CN111426835A - 肝转移癌相关的尿液蛋白标记物的筛选及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肝转移癌相关的尿液蛋白标记物的筛选及其用途。具体而言，本发明涉及一种建立用于筛选与肝转移癌相关的尿液蛋白质标记物的动物模型的方法，以及通过本发明的方法获得的肝转移癌相关的尿液蛋白标记物在制备用于诊断受试者中肝转移癌早期的试剂盒中的用途，所述尿蛋白标记物选自小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白‑2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素‑3结合蛋白、HLA‑I类组织相容性抗原、β‑2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、α‑1‑酸性糖蛋白中的一种或多种或其组合。
Description
技术领域
本发明涉及临床医学；具体而言涉及人肝转移癌相关的尿液蛋白标记物的筛选及其在诊断和治疗中的用途。具体而言，本发明涉及利用肝转移癌大鼠疾病模型和质谱分析蛋白组学技术筛选获得人肝转移癌诊断和/或监测相关的尿液蛋白标记物，及其在诊断和治疗中的用途。
背景技术
肿瘤标记物可确定个体是否处于癌症风险状态，能早期检测癌症、预测生存和复发、监测治疗效果等。这样的肿瘤标记物主要来源于体液或组织器官，主要包括核酸、蛋白质、代谢物等。
尿液作为体液的重要来源之一，它在人体中起着重要作用。由于尿液缺乏维持稳态的机制，因此可以及时、动态的反映身体的许多变化(参见Gao Y.Urine--an untappedgoldmine for biomarker discovery.Sci China.Life Sci,2013,56(12):1145；Wu J,GaoY.Physiological conditions can be reflected in human urine proteome andmetabolome.Expert review of proteomics,2015,12(6):623-636.)。这是血与尿的主要区别。许多研究表明，使用蛋白质组学技术可以发现许多潜在的生物标记物，以反映尿液中的不同疾病。尿液的另一个优点是可以用无创的方式大量获得，在尿液里挖掘疾病特异的生物标记物，部分替代器官穿刺病理检查已成为科学家及临床医生关注的重要研究方向，具有重要的科学意义和巨大的临床应用前景。
肝癌是世界上癌症死亡率的第三大原因，中国城市癌症的最新数据报告发现，肝癌在癌症死亡率统计结果中居前三位之一(参见Chen W,Zheng R,Zhang S,et al.Cancerincidence and mortality in China in 2013:an analysis based on urbanizationlevel[J].Chinese Journal of Cancer Research,2017,29(1):1.)。同时，由于肝脏的血流量非常丰富，全身各脏器的恶性肿瘤大部分都能转移至肝脏，肝转移癌也同样是造成人类死亡原因的重要杀手。它具有显著的发病率和死亡率，严重威胁人类的生命健康。改善肝癌预后的有效策略之一是在早期发现肿瘤，即使患者没有明显症状，在尽可能的保留肝功能同时，采用更有效的治疗方法。早期诊断和早期治疗是预防和治疗癌症和降低死亡率的最有效方法(参见Ayuso C,Rimola J,Vilana R,et al.Diagnosis and staging ofhepatocellular carcinoma(HCC):current guidelines[J].European Journal ofRadiology,2018.)。目前，肝癌诊断主要依赖于成像设备(如超声、CT和MRI)和生物标记物的检测。然而，图像易受操作者经验的影响，很难区分肝癌和非恶性增生，有时在早期也很难检测到许多小结节。大约22％的早期肝癌成像并不典型(参见Pahwa A，Beckett K，Channual S，et al.Efficacy of the American Association for the Study of LiverDisease and Barcelona criteria for the diagnosis of hepatocellular carcinoma[J].Abdom Imaging，2014，39(4):753-760)。另一方面，肿瘤生物标记物敏感性和特异性差，许多研究表明，单独的生物标记物不能单独预测肝癌(参见Hellstern S,Sasaki T,Fauser C,et al.Functional studies on recombinant domains of Mac-2-bindingprotein[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277(18):15690-15696.)。为了提高肝转移癌患者的生存和预后，通过检测尿液中标记物的变化来检测早期的肝转移癌对于肝转移癌的早筛和治疗具有重要的临床意义。
发明内容
鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方式，本发明提供了一种建立用于筛选与肝转移癌相关的尿液蛋白质标记物的动物模型的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过将肿瘤细胞悬液或生理盐水分别注射到大鼠肝叶获得患有肝转移癌的大鼠模型和对照大鼠模型；
ii)收集步骤i)中获得的患有肝转移癌的大鼠模型和对照大鼠模型的尿液；和
iii)通过质谱分析鉴定步骤ii)中收集的患有肝转移癌的大鼠模型和对照大鼠模型尿液中的蛋白质谱，和
iv)比较步骤iii)中获得的患有肝转移癌的大鼠模型和对照大鼠模型尿液中的蛋白质谱，获得与肝转移癌相关的尿液蛋白质标记物。
根据本发明所述的方法，其中在步骤ii)中收集肝叶注射肿瘤细胞悬液或生理盐水之后第3、5、7、和11天的大鼠尿液。
另一方面，本发明提供了用于检测一种或多种根据本发明的方法获得的尿液蛋白质标记物的试剂在制备用于诊断受试者中早期肝转移癌的试剂盒中的用途。
