CN112964879A - 与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物、其获得方法及其用途 - Google Patents

与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物、其获得方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物、其获得方法及其用途。具体地，本发明涉及与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断受试者动脉粥样硬化的试剂中的用途，其中所述与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物选自表1和表2中的任一种或多种、或其组合。

Description

与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物、其获得方法及其 用途
技术领域
本发明涉及临床医学，具体而言涉及与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物。具体而言，本发明涉及利用动脉粥样硬化小鼠疾病模型和质谱分析蛋白组学技术获得的与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物及其用途。
背景技术
疾病生物标志物是与特殊病理过程相关的可测量的变化，用于诊断疾病、监测病程、预测疾病预后和评估治疗效果等。
尿液是理想的疾病标志物来源，可以用无创的方式大量获得；更重要的是尿液中没有内稳态机制的调控，所以尿液可以富集机体内排泄出的各种变化，从而在寻找早期生物标志物方面有巨大潜能(参见Gao Y.Urine--an untapped goldmine for biomarkerdiscovery.Sci China.Life Sci,2013,56(12):1145)。
尿液蛋白质组技术(urinary proteomics)作为一种快速发展的分析工具，旨在建立一种无创的“液体活检”(liquid biopsy)诊断方法。在尿液里挖掘疾病特异的生物标志物，部分替代器官穿刺病理检查已成为科学家及临床医生关注的重要研究方向，具有重要的科学意义和巨大的临床应用前景。
动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病的主要病理基础(CVD)(参见Rahman,M.S.等人,Atherosclerosis.Adv Exp Med Biol,2017.1003:p.121-144.)，心脑血管疾病是当今世界第一大致死因素(参见Tabas,I.等人,Recent insights into the cellular biologyof atherosclerosis.J Cell Biol,2015.209(1):p.13-22.)。2015年有1700多万人死于心血管疾病，占全球所有死亡人数的31％(参见World HealthOrganization.Cardiovascular diseases(CVDs)Fact Sheet.2017.)。动脉粥样硬化的影响在晚期会更为显著并诱发心肌梗塞和中风等一系列致命后果，因此，在其早期阶段进行诊断或监测其进展程度有着重要的意义。
发明内容
鉴于本领域的上述需求，一方面，本发明提供了一种用于获得与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)采用高脂饮食喂养1个月龄的ApoE-/-小鼠；
2)分别在步骤1)中的ApoE-/-小鼠第2、3、4、5和6个月龄时，过夜收集小鼠10小时尿液；
3)通过质谱分析，鉴定步骤2)中收集的小鼠尿液与对照小鼠尿液中的差异蛋白，所述对照小鼠与相应月龄的采用正常饮食喂养的C57BL/6小鼠；优选地，所述差异蛋白在相应月龄的ApoE-/-小鼠和对照小鼠之间的变化倍数≥1.5或≤0.67；和
4)将所获得的差异蛋白转化成人的同源蛋白，获得与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物。
另一方面，本发明提供了与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断受试者动脉粥样硬化的试剂中的用途，其中所述与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物选自表1和表2中的任一种或多种、或其组合。
