JP2013545993A - 結腸直腸癌（ｃｒｃ）肝転移に対するバイオマーカー、バイオマーカーの使用及びバイオマーカーを同定する方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとしてのタンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３、タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１、タンパク質ＥＭＩＬＩＮ１、タンパク質ペリオスチン、タンパク質ＣＤ９７、タンパク質プロラルギン、タンパク質Ｔｈｙ−１膜糖タンパク質、タンパク質成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質、タンパク質ビグリカン、タンパク質ＥＰＣＡＭ及びタンパク質ＥＭＩＬＩＮ２の１つ又は複数の使用に関する。本発明は、ＣＲＣ肝転移の治療的治療及び／又は予防的治療において使用される上述のバイオマーカーに指向性を有するリガンドにも関する。

Description

本発明は、新規のバイオマーカー、特定の疾患、特にがんに対する接近可能なバイオマーカーを同定するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法、及び該バイオマーカーの使用に関する。

がん等の疾患に関する研究の多くの態様における主要な工程は、効果的な改善された診断法、予後診断法及び治療法の開発に好適な特異的な感受性バイオマーカーの同定である。本発明の目的は、新規の診断マーカー及び／又は予後マーカーとして使用される、及び／又は新規の治療法の開発において使用される新規のバイオマーカーを提供することである。

質量分析、ショットガンプロテオミクス及びＤＮＡ／ＲＮＡマイクロアレイ分析によって、報告された潜在的腫瘍バイオマーカーのリストは増加しているが、臨床評価段階にまで進むものはほとんどなく、信頼性のある治療標的又は診断マーカーとして使用されるものは更に少ない（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。

細胞中のｍＲＮＡ量とタンパク質量との間に相関はなく、このことがマイクロアレイ技術を新規の臨床的に有用なバイオマーカーの同定にとって信頼性に欠けるものにしていることが既知であり、一般に認められている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。

したがって、特許文献１は１２０個のマーカー遺伝子の遺伝子発現プロファイル、又はマイクロアレイ実験を用いた結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移に対するその選択を開示しているが、対応するポリペプチドの同時上方制御の証拠は提示していない。

同様に、Koehler A et al（非特許文献７）は、ＲＮＡ発現プロファイリングによる結腸直腸癌におけるトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３（ＩＨＣ）の過剰発現を報告しているが、対応するタンパク質の過剰発現の証拠は提示していない。

国際公開第２００６／０１５７４２号

Clin. Chem. 48 (2002, whole issue) 1145-1375 Clin. Biochem. 37 (2004, whole issue) 503-647 J. Proteome Res. 4 (2005, whole issue) 1043-1456 Drug Discovery Today 7 (2002) S197-S203, page s200, col 1 and 2 FEBS Letters 583 (2009) 3966-3973 Biotechnol Genet Eng Rev 25 (2008) 77-92 Pathology Research and Practice, Gustave Fischer, Stuttgart, 197 (2001) page 301

本発明の目的は、診断目的及び治療目的で有用かつ信頼性がある可能性が最も高いタンパク質を標的とする潜在的バイオマーカーを同定する方法を提供することである。本発明にとって興味深いバイオマーカーは接近可能なバイオマーカー、すなわち細胞外マトリックス中又は細胞外膜上に見られるバイオマーカーである。これらのタンパク質は、全身に送達される特定の作用物質、例えば放射標識するか又は薬理化合物と連結することができる抗体によって到達可能であるため、特に興味深い。

有効なバイオマーカーの同定における主な制限は、バイオマーカーを回収する必要がある組織の希少性である。これは、ごく少量でしか分析に利用可能でないヒト病理組織、例えばがん病変に特に当てはまり、これらのサンプルを非常に貴重なものにしている。そのように限られた量の組織からの接近可能(accessible)なタンパク質の分析を可能にする現在利用可能なプロテオミクス方法は、十分に改善の余地がある。この利用可能な技法は、主に対象のバイオマーカーの物理的位置を利用することによってこの問題に取り組むものであり（Celis, J.E. et al. Mol. Cell. Proteomics 3, 327-344 (2004)）、それほど化学的妥当性に焦点を置いてはいない。この目的で、ストレプトアビジン親和性クロマトグラフィーと併用した、接近可能なタンパク質をそれらの遊離アミン基を介して標識する化学的に修飾したビオチンの使用が有効な方法であることが実証されている（Castronovo, V. et al. Proteomics 7, 1188-1196 (2007)）。しかしながら、かかる遊離アミン基を有しない接近可能なタンパク質は更なる研究から除外される。本発明の方法では、外膜に結合したタンパク質及び細胞外タンパク質の大半が糖タンパク質であるという事実が利用される。

第１の態様によると、本発明は、乳がん又はその素因に対するバイオマーカーとしてのミオフェリン(myoferlin)、ＣＤ２７６、マクロファージマンノース受容体２(macrophage mannose receptor 2)（ＣＤ２８０）、９回膜貫通型スーパーファミリーメンバー３(transmembrane 9 superfamily member 3)（ＥＰ７０−Ｐ−ｉｓｏ）、ＥＭＩＬＩＮ１、脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１(adipocyte enhancer-binding protein 1)、アグリン(agrin)、コラーゲンα１（ＸＩＩ）鎖(collagen alpha-1(XII) chain)、ラミニンα５(laminin alpha-5)、ロイシンリッチリピート含有タンパク質１５(leucine-rich repeat-containing protein 15)、ネクチン様タンパク質２(nectin-like protein 2)、オルファクトメジン様１(olfactomedin-like 1)、イノシトールモノホスファターゼ３(inositol monophosphatase 3)及びトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３(transforming growth factor beta induced protein ig-h3)（ＩＨＣ）の１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、本発明は、乳がん又はその素因に対するバイオマーカーとしての脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１、アグリン、ラミニンα５、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３（ＩＨＣ）、コラーゲンα１（ＸＩＩ）鎖、マクロファージマンノース受容体２（ＣＤ２８０）及びネクチン様タンパク質２の１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、本発明は、乳がん又はその素因に対するバイオマーカーとしてのアグリン、ラミニンα５、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３（ＩＨＣ）、コラーゲンα１（ＸＩＩ）鎖、マクロファージマンノース受容体２（ＣＤ２８０）及びネクチン様タンパク質２の１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアグリン、ラミニンα５、ミオフェリン及びオルファクトメジン様１の１つ又は複数である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアグリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＣＤ２７６である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンα１（ＸＩＩ）鎖である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンα５である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はロイシンリッチリピート含有タンパク質１５である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はマクロファージマンノース受容体２（ＣＤ２８０）である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はミオフェリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はネクチン様タンパク質２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はオルファクトメジン様１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は９回膜貫通型スーパーファミリーメンバー３（ＥＰ７０−Ｐ−ｉｓｏ）である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はイノシトールモノホスファターゼ３である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３（ＩＨＣ）である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＥＭＩＬＩＮ１である。

好ましくは、本発明は、乳がんの治療バイオマーカーとしての脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１の使用を提供する。

第２の態様によると、本発明は、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとしての潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２(latent-transforming growth beta binding protein 2)、アスポリン(asporin)、脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１(adipocyte enhancer-binding protein 1)、アネキシンＡ６(annexin A6)、ラミニンα２サブユニット(laminin alpha-2 subunit)、ラミニンサブユニットα４(laminin subunit alpha-4)、ミメカン(mimecan)、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｐ−２ｂ(Ras-related protein Rap-2b)、コラーゲンα１（ＸＩＶ）鎖(collagen alpha-1 (XIV) chain)、コラーゲンα３（ＶＩ）鎖(collagen alpha-3(VI) chain)、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３(transforming growth factor beta induced protein ig-h3)、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質１(latent-transforming growth factor beta binding protein 1)、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼ触媒サブユニットＡ(V type proton ATPase catalytic subunit A)、タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ２(protein-glutamine gamma-glutamyl transferase 2)、ラミニンα４(laminin alpha-4)及び膜貫通タンパク質６２(transmembrane protein 62)の１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、本発明は、膵臓がん又はその素因に対するバイオマーカーとしての脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１、アネキシンＡ６、ラミニンサブユニットα４、コラーゲンα１（ＸＩＶ）鎖、コラーゲンα３（ＶＩ）鎖、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質１、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２、ラミニンα２サブユニット及びタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ２、ラミニンα４及び膜貫通タンパク質６２の１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアスポリン、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３及び潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２を含む群から選択される。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアネキシンＡ６である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアスポリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンα２サブユニットである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンサブユニットα４である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はミメカンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＲａｓ関連タンパク質Ｒａｐ−２ｂである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンα１（ＸＩＶ）鎖である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンα３（ＶＩ）鎖である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＶ型プロトンＡＴＰアーゼ触媒サブユニットＡである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンα４である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は膜貫通タンパク質６２である。

好ましくは、本発明は、膵臓がんの治療バイオマーカーとしての潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２の使用を提供する。

第３の態様によると、本発明は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとしてのタンパク質ミオフェリン(myoferlin)、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２(latent-transforming growth factor beta binding protein 2)、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３(transforming growth factor beta induced protein ig-h3)、タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１(adipocyte enhancer-binding protein 1)、タンパク質ＥＭＩＬＩＮ１、タンパク質ペリオスチン(periostin)、タンパク質ＣＤ９７、タンパク質プロラルギン(prolargin)、タンパク質Ｔｈｙ−１膜糖タンパク質(Thy-1 membrane glycoprotein)、タンパク質成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質(growth hormone inducible transmembrane protein)、タンパク質ビグリカン(biglycan)、タンパク質ＥＰＣＡＭ及びタンパク質ＥＭＩＬＩＮ２の１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、本発明は、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとしてのタンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３、タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１、タンパク質ＥＭＩＬＩＮ１及びタンパク質ペリオスチンの１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はミオフェリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質ＥＭＩＬＩＮ１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質ペリオスチンである。

ＣＲＣ肝転移への言及は、原発腫瘍が肝転移を生じる結腸直腸癌である症例に関する。

第４の態様によると、本発明は、がん又はその素因に対するバイオマーカーとしての脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＩＵＸ７）、アグリン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｏ００４６８）、ＣＤ２７６（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ５ＺＰＲ３）、オルファクトメジン様１、ミオフェリン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９ＮＺＭ１）、ラミニンα５（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｏ１５２３０）、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ１５５８２）、ロイシンリッチリピート含有タンパク質１５（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ８ＴＦ６６）、９回膜貫通型スーパーファミリーメンバー３（ＥＰ７０−Ｐ−ｉｓｏ）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９ＨＤ４５）、イノシトールモノホスファターゼ３（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９ＮＸ６２）、ＥＭＩＬＩＮ１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９Ｙ６Ｃ２）、コラーゲンα１（ＸＩＩ）鎖（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９９７１５）、マクロファージマンノース受容体２（ＣＤ２８０）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９ＵＢＧ０）、ネクチン様タンパク質２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９ＢＹ６７）、アネキシンＡ６（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０８１３３）、ラミニンα４（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ１６３６３）、コラーゲンＡ１（ＸＩＶ）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ０５７０７）、コラーゲンＡ３（ＶＩ）（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ１２１１１）、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質１（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ１４７６６）、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ１４７６７）、アスポリン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９ＢＸＮ１）、ラミニンα２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ２４０４３）、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｐ−２ｂ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ９Ｙ３Ｌ５）、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼ触媒サブユニットＡ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ３８６０６）、タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ２１９８０）、膜貫通タンパク質６２（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｑ０Ｐ６Ｈ９）、ミメカン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ２０７７４）、プロラルギン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ５１８８８）、ビグリカン（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：ｐ２１８１０１０）、ＥＰＣＡＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ１６４２２）、ＣＤ９７（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ４８９６０）、Ｔｈｙ−１膜糖タンパク質（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号：Ｐ０４２１６）及び成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質の１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、本発明は、がん又はその素因に対するバイオマーカーとしてのオルファクトメジン様１、ミオフェリン、ロイシンリッチリピート含有タンパク質１５、９回膜貫通型スーパーファミリーメンバー３（ＥＰ７０−Ｐ−ｉｓｏ）、イノシトールモノホスファターゼ３、ＥＭＩＬＩＮ１、アスポリン、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｐ−２ｂ、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼ触媒サブユニットＡ、膜貫通タンパク質６２、ビグリカン、ＥＰＣＡＭ、成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質及びＥＭＩＬＩＮ２の１つ又は複数の使用を提供する。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアグリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＣＤ２７６である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はオルファクトメジン様１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はミオフェリンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンα５である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はトランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はロイシンリッチリピート含有タンパク質１５である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は９回膜貫通型スーパーファミリーメンバー３（ＥＰ７０−Ｐ−ｉｓｏ）である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はイノシトールモノホスファターゼ３である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＥＭＩＬＩＮ１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＥＭＩＬＩＮ２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンα１（ＸＩＩ）鎖である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はマクロファージマンノース受容体２（ＣＤ２８０）である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はネクチン様タンパク質２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアネキシンＡ６である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はラミニンα４である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンＡ１（ＸＩＶ）である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はコラーゲンＡ３（ＶＩ）である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質１である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はアスポリンである。ラミニンα２．好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＲａｓ関連タンパク質Ｒａｐ−２ｂである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＶ型プロトンＡＴＰアーゼ触媒サブユニットＡである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はタンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は膜貫通タンパク質６２である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はミメカンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はプロラルギンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はビグリカンである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＥＰＣＡＭである。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＣＤ９７である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質はＴｈｙ−１膜糖タンパク質である。好ましくは、バイオマーカーとして使用されるタンパク質は成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質である。