另一方面，本发明提供了用于检测一种或多种根据本发明的方法获得的尿液蛋白质标记物的试剂在制备用于诊断受试者中早期肝转移癌的试剂盒中的用途，其中所述尿液蛋白质标记物选自小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、α-1-酸性糖蛋白中的一种或多种或其组合。
在另一个实施方式中，提供了用于检测一种或多种根据本发明的方法获得的尿液蛋白质标记物的试剂在制备用于诊断和/或预后受试者中肝转移癌疾病的试剂盒中的用途，其中所述尿液蛋白质标记物选自：小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素-3结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、α-1-酸性糖蛋白、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合物免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区、胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1、NKG2-DII型整合膜蛋白、免疫球蛋白2A链C区、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、单核细胞分化抗原CD14、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、吸引素、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、β-氨基己糖苷酶亚基α、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合
在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在肝转移癌的早期损伤：溶酶体硫酯酶、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体及其组合；
在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在肝转移癌的早期损伤：小清蛋白α、膜联蛋白A1、β-2微球蛋白、补体C4、半乳凝素-3结合蛋白、血管细胞粘附蛋白1、Ⅰ类组织相容性抗原、聚合物免疫球蛋白受体、α-1-酸性糖蛋白及其组合。
在具体的实施方式中，健康对照是指未患有肝转移癌的个体。
在另一个实施方式中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于监测受试者的肝转移癌严重程度的试剂中的用途：半乳凝素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合物免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、α-1-酸性糖蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区、胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1及其组合。
在具体的实施方式中，对受试者进行取样，和健康对照中的蛋白水平相比较，根据患者尿液中蛋白标记物的变化情况来判断患者肝转移癌的严重程度。
在具体的实施方式中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者肝转移癌进展：半乳凝素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合物免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、α-1-酸性糖蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区及其组合。
在具体的实施方式中，相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者肝转移癌进展：胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1及其组合。
在另一个实施方式中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于受试者的肝转移癌肿瘤恶病质诊断的试剂中的用途：NKG2-D II型整合膜蛋白、β-2-微球蛋白、I类组织相容性抗原、免疫球蛋白2A链C区、钙粘蛋白-2、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、免疫球蛋白κ链C区、半乳糖凝集素-3结合蛋白、单核细胞分化抗原CD14、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(LHPP)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、聚合免疫球蛋白受体、二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、α-烯醇化酶、吸引素、运钴胺素蛋白-2、载脂蛋白H、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、维生素D结合蛋白、β-氨基己糖苷酶亚基α、苹果酸脱氢酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1、尿调节素、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、补体C3、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合。
在具体的实施方式中，对受试者进行取样，和健康对照中的蛋白水平相比较，根据患者尿液中蛋白标记物的变化情况来判断患者是否存在肿瘤恶病质。
