세포암에서 발현이 증가되며, 상기 BASP1, CAPN1, C4A, PABPC1는 발현이 감소된다. 본원에 따른 방법은 마이크로어레이, 유전자 증폭, 항원-항체 반응, 질량분석 방식으로 실시될 수 있다. 그 외 본원에 따른 방법에서 각 마커의 조합 및 분석 방법에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다.

다른 양태에서 본원은 다음의 단계를 포함하는 간암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본원에 따른 방법은 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포와 시험물질을 접촉시키는 단계;상기 핵산 서열의 발현정도를 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과, 시험물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질이 처리된 세포에서 상기 하나 이상의 핵산 서열의 발현량이 감소한 경우, 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원에 따른 바이오마커는 높은 정확도와 민감도로 간암의 조기진단, 모니터링 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다. 또한 본원에 따른 바이오마커는 혈액 또는 뇨 등을 이용한 비침습성 검사로 간단하고 유효성 있는 간암 진단 또는 모니터링이 가능하여, 예를 들면 POCT (point of care testing) 개발을 통한 가정 및 일반 의원에서의 간암 조기 발견은 물론 간세포암 치료 후 치료 경과 확인에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본원에서 사용된 HCC 바이오마커 발굴 절차를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2f는 간암마커의 데이터 마이닝 결과를 나타내는 결과로, 각각 단백질체분석, 유전자발현분석, 유전자 복제수 변이, 후생유전학 분석, 체세포 돌연변이 분석 및 분석결과를 종합한 데이터마이닝 결과이다.
도 3은 ATP-의존성 RNA 헬리케이즈 A (DHX9) 펩타이드를 이용한 반응 커브를 나타낸다.
도 4a 내지 4d는 본원에 따른 마커 중 4개 마커 AFP, ANLN, C4A 및 FLNB 각각을 웨스턴블랏으로 검증한 결과이다.
도 5a 내지 도 5c는 AFP 및 2-마커 패널의 ROC 커브를 나타낸다. AFP를 두 개의 마커 패널과 비교하여 LR 분석을 수행하였다. LR 분석 모델을 이용하여 위양성/음성 비율을 분류표로 작성하고, 에러율을 나타냈다. 각 도면에 표시된 바와 같은 3 종류에 대하여 LR 분석을 수행하였다.
도 6a 내지 6j는 LR 분석 모델을 이용하여 조합된 다중 마커 패널의 ROC 커브를 나타낸다. 조합된 마커의 종류는 각 ROC 커브에 기재된 바와 같다.

질병 특이적인 단백질 마커 후보군을 발굴하는데 있어서 많은 시간과 노력이 필요하다. 따라서 기존의 연구에서 밝혀진 간암 특이적 마커를 활용할 수 있다면, 중복된 실험을 배제하고 시간을 절약하면서 신규 마커를 보다 신속하게 발굴할 수 있다. 이를 위해 단백질체분야 뿐만 아니라 다른 분야에서 연구된 간암 관련 글로벌 데이터 마이닝 (global data mining)을 통해 정보를 수집하고, 이 중에서 가장 유의성이 높은 후보군을 선별하여 사용하였다.

본원은 단백질체, cDNA 마이크로어레이를 이용한 유전자발현, 복제수 변이, 후생유전학 및 체세포 돌연변이의 5 가지 영역에서 데이터 발굴 (data mining)을 통해 간암에서 가장 높은 유의성을 보이는 단백질 50 개를 선별한 후, 정상 및 간암 환자 (치료 전 및 후)의 시료를 대상으로 상기 단백질의 발현량 검증을 통해 상기 그룹 간에 유의적 차이를 나타내는 단백질 발견을 근거로 한 것이다.

따라서 한 양태에서 본원은 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 간세포암 진단 또는 예후 분석용 바이오 마커에 관한 것이다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상자의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상자의 예후(prognosis)(예컨대, 트랜지션성 암 상태의 동정, 암의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에서 용어 진단용 바이오마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)란 간암이 발생한 조직 또는 세포를 정상 세포 또는 적절한 간암치료를 받은 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 검체에 비하여 질환이 발생한 조직이나 부위에서 증가 또는 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산, 지질, 당지질, 당단백질 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본원에서 간세포암 조직이나 혈액에서 발현이 증가하거나 감소하는 long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondria (ACADVL), actin-binding protein, anillin (ANLN), brain acid-soluble protein 1 (BASP1), c-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic (MTHFD1), calpain-1 catalytic subunit (CAPN1), complementary C4-A (C4A), filamin-B (FLNB), 및 polyadenylate-binding protein 1 (PABPC1) 단백질 또는 그 유전자 또는 그 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커이다. 구체적으로 ACADVL, ANLN, MTHFD1, FLNB 는 HCC에서 발현이 증가되며, BASP1, CAPN1, C4A, PABPC1는 발현이 감소된다.

본원에 따른 마커는 하나 또는 두 개 이상의 조합, 예를 들면 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개, 여섯 개, 일곱 개 또는 그 이상의 조합으로 사용될 수 있으며, 기존의 마커 예를 들면 AFP, 및/또는 진단방법 예를 들면 간초음파 등과 함께 사용될 수 있다. 당업자라면 본원 실시예에 기재된 방법과 같은 정상인 및 환자를 포함하는 대상체의 생물학적 시료를 사용한 분석 및/또는 Logistic regression 분석과 같은 방법을 통해 목적하는 민감도 및 특이성을 만족하는 마커의 조합을 선별할 수 있을 것이다. 본원에 따른 일 구현예에서는 하기 각 마커의 조합, 예를 들면 ANLN 및 FLNB; BASP1 및 PABPC1; BASP1, PABPC1, 및 CAPN1; BASP1, PABPC1, CAPN1 및 ANLN; BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN 및 C4A; BASP, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A 및 MTHFD1; BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1 및 ACADVL; 또는 BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1, ACADVL 및 FLNB와 같은 마커의 조합을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에서 간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 간암의 일종으로 알콜 남용, 바이러스성 간염 및 대상성 간질환과 같은 위험인자를 갖는 환자에서 발생하는 간조직 자체에서 발생하는 원발성 악성 종양을 일컫는 것이다. HCC는 섬유성 스트로마가 없어 출혈과 세포괴사가 발생하며, 간문맥 시스템으로의 혈관침윤이 일어나며, 심한 경우 간파열 및 복강내혈액삼출로 이어질 수 있다.

본원에서 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 간세포암 마커의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 뇨, 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 간세포암이 발생한 또는 발생이 의심되는 또는 발생가능성이 있는 생물체에서 수득한 간조직/세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

이러한 본원에 따른 간세포암 진단용 마커는 이의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것이다. 단백질을 활성, 기능 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질 수준(level)에서 특이적으로 상호작용하는 제제를 사용하여 검출될 수 있다.

이런 측면에서 본원은 또한 각 바이오 마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열의 단편, 또는 상기 핵산서열에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 마커에 관한 것이다.

간세포암 진단을 위한 본원에 따른 마커의 정량적, 정성적 분석에는 공지된 핵산 및 단백질을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 또는 항체와 같은 단백질 어레이 또는 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템, 핵산 전사 및 증폭 시스템, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합 및 유세포 분석기를 통한 검출, 또는 질량분석기 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

본원 일 구현예에 따르면 질량분석법(Mass spectrometry)를 이용하여 마커를 검출할 수 있으며, 검체로부터 단백질을 분리 한 후 예를 들면 본원 실시예에 기재된 방식대로 분석될 수 있으며, 또한 예를 들면 (Kim, et al. 2010 J Proteome Res. 9: 689-99; Anderson, L et al. 2006. Mol Cell Proteomics 5: 573-88.)를 참조할 수 있다. 한 구현예에서는 예를 들면 Triple Quadrupole LC-MS/MS, QTRAP 등을 이용한 다중반응모니터링 (Multiple reaction monitoring, MRM) 기술이 사용된다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 표지 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 전구이온 또는 모이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 전구이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 산물이온 또는 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. 예를 들면 Gillette et al., 2013, Nature Methods 10:28-34에 기재된 것을 참조할 수 있다.