本発明の第１、第２、第３及び第４の態様で言及されたタンパク質及び／又はペプチドは、本明細書中で「バイオマーカー」（単数又は複数）と称される。例えば、本発明の第１の態様で言及されたバイオマーカーへの言及は、本発明の第１の態様に挙げた全てのタンパク質に言及することを意図する。

更に別の態様によると、本発明は、被験体の乳がんの状態を決定する方法であって、
（ａ）被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、
（ｂ）サンプルにおける本発明の第１の態様で言及されたバイオマーカーの１つ又は複数のレベル(level)を決定する工程と、
（ｃ）（ｂ）で決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による１つ又は複数の参照値と比較する工程と、
を含む、方法を提供する。

更に別の態様によると、本発明は、被験体の膵臓がんの状態を決定する方法であって、
（ａ）被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、
（ｂ）サンプルにおける本発明の第２の態様で言及されたバイオマーカーの１つ又は複数のレベルを決定する工程と、
（ｃ）（ｂ）で決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による１つ又は複数の参照値と比較する工程と、
を含む、方法を提供する。

更に別の態様によると、本発明は、被験体のＣＲＣ肝転移の状態を決定する方法であって、
（ａ）被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、
（ｂ）サンプルにおける本発明の第３の態様で言及されたバイオマーカーの１つ又は複数のレベル(level)を決定する工程と、
（ｃ）（ｂ）で決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による１つ又は複数の参照値と比較する工程と、
を含む、方法を提供する。

更に別の態様によると、本発明は、被験体のがんの状態を決定する方法であって、
（ａ）被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、
（ｂ）サンプルにおける本発明の第４の態様で言及されたバイオマーカーの１つ又は複数のレベルを決定する工程と、
（ｃ）（ｂ）で決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による１つ又は複数の参照値と比較する工程と、
を含む、方法を提供する。

本発明の先の態様の工程（ａ）で言及されたサンプルは、被験体から得ることができる。好ましくは、サンプルを得る工程は本発明の方法の一部を形成しない。

本発明のがん状態又は転移状態を決定する方法は、臨床症状の評価と併用することができる。

「がん状態」又は「転移状態」という表現は、バイオマーカーが対象とする特定のがん又は転移、例えば乳がん、膵臓がん又はＣＲＣ肝転移の任意の識別可能な兆候を含む。例えば、がん状態としては、がんの有無、がんを発症する危険性、がんの病期、がんの進行（例えば経時的ながんの進行又はがんの寛解）及びがんの治療に対する有効性又は被験体の応答が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の方法は、例えば以下のいずれか１つ又は複数に用いることができる：被験体におけるがんの診断、被験体ががんを発症する可能性の評価、がんが見られる被験体の予後についてのアドバイス、疾患進行のモニタリング、及び治療に対する有効性又は被験体の応答のモニタリング。

本発明のバイオマーカーは、診断バイオマーカー、予後バイオマーカー及び治療バイオマーカーの１つ又は複数として使用することができる。好ましい実施の形態では、治療バイオマーカーと明記されないバイオマーカーは、好ましくは診断バイオマーカー若しくは予後バイオマーカーの少なくとも一方、又はその両方である。

好ましくは、この方法は、被験体によって提供される又は被験体から得られるサンプルにおける１つ又は複数のバイオマーカーのレベルの分析から、被験体におけるがんの診断を可能にする。

本発明の方法は更に又は代替的に、バイオマーカーを標的とする療法を開発するために用いることができる。本明細書での治療バイオマーカーへの言及は、療法の標的として使用することのできるバイオマーカーに言及することを意図し、このバイオマーカーは、診断目的及び／又は予後診断目的で使用されるバイオマーカーに加えて又はその代わりに使用することができる。好ましくは、治療バイオマーカーは、薬物を送達するためにリガンドの標的とすることができるタンパク質を表す。例えば、治療バイオマーカーは抗体−薬物複合体によって認識されることができ、この場合、抗体は治療バイオマーカーを認識し、複合した薬物を送達する。

被験体から得られるサンプル物質は全血、血清、血漿、尿、粘液又は組織を含み得る。好ましくは、サンプルは組織のサンプル、好ましくはがんの疑いがある組織のサンプル、例えば乳房組織、膵臓組織又は肝臓組織のサンプル、例えば生検サンプルである。

好ましくは、サンプルにおけるバイオマーカーのレベルの決定は、バイオマーカーの公開配列に対して少なくとも６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドの検出を含む。

タンパク質は、１つ又は複数のポリペプチドを含む生化学的化合物である。ポリペプチドは、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって結合したアミノ酸の単一の線状高分子鎖である。タンパク質は、体内及びそれに由来するサンプル中に複数の異なる形態で多数存在する。これらの形態は、翻訳前修飾及び翻訳後修飾の一方又は両方に起因し得る。サンプルにおけるタンパク質のレベルを検出又は決定する場合、タンパク質の異なる形態を区別する能力は、相違の性質及びタンパク質レベルを検出又は測定するために用いられる方法によって決まる。例えば、モノクローナル抗体を使用する免疫測定法によって、抗体の産生対象のエピトープを含有するタンパク質の全ての形態が検出され、異なる形態は識別されない。しかしながら、タンパク質上の異なるエピトープに対して指向性を有する２つの抗体を用いるサンドイッチ免疫測定法によって、両方のエピトープを含有するタンパク質の形態と一方のみのエピトープを含有するタンパク質の形態とが識別される。

本発明の方法では、バイオマーカータンパク質のレベルを決定するために用いられるアッセイ方法によって、好ましくは特定のバイオマーカータンパク質の全ての形態が検出される。好ましくは、バイオマーカータンパク質の少なくとも全ての生物学的に活性な形態が検出される。好ましくは、バイオマーカーの公開アミノ酸配列と少なくとも７５％以上、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％以上の配列同一性を有するバイオマーカータンパク質の全ての形態が本発明の方法において検出される。

ポリペプチド／タンパク質／核酸の同一性を測定する方法は、当該技術分野で既知である。例えばＵＷＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅは、同一性を計算するために使用する（例えば、そのデフォルト設定で使用する）ことができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えばAltschul S .F. (1993) J Mol Evol 36:290-300、Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載のように、ＰＩＬＥＵＰアルゴリズム及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを（通常そのデフォルト設定で）相同性又はラインアップ配列（line up sequences）を計算するために用いることもできる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）により公的に入手可能である。

サンプル中に存在するバイオマーカーのレベルは、酵素アッセイ、免疫測定法、分光測定、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、顕微鏡検査、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＣＲ、定量ＲＴ−ＰＣＲ、ゲル電気泳動、タンパク質マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ及び抗体マイクロアレイ、又はこれらの組合せを含む群のいずれかの使用を含み得る任意の好適なアッセイによって決定することができる。

抗体を使用する場合、１つ又は複数の抗体が合成抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であってもよい。キメラ抗体は異なる動物に由来する部分を含む。ヒト化抗体は、非ヒト種に由来する１つ又は複数の相補性決定領域とヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを有する、非ヒト種に由来する抗体である。キメラ抗体及びヒト化抗体は、当該技術分野で既知の組換え法によって作製することができる。

１つ又は複数の抗体は、放射性、蛍光性、化学発光性、色素、酵素若しくはヒスチジンのタグ若しくは標識、又は当該技術分野で既知の任意の他の好適な標識若しくはタグを含む群から選択されるタグ若しくは標識を含み得る。

好ましくは、決定されたバイオマーカーのレベルを比較する参照値は、１つ又は複数の正常サンプルにおいて観察される同じタンパク質のレベルである。正常サンプルは、好ましくは試験される潜在的な病理／罹患組織に対応する正常／非罹患位置から採取された組織のサンプルを指す。対応する正常／非罹患組織は、疑わしい病理／罹患組織と同じ又は異なる個体から採取することができる。組織が同じ個体から採取される場合、組織は例えば薬物治療、放射線治療又は外科治療等の医療の間に採取することができる。代替的には、正常サンプルは疑わしい病理／罹患組織とは異なる組織である正常／非罹患組織のサンプルであってもよく、この場合も組織は同じ又は異なる個体から採取することができる。例えば、乳がんの疑いがある患者については、サンプルを疑わしいがんから採取することができ、正常サンプルを同じ又は異なる個体に由来する非罹患乳房組織から採取することができる。

代替的には、参照値は特定の被験体について得られた以前の値であり得る。この種の参照値は、この方法ががんの進行をモニタリングするか、又は特定の治療に対する被験体の応答をモニタリングするために用いられる場合に使用することができる。

決定されたバイオマーカーのレベルを参照値と比較する場合、バイオマーカーのレベルの上昇又は低下は被験体のがん状態の指標となり得る。

より具体的には、バイオマーカーのレベルの上昇は、がんの指標となるか又は診断に役立つ場合がある。

代替的には、同じ個体において以前に測定されたレベルと比較したバイオマーカーのレベルの低下は、特定の療法が効果的であったか、又は効果的であることの指標となり得る。

本発明の方法は、がん進行をモニタリングする及び／又は被験体に対して適用される治療の効果をモニタリングするために用いることもできる。これは、初期診断後の様々な時点で被験体から採取されたサンプルを分析し、バイオマーカーのレベルの変化をモニタリングし、これらのレベルを正常値及び／又は参照値と比較することによって達成することができる。この場合、参照レベルは被験体におけるバイオマーカーの初期レベル、若しくは最後に試験した時点での被験体におけるバイオマーカーのレベル、又はその両方を含み得る。

好ましくは、本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。

被験体は哺乳動物とすることができ、好ましくはヒトであるが、代替的にサル、類人猿、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ウサギ又は齧歯類であってもよい。

更なる態様によると、本発明は、療法の適用後の患者における有益な応答の有無を検出する方法であって、
（ａ）患者に由来する生体サンプルを準備することと、
（ｂ）サンプルにおけるバイオマーカーの発現レベルを測定することと、
（ｃ）（ｂ）におけるレベルをバイオマーカーのレベルの対照値と比較することと、
（ｄ）サンプルと対照との間のレベルの相違が患者における有益な応答を反映しているか否かを決定することと、
を含み、バイオマーカーが本発明の第１、第２、第３又は第４の態様において特定されたものから選択される、方法を提供する。

本発明のこの態様では、患者は乳がん、膵臓がん、ＣＲＣ肝転移又は任意の他のがんの１つ又は複数を患っている場合がある。

本発明のこの方法は、特定の治療剤が特定の病態の治療に有効であるか否かを決定することを可能にし得る。

好ましくは、対照値は、特定の療法の適用の前又は適用期間中の患者における特定のバイオマーカーのレベルである。好ましくは、（ｂ）におけるレベルが対照値よりも低い場合、これは適用される療法が有効であることの指標となる。

本発明の全ての態様において、サンプルを準備する工程は、好ましくはサンプルを個体／患者／被験体から得る／採取する工程を含まない。

本発明の別の態様によると、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び／又は予防的治療用の薬剤の製造のための、本発明によるバイオマーカーに指向性を有するリガンド、好ましくは高親和性リガンドの使用が提供される。好ましくは、薬剤は特定のリガンド、好ましくは抗体又は抗体−薬物複合体の使用に基づく。

本発明との関連で、リガンドという用語は抗体、抗体フラグメント、薬物、プロドラッグ、リガンド、ビオチン、並びにそれらの誘導体及び複合体、好ましくは抗体又は抗体フラグメントと薬物又はプロドラッグとの複合体に関する。

好ましくは、リガンドはバイオマーカーの細胞外ドメインに指向性を有する。バイオマーカーの細胞外ドメインとは、がん細胞の外側に位置するバイオマーカーのドメインを意味する。

例えば、バイオマーカーの細胞外ドメインは、バイオマーカーの一部又は全体を表し得る。一部とは、バイオマーカーの全体の１％、２％、３％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％、又はその端数を意味する。

更なる態様によると、本発明は、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び／又は予防的治療において使用される、本発明によるバイオマーカーに指向性を有するリガンド、好ましくは高親和性リガンドを提供する。好ましくは、リガンドは抗体又は抗体−薬物複合体である。

本発明のまた更なる態様によると、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び／又は予防的治療の方法であって、本発明によるバイオマーカーに指向性を有する治療的又は予防的に効果的な量のリガンド、好ましくは高親和性リガンドを投与することを含む、方法が提供される。好ましくは、リガンドは抗体又は抗体−薬物複合体である。

本発明の別の態様によると、被験体のがん状態又は転移状態の決定において使用されるキットであって、被験体によって提供されるサンプルにおける本発明による１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを決定するための少なくとも１つの作用物質を含む、キットが提供される。