在具体的实施方式中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于肿瘤恶病质状态：NKG2-D II型整合膜蛋白、β-2-微球蛋白、I类组织相容性抗原、免疫球蛋白2A链C区、钙粘蛋白-2、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、免疫球蛋白κ链C区、半乳糖凝集素-3结合蛋白、单核细胞分化抗原CD14、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(LHPP)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、聚合免疫球蛋白受体及其组合；
和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于肿瘤恶病质状态：二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、α-烯醇化酶、吸引素、运钴胺素蛋白-2、载脂蛋白H、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、维生素D结合蛋白、β-氨基己糖苷酶亚基α、苹果酸脱氢酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1、尿调节素、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、补体C3、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合。
适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。
在具体的实施方式中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。
在具体的实施方式中，根据本公开的蛋白标记物能够用于诊断和/或预后肝转移癌。
在具体的实施方式中，表达水平选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。
在具体的实施方式中，表达水平是在尿液样本中测定的。
在具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。
在具体的实施方案中，所述蛋白是尿液蛋白。
根据另一些实施方式，还提供了一种用于诊断和/或预后肝转移癌疾病的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、α-1-酸性糖蛋白、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合物免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区、胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1、NKG2-D II型整合膜蛋白、免疫球蛋白2A链C区、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、单核细胞分化抗原CD14、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、吸引素、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、β-氨基己糖苷酶亚基α、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合。
在一些实施方式中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。在另一些实施方式中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。在一些实施方式中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。
在具体的实施方式中，提供了一种肝转移癌早期诊断的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、α-1-酸性糖蛋白及其组合。
在另一些具体的实施方式中，提供了一种用于受试者肝转移癌病程监测的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：半乳凝素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合物免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、α-1-酸性糖蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区、胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1及其组合。
在另一些具体的实施方式中，提供了一种用于诊断受试者肿瘤恶病质的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：NKG2-DII型整合膜蛋白、β-2-微球蛋白、I类组织相容性抗原、免疫球蛋白2A链C区、钙粘蛋白-2、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、免疫球蛋白κ链C区、半乳糖凝集素-3结合蛋白、单核细胞分化抗原CD14、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(LHPP)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、聚合免疫球蛋白受体、二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、α-烯醇化酶、吸引素、运钴胺素蛋白-2、载脂蛋白H、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、维生素D结合蛋白、β-氨基己糖苷酶亚基α、苹果酸脱氢酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1、尿调节素、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、补体C3、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合。