다른 구현예에서는 각 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA와 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용된다.

또 다른 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1 항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출 할 수 있다.

기타 다른 면역 반응 기반의 방법의 사용될 수 있으며 다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동 (Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 항원-항체반응, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자와의 반응을 통해 검출될 수 있거나, 또는 질량분석기를 이용할 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

본원의 각 마커는 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 정량적 및/또는 정성적 검출을 통해 간세포암의 진단 또는 예후 측정에 사용될 수 있다. 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 RNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다.

상기 mRNA의 존재 여부와 그 양 또는 패턴을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로, 예를 들면 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍를 포함한다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던블랏 또는 역전사 PCR (중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성 한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

다른 양태에서 본원은 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 검출시약을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트 또는 시스템에 관한 것이다. 검출 시약 및 이러한 시약이 사용되는 방법은 상술한 바와 같다. 이러한 본원의 마커를 검출할 수 있는 시약은 구획이 되어 있는 용기에 개별적으로 분주되어 존재할 수 있으며, 이러한 의미에서 본원은 또한 본원의 마커 검출시약을 구획되어 포함하는 장치/기구에 관한 것이다.

일 구현예에서 검출시약은 본원에 따른 하나 이상의 마커에 특이적으로 결합하는 항체로, 혈청 중의 단백질의 정량 및/또는 정성 평가가 가능하다. 다른 일 구현예에서, 이러한 항체는 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다.

다른 구현예에서, 검출시약은 마이크로어레이를 포함하는 어레이 또는 칩의 형태로 제공될 수 있다. 유리 또는 나이트로셀룰로스와 같은 기질의 표면에 검출시약이 부착될 수 있으며, 어레이 제조 기술은 예를 들면 Schena et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA. 93(20):10614-9; Schena et al., 1995, Science 270(5235):467-70; 및 U.S. Pat. Nos. 5,599,695, 5,556,752 또는 5,631,734를 참조할 수 있다. 어레이에 부착될 수 있는 검출시약은 예를 들면 한 단백질에 특이적 결합이 가능한 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함한다.

검출시약은 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성입자 및 고밀도전자입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다.

형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Affymetrix, Inc. 또는 Agilent Technologies, Inc 등에서 입수할 수 있다.

본원의 키트는 추가로 결합분석에 필요한 하나 이상의 부가 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들면 결합 버퍼, 시료 준비에 필요한 시약, 혈액채취용 주사기 또는 음성 및/또는 양성대조군을 추가로 포함할 수 있다.

상기 다양한 검출시약을 포함할 수 있는 본원의 키트는 분석양태에 따라 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용 등으로 제공될 수 있으며, 분석 양태에 맞추어 적절한 검출시약을 선별할 수 있을 것이다.

일 구현예에서는 ELISA 또는 딥스틱 래피드 키트가 사용되며, 이 경우 본원에 따른 하나 이상의 마커를 인식하는 항체가 기질, 예를 들면 다중웰 플레이트의 웰 또는 유리 슬라이드의 표면 또는 나이트로셀룰로스에 부착되어 제공될 수 있다. 딥스틱의 경우, POCT 분야에서 널리 이용되는 기술로, 본원에 따른 바이오마커를 인식하는 하나 이상의 항체가 나이트로셀룰로스와 같은 기질에 결합되어 있고, 이를 혈청과 같은 시료와 접촉시 예를 들면 딥스틱의 일 말단을 혈청시료에 답그면, 시료가 모세관 현상에 의해 기질을 이동하여, 기질 중의 항체와 결합시 발색하는 방식으로, 마커를 검출하는 것이다.

다른 구현예에서는 펩타이드를 근간으로 하는 MRM 키트가 제공되며, MRM 방식에 대하여는 앞서 설명한 바와 같다. MRM 방법은 특정 단백질을 선택적으로 인식하는 펩타이드를 이용하는 것으로, 온도, 습도 등 환경에 민감한 항체를 이용하는 기존의 방법과 비교하여, 보다 안정적으로 생체시료에서 마커를 검출할 수 있다.

또한 본원의 키트는 본원에 따른 바이오 마커의 사용법에 관한 안내서를 포함할 수 있다.

또다른 양태에서 본원은 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커를 포함하는 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

또다른 양태에서 본원은 간세포암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대상체의 생물학적 시료로부터 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오 마커의 핵산 또는 단백질 수준, 또는 핵산 또는 단백질의 존재여부를 검출하는, 간세포암 바이오마커 검출 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 추가로 본원에 따른 마커에 대한 핵산 또는 단백질의 수준 또는 존재에 대한 검출 결과를 정상 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및 상기 정상 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 수준에 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질의 존재 여부의 변화가 있을 경우, 이를 간세포암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간세포암 마커를 검출하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서 본원에 따른 마커 중ACADVL, ANLN, MTHFD1, FLNB는 대조군과 비교하여 간세포암에서 발현이 증가되며, 상기 BASP1, CAPN1, C4A, PABPC1는 발현이 감소된다.

본 방법에 사용되는 생물학적 시료, 대조군 또는 참조군, 바이오마커 검출 방법 및 이에 사용되는 시약 및 판정을 위한 데이터 분석 방법은 앞서 설명한 바와 같다.

본원의 방법은 포유류 특히 인간을 대상으로 포함한다. 인간 대상체는 HCC가 발병했을 것으로 의심되는 사람, 의심되지 않는 사람으로 HCC 진단여부가 필요한 사람을 포함한다. 일 구현예에서, 본 방법은 간질환 관련 증상 예를 들면 복부통증, 비대간, 복수, 황달, 근육쇠약, 간염 (예를 들면 HCV 감염), 또는 식도 정맥류 등과 같은 대상체가 HCC 여부를 결정하기 위한 다른 증상을 가진 대상체에게 수행될 수 있다. 다른 구현예에서는 외관상으로는 정상으로 HCC 증상을 나타내지 않는 대상체이다.

다른 구현예에서, 대상체는 혈장 AFP 농도가 낮거나 또는 정상일 수 있어, AFP를 기준으로는 HCC로 진단되지 않을 수도 있는 사람이다. 이러한 경우, AFP의 혈청 농도는 약 0 μg/l (비검출) 내지 20 μg/l, e.g., 0 μg/l (비검출) 내지 5 μg/l, 5 μg/l 내지 10 μg/l, 10 μg/l 내지 15 μg/l, 또는 15 μg/l 내지 20 μg/l 일 수 있다.

상술한 방법을 사용하여 두 개 이상을 포함하는 마커의 조합을 사용하는 경우 프로파일, 즉 시료 중 마커 단백질 발현과 관련된 정량적 정보를 포함하는 데이터세트가 생성될 수 있다.