作用物質は酵素、核酸、タンパク質プローブ、代謝産物、抗体等のリガンド、又は任意の他の好適な組成物であり得る。

キットは、レベルを決定するバイオマーカーを捕捉するための１つ又は複数の捕捉剤を含んでいてもよい。捕捉剤は１つ又は複数の抗体であり得る。

キットは、ラベル又は折込みの形態の好適な操作パラメータに関する説明書を含んでいてもよい。説明書は、消費者にサンプルを収集する方法及び／又は捕捉剤を洗浄する方法についての情報を与えるものであり得る。

更なる態様によると、本発明は、個体におけるがん状態を評価する手段としての本発明による１つ又は複数のバイオマーカーのレベルの決定の使用を提供する。

別の態様によると、本発明は、被験体においてがんを治療する方法であって、被験体における本発明によるバイオマーカーのレベルを調節することが可能な作用物質を被験体に投与することを含む、方法を提供する。

作用物質は転写レベル、翻訳レベル及び／又は翻訳後レベルで作用し得る。

更なる態様によると、本発明は、がんを治療するための化合物を同定する方法であって、本発明による１つ又は複数のバイオマーカーのレベルを調節する１つ又は複数の化合物をスクリーニングすることを含む、方法を提供する。

本発明の別の態様によると、サンプル中の接近可能なタンパク質を分析するｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、
サンプルを準備することと、
サンプル中の接近可能なタンパク質を標識試薬で標識することと、
サンプルから標識試薬で標識されたタンパク質を単離し回収することと、
サンプル中の残りの非標識タンパク質を消化することと、
消化されたサンプルから糖ペプチドを単離し回収することと、
標識されたタンパク質又は糖ペプチドの単離の際に回収されなかった非グリコシル化ペプチドを回収することと、
回収されたタンパク質／ペプチドを分析することと、
を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法が提供される。

驚くべきことに、本発明の方法における工程の組合せは、工程のいずれかを単独で実行する場合と比較して、サンプルから接近可能なタンパク質が同定される可能性を顕著に増大させる。

本発明の方法は、病理／罹患組織サンプル、例えば組織生検材料から接近可能なバイオマーカーを同定する改善された方法を提供する。接近可能なバイオマーカー／タンパク質は、膜結合タンパク質又は細胞外空間／マトリックスに分泌されるタンパク質であり得る。

好ましくは、接近可能なタンパク質は、全身に送達される作用物質、例えば全身に送達される抗体によって到達することができる。好ましくは、これは接近可能なタンパク質が他のタンパク質よりも間質液に曝されているために達成される。

本発明の方法は好ましくは、接近可能なタンパク質のみを考慮に入れたまま、貴重なサンプル、例えば生検材料において同定されるバイオマーカーの数を最大にすることを可能にする。

接近可能なタンパク質を分析することにより、この方法によって疾患の診断、疾患の予後診断、疾患進行のモニタリング、治療の効果のモニタリングの１つ又は複数を含む多数の目的、及びバイオマーカーを発現する細胞又は組織に対する潜在的療法の標的化に使用することのできるバイオマーカーを同定することが可能となる。潜在的療法の例としては、特定のバイオマーカーを標的とすることができる抗体、抗体フラグメント、薬物、プロドラッグ又は他のリガンドが挙げられる。

好ましくは、本発明の方法は、組織サンプル又は細胞サンプル中の細胞外空間から接近可能な、特定の疾患に対するバイオマーカーをスクリーニング／同定するために用いることができる。

本発明の方法は、好ましくは使用する材料の量を最小にすることを可能にし、希少な生検組織の定量分析に好適である。この方法は、貴重なサンプルから同定される有益なバイオマーカーの数を、これらのタンパク質の品質を維持しながら最大にすることを可能にし、それにより潜在的に接近可能な、したがって関連性のあるバイオマーカーを同定することを可能とし得る。

標識試薬は、特徴的な官能基によってタンパク質を標識することが可能な任意の試薬であり得る。これにより標識試薬は標識されたタンパク質の濃縮を可能にする。好適な標識試薬の例は、サンプル中のタンパク質／ペプチドの第一級アミンを標識するために使用することのできる反応性ビオチン、好ましくはビオチン反応性エステル誘導体である。本発明の方法では、サンプルは好ましくは細胞が実質的に無傷であり、実質的に無傷な膜を有する組織サンプルであるため、標識試薬を添加しても試薬が細胞に浸透することができず、したがって実質的に細胞外タンパク質又は膜結合タンパク質のみが標識される。

ビオチンを標識試薬として使用する場合、アビジンに対するビオチンの高い親和性をビオチン標識タンパク質を単離し回収するために利用することができる。接近可能なタンパク質を標識するための他の好適な試薬としては、タンパク質又はペプチドの糖部分に結合する試薬、及び糖部分又は第一級アミンと反応する官能基が結合した磁性ビーズが挙げられる。

本発明の方法は、グリコシル化ペプチドを回収することによって接近可能なタンパク質を濃縮することを更に含む。グリコシル化ペプチドは膜結合性又は分泌性であることが多く、したがって接近可能である。

グリコシル化とは、本明細書中では糖類基が結合したタンパク質又はペプチドに言及するために使用される。糖タンパク質／糖ペプチドという用語は、本明細書中ではグリコシル化タンパク質／グリコシル化ペプチドと区別なく使用され、同じ意味を有することが意図される。

サンプルは細胞サンプル又は組織サンプルであり得る。好ましくは、サンプルは組織サンプルである。組織サンプルは病理組織サンプルであり得る、すなわち罹患組織に由来し得る。代替的には、組織サンプルは正常な非罹患組織のサンプルであり得る。組織サンプルが病理組織サンプルである場合、組織は腫瘍組織、炎症組織、アテローム（atheromatatic）組織、及び変性疾患、代謝性疾患又は遺伝性疾患によって生じる組織から選択することができる。好ましくは、サンプルは組織生検材料である。

本明細書中の正常／非罹患組織への言及は、同じ個体又は異なる個体に由来する病理／罹患組織に対応する正常／非罹患組織を指す。この正常及び病理の２つの組織サンプルは、同じ若しくは異なる個体の同じ位置から採取されても（例えばどちらも肝臓である、若しくはどちらも乳房である）、又は異なる位置から採取されてもよい。例えば、病理組織が乳房組織であり、正常組織が同じ個体に由来する非罹患乳房組織のサンプル、又は異なる個体に由来する非罹患乳房組織のサンプル、又は同じ若しくは異なる個体に由来する異なる組織のサンプルであり得る。好ましくは、正常／非罹患組織は病理／罹患組織と同じタイプの組織のサンプルである。

「バイオマーカー」という用語は、本明細書中では本発明の方法に関連して、病理組織におけるその発現レベルが病理組織を正常組織から識別することを可能にする任意のタンパク質又はペプチド（修飾、例えばグリコシル化されていてもよい）に言及するために使用される。

好ましくは、サンプル中のタンパク質は、標識試薬を含む溶液にサンプルを浸漬することによって標識試薬で標識される。好ましくは、浸漬によって接近可能なタンパク質が標識試薬で標識される。ビオチン誘導体等の標識試薬は、タンパク質中の接近可能な第一級アミンと共有結合することが可能であることが好ましい。これにより接近可能な第一級アミンを有するタンパク質のみが標識される。好ましくは、接近可能なタンパク質を標識するために、サンプルを反応性ビオチンエステル誘導体の溶液に浸漬する。

標識試薬を含有する溶液に浸漬されるサンプルは、好ましくは接近可能なタンパク質のみが標識され、接近可能でないタンパク質が標識されていないか又は基本的に標識されていない天然サンプルである。

天然サンプルとは、標識試薬を含有する溶液への浸漬前にサンプルが変性又は固定されていないことを意味する。好ましくは、標識試薬を含有する溶液へのサンプルの浸漬の際に、接近可能なタンパク質の多くが標識試薬で標識される。しかしながら、全てのタンパク質を標識することが可能ではないため、更なるタンパク質／ペプチド回収工程を本発明の方法に追加し、同定されるバイオマーカーを最大限にする。

標識工程の後、サンプルを好ましくは可溶化工程に供するが、ここでは可溶性画分のみを保管しておき、方法の残りの部分で使用する。好ましくは、不溶性画分は捨てられる。

タンパク質をビオチン又はビオチン誘導体で標識した場合、標識されたタンパク質はストレプトアビジン、好ましくはストレプトアビジンビーズを用いて回収することができる。ビオチン化タンパク質／ペプチドは、ビオチンとストレプトアビジンとの間の極めて特異的な相互作用のために容易に精製される。強力な洗剤を含有する溶解バッファーの存在下であっても、この相互作用は強力であるため、精製時の非特異的結合が最小限に抑えられる。ビオチン化タンパク質はＤＴＴを用いてストレプトアビジンビーズから溶出させることができる。次いで、溶出したタンパク質を例えばトリプシンで消化して、質量分析による分析のためのペプチドフラグメントを得ることができる。

好ましくは、非標識タンパク質を任意のプロテイナーゼ（トリプシン等）を用いて消化し、より短いペプチドを生成した後にグリコシル化ペプチドを回収する。

残りのタンパク質／ペプチド中の糖タンパク質／糖ペプチド、好ましくは糖ペプチドは、初めにタンパク質／ペプチドの糖部分を酸化することによって単離することができる。糖部分は過ヨウ素酸塩溶液を用いて酸化することができ、次いで酸化された糖部分を有する任意のタンパク質／ペプチドを、例えばヒドラジド樹脂を用いて単離する。結合したタンパク質／ペプチドは、ＰＮＧアーゼＦを用いてヒドラジドから放出させることができる。糖タンパク質／糖ペプチドを単離する他の方法が既知であり、本発明の方法に使用することができる。

次いで、残りの非標識及び非グリコシル化タンパク質／ペプチド、好ましくはペプチドを回収し、同様に例えば質量分析によって分析する。

好ましくは、残りの非標識及び非グリコシル化ペプチドは、グリコシル化タンパク質／ペプチドを回収するために用いられる方法のフロースルー画分で回収される。

好ましくは、回収されたタンパク質／ペプチドを分析して、それらの配列、したがってそれらが由来するタンパク質の同一性を決定する。回収されたタンパク質／ペプチドは質量分析によって分析することができる。好ましくは、質量分析によってタンパク質／ペプチドに関する配列情報が得られ、これを次いでタンパク質／ペプチド配列データベースと比較して、タンパク質／ペプチドを同定することができる。

好ましくは、質量分析を用いる場合、質量分析はタンデム質量分析によるシークエンシングを含む。

好ましくは、回収された非グリコシル化ペプチドの分析によって、グリコシル化ペプチドのみの分析では確信を持って特定のタンパク質に割り当てることができないグリコシル化ペプチド（本発明の方法の先の工程で回収される）の同定が可能となる。より具体的には、グリコシル化タンパク質中に見られる非グリコシル化ペプチドの同定によって、単離されたグリコシル化ペプチドを、より確信を持って特定のグリコシル化タンパク質に割り当てることが可能となり得る。

非グリコシル化ペプチドの分析は、接近可能な非グリコシル化タンパク質を同定することも可能にし得る。

好ましくは、グリコシル化ペプチド及び非グリコシル化ペプチドを全て質量分析によって分析する。

本発明の方法は、病理組織サンプルから回収されたタンパク質／ペプチドを正常組織サンプルから回収されたタンパク質／ペプチドと比較する更なる工程を含み得る。

好ましくは、病理組織サンプルから回収されたタンパク質／ペプチドの差次的発現を正常サンプルと比較することによって、病理組織サンプルの疾患に対する潜在的バイオマーカーを同定することができる。

好ましくは、正常組織サンプルと比較して、病理組織サンプルにおいてより高い発現を有する回収されたタンパク質／ペプチドを同定することによって、特定の疾患に対する１つ又は複数のバイオマーカーを同定することができる。同定されたバイオマーカーは、本発明の方法の性質のために、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで細胞外空間から接近可能である。

本発明の方法は、任意の組織及び任意の病態／疾患に適用することができ、接近可能なタンパク質を考慮に入れるため、バイオマーカーを同定するだけでなく、極めて接近可能な標的を標的とするカスタム療法(custom therapies)を開発することができる。例えば、抗体に基づいた治療によってバイオマーカーを標的とすることができる。

本発明の好ましい実施の形態では、標識工程及び回収工程は病理組織サンプル及び正常組織サンプルを用いて行われ、回収されたタンパク質／ペプチドの差次的発現を比較する。より好ましくは、この方法は、
正常組織のサンプル及び病理組織のサンプルを準備する工程と、
各々のサンプル中の接近可能なタンパク質を標識試薬で別個に標識する工程と、
標識されたタンパク質を各々のサンプルから単離し回収する工程と、
各々のサンプル中の残りの非標識タンパク質を消化する工程と、
各々の消化されたサンプルから糖ペプチドを単離し回収する工程と、
標識されたタンパク質又は糖ペプチドの単離の際に回収されなかった非グリコシル化ペプチドを各々のサンプルから回収する工程と、
回収された全てのタンパク質及びペプチドを分析する工程と、
正常サンプルと比較した、病理サンプルにおける回収されたタンパク質／ペプチドの差次的発現パターンを決定する工程と、
正常組織サンプルと比較して、病理組織サンプルにおいてより高い発現を有するか、又は正常組織サンプルと比較して、病理組織サンプルにおいてより頻繁に発現されるタンパク質／ペプチドを同定する工程と、
を含む。これらのタンパク質／ペプチドは病理組織に対するバイオマーカーとして使用することができ、好ましくは高親和性リガンドが細胞外空間から接近可能である。