在本发明的具体实施方案中，本发明提供了选自以下的一种或多种蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断受试者动脉粥样硬化的试剂中的用途：泛酰巯基乙胺酶、碳酸酐酶1、α-1-抗胰蛋白酶1-4、β-2-微球蛋白、溶酶体保护蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白2、前列腺素-H2 D-异构酶、组织蛋白酶Z、神经节苷脂GM2激活剂、H-2I类组织相容性抗原、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、β-防御素1、钙蛋白、基质重塑相关蛋白8、纤溶酶原、巯基氧化酶1、淋巴管内皮透明质酸受体1、CMRF35样分子3、聚合免疫球蛋白受体、凝血酶原、膜突蛋白、磷酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白1、维生素D结合蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、CCN家庭成员4、糖蛋白整合膜蛋白1、白蛋白、巢蛋白-2、谷胱甘肽水解酶1酶、载脂蛋白A-I、核运输因子2、分泌和跨膜蛋白1A、肿瘤坏死因子受体超家族成员19L、蛋白聚糖4、血清转铁蛋白和抵抗素样α。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物组在制备用于诊断受试者动脉粥样硬化的试剂中的用途，所述尿液蛋白标志物组为泛酰巯基乙胺酶、碳酸酐酶1、α-1-抗胰蛋白酶1-4、β-2-微球蛋白、溶酶体保护蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白2、前列腺素-H2 D-异构酶、组织蛋白酶Z、神经节苷脂GM2激活剂、H-2I类组织相容性抗原、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、β-防御素1、钙蛋白、基质重塑相关蛋白8、纤溶酶原、巯基氧化酶1、淋巴管内皮透明质酸受体1、CMRF35样分子3、聚合免疫球蛋白受体、凝血酶原、膜突蛋白、磷酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白1、维生素D结合蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、CCN家庭成员4、糖蛋白整合膜蛋白1、白蛋白、巢蛋白-2、谷胱甘肽水解酶1酶、载脂蛋白A-I、核运输因子2、分泌和跨膜蛋白1A、肿瘤坏死因子受体超家族成员19L、蛋白聚糖4、血清转铁蛋白和抵抗素样α的组合。
在具体的实施方式中，和健康对照尿液中的蛋白含量相比较，选自以下的蛋白的含量升高指示所述受试者存在动脉粥样硬化：泛酰巯基乙胺酶、碳酸酐酶1、α-1-抗胰蛋白酶1-4、β-2-微球蛋白、溶酶体保护蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白2、前列腺素-H2 D-异构酶、组织蛋白酶Z、神经节苷脂GM2激活剂、H-2I类组织相容性抗原、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、β-防御素1、钙蛋白、基质重塑相关蛋白8；和/或
与健康对照尿液中的蛋白含量相比较，选自以下的蛋白的含量降低指示所述受试者存在动脉粥样硬化：纤溶酶原、巯基氧化酶1、淋巴管内皮透明质酸受体1、CMRF35样分子3、聚合免疫球蛋白受体、凝血酶原、膜突蛋白、磷酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白1、维生素D结合蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、CCN家庭成员4、糖蛋白整合膜蛋白1、白蛋白、巢蛋白-2、谷胱甘肽水解酶1酶、载脂蛋白A-I、核运输因子2、分泌和跨膜蛋白1A、肿瘤坏死因子受体超家族成员19L、蛋白聚糖4、血清转铁蛋白、抵抗素样α。
在具体的实施方案中，健康对照是指未患有动脉粥样硬化的个体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种或多种选自以下的尿液蛋白的鉴定试剂在制备用于早期诊断受试者中动脉粥样硬化的试剂中的用途：波形蛋白、纤维蛋白原β链、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙黏着蛋白13、α-1-抗胰蛋白酶1-4、细胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、纤连蛋白、NPC细胞内胆固醇转运蛋白2、含EGF的类纤维蛋白样细胞外基质蛋白1、富含亮氨酸的重复序列蛋白19、维生素D结合