根据一些实施方式，提供了一种用于诊断和/或预后受试者中肝转移癌疾病的方法，包括步骤：
1)获得受试者的尿液样本，
2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，
3)确定所述受试者的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：
小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、α-1-酸性糖蛋白、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合物免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区、胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1、NKG2-D II型整合膜蛋白、免疫球蛋白2A链C区、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、单核细胞分化抗原CD14、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、吸引素、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、β-氨基己糖苷酶亚基α、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合。
在具体的实施方式中，使用质谱方法、ELISA方法、或Western方法确定表达水平。
当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方式中，用蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。
根据一些实施方式，提供了一种用于早期诊断受试者中肝转移癌的方法，包括步骤：
1)获得受试者和健康对照的尿液样本，
2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、α-1-酸性糖蛋白及其组合；
3)将受试者中所述蛋白的表达水平和健康对照中所述蛋白的表达水平进行比较，
4)确定所述受试者是否具有肝转移癌的早期损伤。
在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在肝转移癌的早期损伤：溶酶体硫酯酶、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体及其组合；
在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在肝转移癌的早期损伤：小清蛋白α、膜联蛋白A1、β-2微球蛋白、补体C4、半乳凝素-3结合蛋白、血管细胞粘附蛋白1、Ⅰ类组织相容性抗原、聚合物免疫球蛋白受体、α-1-酸性糖蛋白及其组合。
根据一些实施方式，提供了一种用于监测受试者中肝转移癌严重程度的方法，包括步骤：
1)获得受试者和健康对照的尿液样本，
2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：半乳凝素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合物免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、α-1-酸性糖蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区、胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1及其组合，
3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较，
4)确定所述受试者的肝转移癌是否进展。
在具体的实施方式中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者肝转移癌进展：半乳凝素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合物免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、α-1-酸性糖蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区及其组合。
在具体的实施方式中，相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者肝转移癌进展：胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1及其组合。
根据一些实施方式，提供了一种用于诊断受试者肿瘤恶病质的方法，包括步骤：
1)获得受试者和健康对照的尿液样本，
2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：NKG2-D II型整合膜蛋白、β-2-微球蛋白、I类组织相容性抗原、免疫球蛋白2A链C区、钙粘蛋白-2、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、免疫球蛋白κ链C区、半乳糖凝集素-3结合蛋白、单核细胞分化抗原CD14、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(LHPP)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、聚合免疫球蛋白受体、二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、α-烯醇化酶、吸引素、运钴胺素蛋白-2、载脂蛋白H、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、维生素D结合蛋白、β-氨基己糖苷酶亚基α、苹果酸脱氢酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1、尿调节素、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、补体C3、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合，