好ましくは、バイオマーカーは病理組織において発現され、正常組織においては発現されない。

精製した標識タンパク質を精製後により小さいペプチドへと切断した後、更なる分析を行ってもよい。切断は好ましくはタンパク分解によるものであり、トリプシンを用いて達成することができる。

更なる態様によると、本発明は本発明の方法によって同定されるバイオマーカーを提供する。

本発明の別の態様によると、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び／又は予防的治療用の薬剤の製造のための、本発明の方法によって同定されるバイオマーカーに指向性を有するリガンド、好ましくは高親和性リガンドの使用が提供される。好ましくは、薬剤は特定のリガンド、好ましくは抗体又は抗体−薬物複合体の使用に基づく。

更なる態様によると、本発明は、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び／又は予防的治療において使用される、本発明の方法によって同定されるバイオマーカーに指向性を有するリガンド、好ましくは高親和性リガンドを提供する。好ましくは、薬剤は特定のリガンド、好ましくは抗体又は抗体−薬物複合体の使用に基づく。

本発明のまた更なる態様によると、ヒト又は動物の疾患の治療的治療及び／又は予防的治療の方法であって、本発明の方法によって同定されるバイオマーカーに指向性を有する治療的又は予防的に効果的な量のリガンド、好ましくは高親和性リガンドを投与することを含む、方法が提供される。好ましくは、リガンドは抗体又は抗体−薬物複合体である。

本発明の１つの態様又は実施形態に適用可能な任意の特徴は、任意の組合せ及び任意の数で用いることができる。さらに、これらの特徴は、本発明の他の態様又は実施形態のいずれかとともに任意の組合せ及び任意の数で用いることもできる。これには、本願の特許請求の範囲において、任意の請求項の従属請求項を任意の他の請求項の従属請求項として用いることが含まれるが、これに限定されない。

ここで、本発明の実施形態を、ほんの一例として添付の図面を参照して本明細書中で説明する。

組織サンプルからの接近可能なタンパク質の逐次的抽出を示す概略図である。第１の工程は、接近可能なタンパク質のビオチン化及びそれらの単離からなる（Ｂ画分）。第２の工程は、非ビオチン化タンパク質のペプチドへのタンパク質消化、続く糖ペプチドの単離を利用する（Ｇ画分）。また、最後の工程は非グリコシル化ペプチドを収集し（Ｒ）、それらを用いて割り当てられていない糖ペプチドの配列情報を補足する（図２に詳述する）。さらに、Ｒ画分は、Ｂ画分及びＧ画分において既に同定されたタンパク質を補完する相当数の接近可能なタンパク質を含有する。３つの内部標準（ＩＳ１、ＩＳ２及びＩＳ３）を、回収率、再現性及び定量化の精度をモニタリングするために、方法の種々の操作段階で添加した。それぞれの内部標準の組成は後で概説する。全ての画分を、それぞれｐＨ１０及びｐＨ３で送液される２つのＣ１８相から基本的になる２Ｄ−ｎａｎｏＵＰＬＣ−ＭＳ^ｅシステムを用いて分析した。 図１に記載の技法の定量化精度、回収率及び再現性を示す図である。図２Ａは、逐次的方法（図１を参照されたい）を用いた調製プロセスの間にサンプルにスパイクされた内部標準の絶対的定量評価を示す。タンパク質量は、ＰＬＧＳソフトウェアを用いて、以前に計算された応答係数に基づいて計算した。エラーバーは、３回の完全プロセスの技術的反復試験に基づく平均値の標準偏差を示す。図２Ｂは、糖ペプチド分析単独の間にサンプルにスパイクされた内部標準の絶対的定量化を示す。比較のために、独立型技法として糖ペプチドの単離も行った。定量化及びエラーバーは図２Ａと同じである。 図３Ａおよび３Ｂは、個々の成分単独（ビオチン、糖ペプチド及び残り）及び同定された接近可能なタンパク質の絶対数（接近可能なタンパク質：細胞外、分泌及び／又は膜）に関する、図１Ａの組合せ法の実効値の分析を示す図である。図３Ａは、組合せ法の各々の工程において同定された接近可能なタンパク質の数及び全ての成分の総計を示す。３回の完全プロセスの技術的反復試験を示す。特に、Ｇは捕捉された糖タンパク質画分によるデータのみを用いて得られたタンパク質の平均数を示す。しかしながら、コンピューターによる方法を用いると、糖タンパク質の全体数は増加した。これによりＧＲと記したデータが得られた。重要なことには、Ｒ（残りの）画分を特徴付けるタンパク質の特異的ダイナミックレンジによって、付加的な接近可能なタンパク質の顕著な同定が可能となった。 図３Ｂは、独立型技法として糖ペプチド単離手順について行った以外は図３Ａと同じである。 図１の組合せ法及び糖ペプチド分析単独の種々の画分における接近可能なタンパク質の同定重複の比較を示す図である。ベン図は３回の完全プロセスの反復試験を示す。組合せ法に関して、図４は別個の画分の全てにおいて相当な重複があることを示す。しかしながら、各々の画分は相当数の特有のタンパク質も含有する。技術的プロセスのために、組合せ法の個々の工程には顕著な付加価値があること、及びそれが再現可能であり、測定される分析の変動性を超えていることが反復試験から実証される。図の下部に組合せ法（ＢＧＲ）と糖タンパク質分析単独（ＧＲ＆Ｒ）との比較を示す。図には接近可能なタンパク質のみを示す。正確な比較のために、残りの画分中に見られる接近可能なタンパク質が常に加えられる。独立型技法としての糖タンパク質分析によって、平均して１８％の特有のタンパク質が同定されることは注目に値する。これに対し、組合せ法で同定されたタンパク質の５０％超が特有である。 タンパク質ラミニンα５及びタンパク質ミオフェリンが乳がん組織において過剰発現される免疫組織化学的検証を示す図である。図５は２５人の腫瘍個体及び１１人〜１３人の正常個体からの代表的な症例を示す。ラミニンα５及びミオフェリンの両方が、正常組織と比較して腫瘍組織において強力な陽性染色を示す（原倍率×４００）。グラフ中の値はスコアとして報告する（ＮＢ＝正常乳房、ＤＣ＝導管癌）。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。０．０５以下のＰ値を有意であるとみなした。 図６Ａは３つの非腫瘍隣接試料及び３つの腫瘍試料の分析によって得られる潜在的乳房腫瘍バイオマーカーのリストを示す図である。潜在的バイオマーカーの選択は、タンパク質の腫瘍組織サンプルにおける存在及び非腫瘍組織サンプルにおける非存在又は存在減少に関して行った。腫瘍組織及び隣接正常組織の両方で存在を示した或る特定のタンパク質について、これらが腫瘍組織において顕著に過剰発現される場合（２．０を超える比率）に半定量的データ（ｅｍＰＡＩ比）を含める。全てのタンパク質は細胞膜の外側に位置するため（分泌、細胞外又は膜）、潜在的に接近可能である。以下の略語を使用した：細胞内位置：Ｓ：分泌、Ｅ：細胞外、Ｍ：膜、Ｃ：細胞膜、ＰｌＭ：原形質膜、ＳＰ：１回貫通型膜タンパク質、ＭＰ：複数回貫通型膜タンパク質、ＬＡ：脂質アンカー、ＭＭ：ミトコンドリアマトリックス、ＰＭ：表在性膜タンパク質、Ｃｙ：細胞質、ＮＭ：核膜、Ｕ：未知の細胞成分。生物学的プロセス：Ｃ：細胞間連絡、ＳＴ：シグナル伝達、Ｉ：免疫応答、Ｍ：代謝、Ｅ：エネルギー経路、Ｔ：輸送、Ａ：アポトーシス、ＣＧ：細胞の成長及び／又は維持、Ｕ：未知の生物学的プロセス。画分：Ｇ−糖ペプチド、Ｂ−ビオチン化ペプチド、Ｎ−非糖ペプチド。 図６Ｂ〜図６Ｄは、５個の非腫瘍隣接試料及び５個の個体にマッチングした腫瘍試料の分析により得られる潜在的に接近可能な調節タンパク質のリストを示す図である。図６Ｂはビオチン画分において単離されたタンパク質を表し、図６Ｃは残りの画分において単離されたタンパク質を表し、図６Ｄはグリコ画分において単離されたタンパク質を表す。タンパク質は、それらの腫瘍組織サンプルにおける存在及びそれらの非腫瘍組織サンプルにおける非存在又は存在減少に関して選択した。腫瘍組織及び隣接正常組織の両方に存在する或る特定のタンパク質について、これらが腫瘍において顕著に過剰発現される場合（１．５以上の比率）に定量的データ（相対発現比）を含める。全てのタンパク質は細胞膜の外側に位置するため（分泌、細胞外又は膜）、接近可能である。以下の略語を使用した：細胞内位置：Ｓ：分泌、Ｅ：細胞外、Ｍ：膜、Ｃｙ：細胞質、ＣＪ：細胞間結合、ＣＰ：細胞突起、ＣＳｕ：細胞表面、Ｎ：核、Ｇ：ゴルジ、ＥＲ：小胞体、Ｍｅｌ：メラノソーム、ＳＲ：筋小胞体、Ｌ：リソソーム。 図６Ｂ−１説明参照 図６Ｂ−１説明参照 図６Ｂ−１説明参照 図６Ｂ−１説明参照 図６Ｂ−１説明参照 正常組織（ｎ＝３）と比較して、膵臓腫瘍（ｎ＝３）において過剰発現されるとして同定された接近可能な差次的に発現されるタンパク質を示す図である。ｉ）腫瘍条件のみで検出された場合、（ｉｉ）両方の条件で見られたが、正常サンプルよりも腫瘍サンプル中で頻繁に同定された場合、（ｉｉｉ）２を超えるｅｍＰＡＩ腫瘍／正常の倍数変化率で見られた場合にタンパク質は過剰発現されるとみなす。以下のタンパク質が複数のアイソフォーム／サブユニットとして同定された：^１カルパイン１触媒サブユニット(Calpain-1 catalytic subunit) 及びカルパイン２触媒サブユニット；^２グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｉ）サブユニットα２(Guanine nucleotide-binding protein G (i) subunit alpha)、（ｏｌｆ）サブユニットα、（ｋ）サブユニットα、（ｏ）サブユニットα、（ｑ）サブユニットα、（ｔ）サブユニットα１及び（ｔ）サブユニットα２；^３コラーゲンα２（ＩＶ）鎖及びコラーゲンα１（ＸＩＶ）鎖；^４フィビュリン１(Fibulin-1)及びフィビュリン２；^５ガレクチン３(Galectin-3)及びガレクチン４；^６ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原ＤＱα２鎖(HLA class II histocompatibility antigen DQ alpha 2 chain)及びＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原ＤＲα鎖；^７トロンボスポンジン２(Thrombospondin-2)及びトロンボスポンジン１；^８ラミニンサブユニットβ２及びラミニンサブユニットα１；^９テネイシン及びアイソフォームＸ。潜在的細胞内位置：Ｃ＝細胞膜。ＣＳ＝細胞表面。Ｅ＝細胞外。Ｎ＝核。Ｃｙ＝細胞質。Ｓ＝分泌。ＥＲ＝小胞体。Ｇ＝ゴルジ；生物学的プロセス：Ｕ＝未知。Ｒ＝核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸の代謝の制御。Ｃｃ、Ｓｔ＝細胞間連絡、シグナル伝達。ＧＭ＝細胞の成長及び／又は維持。Ｐ＝細胞増殖。Ｉ＝免疫応答。Ｍ、Ｅｐ＝代謝、エネルギー経路。Ｐｍ＝タンパク質代謝。Ｔ＝輸送。 図７−１の説明参照。 図７−１の説明参照。 図７−１の説明参照。 図７−１の説明参照。 膵臓非がん組織（正常膵臓及び膵炎）及び腺癌において同定された調節タンパク質の免疫組織化学的評価（ボックスプロット）を示す図である。（Ａ）ＴＧＦＢＩ：膵炎と比較して、腫瘍における陽性率は有意であった（Ｐ≦０．０００１）；正常組織及び膵炎組織におけるＴＧＦＢＩの発現レベルは有意には異ならなかった。（Ｂ）ＬＴＢＰ２：統計的検定により、腺癌組織と正常／膵炎組織との有意差が示された（Ｐ≦０．０００１）；正常組織におけるＬＴＢＰ２発現レベルは膵炎と比較して有意には異ならなかった。（Ｃ）ＭＹＯＦ：統計的検定により、腺癌組織と炎症膵臓組織及び正常膵臓組織の両方との有意差が示された（Ｐ≦０．００２）；正常組織及び膵炎組織におけるＭＹＯＦの発現レベルは有意には異ならなかった。（Ｄ）ＡＳＰＮについては、膵炎組織に対して有意な陽性率が腫瘍において観察された（Ｐ≦０．０００１）；膵炎は正常膵臓と比較して少ししか陽性でなかったが、その差は統計的に有意であった（Ｐ≦０．０５）。統計評価をウイルコクソンの順位和検定を用いて行った。 ＡＳＰＮ標的、ＴＧＦＢＩ標的及びＬＴＢＰ２標的に対する抗体を用いて正常組織ＴＭＡに対して行った免疫組織化学検査を示す図である。ここでは、スコアリングされた最も重要な組織の例を示す。脳、腸、子宮内膜及び前立腺の組織が、調査した全ての抗原について陰性であるとスコアリングされた。ＴＧＦＢＩ発現が肝臓において観察されたが、強度は弱かった。腎臓皮質及び食道は弱いＡＳＰＮの発現を生じた（スコア２〜４）。ＴＧＦＢｉ発現が副腎皮質及び前立腺管において見られた（スコア４〜６）。弱いＬＴＢＰ２の発現が副腎髄質及び舌上皮において観察された（スコア２）。 ウエスタンブロット分析を用いた膵臓腺癌におけるＡＳＰＮタンパク質、ＬＧＡＬ３タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＹＯＦタンパク質、ＰＯＳＴＮタンパク質、ＴＮＸＢ（ＴＮＣ）タンパク質及びＴＧＦＢＩタンパク質の検証を示す図である。各々のレーンは１人の個々の患者を示し、ＰＮは正常膵臓組織を指し、ＰＩは炎症組織を指し、ＰＴは腫瘍膵臓を指す。正規化の目的で、転写後にＷＢ膜のポンソーレッド染色を行った（結果は図示しない）。 ＦＮ１、ＰＲＥＬＰ、ＴＧＭ２及びＡＧＲＮによって調節されたタンパク質のＭＲＭに基づく検証を示す図である。相対的定量化は対応する標準偏差とともに平均値として計算する。 ｓｉＲＮＡによる（Ａ）ＴＧＦＢＩタンパク質及び（Ｂ）ＭＹＯＦタンパク質の除去後のＢＸＰＣ３膵臓癌細胞の遊走能（走化性／走触性）の評価を示す図である。エラーバーは、３回の独立した反復試験により計算された平均値の標準偏差を示す。有意性は両側スチューデントｔ検定を用いて評価した（ここで、^＊＊＊はｐ値＜０．０１を示す）。 正常組織（ｎ＝３）と比較して、肝臓腫瘍（転移）組織（ｎ＝３）において同定された接近可能な差次的に発現されるタンパク質を示す図である。 図１３-１の説明参照 図１３-１の説明参照 図１３-１の説明参照 結腸直腸癌肝転移において同定された調節タンパク質の免疫組織化学的評価（ボックスプロット）を示す図である。（Ａ）ＡＥＢＰ１：正常肝細胞と比較して、腫瘍間質における陽性率は有意であり（Ｐ≦０．０１）、腫瘍細胞は陰性であった。（Ｂ）ＥＭＩＬＩＮ１：統計的検定により、腫瘍間質と正常肝臓組織との有意差が示され（Ｐ≦０．０１）、腫瘍細胞は陰性であった。（Ｃ）ＬＴＢＰ２：統計的検定により、肝細胞と腫瘍間質との有意差が示された（Ｐ≦０．００１）。（Ｄ）ＰＯＳＴＮ：統計的検定により、腫瘍間質と正常肝臓組織との有意差が示され（Ｐ≦０．０１）、低い陽性率が腫瘍細胞において検出可能であったが、正常肝細胞と比較して統計的に異ならなかった。（Ｅ）ＴＧＦＢＩ：肝細胞と比較して、腫瘍間質及び腫瘍細胞における陽性率は有意であった（Ｐ≦０．００１）。統計評価をウイルコクソンの順位和検定を用いて行った。 ウエスタンブロット分析を用いた正常肝臓組織及び結腸直腸癌肝転移組織における（Ａ）ＡＥＢＰ１タンパク質、（Ｂ）ＥＭＩＬＩＮタンパク質、（Ｃ）ＬＴＢＰ２タンパク質、（Ｄ）ＰＯＳＴＮタンパク質、（Ｅ）ＴＧＦＢＩタンパク質及び（Ｆ）ＭＹＯＦタンパク質の発現の検証を示す図である。（Ａ〜Ｆ）７人の個々の患者に対して行ったウエスタンブロットの濃度測定分析を示す。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。転写後にＨＳＣ７０タンパク質を正規化目的で使用した。肝転移病変において以下の幾つかの領域を評価した：転移組織の周囲の健常肝臓組織（腫瘍周辺）、転移組織の辺縁（辺縁）及び病変の中央（中心）。全てのサンプルを、病変部位から遠くに見られる正常肝臓組織（正常）に対して比較した。 ｓｉＲＮＡによるＭＹＯＦタンパク質の除去後の結腸直腸癌ＳＷ１２２２細胞の遊走能（走化性／走触性）の評価を示す図である。エラーバーは、３回の独立した反復試験により計算された平均値の標準偏差を示す。有意性は両側スチューデントｔ検定を用いて評価した（ここで、^＊＊＊はｐ値＜０．０１を示す）。 ポリクローナルＭＹＯＦ抗体（抗ＭＹＯＦ）とのプレインキュベーション後の結腸直腸癌ＳＷ１２２２細胞の遊走能（走化性／走触性）の評価を示す図である。エラーバーは、３回の独立した反復試験により計算された平均値の標準偏差を示す。有意性は両側スチューデントｔ検定を用いて評価した（ここで、^＊＊はｐ値＝０．０５を示す）。 本発明の方法を用いた様々な異なる腫瘍組織の分析によって得られる接近可能なタンパク質の詳細を示し、タンパク質バイオマーカーの同定をもたらす発見されたペプチド配列の詳細を示す図である。 図１８−１の説明参照。 図１８−１の説明参照。 図１８−１の説明参照。 図１８−１の説明参照。 図１８−１の説明参照。 図１８−１の説明参照。 図１８−１の説明参照。