마커를 이용하여 프로파일을 수득한 후에, 참조군 또는 대조군과의 결과 비교를 통해 대상체의 시료의 간세포암 여부를 판별한다. 대조군 또는 참조군으로는 음성 대조군으로 정상 시료, 또는 간세포암에 걸린 후 치료된 환자 유래의 시료, 양성대조군으로 본원에 따른 마커 이외에 방법으로 간세포암으로 판정된 환자 유래의 시료, 간경화 환자 유래의 시료, 간염 유래 환자의 시료일 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서는 정상인 유래의 시료, 간세포암으로 판정후 치료를 받은 환자 유래의 시료가 대조군 또는 참조군으로 사용되어, 수득된 프로파일의 비교에 사용된다.

대조군과 시료를 이용한 시험군 사이의 마커 프로파일의 비교에는 공지된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면 발현 프로파일의 디지털 영상 비교, 발현 데이터에 대한 DB를 이용한 비교, 또는 U.S. 특허 6,308,170 및 6,228,575에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 마커 검출을 통하여 수득된 프로파일은 공지의 데이터 분석방법을 이용하여 처리될 수 있다. 예로는 nearest neighbor classifier, partial-least squares, SVM, AdaBoost 및 clustering-based classification 방법이 사용될 수 있으며, 예를 들면 Ben-Dor et al (2007, J. Comput. Biol. 7: 559-83), Nguyen et al (2002, Bioinformatics 18:39-50), Wang et al (2003, BMC Bioinformatics 4:60), Liu et al (2001, Genome Inform. Ser. Workshop Genome Inform.12:14-23), Yeang et al (2001, Bioinformatics 17 Suppl 1:S316-22) 및 Xiong (2000, Biotechniques 29(6):1264-8, 1270) 등을 포함하는 문헌을 참조할 수 있다.

또한 본원의 마커를 통하여 검출된 결과가 간세포암 판별에 유의한 것으로 판정하기 위해 다양한 통계처리 방법이 사용될 수 있다. 통계적 처리 방법으로 일 구현예에서는 logic regression 방법이 사용되며, Ruczinski, 2003, Journal of Computational and Graphical Statistics 12:475-512를 참조할 수 있다. 상기 방법은 클래시파이어가 바이너리 트리로 제시되는 CART 방법과 유사하나, 각 노드는 CART에 의해 생성되는“and" 연산자와 비교하여 보다 일반적인, 특성과 관련된 불린(Boolean) 연산자가 사용된다. 다른 분석 방법의 예로는 nearest shrunken centroids (Tibshirani. 2002 PNAS. 99:6567-72), random forests (Breiman. 2001. Machine Learning 45:5-32 및 MART (Hastie. 2001. The Elements of Statistical Learning, Springer)을 들 수 있다.

일 구현예에서, 통계처리를 통해 HCC로 진단하기 위해 시험물질과 대조군간의 유의한 차이에 관한 신뢰수준을 결정할 수 있다. 통계 처리에 사용되는 원 데이터는 각 마커에 대하여 이중, 삼중 또는 다중으로 분석된 값이다.

일 구현예에 따르면 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 중 적어도 한 개, 또는 적어도 두 개 이상의 마커가 유의성이 있는 값으로 미리 정의된 수준보다 높은 경우, 정상 대조군과 차이가 있는 것으로 판별할 수 있다. 다른 일 구현예에서는 ANLN 및/또는 FLNB의 마커가 유의성이 있는 값으로 미리 정의된 수준보다 높은 경우, 정상 대조군과 차이가 있는 것으로 판별할 수 있다.

이러한 통계적 분석 방법은 바이오마커는 물론, 임상 및 유전적 데이터의 통계적 처리를 통하여 임상적으로 유의한 판단을 하는데 매우 유용하다.

본원에 따른 방법은 HCC가 심각성 정도를 판단하는데 사용될 수 있다. 예를 들면 양성대조군 및 음성대조군의 프로파일과 비교하여, 경증 HCC, 중간정도 HCC 또는 중증 HCC로 평가될 수 있다. 나아가 일정 HCC 집단에 대한 마커 프로파일 분석을 수행하여, 프로파일 결과를 근거로 일정 기준에 따라 분류할 수 있다. 이런 방식으로 조기발견을 통해 자기공명영상(MRI)와 같은 고가의 검사를 하지 않을 수도 있다.

다른 구현예에서, 본 방법은 특정 기간 동안 예를 들어 1년에 걸쳐 수차례 수행될 수 있으며, 발현 패턴의 변화 추이 모니터링에 사용될 수 있다. 마커의 종류에 따라 발현의 증가 또는 감소를 HCC의 상태와 연관지을 수 있다. 동일 대상체에 대한 종전의 검사수치 또는 대조군의 수치와 비교하여, HCC 발병, 진행, 악화 등의 판단에 사용될 수 있다. 시간의 경과에 따른 HCC 마커의 변화를 근거로 간세포암 또는 중증 간세포암으로의 진행을 막기 위한 예방적 조치를 취할 수 있다. HCC의 확진을 위해, 바이오마커는 보조 수단으로 사용될 수 있으며, 다른 진단 방법 예를 들면 AFP 테스트, 초음파, 컴퓨터단층촬영 (computerized axial tomography (CT scan)) 또는 자기공명영상(magnetic resonance imaging (MRI)) 검사와 함께 사용될 수 있다.

다른 양태에서 본원은 다음의 단계를 포함하는 간암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 간세포암 조직 또는 세포에서 본원에 따른 마커의 발현 변화를 가져오는 것은 간세포암 치료제 후보물질로 선별할 수 있다. 일구현예에서 상기 방법은 ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, FLNB 및 PABPC1 로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 세포를 제공하는 단계; 상기 세포와 시험물질을 접촉시키는 단계; 상기 핵산 서열의 발현정도를 mRNA 또는 단백질 수준에서 측정하는 단계; 및 상기 측정 결과, 시험물질이 처리되지 않은 대조군과 비교하여 시험물질이 처리된 세포에서 상기 하나 이상의 핵산 서열의 발현량이 감소한 경우, 이를 후보물질로 선별하는 단계를 포함한다.

본원의 방법에 사용되는 시험물질은 본원에 따른 마커 유전자의 발현을 조절할 것으로 기대되는 물질로, 예를 들면 약물의 스크리닝 목적을 위해서는 화합물은 저분자량의 치료효과를 갖는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면 중량이 400 Da, 600 Da 또는 800 Da과 같은 약 1000 Da 내외의 화합물이 사용될 수 있다. 목적에 따라 이러한 화합물은 화합물 라이브러리의 일부를 구성할 수 있으며, 라이브러리를 구성하는 화합물의 숫자도 수십개부터 수백만개까지 다양하다. 이러한 화합물 라이브러리는 펩타이드, 펩토이드 및 기타 환형 또는 선형의 올리고머성 화합물, 및 주형을 기본으로 하는 저분자 화합물, 예컨대 벤조디아제핀, 하이단토인, 바이아릴, 카보사이클 및 폴리사이클 화합물 (예컨대 나프탈렌, 페노티아진, 아크리딘, 스테로이드 등), 카보하이드레이트 및 아미노산 유도체, 디하이드로피리딘, 벤즈하이드릴 및 헤테로사이클 (예컨대 트리아진, 인돌, 티아졸리딘 등)을 포함하는 것일 수 있으나, 이는 단지 예시적인 것으로 이로 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에서는 세 종류의 대상체 그룹 (정상인, 간암 치료 전 및 간암 치료 후) 유래의 혈청시료에서 상기 50개 단백질에 대한 발현량을 질량분석기 (Triple Quadrupole LC-MS/MS)를 이용한 다중반응모니터링 (Multiple reaction monitoring, MRM) 기술로 검증하여, 상기 그룹간에 유의적 차이를 나타내는 간암 마커를 발견하였다.

이하 본원에 사용된 실험방법을 기술한다.