3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较，
4)确定所述受试者的是否处于肿瘤恶病质状态。
在具体的实施方式中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于肿瘤恶病质状态：NKG2-D II型整合膜蛋白、β-2-微球蛋白、I类组织相容性抗原、免疫球蛋白2A链C区、钙粘蛋白-2、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、免疫球蛋白κ链C区、半乳糖凝集素-3结合蛋白、单核细胞分化抗原CD14、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(LHPP)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、聚合免疫球蛋白受体及其组合。
和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于肿瘤恶病质状态：二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、α-烯醇化酶、吸引素、运钴胺素蛋白-2、载脂蛋白H、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、维生素D结合蛋白、β-氨基己糖苷酶亚基α、苹果酸脱氢酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1、尿调节素、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、补体C3、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合。
附图说明
图1：肿瘤造模不同时间点大鼠生长曲线。●代表肿瘤模型组；■代表正常对照组。*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。
图2A到2E分别为对照组、肝转移癌造模实验组的第3天、第5天、第7天、第11天大鼠肿瘤组织HE染色结果。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。
实施例
实施例1.肿瘤动物模型的建立
1.walker256大鼠肿瘤模型是经典的研究肿瘤进展或肿瘤恶病质的动物模型，适合用来研究肿瘤进展过程中病理生理及形态学的变化。
利用该动物模型模拟肿瘤的发病过程，观察肿瘤从正常、早期肿瘤、肿瘤进展及肿瘤晚期恶病质的整体变化，对临床上早期诊断肝转移癌、监测肝转移癌的病情进展、诊断晚期肿瘤恶病质有重要的指导意义。
2.材料与试剂
1)仪器：
大鼠代谢笼：购自北京佳源兴业科技有限公司。
Thermo-Orbitrap Lumos购自Thermo公司；
2)主要试剂：
去离子水来源于MillliQ RG超纯水系统；色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Fisher公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Sigma公司购买；测序级胰酶从Promega公司购买。
3)动物：
雄性SD大鼠(体重140g±20)购自中国医学科学院实验动物研究所，在标准饲养环境中饲养。
3.实验方法
-肿瘤细胞的传代：将冻存的walker256大鼠腹水快速37℃复苏后，接种大鼠腹腔内，一周后处死动物抽取腹水。腹水用生理盐水稀释后定量接种于另两只大鼠腹腔内。一周后处死大鼠抽取腹水。
-肿瘤的接种：用无菌生理盐水将腹水肿瘤细胞进行稀释2.5×106个/ml，麻醉大鼠，打开腹腔暴露肝叶，将100μl肿瘤细胞悬液注射到大鼠肝叶左侧，缝合关闭伤口。假手术组大鼠同样部位接种100ul生理盐水。
-样本收集流程：在造模之前，将大鼠置于代谢笼中收集正常尿液，在造模之后分别于第3、5、7、9、11、13、15、17天将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。同时每天测量造模后模型组大鼠和假手术组大鼠的体重。
测试例
测试例1.组织病理学检查
在大鼠肿瘤造模第3、5、7、11、18天，将实施例1中的大鼠安乐死并取大鼠皮下肿瘤组织用福尔马林固定，蜡块包埋后进行HE染色。
测试例2.蛋白质分析
1.尿蛋白提取与保存：各时段尿液于4℃2000g离心20分钟，取上清，置于新EP管内，继续12000g 4℃离心20分钟；取上清，-80℃保存。
2.乙醇沉淀尿液蛋白，用Bradford法测蛋白浓度后进行膜上酶切，参见Wisniewski JR,Zougman A,Nagaraj N,Mann M.Universal sample preparation methodfor proteome analysis.Nature methods 2009；6:359-62。BCA法测量多肽浓度。
3.LC-MS/MS串联质谱分析：
将多肽样本用0.1％甲酸稀释成0.5μg/μl。多肽样本通过Thermo液相系统EASY-nLC 1200上样系统分离。洗脱时间120分钟，色谱柱流速为0.3μl/min。洗脱梯度为5％至40％流动相B(流动相A为：0.1％甲酸；流动相B为：89.9％乙腈)。洗脱下的肽段使用ThermoOrbitrap Lumos质谱仪进行分析。采用阳离子模式，母离子和子离子的分辨率为120000。
4.数据库检索：
所有质谱结果用mascot软件进行数据库检索。所用数据库为Swissprot_rat。检索条件为：胰酶酶切；允许有2个漏切位点；半胱氨酸+57Da的固定修饰；质谱数据检索容许误差为：母离子0.05Da，子离子0.05Da。