乳がんに対するバイオマーカー
以下の研究は、本発明、すなわち本発明の方法及び新規の乳がんバイオマーカーの両方を説明するものである。この研究では、接近可能なタンパク質バイオマーカーを乳がん生検サンプルから単離し、乳がんに対するバイオマーカーとしてのそれらの使用を実証した。

本研究に参加する全ての個体（個人）に研究の目的に関して詳細な情報を与え、書面による同意を得た。この計画の目的及び実施した実験は、リエージュ大学（Belgium）の規定及び倫理指針に従うものであった。この研究は以下の２つのパートに分けられる：ｉ）技術的パート（方法の価値、再現性及び精度の実証）及びｉｉ）生物学的パート（新規のバイオマーカーの発見及び検証のための概念研究の証明）。技術的パートには、ＭＳ分析に関わる全組織サンプル（全ての個体、腫瘍試料及び正常試料の両方）の等量のプールとして調製した１つの「マスターサンプル」を用いた。生物学的パート、具体的には調節タンパク質の発見は、技術的パートで単離したタンパク質を用いて行った。最後に、選択した差次的に発現されるタンパク質の検証を、別個の乳がん患者群（２５人の腫瘍個体及び１３人の正常個体）に対して行った。免疫組織化学検証研究に参加する全ての患者は、乳管腺癌と診断され、臨床グレードが少なくとも２であり、外科手術の時点では転移を示していなかった。

この研究に関わる反復試験の回数及び形式に関して、ｉ）技術的パートにおいて行った全ての分析が、別々の日に行われ、「マスターサンプル」を使用するそれぞれ３回の完全な技術的反復試験（組織の可溶化からＭＳ分析まで）を含んでいたこと、ｉｉ）生物学的パートにおいて行った調査、具体的にはＭＳを用いた発見段階が、５人の個体に由来するマッチングした腫瘍サンプル及び正常サンプルの単一の反復試験であることに留意されたい。

組織サンプル調製
リエージュ大学病院（Belgium）の病理部から入手した新鮮なヒト乳がん生検材料片を即座にスライスし、新たに調製したＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ−ＳＳビオチン（１ｍｇ／ｍｌ、Pierce（Rockford，IL，USA））溶液に浸漬した。次いで、組織サンプルを液体窒素中で急速凍結し（snap-frozen）、Ｍｉｋｒｏ−Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ Ｕ（Braun Biotech（Melsungen，Germany））を用いて粉砕した。およそ１００ｍｇの組織粉末を、プロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）カクテル（Ｈａｌｔ（商標）、Pierce（Rockford，IL，USA））、０．５ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）、及びレベル１の内部標準ミックス（ウシα２−ＨＳ糖タンパク質、ウシカゼイン、及びビオチン化ニワトリ卵白アルブミン（卵白アルブミンとＥＺ−ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ ＮＨＳ−ＳＳビオチン試薬とのインキュベーションによって行われる）からなるＩＳ１；スパイク／サンプル比 １／２００）を含有するＰＢＳバッファー（５０ｍＭ ＰＢＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７）に溶解した。次いで、２ｍｍマイクロプローブを用いてホモジネートを超音波処理し（２×３０秒）、４℃で１０分間２００００×ｇで遠心分離した。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）及び免疫グロブリン（ＩｇＧ）を、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ ＨＳＡ ａｎｄ ＩｇＧｓ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（Qiagen（Valencia，CA，SA））を用いて取り除いた。残りのペレットをＲＩＰＡバッファー（ＰＢＳ中の１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０（ＮＰ４０）、０．５％デオキシコール酸（ＤＯＣ）、０．１％ＳＤＳ、０．５ｍＭ ＧＳＳＧ及びＰＩカクテル、ｐＨ＝７．０）に懸濁し、超音波処理し（２×３０秒）、（４℃で）１０分間２００００×ｇで遠心分離した。サンプルを上記のようなＨＳＡ及びＩｇＧの除去に供した。２％ＳＤＳ溶液を残りの不溶性ペレットに添加した後、最後の再可溶化を行った。次いで、サンプルを（上述のように）遠心分離し、上清を収集した。最後に、３回の可溶化工程による全ての溶解物をプールし、５分間煮沸した。

ビオチン化タンパク質の単離
総タンパク質抽出物を、１００μＬ／ｍｇのストレプトアビジン（ＳＡ）樹脂（Pierce（Rockford，IL，USA））と回転条件下、室温で１２０分間混合した。ストレプトアビジンとのインキュベーションの後、その後のグリコプロテオミクス（glycoproteomic）分析のために上清を保管しておいた（画分１）。ストレプトアビジンビーズを０．５ｍＬのバッファーＡ（ＰＢＳバッファー中の１％ＮＰ４０、０．１％ＳＤＳ及び０．５ｍＭ ＧＳＳＧ）で４回、０．５ｍＬのバッファーＢ（ＰＢＳバッファー中の０．１％ＮＰ４０、１．５Ｍ ＮａＣｌ及び０．５ｍＭ ＧＳＳＧ）で４回、０．５ｍＬのバッファーＣ（ＰＢＳバッファー中の０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３及び０．５ｍＭ ＧＳＳＧ、ｐＨ＝１１．０）で２回、最後にＧＳＳＧを含まない０．５ｍＬのＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７）で２回洗浄した。ビオチン化タンパク質を、０．４ｍＬの１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で２回溶出させ、６０℃で３０分間インキュベートした（画分２）。画分１も１００ｍＭ ＤＴＴ中で還元した。両方の画分を、１５０ｍＭヨードアセトアミドを用いて暗所で（in the absence of light）３０分間アルキル化した。この段階で、レベル２の内部標準（ウシβラクトグロブリン（１／２００）からなるＩＳ２）を両方の画分に添加した。次いで、タンパク質を２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて４℃で一晩沈殿させた。タンパク質ペレット（画分１及び画分２）を５０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３に可溶化し、トリプシン（Promega（Madison，WI，USA））（１：５０のプロテアーゼ／タンパク質比）を用いて３７℃で一晩消化した。ビオチン化ペプチド（画分１）をＭＳを用いて更に処理した。画分２を下記のような糖ペプチドの単離に使用した。

糖ペプチドの単離
消化されたタンパク質サンプルを３０μＬの１％ＨＣｌで酸性化し、Ｃ１８ Ｓｅｐ−ｐａｋカラム（Waters（Milford，Massachusetts））に移し、３×１ｍＬの０．１％ギ酸溶液で洗浄した。ペプチドをアセトニトリル（８０％）を用いて溶出させ、蒸発乾固させた。ペプチド含有サンプルを酸化バッファー（ｐＨ＝５．５の１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解し、１０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム（Pierce（Rockford，IL，USA））とともに暗所で１時間インキュベートした。その後、１０μＬの１２０ｍＭ亜硫酸ナトリウムを添加し、インキュベーションを更に１０分間延長した。サンプルをヒドラジド樹脂（Bio-Rad（Hercules，CA，USA））にロードし、糖ペプチドを室温で一晩結合させた。糖ペプチドを含まないフロースルーをその後のＭＳ分析のために収集した（非グリコシル化タンパク質、ＮＧＰ又はＲ）。十分な洗浄（Ｈ_２Ｏ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、メタノール、８０％ＡＣＮ及び５０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３で各々２回）の後、ヒドラジド樹脂に５０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３溶液をロードし、５００単位のＰＮＧアーゼＦ（New England Biolabs（Ipswich，MA，USA））とともに３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション期間の後、糖ペプチドを含有するフロースルー（Ｇ）を収集し、乾燥させた。