蛋白、溶酶体保护蛋白、铜蓝蛋白、前胶原C内肽酶增强剂1、干扰素α/β受体2、脱氧核糖核酸酶1、血管紧张素原、H-2I类组织相容性抗原、组织蛋白酶B、激活素受体1B型、反钴胺素2、γ-谷氨酰水解酶、淋巴细胞抗原6D、补体因子I、桥粒胶蛋白-2、信号肽，CUB和类似EGF的域蛋白2、心钠素转化酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal1型、Costars家族蛋白ABRACL、内皮细胞选择性粘附分子、Afamin、WAP四二硫核心结构域蛋白2、巯基氧化酶1、钙黏着蛋白1、催乳素诱导蛋白同源物、糖蛋白整合膜蛋白1、蛋白质YIPF3、CD44抗原、β-己糖胺酶亚基β、气味结合蛋白2a、β-半乳糖苷酶、蛋白质LEG1同源物、胰腺α-淀粉酶、钙黏着蛋白3、β-防御素1、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、硫氧还蛋白、胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP]、SH3结构域结合的富谷氨酸样蛋白3、载脂蛋白A-I、泛素B、三叶因子2、激肽释放酶1、CD59A糖蛋白、血清转铁蛋白、神经节苷脂GM2激活剂、酪氨酸蛋白激酶受体、结粘附分子A、白蛋白、H-2II类组织相容性抗原γ链、桥粒斑蛋白、过氧化物还原酶-1、碳酸酐酶6、胶原α-1(I)链、免疫球蛋白κ、伸长因子1-alpha 1、钙蛋白、SPARC样蛋白1、胶原α-1(XII)链、血管细胞粘附蛋白1、真核翻译起始因子6、CCN家庭成员4、溶酶体相关膜糖蛋白2、白介素-18结合蛋白、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白1、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、基质重塑相关蛋白8、血管生成素2、半乳糖凝集素-3结合蛋白、α-1-抗胰蛋白酶1-1、鞘磷脂磷酸二酯酶、天冬氨酸蛋白酶A、三叶因子1、铜转运蛋白ATOX1、肾脏雄激素调节蛋白、表皮生长因子受体底物15、尿调蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、前列腺干细胞抗原、溶酶体α-葡萄糖苷酶、谷胱甘肽过氧化物酶6、前表皮生长因子、粘连蛋白-2、ATP结合盒亚家族A成员13、组织蛋白酶L1、补体因子D、二-N-乙酰壳聚糖酶、泛酰巯基乙胺酶、组织蛋白酶E、附睾特异的α-甘露糖苷酶、α-1-抗胰蛋白酶1-2、碳酸酐酶1、纤溶酶原、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、血红蛋白亚基beta-1、补体C3、α-1-抗胰蛋白酶1-5、1-酸糖蛋白2、触珠蛋白、1-酸糖蛋白1、中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白，或其组合。
在具体的实施方案中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的含量提高：波形蛋白、纤维蛋白原β链、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙黏着蛋白13、α-1-抗胰蛋白酶1-4、细胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn]；和/或
相较于健康对照，选自以下的蛋白的含量降低：纤连蛋白、NPC细胞内胆固醇转运蛋白2、含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1、富含亮氨酸的重复序列蛋白19、维生素D结合蛋白、溶酶体保护蛋白、铜蓝蛋白、前胶原C内肽酶增强剂1、干扰素α/β受体2、脱氧核糖核酸酶1、血管紧张素原、H-2I类组织相容性抗原、组织蛋白酶B、激活素受体1B型、反钴胺素2、γ-谷氨酰水解酶、淋巴细胞抗原6D、补体因子I、桥粒胶蛋白-2、信号肽，CUB和类似EGF的域蛋白2、心钠素转化酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型、Costars家族蛋白ABRACL、内皮细胞选择性粘附分子、Afamin、WAP四二硫核心结构域蛋白2、巯基氧化酶1、钙黏着蛋白1、催乳素诱导蛋白同源物、糖蛋白整合膜蛋白1、蛋白质YIPF3、CD44抗原、β-己糖胺酶亚基β、气味结合蛋白2a、β-半乳糖苷酶、蛋白质LEG1同源物、胰腺α-淀粉酶、钙黏着蛋白3；和/或