5.蛋白相对定量：
Mascot搜库结果通过Scaffold软件进行蛋白组数据定量分析。蛋白的FDR值设为1％，蛋白至少拥有2个unique多肽。
6.统计分析
将不同时间点的蛋白组数据进行统计分析，筛选出于假手术组相比谱图数变化倍数在1.5倍以上，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白。
实验结果
1.体重变化：
对不同时间点大鼠体重的测量，发现与假手术组相比，walker256大鼠体重明显下降，随着病情加剧，实验组大鼠腹水加重，又出现体重的增加，但对照组相比，仍具有显著性差异(图1)。
2.HE染色结果：
造模后第3、5、7、11天分别处死实验组和对照组大鼠，取肝部做病理，与对照组相比，实验组大鼠的肝部镜下可看到肿瘤细胞逐渐增多，随后形成明显的瘤体，显示造模成功(图2A、2B、2C、2D、2E)
3.蛋白鉴定结果：
来源于大鼠4个时期(3天、5天、7天和11天)的尿液，在FDR小于1％的水平，基于两肽以上鉴定的蛋白为633个。
与假手术组的蛋白定量的谱图数进行比对，筛选出其他时间点变化倍数在1.5倍以上及重复测量ANOVA p值小于0.05的差异蛋白，同时使用Uniprot数据库将大鼠蛋白转化为相应的人同源蛋白。
表1显示，在肿瘤早期(造模3天)筛选出差异蛋白12个。并且这12个差异蛋白在肿瘤的其他阶段也有明显差异(表2)，说明了这些蛋白作为肿瘤早期诊断的可靠性。转化为人同源蛋白后，在肝转移癌早期，溶酶体硫酯酶、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体表达量降低；小清蛋白α、膜联蛋白A1、β-2微球蛋白、补体C4、半乳凝素-3结合蛋白、血管细胞粘附蛋白1、Ⅰ类组织相容性抗原、聚合物免疫球蛋白受体、α-1-酸性糖蛋白表达量增加。
表1.肝转移癌早期诊断的尿液蛋白标记物
对不同时间点差异蛋白进行汇总，根据这些变化可以用于监测肿瘤的病程(表2)。
表2.在肿瘤进展过程中蛋白表达水平的变化
将肿瘤晚期(造模11天)这一阶段特异出现的差异蛋白作为肿瘤恶病质的诊断标记物。
表3.肿瘤恶病质的蛋白标记物
Claims (10)
1.一种建立用于筛选与肝转移癌相关的尿液蛋白质标记物的动物模型的方法，所述方法包括以下步骤：
i)通过将肿瘤细胞悬液或生理盐水分别注射到大鼠肝叶获得患有肝转移癌的大鼠模型和对照大鼠模型；
ii)收集步骤i)中获得的患有肝转移癌的大鼠模型和对照大鼠模型的尿液；其中收集肝叶注射肿瘤细胞悬液或生理盐水之后第3、5、7、和11天的大鼠尿液；和
iii)通过质谱分析鉴定步骤ii)中收集的患有肝转移癌的大鼠模型和对照大鼠模型尿液中的蛋白质谱，和
iv)比较步骤iii)中获得的患有肝转移癌的大鼠模型和对照大鼠模型尿液中的蛋白质谱，获得与肝转移癌相关的尿液蛋白质标记物。
2.用于检测一种或多种尿液蛋白质标记物的试剂在制备用于诊断受试者中肝转移癌早期的试剂盒中的用途，其中所述尿液蛋白质标记物选自小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素-3结合蛋白、HLA-I类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4-A、α-1-酸性糖蛋白中的一种或多种或其组合。
3.根据权利要求2所述的用途，其中：
相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在肝转移癌的早期损伤：溶酶体硫酯酶、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体及其组合；
相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在肝转移癌的早期损伤：小清蛋白α、膜联蛋白A1、β-2微球蛋白、补体C4-A、半乳凝素-3结合蛋白、血管细胞粘附蛋白1、HLA-I类组织相容性抗原、聚合物免疫球蛋白受体、α-1-酸性糖蛋白及其组合。
4.用于检测一种或多种尿液蛋白质标记物的试剂在制备用于诊断或监测受试者中肝转移癌肿瘤进展严重程度的试剂盒中的用途，其中所述尿液蛋白质标记物选自：半乳凝素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4-A、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、α-1-酸性糖蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区、胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1中的一种或多种或其组合。
5.根据权利要求4所述的用途，其中：
相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者肝转移癌的进展：
半乳凝素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4-A、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、α-1-酸性糖蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区及其组合；
相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者肝转移癌的进展：胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1及其组合。