ＭＳ分析
ビオチン化画分、グリコシル化画分、更には非糖ペプチド画分に由来するペプチドを質量分析の前にＣ１８ ＺｉｐＴｉｐピペットチップ（Millipore（Billerica，MA，USA））を用いて脱塩した。その後、５μｇのペプチド含有サンプルを１８μＬの１００ｍＭギ酸アンモニウムバッファーに溶解した。溶解したサンプルに、レベル３の内部標準ミックス（酵母アルコール脱水素酵素、ウサギグリコーゲンホスホリラーゼｂ、ウシ血清アルブミン及び酵母エノラーゼの等モルミックスを含有するＭａｓｓＰＲＥＰ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｍｉｘｔｕｒｅ １（商標）（Waters Corporation）からなるＩＳ３；１８μＬのサンプル中の最終濃度は、酵母アルコール脱水素酵素１３５ｆｍｏｌに調整した）を添加した。２．５μｇの推定タンパク質ロードに応じて、調製したサンプルを９μＬ投入した。ＭＳ分析のために、ｎａｎｏ Ａｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（Waters）をＳＹＮＡＰＴ Ｇ１ ｑＴＯＦシステム（Waters）とオンラインで接続した。ＵＰＬＣシステムの構成は以下のようにした：トラップカラムＳｙｍｍｅｔｒｙ（商標）Ｃ１８ ５μｍ、１８０μｍ×２０ｍｍ（Waters）、分析カラムＢＥＨ（商標）Ｃ１８ １．７μｍ、７５μｍ×１５０ｍｍ（Waters）、溶媒Ａ（水中の０．１％ギ酸）及び溶媒Ｂ（ＡＣＮ中の０．１％ギ酸）。流量は３００ｎＬ／分に設定し、勾配は以下の組成を有するものとした：０分、９７％のＡ；９０分、６０％のＡ。ＭＳの取得パラメータは以下のようにした：データ独立交互スキャン（alternate scanning）（ＭＳ^Ｅ）モード、５０〜１５００のｍ／ｚ範囲、ＥＳＩ＋、Ｖオプティクス、スキャン時間１秒、コーン３０Ｖ及びロックマス（Ｇｌｕ１）フィブリノペプチドＢ［Ｍ＋２Ｈ］^２＋ ７８５．８４２６ｍ／ｚ。生データは、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ ＧｌｏｂａｌＳＥＲＶＥＲ（商標）（ＰＬＧＳ）ｖ２．４を用いて処理した（デコンボリューション、デアイソトープ（deisotoped）、タンパク質同定、絶対的定量化及び相対的定量化）。処理パラメータは以下のようにした：ＭＳ ＴＯＦ分解能及びクロマトグラフピーク幅を自動、低／高エネルギー検出閾値を２５０／１００カウント、同定強度閾値を１５００カウント、ロックマスウィンドウを７８５．８４２６±０．３５Ｄａに設定した。タンパク質同定のために、ＵｎｉＰｒｏｔ（商標）ヒトデータベースを参照とした（２０２８０個のエントリ（正：entries）を含む正準配列データ）。ペプチド修飾のカルバミドメチル化を固定、酸化（Ｍ）を可変として設定した。加えて、糖タンパク質分析のために、脱アミド化（Ｎ）を同様に可変修飾に含めた。ペプチド強度の絶対量への変換のための応答係数（２２００）を、アルコール脱水素酵素（酵母、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ００３３０）消化物の反復投入後に予め推測した。この応答係数を研究の間中一定に維持した。日常的には、ＩＳ１、ＩＳ２及びＩＳ３を、スパイクした絶対量と測定された絶対量との間の正確な関係及び比較されるサンプル間の相対比について確認した。絶対量及び相対比の両方についてのＩＳ許容差は、データセットを許容可能にし、更なる分析に含めるためには±２５％偏差内でなければならなかった。ＰＬＧＳ（商標）ソフトウェアによって、各々個々のタンパク質ヒットについてスコア及び偽陽性率（ＦＰＲ）を計算した。本研究では、ＦＰＲが９６％以上かつスコアが８０以上である場合にタンパク質が同定されたとみなした。

糖タンパク質データ分析
糖タンパク質に関して、処理したＭＳデータ（デコンボリューションしたスペクトル）を、初めにヒドラジドビーズ（Ｇ）から得られる画分について別個に、次いでフロースルー画分（Ｒ）と組み合わせてデータベース検索に供した。その後、ヒドラジドビーズに由来する全ての糖タンパク質を、自作プログラム（ＡＲＡＣ ｖ３．５、要求に応じて利用可能）を用いて取り除いた。このプログラムによって、問題のペプチドの各々について、コンセンサス配列部位（ＮＸＳ／Ｔ、ここでＸをプロリン以外の任意のアミノ酸によって置き換えることができる）での脱アミド化アスパラギンの存在を確認した。この初期段階では、或る特定数の糖ペプチドを、それぞれの糖タンパク質（Ｇ画分）に即座に割り当てることができた。残りの糖ペプチドは十分に特異的でないか、又は明確にタンパク質と関連付けることができないほど低いスコアを有していた。これらのペプチドがタンパク質に割り当てられるように、幾つかの非グリコシル化ペプチドが、グリコシル化ペプチド（Ｇ画分に由来する）とともに顕著なタンパク質同定を可能にする、Ｒ画分分析によるペプチドとマッチングした。この新たなプロテオミクス結果の複合プールをＧＲ画分と名付けた。

選択されたバイオマーカーの免疫組織化学的検証
ラミニンα５及びミオフェリンの発現を、ホルマリンで固定したパラフィン包埋乳房組織切片において免疫組織化学検査によって評価した。２５例の腫瘍乳房及び１３例の正常乳房に由来するサンプルを、抗ラミニンα５（Millipore（Billerica，US）、希釈率１００倍）及び抗ミオフェリン（Abcam（Cambridge，UK）、希釈率４００倍）を用いて免疫染色した。５μｍ厚の組織切片を５分間、２回のキシレン浴によってパラフィン除去し（unparaffined）、メタノール勾配（１００％、９５％、７０％、５０％及びＨ_２Ｏ）中で水和させた。内因性ペルオキシダーゼのブロッキングを、３％Ｈ_２Ｏ_２及び９０％メタノールとの３０分間のインキュベーションによって行った。抗原回復を、９５℃の水浴を用いて１０ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ６）中で４０分間行った。ＰＢＳ−正常血清溶液（１０ｍｌのＰＢＳ中、１５０μｌの正常ヤギ血清及び２０μｌのＴｗｅｅｎ ２０）中で３０分間のブロッキングに続いて、切片を一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次いで、切片をビオチン化二次抗体とともに３０分間、更にはアビジンビオチン複合体キット（ＡＢＣキット）とともに更に３０分間インキュベートした。５％Ｈ_２Ｏ_２を加えた３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩二水和物（ＤＡＢ）を、発色（colorization）に使用した。スライドガラスを最後にヘマトキシリンで対比染色した。免疫染色を、サンプルを陽性細胞の割合（５つの任意単位／クラス：０＝０％、１＝０％〜２５％、２＝２５％〜５０％、３＝５０％〜７５％及び４＝７５％〜１００％）及び染色強度（４つの任意単位／クラス：０＝染色なし、１＝弱い染色、２＝中程度の染色及び３＝強い染色）について評価することによって評価した。次いで、これら２つの尺度によって得られた結果を掛け合わせて、スコアと名付けられる単一の値を得た（図５のｙ軸）。群間比較のために、対応のない両側スチューデントｔ検定を用いて統計分析を行った。ガウス分布は、ダゴスティーノ−ピアソン検定によって検証した。ガウス分布及び／又は不均一分散が確認されなかった場合（正常サンプルが任意の陽性細胞を示さず、及び／又は染色がなかった場合）、両側マン−ホイットニーＵ検定を用いた。０．０５以下のＰ値を有意であるとみなした。統計分析は、ＰＲＩＳＭソフトウェア（GraphPad Software（San Diego，California）、バージョン４．０ｂ）を用いて行った。

結果
組織サンプルからの接近可能なタンパク質の単離−逐次的方法
逐次的方法の概略図を図１に示す。この方法は基本的に、ｉ）ビオチン化タンパク質の単離、ｉｉ）糖ペプチドの精製、及びｉｉｉ）残りのペプチドの分析という３つの異なる工程からなる。後者の画分は、割り当てられていない糖ペプチドのコンピューターによる補足に用いた。加えて、この画分は相当数の接近可能なタンパク質を含有するため、この対象の群を調節タンパク質のプール全体に寄与させることができた。方法の複雑さのために、反復試験間の再現性をモニタリングする幾つかの高速ツールを導入した。これらは主として、ｉ）残りのビオチン化タンパク質についてのビオチン工程のフロースルーの検査、及びｉｉ）残留糖ペプチドのヒドラジド捕捉後のフロースルー画分の測定からなるものであった。更なるプロセス対照は、３つの異なる工程でスパイクした非ヒト起源の合計８個の個別タンパク質である内部標準とした。全体的には、ビオチン化タンパク質及び糖ペプチドの両方の捕捉が効率的であり、ほぼ完璧な特異性及びサンプルの少ない損失が可能となるといえる。このことは、図２Ａに示すデータから特に明らかである。ここで、ビオチン化タンパク質画分において、ビオチン化アルブミンの定量的回収及び無視することができるフェチュインの混入が検出されたことは注目に値する（ＩＳ１）。他の２つの画分（グリコ画分及び残りの画分）に関する限り、フェチュインが両方の画分において再現性よく定量化され（グリコシル化ペプチド及び非グリコシル化ペプチドの両方による）、純粋なリンタンパク質であるカゼイン（ＩＳ１）が残りの画分のみで回収された。タンパク質消化工程及びその後の精製工程の再現性に関して、糖ペプチド画分以外（これがグリコシル化タンパク質ではないため）の全ての画分におけるβラクトグロブリン（ＩＳ２）の良好な回収率から、これらの工程によって導入される量的及び質的な変動性が許容範囲内であることが示される。

本研究では、絶対的無標識定量化を行うためにＭＳ^ｅ技術を用いた。この方法には極めて再現可能なＨＰＬＣ及びデータ独立交互スキャンを用いた。加えて、高質量精度測定が直交飛行時間型質量分析計、及びその後の再較正を可能にするロックマスの「飛行中」取得によって得られる。データを、同じクロマトグラフプロファイルを有する全ての検出可能な前駆イオン及びフラグメントイオンの検出及び相関付けに基づいて処理した。衝突セルに適用される低エネルギー状態と高エネルギー状態との間の急速な変化によって、タンパク質が単一の実験で同時に定量化及び同定された。ＩＳ３は逐次的方法の極めて後の工程（サンプルをＵＰＬＣに投入する前の最後の工程）でサンプルにスパイクされることが観察され、これにより定量化アプローチの性能の良好な推定が可能となった。図２Ａ／図２Ｂに概説されるように、４つのタンパク質の定量化から絶対的定量化が実行可能かつ正確であることが実証された。しかしながら、とりわけアルブミン（ウシ）及びグリコーゲンホスホリラーゼｂ（ウサギ）についてタンパク質量の僅かな過大評価が確かに認められる。このことは、サンプル中に豊富に見られるヒト相同体の存在と関係付けることができた。この変動がタンパク質の差次的発現を主張するための閾値として選ばれる２倍比をはるかに下回るという原理から、この偏差を有意とはみなさなかった。

本発明の方法を用いた実際の結果及び見られるペプチドを図１８に示す。

逐次的アプローチと個別法との比較
新たな方法において２つの既知の手順を組み合わせることの正確な利益を決定するために、逐次的技法を個別法のパートのそれぞれと比較した。この目的で、この方法の第２のパートである糖ペプチドの単離を「独立型」技法として行うことが必要であった。この方法の技術的側面に関する限り、グリコシル化ペプチドの直接的な単離及び残存する残りの画分の分析によって、逐次的方法と同様の結果が得られた。図２Ａ及び図２Ｂに示されるように、グリコ画分には特にグリコシル化フェチュインが回収され、ビオチン化卵白アルブミン及びカゼインはフェチュインとともに残りの画分中にしか存在しない。内部標準２及び内部標準３は再現可能な消化、精製及びＭＳ定量化を示す。