1-1. 본원에 사용된 임상시료 정보

본 실험은 서울대학교의 의학연구윤리심의위원회의 허가된 프로토콜에 따라 수행되었으며, 각 환자로부터 충분한 설명에 근거한 서면동의를 수득하였으며, 임상정보는 다음과 같다.

본원에서는 정상인 36명(남/여=18/18)과 간암 치료 전 18명(남/여=13:5), 간암 치료 후 18명(남/여=13:5)의 시료가 사용되었다. 간암 치료 전과 치료 후 시료는, 동일한 환자 유래이고, 간암 치료 전에 혈청 시료를 취한 다음, 간암 치료 후 1년 이상 후속 데이터를 근거로 간암이 재발하거나 전이되지 않고 완전히 완치가 된 건강한 간암 환자의 시료만을 분석에 포함시켰다. 간암은 본래 여성에 비해 남성에서 발생 가능성이 70% 정도 높다는 사실을 근거로 남성의 비율이 여성의 비율 보다 70% 정도 높도록 간암 시료를 선정했고, 가능하면 시료 자체에 대한 복잡성을 줄이기 위해서 간암 치료에 가장 많이 사용되고 있는 경피적 화학색전술(TACE)과 에탄올 주입술(PEIT) 2가지 방식으로만 치료를 받은 환자 시료만을 선별했다. 또한, 간암의 주된 원인은 환자별로 크게 바이러스성 (HBV, HCV)과 알콜성으로 나눌 수 있지만, 최근에 아시아와 아프리카에서 간암 원인에 대해 조사한 결과, HBV 에 의해서 간암이 발생되는 경우는 70%, HCV 에 의해 발생되는 경우는 20%, 알콜성에 의해서 발생되는 경우는 10% 라는 보고를 근거로, 아시아에서 가장 높은 간암 발생 원인을 차지하고 있는 HBV에 의해 간암이 발생되는 경우의 시료만을 선별했고, 해당 임상시료 정보는 아래와 같다.

[표1]

각 환자에서 혈액시료를 채취한 즉시 4℃, 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 수집하였다. 혈청은 분석에 사용할 때까지 50μl 단위로 분주하여 -80℃에서 보관하였다.

1-2 혈청의 트립신 효소 처리

MRM 분석을 위해 혈청 단백질을 다음과 같이 처리하였다. 혈청 단백질은 비씨코닌산(bicinchoninic acid, BCA) 분석법으로 정량하였다. 200μg의 혈청 시료를 6 M urea, 50 mM Tris, pH 8.0, 및 30 mM dithiothreitol (DTT)를 이용하여 37℃에서 60분간 변성한 후 50 mM iodoacetamide (IAA)로 실온의 암실에서 30분간 알킬화 하였다. 우레아를 50 mM Tris, pH 8.0를 이용하여 15배 희석한 후 트립신(Promega, sequencing-grade modified)을 1:50 (w/w)의 효소 대 혈청 농도의 비로 첨가하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다.

트립신 분해는 최종농도 1%의 포름산을 첨가하여 중지하였으며, Sep-pak tC18 cartridges (Waters Corp., USA)에서 염을 제거하였다. 상기 카트리지는 사용전에 0.1% trifluoroacetic acid (TFA)를 포함하는 5ml의 물 및 3ml의 메탄올로 평형화하였다. 사용 후 3 ml 0.1% TFA로 세척한 후 1 ml의 60% ACN, 0.1 % TFA로 용출하였다. 용출된 시료를 스피드 진공에서 건조 후 동결하였다. MRM 분석 전에 시료는 0.1% 포름산에 2 μg/μl 농도로 용해하여 사용하였다.

1-3. 표준 펩타이드

MRM 분석은 표준 펩타이드를 사용하여 노말라이즈하였다. 합성된 안정한 방사능 물질로 표지된 펩타이드인 ATP-의존성 RNA 헬리케이즈 A (DHX9) (서열 ELDALDANDELTPLG R )(C-말단 ¹⁵N-,¹³C-표지된 알지닌 잔기 (99 원자 % isotopic enrichment)(21^stCentury Biochemicals Inc, USA)를 사용하였다. 표준용 펩타이드는 MRM 분석 전에 50fmol 농도로 HCC 혈청 펩타이드 혼합물에 추가하여 사용하였으며, MRM 분석에서 각 시료의 피크 면적을 표준 펩타이드의 피크 면적에 대하여 노말라이즈하였다.

1-4. MRM 분석

각 표적 단백질에 대하여, Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline)을 사용하여 MRM 분석용 펩타이드 및 단편 이온을 선별하였다. Skyline은 MRM 방법 개발 및 분석용의 오픈 소스 소프트웨어이다 (Stergachis AB, et al., 2011, Nat Methods 8: 1041-1043).

요약하면, 전장의 단백질 서열을 FASTA 포맷으로 Skyline에 입력한 후, 이를 펩타이드로 디자인하여 산물 이온 리스트를 생성하였고, 이를 MRM으로 모니터링하였다. 트랜지션 선택에 사용된 펩타이드 필터 조건은 다음과 같다: 펩타이드 최대 길이는 20, 최소 길이는 8개 아미노산으로, 반복되는 알지닌 (Arg, R) 또는 라이신 (Lys, K)은 포함시키지 않았다. 메티오닌 (Met, M)도 펩타이드에 포함되면, 변형가능성으로 인해 제거하였다. 프롤린이 알지진 또는 라이신 다음에 오는 경우도 사용하지 않았으며, 히스티딘 (His, H)이 포함되는 경우에도 전하 변경의 우려로 인해 사용하지 않았다.

이러한 조건을 만족하는 펩타이드를 Q1 트랜지션으로 사용하였다. 이어 Q1 트랜지션 유래의 단편화 이온으로부터 최대 5개의 Q3 트랜지션을 감소하는 순서로 선별하였다. 이러한 정보를 포함하는 파일을 MRM 분석을 위해 Analyst (AB SCIEX, USA)에 입력한 후 nonscheduled MRM 방법으로 분석하였다. MRM 결과는 wiff 및 wiff.scan 파일로 생성되었으며, 이를 mzWiff를 사용하여 mzXML 포맷으로 변환하여 MRM 데이터 처리를 위해 Skyline에 입력하여, MRM 트랜지션의 피크 강도를 구하였다.

1-5. 다중반응 모니터링을 이용한 정량

MRM은 나노전자분무 인터페이스를 갖춘 하이브리드 트리플 쿼드러플/이온 트랩 질량 분석기 (4000 QTRAP, AB SCIEX, USA) 에 연결된 나노 LC 시스템에서 수행하였다. 상기 질량분석기를 양성 이온 MRM 모드에서 작동되었으며, Q1 and Q3는 상이한 전구체/산물 이온쌍을 전달하도록 세팅하였다.

LC 버퍼 시스템은 하기와 같다: 이동상 A, 2% 아세토니트릴/0.1% 포름산 및 이동상 B, 98% 아세토니트릴/0.1% 포름산. 펩타이드를 분리하여 유속 300 nl/min로 43분내에 2% 내지 40% B 로 선형 농도구배의 이동상 B에서 용출하였다. 총 LC 분석 시간은 60분이었으며, 분석용 컬럼의 크기는 75μm 15 cm로 이는 Magic C18AQ resin (5 μm, 100Å , Michrom Bioresources)로 채워서 사용하였다.