6.用于检测一种或多种尿液蛋白质标记物的试剂在制备用于诊断或监测受试者中肝转移癌肿瘤晚期恶病质的试剂盒中的用途，其中所述尿液蛋白质标记物选自：NKG2-D II型整合膜蛋白、β-2-微球蛋白、I类组织相容性抗原、免疫球蛋白2A链C区、钙粘蛋白-2、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、免疫球蛋白κ链C区、半乳糖凝集素-3结合蛋白、单核细胞分化抗原CD14、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(LHPP)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、聚合免疫球蛋白受体、二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、α-烯醇化酶、吸引素、运钴胺素蛋白-2、载脂蛋白H、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、维生素D结合蛋白、β-氨基己糖苷酶亚基α、苹果酸脱氢酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1、尿调节素、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、补体C3、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1中的一种或多种或其组合。
7.根据权利要求6所述的用途，其中：
相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于肿瘤晚期恶病质：NKG2-D II型整合膜蛋白、β-2-微球蛋白、I类组织相容性抗原、免疫球蛋白2A链C区、钙粘蛋白-2、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、免疫球蛋白κ链C区、半乳糖凝集素-3结合蛋白、单核细胞分化抗原CD14、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶(LHPP)、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、聚合免疫球蛋白受体及其组合；
相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于肿瘤晚期恶病质：二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、α-烯醇化酶、吸引素、运钴胺素蛋白-2、载脂蛋白H、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、维生素D结合蛋白、β-氨基己糖苷酶亚基α、苹果酸脱氢酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、果糖-1,6-二磷酸酶1、尿调节素、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、补体C3、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合。
8.根据权利要求2至7中任一项所述的用途，其中：
用于检测一种或多种尿液蛋白质标记物的试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段，优选所述抗体是单克隆抗体。
9.根据权利要求2至7中任一项所述的用途，其中所述试剂盒用于测定受试者尿液样本中所述尿液蛋白质标记物的水平，并与健康对照者相应的尿液蛋白质标记物水平进行比较；其中优选地所述受试者为哺乳动物，优选人。
10.一种用于诊断和/或预后肝转移癌的试剂盒或芯片，其包含用于检测一种或多种选自以下的尿液蛋白质标记物的试剂：
小清蛋白α、膜联蛋白A1、聚合物免疫球蛋白受体、溶酶体硫酯酶(PPT2)、运钴胺素蛋白-2、组织蛋白酶H前体、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Ⅰ类组织相容性抗原、β-2微球蛋白、血管细胞粘附蛋白1、补体C4、α-1-酸性糖蛋白、1,2-二羟基-3-酮-5-甲硫基戊烯双加氧酶、钙粘蛋白-2、蛋白质ABHD14B、细胞间粘附因子1、血浆蛋白酶C1抑制剂、胶原凝素-12、聚合免疫球蛋白受体、胱抑素-C、胃蛋白酶原C、血管紧张素原、蛋白质AMBP、磷酸肌氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶、内皮细胞选择性粘附分子、免疫球蛋白κ链C区、胎球蛋白-B、表皮生长因子、L-乳酸脱氢酶B链、磷脂酶D3、载脂蛋白H、尿激酶型纤溶酶原激活剂、核苷二磷酸激酶B、维生素D结合蛋白、氨基酰化酶-1A、尿调节素、脑啡肽酶、补体C3、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、果糖二磷酸醛缩酶B、α-烯醇化酶、醌氧化还原酶、埃兹蛋白、核糖核酸酶胰腺γ型、碱性磷酸酶、过氧氧化还原酶-6、果糖-1,6-二磷酸酶1、磷酸甘油酸变位酶1、苹果酸脱氢酶、程序性细胞死亡6-相互作用蛋白、膜突蛋白、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、异柠檬酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、过氧化物酶-1、NKG2-D II型整合膜蛋白、免疫球蛋白2A链C区、血管细胞粘附蛋白1、铜转运蛋白、单核细胞分化抗原CD14、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、二肽基肽酶2、羧肽酶Q、凝溶胶、血清淀粉样蛋白P-成分、蛋白质FAM151A、吸引素、酒精脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、二肽基肽酶1、β-氨基己糖苷酶亚基β、β-氨基己糖苷酶亚基α、组织α-L-岩藻糖苷酶、三肽基肽酶1、Xaa-Pro氨肽酶2(XPP2)、异柠檬酸脱氢酶、钙结合蛋白、溶酶体α-葡萄糖苷酶、硒结合蛋白1及其组合；
所述试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段，优选所述抗体是单克隆抗体；
所述诊断和/或预后选自：肝转移癌的早期诊断、诊断或监测受试者的肝转移癌严重程度、诊断肝转移癌肿瘤晚期恶病质及其组合。
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