相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的含量提高：β-防御素1、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、硫氧还蛋白、胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP]、SH3结构域结合的富谷氨酸样蛋白3、载脂蛋白A-I、泛素B、三叶因子2、细胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn]；和/或
相较于健康对照，选自以下的蛋白的含量降低：激肽释放酶1、CD59A糖蛋白、糖蛋白整合膜蛋白1、血清转铁蛋白、淋巴细胞抗原6D、神经节苷脂GM2激活剂、酪氨酸蛋白激酶受体、Afamin、富含亮氨酸的重复序列蛋白19、结粘附分子A、含EGF的纤维蛋白样细胞外基质蛋白1、巯基氧化酶1、白蛋白；和/或
相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的含量提高：H-2II类组织相容性抗原γ链、桥粒斑蛋白、过氧化物还原酶-1、桥粒胶蛋白-2、碳酸酐酶6、胶原α-1(I)链、钙黏着蛋白3、免疫球蛋白κ、伸长因子1-alpha 1、钙蛋白、钙黏着蛋白1、SPARC样蛋白1、胶原α-1(XII)链、血管细胞粘附蛋白1、真核翻译起始因子6、CCN家庭成员4、溶酶体相关膜糖蛋白2、Costars家族蛋白ABRACL、酪氨酸蛋白激酶受体、白介素-18结合蛋白、三叶因子2、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白1、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、基质重塑相关蛋白8、血管生成素2、半乳糖凝集素-3结合蛋白；和/或
相较于健康对照，选自以下的蛋白的含量降低：α-1-抗胰蛋白酶1-1、鞘磷脂磷酸二酯酶、富含亮氨酸的重复序列蛋白19、催乳素诱导蛋白同源物、蛋白质LEG1同源物、血清转铁蛋白、天冬氨酸蛋白酶A、β-己糖胺酶亚基β、气味结合蛋白2a、β-半乳糖苷酶；和/或
相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的含量提高：H-2II类组织相容性抗原γ链、三叶因子1、三叶因子2、铜转运蛋白ATOX1、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白1、肾脏雄激素调节蛋白、钙黏着蛋白3、β-防御素1、表皮生长因子受体底物15、钙蛋白、尿调蛋白、激活素受体1B型、酪氨酸蛋白激酶受体、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、前列腺干细胞抗原、溶酶体相关膜糖蛋白2、CD44抗原、溶酶体α-葡萄糖苷酶、细胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、谷胱甘肽过氧化物酶6、前表皮生长因子、粘连蛋白-2、ATP结合盒亚家族A成员13、组织蛋白酶L1、补体因子D、CD59A糖蛋白、二-N-乙酰壳聚糖酶、钙黏着蛋白1、泛酰巯基乙胺酶、纤连蛋白、组织蛋白酶E、血管细胞粘附蛋白1、附睾特异的α-甘露糖苷酶、激肽释放酶1；和/或
相较于健康对照，选自以下的蛋白的含量降低：α-1-抗胰蛋白酶1-2、碳酸酐酶1、白蛋白、铜蓝蛋白、胰腺α-淀粉酶、纤溶酶原、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、α-1-抗胰蛋白酶1-1、血红蛋白亚基beta-1、气味结合蛋白2a、补体C3、α-1-抗胰蛋白酶1-5、血管紧张素原、1-酸糖蛋白2、触珠蛋白、血清转铁蛋白、1-酸糖蛋白1、中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白；
可用于早期诊断受试者的动脉粥样硬化。
适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。
在具体的实施方式中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。
在具体的实施方案中，含量选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。
在具体的实施方案中，含量是在尿液样本中测定的。