전형적인 장비 세팅은 다음과 같다: 이온스프레이(IS) 볼트 2.3 kV, 인터페이스 히터의 온도 200℃, GS1 (nebulizer gas) 셋팅 12, 및 커튼 가스 셋팅 15. 디클러스터링 전위 (DP) 및 충돌 에너지 (CE) MS 계수는 Skyline에서 적정화된 수치를 선형회귀분석하여 결정하였다. MRM 실험은 Q1 and Q3에 대하여 0.7 Da (FWHM)의 해상도를 이용하여 50ms의 스캐닝 시간 0.002 m/z의 스캐닝 폭으로 수행되었다. MRM 수행시 스캐닝 시간은 각 트랜지션에서 50 ms이었고, 트랜지션 스캐닝 간의 퍼즈는 3ms로 맞추었다. MRM 트랜지션은 최고 강도의 단편이온을 모니터링 하기 위해 선별되었다. MRM 트랜지션은 모 펩타이드의 것과 비교하여 높은 m/z 값을 갖는 단편을 우선 선별하였다 (Kirkpatrick DS, et al., 2005, Methods 35: 265-273).

각 표적 펩타이드에 대한 적정한 트랜지션은 중방사능으로 표지된 합성 참조 펩타이드를 사용하여 실험적으로 결정하였다. 각 단백질 량을 노말라이즈하기 위해, 0.1% 포름산 중의 50fmol의 중방사능으로 표지된 펩타이드를 각 혈청 시료에 주입하였다.

1-6. 바이오마커 후보물질 확증용 통계 분석

MRM 분석의 원 테이터 파일을 Skyline을 사용하여 처리하였다. 각 표적 펩타이드에 대하여, 피크 면적 통합 결과는 수동으로 검사하여 잘못 통합된 것을 수정하였다. 디폴트 피크 통합 및 Savitzky-Golay smoothing 알고리즘을 사용하였다. 신호 대 노이즈의 비가 적어도 3배인 펩타이드를 검출가능한 것으로 간주하였다.

HCC 후보 단백질을 평가하기 위해 두 가지의 접근법을 사용하였다. 먼저, 질환 군 (치료 전 HCC 군)을 비질환군 (정상군, 치료된 HCC군)과 구분하였다. 비치료 HCC 군 (n=18) 대 정상 대조군 (n=36) 및 비치료 HCC 군 (n=18) 대 치료 HCC 군 (n=18) 간의 비교는 ANOVA를 근거로 하는 variance (ANOVA) 분석으로 수행하였다. 그 결과 두 군간의 평균 강도 수준에 있어, 0.05 미만의 유의성을 갖는 표적 펩타이드를 선별하였다.

두 번째로, 질환군을 비질환군과 구분하는 혈청 바이오마커의 효능을 평가하기 위하여, 리시버 오퍼레이터 특성 (Receiver Operator Characteristic, ROC) 커브 및 스캐터 플롯을 분석하였다. ROC 는 민감도와 특이도가 서로 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면 상에 표현한 것인데, ROC 아래의 면적에 해당하는 AUC (Area Under Curve) 값이 클수록 우수한 진단 방법이라고 할 수 있다. 모든 통계 분석 및 생성된 모든 스캐터 플롯 및 ROC는 MedCalc (MedCalc, Mariakerke, Belgium, version 12.2.1)를 이용하였다.

1-7. 웨스턴블랏 분석

MRM 결과의 정량 정확도를 확인하기 위하여, 다음 9개 단백질을 웨스턴블랏으로 분석하였다: long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondria (ACADVL), actin-binding protein, anillin (ANLN), brain acid-soluble protein 1 (BASP1), c-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic (MTHFD1), calpain-1 catalytic subunit (CAPN1), complementary C4-A (C4A), alpha-fetoprotein (AFP), filamin-B (FLNB), 및 polyadenylate-binding protein 1 (PABPC1).

웨스턴블랏에 사용된 임상시료는 13개의 건강한 정상 대조군, 비치료 HCC 군, 및 치료 HCC 군 (표 1 참조)로 구성되었다. 혈청시료 농도를 BCA 단백질 분석으로 결정한 후 동량의 단백질(30 μg)을 SDS 로딩 버퍼 (62 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% glycerol, 2% SDS, 2% ß-mercaptoethanol, 및 bromophenol blue)와 혼합 한 후, 10분간 끓인 후 12% SDS-PAGE에서 전기영동 하였다. 전기영동 후 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (polyvinylidene difluoride (PVDF)) 막 (Bio-Rad, Cat. #162-0177)으로 전달 후 5% BSA (w/v)를 포함하는 TBS-T (25 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 및 0.05% (w/v) Tween-20)에서 2시간 동안 실온에서 블록킹 하였다.

이어 막을 4℃에서 개별 일차 항체 (1:100 내지 1: 1000) 와 밤새 배양한 후, TBS-T로 5회 세척한 후 퍼옥시다제 컨쥬게이션된 2차 항체와 2시간 배양하였다(1:5000, Santa Cruz Biotechnology, USA). 막을 이어 TBS-T로 5회 세척한 후, 표적 단백질의 밴드를 화학발광 기질 키트(GenDEPOT, W3651-012)를 사용하여 발색하였다. 밴드 강도는 Multi Gauge. (Fujifilm, ScienceLab 2005, version 3.0)로 측정하였다. 혈청 혼합물을 로딩 대조군으로 사용하였다. 모든 블랏은 로딩 대조군의 밴드 강도에 대하여 노말라이즈되었다. 밴드 강도는 T-test로 분석하여 시료간 유의성 있는 차이를 판별하였다.

1-8. 다중마커 패널 구축을 위한 통계 분석

비질환군 (건강한 정상 대조군, 치료된 HCC 군)을 질환군 (비치료 HCC 군)을 다중 마커 패널을 이용하여 비교하였다. 다중마커 패널은 Logistic regression (LR) 분석으로 수행하여 도출하였으며, 암질환을 갖는 대상체를 비질환 대상체와 구분할 수 있는 수 개의 개별마커로 구성된다. 변별력의 정도는 다음의 3가지 경우에서 조사하였다: 정상 대조군 대 비치료 HCC 군, 비치료 HCC 군 대 치료 HCC 군, 및 정상 대조군 플러스 치료 HCC 군 대 비치료 HCC 군.

LR 및 ROC 커브를 MedCalc을 사용하여 구축하였으며 다음과 같이 분석하였다: Case 1은 정상 대조군 대 비치료 HCC 군, Case 2는 비치료 HCC 군 대 치료 HCC 군, Case 3은 정상 대조군 플러스 HCC 군 대 비치료 HCC 군. “Enter” 방법을 사용하였으며, 분류 표 컷오프 값은 0.5로 셋팅하였다.

ROC 커브를 사용하여 다중 마커 패널의 효능을 분석하였다. 각 마커의 AUC 값 및 2 마커 패널의 AUC 값을 계산하여 다양한 조합의 HCC 후보 마커의 변별력을 조사하였다. 패널의 다중공선성(Multicolinearity)은 IBM SPSS Statistics를 이용하여 분석하였다.

실시예 2. 글로발 데이터 마이닝을 이용한 후보 마커 선별

본원은 질병 특이적인 단백질 마커 후보군을 발굴하는데 있어서 많은 시간과 노력이 필요하다. 따라서 기존의 연구에서 밝혀진 간암 특이적 마커를 활용할 수 있다면, 중복된 실험을 배제하고 시간을 절약하면서 신규 마커를 보다 신속하게 발굴할 수 있다. 이를 위해 단백질체학 뿐만 아니라 다른 분야에서 연구된 간암 관련 글로벌 데이터 마이닝 (global data mining)을 통해 정보를 수집하고, 이 중에서 가장 유의성이 높은 후보군을 선별하여 사용하였다.