接近可能なタンパク質の絶対数に関する限り、組合せ法におけるビオチン化タンパク質画分では平均して３１０個のタンパク質が単離された。糖ペプチド画分中の接近可能なタンパク質の数（逐次的アプローチ及び独立型アプローチの両方で）は、およそ８０であり、コンピューターによる組合せ方法後に１１０に増加した。このことは、この操作をとりわけ割り当てられていない糖ペプチドについて実行することの価値を明らかに実証している（３０％の増加）。残りの画分では、平均して２００個の潜在的に接近可能なタンパク質が確信を持って同定された。全ての方法パートの組合せが、逐次的状況で４１０個を超えるタンパク質（ビオチン化単独と比較して＋３０％）及び糖ペプチド状況単独（対応する残りの画分を含む）で２１０個のタンパク質（逐次的方法と比較して−５０％）をもたらした。既にビオチン化されたタンパク質の除去の分析手順は、同定される特有のタンパク質の割合（４５％）に関して、両方の糖ペプチド及び残りの（非グリコシル化及び非ビオチン化タンパク質の分析よりも明らかに優れていた。しかしながら、糖ペプチド単離の追加によって更に約３６％の特有の潜在的に接近可能なタンパク質がもたらされる。タンパク質の残りのプール（残りの画分）は、相対的に高い絶対数並びに高い膜タンパク質及び細胞外タンパク質の割合から、更に２５％の対象の特有タンパク質を有している。

免疫組織化学検査を用いたバイオマーカーの検証
ＭＳベースの半定量的アプローチを用いて、ラミニンα５及びミオフェリンが乳がんサンプルにおいて差次的に過剰発現されることが見出された。乳がんと診断された２５人の患者、及び１３人の正常個体の対照群を用いた研究から、ラミニンα５及びミオフェリンの両方がヒト乳がん組織において強力な陽性染色を示すことが実証された。対応する正常乳房組織は、使用したいずれの抗体についても任意の顕著な陽性率を示さなかった（図５）。

膵臓がんに対するバイオマーカー
本発明の方法を、膵臓がんに対するバイオマーカーを同定するためにも用いた。用いた方法は、サンプルが膵臓がん組織である以外は乳がんに関して上記したとおりであった。検証及び機能的研究に用いた幾つかの具体的な方法を下記に説明する。

ＭＲＭベースの相対的タンパク質定量化
幾つかのバイオマーカーの検証をＭＲＭを用いて行った。簡潔に述べると、１５０μｇの総タンパク質抽出物（バッファー及び条件は「サンプル調製」の項に詳述する）に、２μｇのウシβラクトグロブリン（サンプル調製の正規化に使用される内部標準（ＩＳ１））をスパイクし、２０％ＴＣＡを用いて沈殿させた。ペレットを１５０μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ８）に部分的に溶解し、トリプシン消化（タンパク質／プロテアーゼ ５０／１）に供した。ＭＲＭイオン選択は、腫瘍サンプル及び正常サンプルの併合された（merged）結果を考慮に入れ、２Ｄ−ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳラン（上記のプロテオミクス実験による）に基づくものであった。８０を超えるＭａｓｃｏｔ（商標）スコアを有するペプチドは所与のタンパク質に特有であり、完全に割り当てられたフラグメントを有するそれらのＭＳ／ＭＳスペクトルは、有力な標的であると考えられた。対象のタンパク質の各々を、１つの特異的ペプチド及び幾つかの転移(transitions)（特徴的なフラグメント）を用いて標的とした。全ての転移に陽性であるサンプルのみを定量化した。さらに、前駆イオン／生成イオン転移の特異性を、公的に入手可能なアルゴリズム：http://prowl.rockefeller.edu/prowl/pepfrag.htmlを用いて検証した。

ＬＣ−ＭＳシステムへの投入の前に、合成ペプチド（ＥＥＥＧＴＴＧＰＤＲ^＊（同位体標識したアルギニン^１３Ｃ及び^１５Ｎ）、保持時間１．３分（ＩＳ２））を、各々のサンプルに添加した（０．０２５ｐｇ／μＬ）。このペプチドの既知の転移（親イオン５５０．０５ ＋２［Ｈ］^２＋及びフラグメント１８５．２ｍ／ｚ、２４１．２ｍ／ｚ及び７１３．５ｍ／ｚ）を、異なるサンプルの個々の投入におけるイオン化の相違を正規化するために用いた。

およそ２０μｇの消化サンプルを、ＭＲＭモードに設定したＭＳ装置（Ｑｕａｔｔｒｏ Ｕｌｔｉｍａ Ｐｌａｔｉｎｕｍ、Waters）と連結したＨＰＬＣシステム（Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９０、Waters（Milford，MA，USA））に投入した。サンプルの分離を、２００μＬ／分の流量で送液する２．１ｍｍ×１５０ｍｍのＣ１８カラム（３μｍビーズを含むＰｏｌａｒｉｓ Ｃ−１８ Ａ媒体、孔径２００Å（Varian Inc.（Palo Alto，CA，USA）））を用いて行った。線形勾配は以下のように設定した：ｔ＝０分、１００％水（＋０．１％（ｖ／ｖ）酢酸）及びｔ＝１６分、６０％水及び４０％アセトニトリル（＋０．１％（ｖ／ｖ）酢酸）。ＭＳ装置の関連パラメータは以下のようにした：キャピラリー電圧２．６ｋＶ、脱溶媒和温度１１５℃、コーン脱溶媒和ガス６３０Ｌ／時間、及び衝突セル圧２μバール。データを収集し、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Waters）ソフトウェアバージョン４．１を用いて評価した。

データ評価の目的で、指定のペプチド及び転移の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）のピーク面積（ＰＡ）を、ＩＳ２を用いて種々の投与間で正規化した。１００ｃｐｓの閾値を超えるＸＩＣのみを、分析の考慮に入れた。その後、正規化したＰＡの平均を、それぞれのペプチドの全ての転移を用いて計算した。最後に、２回目の正規化をＩＳ１を用いて行った。

細胞培養及びｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン
ＢｘＰＣ３（膵臓癌）細胞に、ＭＹＯＦ及びＴＧＦＢＩに対して指向性を有する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬、カタログ番号１１６６８−０１９、Invitrogen）を用いて１０ｎＭの濃度でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、培養培地を対応する新鮮培地（血清を含む）と交換した。この時点をｔ＝０とした。ルシフェラーゼに指向性を有するｓｉＲＮＡを対照として使用した。全てのｓｉＲＮＡはEurogentec（Seraing，Belgium）から購入した。

細胞遊走（走化性／走触性）アッセイ
トランスフェクションの４８時間後、２×１０^５個のトランスフェクトＢｘＰＣ３細胞を、無血清培地（０．１％ＢＳＡ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に懸濁し、三連でゼラチン又はラミニン（１００μｇ／ｍｌ）でコーティングしたトランスウェルフィルター（直径６．５ｍｍ、孔径８μｍ、Costar（Cambridge，MA，USA））の上部に播種した。トランスウェルフィルタープレートの下部コンパートメントに、６％血清、１％ＢＳＡ及び１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭを充填した。３７℃で１０時間のインキュベーションの後、遊走細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋキット（Medion Diagnostics、参照番号１３０８３２（Switzerland））を用いて染色した。各々のインサートの写真を５倍の倍率で撮影し、遊走細胞の割合をＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH（USA））を用いた密度測定によって更に定量化した。１つの条件につき３つのウェルをカウントした。

この研究では、３つの正常膵臓組織及び３つの腫瘍病変をプロテオミクス発見段階で分析した。合計で７３６個及び８４１個のタンパク質が正常条件及び腫瘍条件のそれぞれで同定された。これらの中でも、１８％超が３つ全ての正常サンプル（１５７個のタンパク質）及び腫瘍サンプル（１５２個のタンパク質）中に見られた。さらに、正常サンプルのタンパク質の２９％超（２３９個のタンパク質）及び腫瘍サンプルのタンパク質の２９％超（２４４個のタンパク質）が、３回の生物学的反復試験のうち２回で同定された。このことは、それぞれのサンプルの各々に見られるタンパク質の４７％が、少なくとも別の反復試験においても観察されることを示唆している。合計で１１３９個の特有のタンパク質が同定された。それらの調節を、正常条件に対する腫瘍条件におけるそれらの「存在」又は「非存在」によって評価した。さらに、ｅｍＰＡＩ値を両方の条件で見られたタンパク質を半定量化するために用いた。ｅｍＰＡＩ値は複合混合物中のタンパク質量の推定値である。この値は、ＭＳ分析において観察されたペプチドと理論的に観察可能なペプチドとの比率の対数として計算される。本研究では、（ｉ）腫瘍条件のみで検出される場合、（ｉｉ）両方の条件で見られるが、腫瘍サンプル中でより頻繁に同定される場合、（ｉｉｉ）２を超えるｅｍＰＡＩ（腫瘍条件対正常条件）の倍数変化率で見られる場合にタンパク質を過剰発現されるとみなした。これらの基準を考慮すると、４８４個のタンパク質が膵臓腫瘍において過剰発現されるとして見出された。これらの中でも、４０３個が腫瘍サンプルに限定され、８１個が両方の条件で存在していた。差次的に発現されるタンパク質を、それらの潜在的細胞内局在性を決定するためにＳｗｉｓｓｐｒｏｔ（商標）／Ｕｎｉｐｒｏｔ（商標）データベースを用いて分析した。所与のタンパク質の潜在的接近可能性を、以下の基準に従って評価した：タンパク質が（ｉ）細胞膜、（ｉｉ）細胞表面に局在するか、又は（ｉｉｉ）分泌タンパク質若しくは（ｉｖ）細胞外タンパク質と説明される。血清中に豊富に見られるとして知られる分泌タンパク質を更なる分析から除外した。腫瘍条件で過剰発現される４８４個のタンパク質の中でも、８４個のタンパク質を潜在的に接近可能であるとして同定することができ、３１０個、１８個及び７２個がそれぞれ接近不可能なタンパク質、血清タンパク質及び未知のタンパク質と説明された。８４個の差次的に発現される接近可能なタンパク質の生物学的プロファイルを、それらの遺伝子オントロジーアノテーションに従って決定した。タンパク質の大半が細胞間連絡及びシグナル伝達（３０％）、並びに細胞の成長及び／又は維持（３０％）に関与していた。他の生物学的プロセスは目立たなかった：タンパク質代謝（９％）、一般代謝及びエネルギー経路（９％）並びに輸送（６％）。

この特有の方法のために、本研究によって潜在的な接近可能な特徴を有する相当な数のタンパク質（ｎ＝８４）が明らかになった（図７）。

トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３（ＴＧＦＢＩ）、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２（ＬＴＢＰ２）、ミオフェリン（ＭＹＯＦ）、アスポリン（ＡＳＰＮ）、テネイシン（ＴＮＸＢ又はＴＮＣ）、ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）、ガレクチン（ＬＧＡＬＳ３）、フィブロネクチン（ＦＮ１）、プロラルギン（ＰＲＥＬＰ）、タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ２（ＴＧＭ２）及びアグリン（ＡＧＲＮ）タンパク質は、膵臓がんに対する新規のバイオマーカーである。

ＴＧＦＢＩタンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＭＹＯＦタンパク質及びＡＳＰＮタンパク質の発現を、免疫組織化学検査を用いて一連の腫瘍膵臓組織（ｎ＝３４）及び非腫瘍膵臓組織（ｎ＝２８）において研究した（図８）。非腫瘍組織を正常膵臓及び慢性膵炎に更に細分した。このことは、選択されたタンパク質の腫瘍特異性をより良好に特性化することに役立つ。ＴＧＦＢＩに関する限り（図８Ａ）、染色は概して導管腺癌組織のＥＣＭ（細胞外マトリックス）において見られた。腫瘍上皮細胞は中程度の細胞質染色を示した。これは正常組織では観察されなかった。強力なＥＣＭ発現が分析した全ての腺癌の５０％で観察されたが、残りの症例はより低い染色を示した。慢性膵炎の領域に局在する一部の導管が中程度に陽性であった。正常な導管はタンパク質の発現を示さなかった。全体では、腫瘍組織におけるＴＧＦＢＩの平均的発現は、炎症膵臓組織（スコア約２）及び正常膵臓組織（スコア約２）と比較して腫瘍（スコア約８）において有意に強かった（ｐ≦０．０００１）。慢性膵炎及び正常組織におけるＴＧＦＢＩレベルは有意に異ならなかった。ＬＴＢＰ２免疫反応性は主に腫瘍導管組織及び導管周囲の間質組織で見られた。５０％超の腺癌がタンパク質の強力な発現を示し、これは炎症組織（スコア約２）及び正常組織（スコア約２）と比較して腫瘍（スコア約５）において有意に高かった（ｐ≦０．０００１）（図８Ｂ）。正常組織及び膵炎組織におけるＬＴＢＰ２タンパク質発現は有意に異ならなかった。ＭＹＯＦの発現パターンも評価した（図８Ｃ）。ＴＧＦＢＩ及びＬＴＢＰ２とは対照的に、ＭＹＯＦ発現は主に腫瘍細胞の細胞膜及び細胞質で得られた。異なる腫瘍グレード間での相違が顕著であり、染色強度はグレード２及びグレード３（より進行した腫瘍）でより強く現れ、グレード１（あまり進行していない腫瘍）でより低かった。炎症性のものを含む正常導管は主に陰性であった。要約すると、膵炎及び正常膵臓組織（スコア約２）と比較して腫瘍組織（スコア約６）における陽性率は有意に異なっていた（ｐ≦０．００１）。ＡＳＰＮは細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のみで検出され、正常上皮細胞又は腫瘍上皮細胞のいずれにおいても染色は観察されなかった。ＡＳＰＮ発現（図８Ｄ）は、染色がないか又は非常に低い染色しか確認されなかった炎症組織（スコア約３）及び正常組織（スコア約２）と比較してがん試料（スコア約８）において有意に（ｐ≦０．０００１）強かった。炎症組織は低い陽性率しか示さなかったが、ＡＳＰＮのタンパク質レベルは正常試料に対して有意に上昇していた（ｐ≦０．０５）。