在另一方面，本发明提供了一种用于诊断动脉粥样硬化的试剂盒，其包含与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂，其中所述与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物为泛酰巯基乙胺酶、碳酸酐酶1、α-1-抗胰蛋白酶1-4、β-2-微球蛋白、溶酶体保护蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白2、前列腺素-H2 D-异构酶、组织蛋白酶Z、神经节苷脂GM2激活剂、H-2I类组织相容性抗原、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、β-防御素1、钙蛋白、基质重塑相关蛋白8、纤溶酶原、巯基氧化酶1、淋巴管内皮透明质酸受体1、CMRF35样分子3、聚合免疫球蛋白受体、凝血酶原、膜突蛋白、磷酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白1、维生素D结合蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、CCN家庭成员4、糖蛋白整合膜蛋白1、白蛋白、巢蛋白-2、谷胱甘肽水解酶1酶、载脂蛋白A-I、核运输因子2、分泌和跨膜蛋白1A、肿瘤坏死因子受体超家族成员19L、蛋白聚糖4、血清转铁蛋白和抵抗素样α的组合。
在优选的实施方案中，根据本发明的用于诊断动脉粥样硬化的试剂盒进一步包含选自表2中的任一种或多种的蛋白的鉴定试剂。
在另一方面，本发明提供了一种用于早期诊断动脉粥样硬化的试剂盒，其包含与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂，其中所述与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物为表2中所示的蛋白的组合。
在另一方面，本发明提供了一种用于诊断受试者动脉粥样硬化的方法，包括步骤：
1)获得受试者的尿液样本，
2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，
3)确定所述受试者的尿液样本中选自以下的蛋白的含量：
泛酰巯基乙胺酶、碳酸酐酶1、α-1-抗胰蛋白酶1-4、β-2-微球蛋白、溶酶体保护蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白2、前列腺素-H2 D-异构酶、组织蛋白酶Z、神经节苷脂GM2激活剂、H-2I类组织相容性抗原、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、β-防御素1、钙蛋白、基质重塑相关蛋白8、纤溶酶原、巯基氧化酶1、淋巴管内皮透明质酸受体1、CMRF35样分子3、聚合免疫球蛋白受体、凝血酶原、膜突蛋白、磷酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白1、维生素D结合蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、CCN家庭成员4、糖蛋白整合膜蛋白1、白蛋白、巢蛋白-2、谷胱甘肽水解酶1酶、载脂蛋白A-I、核运输因子2、分泌和跨膜蛋白1A、肿瘤坏死因子受体超家族成员19L、蛋白聚糖4、血清转铁蛋白、抵抗素样α及其组合。
在具体的实施方式中，使用质谱方法、ELISA方法、或Western方法确定含量。
当采用质谱方法确定蛋白及其含量时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方式中，用蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。
根据一些实施方式，提供了一种用于早期诊断受试者中动脉粥样硬化的方法，包括步骤：
1)获得受试者和健康对照的尿液样本，
2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的含量：波形蛋白、纤维蛋白原β链、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙黏着蛋白13、α-1-抗胰蛋白酶1-4、细胞外超氧化物歧化酶[Cu-Zn]、纤连蛋白、NPC细胞内胆固醇转运蛋白2、含EGF的类纤维蛋白样细胞外基质蛋白1、富含亮氨酸的重复序列蛋白19、维生素D结合蛋白、溶酶体保护蛋白、铜蓝蛋白、前胶原C内肽酶增强剂1、干扰素α/β受体2、脱氧核糖核酸酶1、血管紧张素原、H-2I类组织相容性抗原、组织蛋白酶B、激活素受体1B型、反钴胺素2、γ-谷氨酰水解酶、淋巴细胞抗原6D、补体因子I、桥粒胶蛋白-2、信号肽，CUB和类似EGF的域蛋白2、心钠素转化酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型、Costars家族蛋白ABRACL、内皮细胞选择性粘附分子、Afamin、WAP四二硫核心结构域蛋白2、巯基氧化酶1、钙黏着蛋白1、催乳素诱导蛋白同源物、糖蛋白整合膜蛋白1、蛋白质YIPF3、CD44抗原、β-己糖胺酶亚基β、气味结合蛋白2a、β-半乳糖苷酶、蛋白质LEG1同源物、胰腺α-淀粉酶、钙黏着蛋白3、β-防御素1、电压依赖性阴离子选择通道蛋白1、硫氧还蛋白、胞质异柠檬酸脱氢酶[NADP]、SH3结构域结合的富谷氨酸样蛋白3、载脂蛋白A-I、泛素B、三叶因子2、激肽释放酶1、CD59A糖蛋白、血清转铁蛋白、神经节苷脂GM2激活剂、酪氨酸蛋白激酶受体、结粘附分子A、白蛋白、H-2II类组织相容性抗原γ链、桥粒斑蛋白、过氧化物还原酶-1、碳酸酐酶6、胶原α-1(I)链、免疫球蛋白κ、伸长因子1-alpha 