간세포암과 관련되어 단백질체학, cDNA 마이크로어레이, 복제수 변이, 후생유전학 및 체세포 변이 부분에서의 데이터 마이닝을 수행하였다. 이어 선별된 후보 마커에 대한 우선순위를“빈도”로 결정하였다. 빈도는 상기 5개 분야에서의 총 발견 횟수로 이를 통해 5222 개의 간암 관련 단백질 중 50개의 고빈도 단백질을 선별하였다. 50개 마커에 대해 혈장으로의 분비여부를 조사하기 위해 최종적으로 Plasma Proteome Database (http://www.plasmaproteomedatabase.org) 검색으로 확인하였다. 50 개의 선별된 후보군에 대한 서열은 Uniprot website (http://www.uniprot.org/)에서 FASTA 포맷으로 수득하여, Skyline을 이용하여 이론적 트랜지션을 생성하여 MRM 분석에 사용하였다. 전반적 절차는 도 1에 기재되어 있다.

2-1. 단백질체학 데이터 마이닝

Impact factor 4.1 이상인 2004년 이후에 publish된 journal들을 대상으로 사람의 간암 세포주나 간암의 조직, 혈액 등에서 ICAT, SILAC, iTRAQ의 방법을 이용하여 단백질체를 정량 분석한 논문 10편을 선별하였으며, 표지되지 않은 방식에 의한 연구 결과는 제외하였다. 10편에서 나온 모든 단백질들을 종합하여 벤다이어그램으로 분석하였으며 그 결과는 도 2a에 나타냈다.

2-2. 유전자발현 데이터 마이닝

간암에서의 cDNA microarray를 이용한 gene expression 결과가 있는 impact factor 6.7 이상, 2003년 이후에 발표된 논문 7건을 선별하여 데이터를 추출하여 유전자발현 데이터 마이닝을 진행하였고 결과는 도 2b에 나타냈다.

2-3. 복제수 변이 데이터 마이닝

간암에서의 염기서열이 증폭되거나 변이가 생겨 유전자 복제수 변이 (copy number variation)가 일어난 보고가 있는 impact factor 4.4 이상, 2004년 이후에 발표된 논문 3건과 OncoDB (http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm)를 이용하여 복제수 변이 데이터 마이닝을 진행하였다. 그 결과는 도 2c에 나타냈다.

2-4. 후생유전학 데이터 마이닝

간암에서 CpG 섬의 DNA 메틸화 보고가 있는 impact factor 4.3 이상, 2005년 이후에 발표된 논문 3건을 이용하여 후생유전학 데이터 마이닝을 진행하였다. 그 결과는 도 2d에 나타냈다.

2-5. 체세포 돌연변이 데이터 마이닝

간암에서 체세포 돌연변이가 일어난 보고가 있는 OncoDB (http://oncodb.hcc.ibms.sinica.edu.tw/index.htm) 및 Japan liver cancer data-International Cancer Genome Consortium (http://www.icgc.org/icgc/cgp/66/420/824)를 이용하여 체세포 돌연변이 데이터 마이닝을 진행하였다. 그 결과는 도 2e에 나타냈다.

위의 결과를 정리한 데이터 마이닝 결과는 도 2f에 나타냈다.

실시예 3. 표준 펩타이드와의 상관성 검증

각 MRM 분석에서 각 시료의 표준 펩타이드의 피크 면적을 사용하여 각 표적 펩타이드의 피크면적을 노말라이즈하였다. MRM의 정량적 상관성을 평가하기 위하여 매트릭스 펩타이드의 존재 중에서 표준펩타이드 (sequence of ELDALDANDELTPLG R , ATP-dependent RNA helicase A (DHX9))의 반응커브를 생성하였다. 표준 펩타이드는 표적 펩타이드와 유사한 조건인 200μg의 혈청 펩타이드 혼합물 중에 1, 5, 10, 50, 100, 250, 및 500 fmol로 사용되었다. 표적 펩타이드에 대한 내인성 신호를 검출하기 위하여, 각 실험에 표준 펩타이드가 결여된 블랭크 시료를 사용하였다. 각 MRM 분석은 3회 반복되었다.

결과는 도 3에 기재되어 있다. 각 실험의 CV%는 20% 미만이었고, 상관계수는 0.9984이었다. 매트릭스로서 혈청 펩타이드와 표준 펩타이드 혼합물의 반응 커브로부터 주어진 농도에서의 혈청 MRM의 정량적 상관성은 표적 펩타이드의 상대적 양을 구할 수 있을 정도의 타당성 및 신뢰성 있는 결과임을 나타낸다.

실시예 4. 통합(pooled)된 혈청에서 표적 후보 마커의 검출성 검증

MRM 분석 전에 72개의 혈청시료 (36명의 건강한 대조군, 18명의 비치료 HCC 군, 및 18명의 HCC 군)를 이용하여 모든 환자의 혈청을 합한 시료를 사용하여 예비 MRM 분석을 수행하여 트랜지션 정보 (혈청에서의 검출가능성 및 트랜지션의 적절성)를 수득하였다. 50개 단백질에 대한 FASTA 형식의 서열 정보를 Skyline software 에 도입해서 선정된 펩타이드 수는 498개, 트랜지션 수는 2174개 이었다. Skyline software를 이용한 트랜지션 선정 시, 펩타이드 필터 조건은 실시예 1-4에 기재된 바와 같다. MRM 데이터 수득 후, 최종 트랜지션은 다음의 조건으로 선별되었다: 단백질당 적어도 두 개의 펩타이드, 및 신호-대-노이즈 (S/N)이 3을 초과하고 펩타이드 당 적어도 3개의 트랜지션을 검출가능한 트랜지션으로 선별.

궁극적으로 50개의 후보 마커 중 28개가 제 1 스크리닝 단계에서 사용된 기준을 만족하였다.

실시예 5. MRM 분석을 위한 기술적 재현성을 갖는 트랜지션 선별

MRM 분석의 재현성은 정량적 분석에서 매우 중요하다. 본 실시예에서는 다음과 같이 수행하였다. 상기 1차 스크리닝 단계에서 선택되어진 28개 단백질, 111개 펩타이드, 333개 트랜지션을 대상으로 개별 시료에 적용하기 위한 표적 단백질을 선정하기 위해서 정상인 36명의 시료를 통합한 시료, 간암 치료 전(비치료) 18명을 통합한 시료, 간암 치료 후 18명을 통합한 시료를 준비하여 총 3군의 통합 혈청 시료를 이용하여 분석을 진행했다.

분석 방법은, 첫 번째 스크리닝 단계에서 결정되어진 보유시간 (retention time) 을 이용해서 scheduled MRM 방식으로 5회 반복 분석을 했고, 트랜지션은 500~1000개 사이로 분석을 했으며, 윈도우 크기는 120초로 분석을 했다. 분석 순서는 정상인 시료, 간암 치료 전 시료(비치료), 간암 치료 후 시료 순서로 각각 1번씩 교차로 5번씩 분석을 했으며, 이를 통해서 얻어진 자료는 Skyline software 에 도입한 다음, 각 펩타이드 트랜지션의 면적 값으로 환산한 다음, 내부 표준 펩타이드의 피크 면적 값으로 노말라이즈한 후 비교 분석 했다.