副腎、脳、子宮内膜、腸、肝臓、胎盤、前立腺（腺及び導管の両方）、肺静脈及び肺動脈、胸腺、甲状腺及び臍帯に由来する他の正常組織は、ＡＳＰＮの存在について陰性であると試験された（図９）。他の正常ヒト組織におけるＴＧＦＢＩの発現に関しては、組織マイクロアレイ分析によって結腸、脳、乳房、子宮内膜、筋層間神経叢、子宮筋層、前立腺（腺）、胸腺及び甲状腺が陰性であることが示された。極めて低い陽性率（スコア２〜４）が副腎、心臓、肝臓、食道、舌及び前立腺（導管）において測定された（図９）。正常組織におけるＬＴＢＰ２の発現に関しては、免疫組織化学実験によって、このタンパク質が大部分の組織（副腎（皮質）、脳、乳房、子宮内膜、心臓、腸、筋層間神経叢、腎臓、肝臓、胎盤、前立腺（腺）、胸腺、甲状腺、臍帯及び静脈）中に存在しないことが明らかになった。弱い陽性率（スコア≦２）が副腎髄質、舌上皮、気管支粘膜及び肺動脈において示された（図９）。

幾つかのバイオマーカーの発現がウエスタンブロット実験によって確認された。図１０に示されるように、ＴＮＸＢ（ＴＮＣ）、ＬＴＢＰ２、ＡＳＰＮ及びＬＧＡＬＳ３が、がんサンプルにおいて独自に発現された。ＰＯＳＴＮは全ての腫瘍サンプルで検出可能であったが、このタンパク質は他の個体と比較して患者ＤＩ−ＰＴ−００３ではあまり発現されないことが見出された。非腫瘍試料は検査した全てのタンパク質についてほぼ陰性であったが、ＡＳＰＮは２人の膵炎患者のうち１人（ＤＩ−ＰＩ−００１）で陽性であると試験された。さらに、ＴＧＦＢＩは全てのがんサンプルにおいて発現された。ＭＹＯＦは全ての腫瘍サンプルで検出可能であったが、このタンパク質は他の個体と比較して患者ＤＩ−ＰＴ−００３ではあまり発現されないことが見出された。非腫瘍試料は検査した３つ全てのタンパク質についてほぼ陰性であったが、ＴＧＦＢＩは２人の膵炎患者のうち１人（ＤＩ−ＰＩ−００１）で陽性であると試験された。

好適な抗体が利用可能であったため、ウエスタンブロット法をこれらの７つのタンパク質に用い、他の４つはＭＲＭを用いて定量化した。ＭＲＭは、所与のタンパク質の特異的ペプチドフラグメントを検出し定量化する標的ＭＳ方法を表す。ＭＲＭをＦＮ１、ＰＲＥＬＰ、ＴＧＭ２及びＡＧＲＮに用い、全てのタンパク質が、正常対応組織と比較してヒト膵臓がんにおいて過剰発現されることが確認された（図１１）。

次に、膵臓がん細胞におけるＴＧＦＢＩ及びＭＹＯＦの機能的役割を明らかにすることに焦点を置いた。主として、がんの進行及び成長における主要な工程の１つとして、膵臓がん細胞の遊走能（走化性／走触性）に対するこれらのタンパク質の影響を評価した。この目的で、ＢｘＰＣ３膵臓癌細胞にＴＧＦＢＩ及びＭＹＯＦに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、トランスフェクション後４８時間に遊走能の変化を評価した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。ｓｉＲＮＡは対応するｍＲＮＡの分解を媒介し、したがってそれぞれの細胞における標的タンパク質の除去をもたらす（図示せず）。図１２に示されるように、ＴＧＦＢＩタンパク質及びＭＹＯＦタンパク質の除去は、膵臓癌細胞における遊走の顕著な阻害（それぞれ−６０％及び−２５％）をもたらす。結果から、両方のタンパク質が治療用途に好適な標的として役立ち得ることが実証される。

ＣＲＣ肝転移に対するバイオマーカー
本発明の方法を、結腸直腸癌の肝転移に対するバイオマーカーを同定するためにも用いた。用いた方法は、サンプルが肝臓がん組織のものである以外は乳がんに関して上記したとおりであった。

機能的研究については、以下の方法を使用した。

細胞培養及びｓｉＲＮＡ媒介ノックダウン
ＳＷ１２２２（結腸直腸癌）細胞に、ＭＹＯＦに対して指向性を有する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬、カタログ番号１１６６８−０１９、Invitrogen）を用いて１０ｎＭの濃度でトランスフェクトした。トランスフェクションの１６時間後、培養培地を対応する新鮮培地（血清を含む）と交換した。この時点をｔ＝０とした。ルシフェラーゼに指向性を有するｓｉＲＮＡを対照として使用した。全てのｓｉＲＮＡはEurogentec（Seraing，Belgium）から購入した。

細胞遊走（走化性／走触性）アッセイ
トランスフェクションの４８時間後、２×１０^５個のトランスフェクト細胞を、無血清培地（０．１％ＢＳＡ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に懸濁し、三連でゼラチン又はラミニン（１００μｇ／ｍｌ）でコーティングしたトランスウェルフィルター（直径６．５ｍｍ、孔径８μｍ、Costar（Cambridge，MA，USA））の上部に播種した。ブロッキング抗体に関する実験については、非トランスフェクト細胞を、ＭＹＯＦ又はウサギＩｇＧ（対照）に対して指向性を有するポリクローナル抗体を５０μｇ／ｍｌの濃度で添加したバッファー（０．１％ＢＳＡ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン）中、３７℃で９０分間プレインキュベートした。トランスウェルフィルタープレートの下部コンパートメントに、６％血清、１％ＢＳＡ及び１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含有するＤＭＥＭを充填した。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、遊走細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋキット（Medion Diagnostics、参照番号１３０８３２（Switzerland））を用いて染色した。各々のインサートの写真を５倍の倍率で撮影し、遊走細胞の割合をＩｍａｇｅＪソフトウェア（NIH（USA））を用いた密度測定によって更に定量化した。１つの条件につき３つのウェルをカウントした。

図１３に肝臓組織を用いて同定された接近可能なタンパク質の詳細を示す。

脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１（ＡＥＢＰ１）、ＥＭＩＬＩＮ１、潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２（ＬＴＢＰ２）、ペリオスチン（ＰＯＳＴＮ）、トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇｈ３（ＴＧＦＢＩ）及びミオフェリン（ＭＹＯＦ）タンパク質は、結腸直腸癌肝転移に対する新規のバイオマーカーである。

これらの抗原の発現を更に検証するために、１４個の腫瘍サンプル及び正常サンプル（マッチングした）に対して免疫組織化学検査を行った。図１４は免疫染色の評価を示す。この分析から、ＡＥＢＰ１抗原、ＥＭＩＬＩＮ１抗原及びＰＯＳＴＮ抗原が主に腫瘍間質中に存在する（全て顕著に上方制御される）が、腫瘍細胞が主に陰性であることが明らかになった。図１４に更に概説されるように、ＴＧＦＢＩは腫瘍間質において顕著な陽性率（スコア約８）を示した。腫瘍細胞におけるＴＧＦＢＩの発現（スコア約６）は間質における発現より低いが、主に陰性である正常肝細胞（スコア約２）より顕著に高かった。ＬＴＢＰ２に関する限り（図１４Ｃ）、このタンパク質の発現は主に腫瘍間質で得られた（スコア約４）。腫瘍細胞及び正常肝細胞におけるＬＴＢＰ２の発現は、有意には異ならなかった（どちらもスコア約２）。

正常肝臓組織及び結腸直腸癌肝転移組織におけるＡＥＢＰ１タンパク質、ＥＭＩＬＩＮ１タンパク質、ＬＴＢＰ２タンパク質、ＰＯＳＴＮタンパク質、ＴＧＦＢＩタンパク質及びＭＹＯＦタンパク質の発現の検証を、ウエスタンブロット分析を用いて確認した（図１５）。６つ全てのタンパク質が主に転移組織の辺縁及び病変の中央で検出されたが、正常肝臓組織では検出されなかった（図１５）。

次に、結腸直腸癌肝転移におけるＭＹＯＦの機能的役割を明らかにすることに焦点を置いた。ＭＹＯＦタンパク質の役割をＳＷ１２２２結腸直腸癌細胞において機能的に評価した。この目的で、ＢＸＰＣ３膵臓がん細胞において行った機能的分析（上記）と同様に、遊走（走化性／走触性）の阻害を、ｉ）ｓｉＲＮＡを用いたＭＹＯＦタンパク質の除去後に、又はｉｉ）細胞をＭＹＯＦタンパク質に指向性を有するポリクローナル抗体とともにインキュベートすることによって評価した。データを図１６及び図１７に概説する。ｓｉＲＮＡによるＭＹＯＦ発現の阻害及び抗ＭＹＯＦ抗体を用いたこのタンパク質の標的化は、結腸直腸がん細胞に対する遊走阻害効果を発揮した。これらのデータは膵臓がん細胞で得られた結果と一致し、２つ以上の特定の悪性腫瘍におけるこのタンパク質の役割が示唆される。

Claims (21)

1. 結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとしてのタンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３、タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１、タンパク質ＥＭＩＬＩＮ１、タンパク質ペリオスチン、タンパク質ＣＤ９７、タンパク質プロラルギン、タンパク質Ｔｈｙ−１膜糖タンパク質、タンパク質成長ホルモン誘導性膜貫通タンパク質、タンパク質ビグリカン、タンパク質ＥＰＣＡＭ及びタンパク質ＥＭＩＬＩＮ２の１つ又は複数の使用。
2. タンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３、タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１、タンパク質ＥＭＩＬＩＮ１及びタンパク質ペリオスチンの１つ又は複数が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項１に記載の使用。
3. タンパク質ミオフェリンが、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項１又は２に記載の使用。
4. タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項１又は２に記載の使用。
5. タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項１又は２に記載の使用。
6. タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項１又は２に記載の使用。
7. タンパク質ＥＭＩＬＩＮ１が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項１又は２に記載の使用。
8. タンパク質ペリオスチンが、結腸直腸癌（ＣＲＣ）肝転移又はその素因に対するバイオマーカーとして使用される、請求項１又は２に記載の使用。
9. 被験体のＣＲＣ肝転移の状態を決定する方法であって、
   （ａ）被験体由来の物質のサンプルを準備する工程と、
   （ｂ）前記サンプルにおける請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオマーカーの１つ又は複数のレベルを決定する工程と、
   （ｃ）（ｂ）で決定されたレベルを同じ被験体又は異なる被験体による１つ又は複数の参照値と比較する工程と、
   を含む、方法。
10. 被験体におけるＣＲＣ肝転移の診断、被験体がＣＲＣ肝転移を起こす可能性の評価、ＣＲＣ肝転移が見られる被験体の予後についてのアドバイス、ＣＲＣ肝転移の疾患進行のモニタリング、及びＣＲＣ肝転移の治療に対する有効性又は被験体の応答のモニタリングのいずれか１つ又は複数において用いられる、請求項９に記載の方法。
11. 前記サンプルが肝生検材料である、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 決定された前記バイオマーカーのレベルと比較される前記参照値が、１つ又は複数の正常サンプルにおいて観察される同じタンパク質のレベルである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記参照値が、特定の被験体について得られた特定のバイオマーカーの以前の値である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記バイオマーカーのレベルの上昇が、ＣＲＣ肝転移の指標となるか又は診断に役立つ、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. ＣＲＣ肝転移の進行のモニタリング及び／又は被験体に対して適用される治療の効果のモニタリングにおいて用いられる、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
16. ＣＲＣ肝転移の治療的治療及び／又は予防的治療において使用される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオマーカーに指向性を有するリガンド。
17. 前記バイオマーカーの細胞外部分に指向性を有する、請求項１６に記載のリガンド。
18. 前記バイオマーカーがタンパク質ミオフェリンである、請求項１６又は１７に記載のリガンド。
19. 被験体のＣＲＣ肝転移の状態の決定において使用されるキットであって、被験体によって提供されるサンプルにおける請求項１〜８のいずれか一項に記載のバイオマーカーのレベルを決定するための少なくとも１つの作用物質を含む、キット。
20. 前記バイオマーカーがタンパク質ミオフェリン、タンパク質潜在型トランスフォーミング成長因子β結合タンパク質２、タンパク質トランスフォーミング成長因子β誘導タンパク質ｉｇ−ｈ３、タンパク質脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１、タンパク質ＥＭＩＬＩＮ１及びタンパク質ペリオスチンからなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
21. 前記バイオマーカーがタンパク質ミオフェリンである、請求項１９に記載のキット。

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