1、钙蛋白、SPARC样蛋白1、胶原α-1(XII)链、血管细胞粘附蛋白1、真核翻译起始因子6、CCN家庭成员4、溶酶体相关膜糖蛋白2、白介素-18结合蛋白、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白1、肿瘤坏死因子受体超家族成员1B、基质重塑相关蛋白8、血管生成素2、半乳糖凝集素-3结合蛋白、α-1-抗胰蛋白酶1-1、鞘磷脂磷酸二酯酶、天冬氨酸蛋白酶A、三叶因子1、铜转运蛋白ATOX1、肾脏雄激素调节蛋白、表皮生长因子受体底物15、尿调蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6硫酸酯酶、前列腺干细胞抗原、溶酶体α-葡萄糖苷酶、谷胱甘肽过氧化物酶6、前表皮生长因子、粘连蛋白-2、ATP结合盒亚家族A成员13、组织蛋白酶L1、补体因子D、二-N-乙酰壳聚糖酶、泛酰巯基乙胺酶、组织蛋白酶E、附睾特异的α-甘露糖苷酶、α-1-抗胰蛋白酶1-2、碳酸酐酶1、纤溶酶原、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、血红蛋白亚基beta-1、补体C3、α-1-抗胰蛋白酶1-5、1-酸糖蛋白2、触珠蛋白、1-酸糖蛋白1、中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白及其组合，
3)将受试者所述蛋白的含量和健康对照所述蛋白的含量进行比较，
4)确定所述受试者是否患有动脉粥样硬化。
在本发明中使用的术语“鉴定试剂”指的是能够特异性地检测相应尿液蛋白含量的任何试剂，包括但不限于质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。
附图说明
图1A至图1C：主动脉整体油红O染色结果及定量分析。
图1A：对照组油红O染色结果；图1B实验组油红O染色结果；图1C着色区域占比对比(***表示p<0.001)。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。
实施例
实施例1.动脉粥样硬化动物模型的建立
1.ApoE功能缺失的小鼠会出现高胆固醇血症，极低密度脂蛋白(VLDL)升高，高密度脂蛋白(HDL)降低，表现为自发形成斑块，且高脂饮食可大大加速斑块/病变的形成(参见Rosenfeld,M.E.等人,Advanced atherosclerotic lesions in the innominate arteryof the ApoE knockout mouse.Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000.20(12):p.2587-92.)。因此载脂蛋白E敲除(ApoE-/-)的小鼠是动脉粥样硬化的良好生物模型，适合用来研究动脉粥样硬化进展过程中病理生理及形态学的变化。
利用该动物模型模拟动脉粥样硬化的发病过程，观察动脉粥样硬化进展的整体变化，对临床上动脉粥样硬化的早期诊断、治疗和预后有重要的指导意义。
2.材料与试剂
1)仪器：
小鼠代谢笼购自北京佳源兴业科技有限公司；
Thermo-Orbitrap Lumos购自Thermo公司。
2)主要试剂：
去离子水来源于MillliQ RG超纯水系统；色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Fisher公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Sigma公司购买；测序级胰酶从Promega公司购买；油红O染液从biotopped公司购买。
3)动物：
6只1月龄雄性ApoE-/-小鼠购自北京大学医学部实验动物科学部，4只2月龄、3月龄、4月龄、5月龄、6月龄c57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物中心，在标准饲养环境中饲养。
3.实验方法