노말라이즈된 펩타이드 강도 변동 폭이 낮은 펩타이드 (CV < 30%)와 정상인 군과 간암 치료 전 군, 간암 치료 전군과 간암 치료 후 군간에 유의적인 차이 (p-value < 0.05) 를 보이는 펩타이드만을 선별해서 개별 시료 분석에 적용할 표적 펩타이드를 선정했다. MedCalc (version 12.2) 통계 프로그램을 이용하여 분석한 결과 (t-TEST, ANOVA), 개별 시료에 적용 할 표적 단백질 수는 19개, 펩타이드 수는 30개, 트랜지션 수는 90개로 선정 되었다.

실시예 6. 개별 혈청 시료를 사용한 MRM 분석을 통한 표적 마커 선별

실시예 5의 2차 스크리닝 단계에서 선별된 19개 단백질, 30개 펩타이드, 90개 트랜지션을 개별 시료에 적용해서 군 간 발현 양상이 통합시료와 유사한 단백질 만을 최종 표적 단백질 마커로 선정하였다. 분석 순서는 정상인 시료 1, 2번, 간암 치료 전 시료 1번, 간암 치료 후 시료 1번 분석 후, 정상인 시료 3,4 번 간암 치료 전 시료 2번, 간암 치료 후 시료 2번 순서로 각각 1번씩 교차로 분석을 진행했으며, 이를 통해서 얻어진 자료는 상술한 바와 같은 Skyline software 에 도입한 다음, MedCalc (version 12.2) 통계 프로그램을 통해서 분석했다. 이를 통해서 통합 시료와 개별 시료에 있어 군 간 (정상인, 간암 치료 전, 간암 치료 후) 발현 양상이 유사한 하기 최종 표적 단백질 9개가 선정되었다: long-chain specific acyl-CoA dehydrogenase, mitochondria (ACADVL), actin-binding protein, anillin (ANLN), brain acid-soluble protein 1 (BASP1), c-1-tetrahydrofolate synthase, cytoplasmic (MTHFD1), calpain-1 catalytic subunit (CAPN1), complementary C4-A (C4A), alpha-fetoprotein (AFP), filamin-B (FLNB), 및 polyadenylate-binding protein 1 (PABPC1).

최종 표적 단백질 9개에 대해서 ROC 커브를 확인했다. ROC 커브는 민감도와 특이도가 서로 어떤 관계를 갖고 변하는지를 이차원 평면상에 표현한 것인데, ROC 커브 아래의 면적에 해당하는 AUC (area under curve) 값이 클수록 좋은 진단 방법이다. 해당 표적 단백질 9개에 대한 AUC 값은 하기 표 2와 같고, ROC 커브 및 상호작용 플랏 그림은 모두 MedCalc (version 12.2) 통계 프로그램으로 작성하였다.

[표2]

ACADVL, ANLN, MTHFD1, AFP, 및 FLNB 정상대조군 대 치료전 HCC 군에서 증가하였으며, 치료전 HCC 군 대 치료 후 HCC 군에서 감소하였다. BASP1, CAPN1, C4A, 및 PABPC1는 정상 대조군 대 치료전 HCC 군과 및 치료전 HCC군 대 치료후 HCC군에서 감소하였다.

통계 분석에서 이들 9개의 단백질은 정상대조군, 치료전 HCC 군, 및 치료 후 HCC 군사이에서 P -values < 0.05 값으로 차별적으로 발현되었다. 이들의 AUC 값은 표 2에 나타난 바와 같이 0.608 내지 0.951 이었다. 정상 대조군 대 치료전 HCC 군에서 6개 단백질의 AUC 값이 0.8을 넘었으며, ANLN, BASP1, CAPN1 및 PABPC1의 AUC 값은 각각 0.920, 0.951, 0.946 및 0.949 이었다. 이러한 결과는 본원 마커의 우수한 민감도와 특이성을 입증하는 것이다.

실시예 7. MRM 분석과 웨스턴블랏 결과의 상관성 분석

상기 선별된 9개의 단백질을 웨스턴블랏으로 검증하였다. 본 실험 전에 상기 단백질의 발현에 관한 조사를 PaxDb (http://pax-db.org)에서 수행하여, 항체의 희석배율을 결정하였다. 웨스턴블랏을 위해 36명의 정상 대조군 중 13명을 무작위로 선별하여 사용하고, 13명의 치료전 HCC군 및 13명의 치료후 HCC 군을 분석하였다. 치료전 HCC 군 및 치료 후 HCC 군의 경우, 13개의 혈청시료는 개별 MRM 분석에 사용된 것과 상이한 것을 사용하였다.

SDS-PAGE 젤 간의 변이성을 최소화하기 위하여, 13명의 정상대조군 혈청, 13명의 치료전 HCC군 및 13명의 치료후 HCC 군 유래의 혈청을 한데 모아 모든 젤(12%)의 첫 번째 래인에 로딩하여, 개별 시료 강도의 노말라이즈에 사용하였다. 그 결과, ACADVL 및 PABPC1는 강도를 구하기에 부적절 하여, 9 개 중 7개의 마커를 웨스턴블랏으로 확인하였다. 이어 MRM과 웨스턴블랏간의 상관관계를 계산하였다.

AFP, ANLN, C4A, 및 FLNB 는 MRM과 동일한 발현 양상을 나타냈다 (도 4 참조). 비질환 군(정상 대조군, 치료 후 HCC 군)에서, AFP, ANLN, 및 FLNB 발현은 질환군 (치료전 HCC 군)과 비교하여 감소하였다. AFP는 HCC에 대하여 공인된 바이오마커로 MRM 및 웨스턴블랏을 통해서 일치하는 결과를 수득하였다. C4A는 정상대조군 대 치료전 HCC 군과 치료전 HCC군 대 치료후 HCC 군에서 감소하였다. MRM- 및 항체 실험결과를 비교하면, 4개 단백질 (AFP, ANLN, FLNB, 및 C4A)의 상대적 양은 유사하였다. 반면 웨스턴블랏에서 BASP1, MTHFD1, 및 CAPN1은 MRM 분석과 비교하여 차이가 나는 발현양상을 나타냈다.

실시예 8. 다중 마커 패널 조합 및 분석

단일 마커와 비교하여 다수의 마커를 조합으로 사용하는 경우 변별력이 향상된다.

MRM과 웨스턴블랏으로 검증된 4개의 단백질을 사용하여 다중마커 패널을 생성하였다. AFP 및 C4A는 colinearity를 나타내며, 10을 넘는 variance inflation factor (VIF)를 지녀 패널에서 제외하였다. 최종 모델은 ANLN 및 FLNB을 포함하며, AFP는 단일마커 대조군으로 사용되었다. 세 가지 유형의 비교를 수행하였다: 정상 대조군 대 치료전 HCC 군, 치료전 HCC 군 대 치료후 HCC 군, 및 정상대조군 플러스 치료후 HCC 군 대 치료전 HCC 군 (도 5a 내지 5c 참조).

AFP를 단독으로 사용한 경우, 18명의 치료전 HCC 군 중 8명, 36명의 정상 대조군 중 29명이 정확하게 분류되었으며, AUC 0.756 및 31% 에러율을 나타냈다.

반면 본원의 두 개 마커 패널을 이용한 경우, 18명의 치료전 HCC 군 중 17명, 모든 36명의 정상 대조군이 정확하게 분류되었으며, AUC 0.981 및 2% 에러율을 나타냈으며, 이는 AFP와 비교하여 월등히 우수한 것이다 (도 5a 참조).

도 4b의 경우, AFP 단독 모델의 경우, 18명의 치료전 HCC 군 중 12명 및 18명의 치료후 HCC 군 중 9명을 정확하게 분류하였다(AUC = 0.735, 에러율 = 42%), 반면 본원에 따른 2 마커 패널은 18명의 치료전 HCC 군 중 15명 및 18명의 치료후 HCC 군 중 11명을 정확하게 분류하였다( AUC = 0.895, 에러율 = 28%). 이는 치료전 HCC 환자 대 치료 후 HCC 환자를 판별하는데 있어, 2 마커 패널의 변별력이 AFP와 비교하여 월등히 우수함을 나타내는 것이다.