-差异饮食：ApoE-/-小鼠饲喂高脂饮食(21％脂肪和0.15％胆固醇，北京科澳协力饲料有限公司)5个月；c57BL/6小鼠均正常饮食。
-样本收集流程：每只小鼠在代谢笼过夜收集尿液10小时，期间不提供食物和饮水。分别收集实验组和对照组小鼠在2月龄、3月龄、4月龄、5月龄、6月龄时的尿液样品。
测试例
测试例1.组织病理学检查
将实验组的6只6月龄ApoE-/-小鼠与4只6月龄正常饮食c57BL/6小鼠一并处死后，取主动脉进油红O整体染色，即先将主动脉在4％多聚甲醛固定后异丙醇脱水，纵向切开后油红O染液(biotopped)染色20分钟，异丙醇漂洗三次后固定。使用数码相机(canon，Japan)拍摄主动脉图像并用imageJ软件(1.52a，NIH，,USA)进行分析。
测试例2.蛋白质分析
1.尿蛋白提取与保存：各时段尿液于4℃2000g离心20分钟，取上清，置于新EP管内，继续12000g 4℃离心20分钟；取上清，-80℃保存。
2.乙醇沉淀尿液蛋白，用Bradford法测蛋白浓度后进行膜上酶切，参见Wisniewski JR,Zougman A,Nagaraj N,Mann M.Universal sample preparation methodfor proteome analysis.Nature methods 2009；6:359-62。BCA法测量多肽浓度。
3.高pH反相色谱预分离
酶切后的样品用0.1％甲酸水重溶，并稀释到0.5μg/uL，取每个样品制备混合多肽样，使用高pH反相肽段分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行分离。将混合多肽样品加于色谱柱上，用乙腈浓度梯度递增的溶液进行洗脱，通过离心收集十份流出液，使用真空干燥仪抽干后用0.1％甲酸水复溶。本次研究使用iRT合成多肽(Biognosis公司)，以10：1的体积比例加入到十个组分和每个样品中。
4.高效液相串联质谱数据采集
使用EASY-nLC 1200色谱系统(Thermo Fisher Scientific)和Orbitrap FusionLumos Tribrid质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行质谱采集和分析。将肽段样品加载到预柱(75μm×2cm,C18,2μm,Thermo Fisher)和反相分析柱(50μm×15cm,C18,2μm,Thermo Fisher)，以300nL/min流速进行洗脱，洗脱时间为120分钟，洗脱用梯度为4％-35％的流动相(80％乙腈+0.1％甲酸+20％水)。参数设置如下：喷雾电压2.4kV,一级全扫描范围为350-1550m/z,分辨率60000；二级扫描范围为200-2000m/z，分辨率30000，循环时间3s，最高速度模式，30％HCD碰撞能量。
将反相色谱柱分离得到的10个组分进行DDA模式采集质谱数据，把DDA采集的结果导入Proteome Discoverer软件(版本2.1)搜库，参数：小鼠数据库(2019年发布，含17038条序列)附加iRT多肽序列，胰酶酶切，最多允许两个漏切位点，母离子质量容差10ppm，碎片离子质量容差0.02Da,甲硫氨酸氧化为可变修饰，固定化修饰为半胱氨酸的氨酰甲基化修饰，蛋白FDR设置为1％。PD搜库结果用于建立DIA采集方法，根据m/z分布密度计算窗口宽度和数量。将单个多肽样品进行DIA模式采集质谱数据。
5.质谱数据分析
使用Spectronaut X软件对质谱数据进行处理和分析(参见Bruderer,R.等人,Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independentacquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional livermicrotissues.Mol Cell Proteomics,2015.14(5):p.1400-10)根据DDA搜库结果pdResult文件与10个DDA raw文件建立谱图库，导入每个样品DIA采集的raw文件进行搜库。高度可信蛋白标准为肽段q value<0.01，采用二级肽段所有碎片离子峰面积进行蛋白定量。
6.统计学分析
对得到的数据进行缺失值填充和CV值筛选(CV<0.3)，每两组数据之间的比较采用独立样本t检验。实验组和对照组每个时间点的样品对比筛选差异蛋白，筛选标准为：两组之间变化倍数FC≥1.5或FC≤0.67,P<0.05。
实验结果
1.油红O染色结果：
比较经过5个月高脂饮食饲喂后的6月龄ApoE-/-小鼠与正常饮食的6月龄小鼠的主动脉整体油红O染色面积占比，实验组平均着色区域面积占比为17.78±2.14％(n＝6)，对照组平均比例为0.88±0.34％(n＝4)，p＝0.0004(见图1A至图1C)，动脉粥样硬化模型造模成功。