APF는 8 명 질환군 (처리 전 HCC 군) 중 4명 및 54명의 비질환군 (정상대조군 및 치료후 HCC 군)중 50명 (AUC = 0.749, 에러율 =25%) 만을 판별하였다 (도 5c참조). 반면 2 마커 패널은 15 of 18 명의 질환 군 중 15명 및 54명의 비질환군 중 50명을 판별(AUC = 0.953, 에러율 = 10%)하여 월등히 우수하였다.

이러한 결과는 모든 비교군에서, 본원의 두 마커 패널이 기존의 AFP 마커보다 월등히 우수한 것임을 나타낸다.

또한 도 6a 내지 j에 나타난 바와 같이, 마커를 조합으로 logistic regression 모형을 이용하여 다양한 간암 마커 패널을 결정하였다. 조합은 상기 마커 중 가장 높은 AUC 값을 가지는 단백질 (BASP1, ANLN) 및 AFP와 그리고 9개 단백질(ACADVL, ANLN, BASP1, MTHFD1, CAPN1, C4A, AFP, FLNB, PABPC1) 을 대상으로 하나의 패널로 결합하는 분석을 수행하였다.

Logistic regression 통계 분석을 통해 9개 단백질로 구성된 9-단백질 패널을 구성하였으며 기존의 AFP 단백질에 대해 간암 완치 환자에 대한 간암 환자의 구분, 정상 대조군 그룹에 대한 간암 환자의 구분 및 간암 완치 환자 및 정상 대조군 환자에 대한 간암 환자의 구분 모든 경우에 대해 기존의 AFP 보다 9-단백질 패널이 우수한 변별력(AUC=1.000)을 보이는 것으로 확인되었다.

또한, 상기 마커 중 가장 높은 AUC 값을 가지는 BASP1의 ROC 커브를 기준으로 기존 간암 마커 단백질인 AFP를 제외한 8개의 마커 단백질을 2-8 단백질 패널로 조합하여 ROC를 작성하여 정상대조군과 치료전 HCC 군간의 AUC 값을 확인했다.

확인 결과, 2-단백질 패널의 경우 AUC 값이 0.949, 3-단백질 패널의 경우 0.955로 확인 되었고, 4,5,6,7,8-단백질 패널 의 경우 AUC 값이 모두 1.000 으로 확인되었으며, 한 개는 물론 2개 이상의 조합에서 우수한 특이도와 민감도를 나타냈다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

하기 바이오마커의 검출시약을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트:
ANLN;
ANLN 및 FLNB;
BASP1 및 PABPC1;
BASP1, PABPC1, 및 CAPN1;
BASP1, PABPC1, CAPN1 및 ANLN;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN 및 C4A;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A 및 MTHFD1;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1 및 ACADVL; 또는
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1, ACADVL 및 FLNB.
제 1 항에 있어서,
상기 검출시약은, 상기 바이오마커의 핵산서열, 상기 핵산서열에 상보적인 핵산서열, 상기 핵산서열의 단편, 또는 상기 핵산서열에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 항체, 항체단편, 앱타머(aptamer), 아비머(avidity multimer) 또는 펩티도모방체(peptidomimetics)를 포함하는, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 검출시약은, 상기 바이오마커의 핵산 또는 단백질 수준, 또는 이의 핵산 또는 단백질 존재여부 검출용 시약인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 3 항에 있어서,
상기 바이오마커의 단백질 수준 또는 존재여부 검출용 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이에 사용되는 시약인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 3 항에 있어서,
상기 바이오마커의 단백질 수준 또는 존재여부 검출용 시약은 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 기질, 앱타머, 아비머, 펩티도모방체, 수용체, 리간드 또는 보조인자인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 3 항에 있어서,
상기 바이오마커의 핵산 수준 또는 존재여부 검출용 시약은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, 뉴클레아제 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), 인시츄 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 3 항에 있어서,
상기 바이오마커의 핵산 수준 또는 존재여부 검출용 시약은 상기 바이오마커에 특이적인, 프라미어 쌍, 또는 프로브, 또는 프라이머쌍 및 프로브인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 키트는 ELISA 분석용, 딥스틱 래피드 키트(dip stick rapid kit) 분석용, MRM 분석용, 마이크로어레이용, 유전자증폭용, 또는 면역분석용인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서,
상기 키트는 상기 바이오마커에 추가하여 AFP 바이오마커 검출용 시약을 추가로 포함하는 것인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 키트.
하기 바이오마커의 검출시약을 포함하는 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물:
ANLN;
ANLN 및 FLNB;
BASP1 및 PABPC1;
BASP1, PABPC1, 및 CAPN1;
BASP1, PABPC1, CAPN1 및 ANLN;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN 및 C4A;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A 및 MTHFD1;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1 및 ACADVL; 또는
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1, ACADVL 및 FLNB.
제 10 항에 있어서,
상기 검출시약은, 상기 바이오마커의 핵산 또는 단백질 수준, 또는 이의 핵산 또는 단백질 존재여부 검출용 시약인, 간세포암 진단 또는 예후 분석용 조성물.
간세포암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
대상체 유래의 생물학적 시료로부터 하기 바이오마커,
ANLN;
ANLN 및 FLNB;
BASP1 및 PABPC1;
BASP1, PABPC1, 및 CAPN1;
BASP1, PABPC1, CAPN1 및 ANLN;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN 및 C4A;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A 및 MTHFD1;
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1 및 ACADVL; 또는
BASP1, PABPC1, CAPN1, ANLN, C4A, MTHFD1, ACADVL 및 FLNB의 핵산 또는 단백질 수준, 또는 핵산 또는 단백질의 존재여부를 검출하는 단계;
상기 핵산 또는 단백질의 수준 또는 존재에 대한 검출 결과를 대조군 시료의 해당 마커의 상응하는 결과와 비교하는 단계; 및
상기 대조군 시료와 비교하여, 상기 대상체 시료의 핵산 또는 단백질 수준의 변화가 있거나, 또는 상기 핵산 또는 단백질이 존재여부에 변화가 있는 경우, 이를 간세포암으로 판정하는 단계를 포함하는, 간세포암 마커를 검출하는 방법.
삭제
삭제
제 12 항에 있어서,
상기 ACADVL, ANLN, MTHFD1, 및 FLNB는 대조군과 비교하여 간세포암에서 발현이 증가되며, 상기 BASP1, CAPN1, C4A, 및 PABPC1는 발현이 감소되는 것인, 간세포암 마커를 검출하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 방법은 상기 바이오마커에 추가하여 AFP 바이오마커의 핵산 또는 단백질 수준, 또는 핵산 또는 단백질의 존재여부를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 간세포암 마커를 검출하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 방법은 마이크로어레이, 유전자 증폭, 항원-항체 반응, 또는 질량분석 방식으로 수행되는 것인, 간세포암 마커를 검출하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 바이오마커의 핵산 수준 또는 이의 존재여부 검출은 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, 뉴클레아제 보호 분석 (RNase, S1 nuclease assay), 인시츄 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 노던블랏 방식으로 수행되고,
상기 바이오마커의 단백질 수준 또는 이의 존재여부 검출은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분광분석, 또는 단백질 마이크로어레이 방식으로 수행되는 것인, 간세포암 마커를 검출하는 방법.