3.蛋白鉴定结果：
来源于小鼠5个时期(2月龄、3月龄、4月龄、5月龄、6月龄)的尿液，在FDR小于1％的水平，基于两肽以上鉴定的蛋白为592个。
将实验组与对照组蛋白定量的谱图数进行比对，筛选出各个时间点变化倍数在1.5倍以上及t检验p值小于0.05的差异蛋白，同时使用Uniprot数据库将小鼠蛋白转化为相应的人同源蛋白。
表1显示，在成模时期(小鼠6月龄)，可靠的差异蛋白人同源的有37个，其中相对于对照组，尿液中的泛酰巯基乙胺酶、碳酸酐酶1、α-1-抗胰蛋白酶1-4、β-2-微球蛋白、溶酶体保护蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白2、前列腺素-H2 D-异构酶、组织蛋白酶Z、神经节苷脂GM2激活剂、H-2I类组织相容性抗原、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、β-防御素1、钙蛋白和基质重塑相关蛋白8的含量升高；纤溶酶原、巯基氧化酶1、淋巴管内皮透明质酸受体1、CMRF35样分子3、聚合免疫球蛋白受体、凝血酶原、膜突蛋白、磷酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白1、维生素D结合蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、CCN家庭成员4、糖蛋白整合膜蛋白1、白蛋白、巢蛋白-2、谷胱甘肽水解酶1酶、载脂蛋白A-I、核运输因子2、分泌和跨膜蛋白1A、肿瘤坏死因子受体超家族成员19L、蛋白聚糖4、血清转铁蛋白和抵抗素样α的含量降低。
表1.动脉粥样硬化诊断的尿液蛋白标志物
Figure BDA0002931464850000141
Figure BDA0002931464850000151
对早于成模时间的差异蛋白进行汇总，根据这些变化，并结合上表1，可以用于早期诊断动脉粥样硬化(表2)。
表2.在动脉粥样硬化进展过程中蛋白含量的变化
Figure BDA0002931464850000152
Figure BDA0002931464850000161
Figure BDA0002931464850000171
Figure BDA0002931464850000181
Figure BDA0002931464850000191

Claims (8)

1.与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断受试者动脉粥样硬化的试剂中的用途，其中所述与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物选自表1和表2中的任一种或多种、或其组合。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物通过以下方法获得，所述方法包括以下步骤：
1)采用高脂饮食喂养1个月龄的ApoE-/-小鼠；
2)分别在步骤1)中的ApoE-/-小鼠第2、3、4、5和6个月龄时，过夜收集小鼠10小时尿液；
3)通过质谱分析，鉴定步骤2)中收集的小鼠尿液与对照小鼠尿液中的差异蛋白，所述对照小鼠与相应月龄的采用正常饮食喂养的C57BL/6小鼠；优选地，所述差异蛋白在相应月龄的ApoE-/-小鼠和对照小鼠之间的含量变化倍数≥1.5或≤0.67；和
4)将所获得的差异蛋白转化成人的同源蛋白，获得与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述的与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物为泛酰巯基乙胺酶、碳酸酐酶1、α-1-抗胰蛋白酶1-4、β-2-微球蛋白、溶酶体保护蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白2、前列腺素-H2 D-异构酶、组织蛋白酶Z、神经节苷脂GM2激活剂、H-2 I类组织相容性抗原、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、β-防御素1、钙蛋白、基质重塑相关蛋白8、纤溶酶原、巯基氧化酶1、淋巴管内皮透明质酸受体1、CMRF35样分子3、聚合免疫球蛋白受体、凝血酶原、膜突蛋白、磷酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白1、维生素D结合蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、CCN家庭成员4、糖蛋白整合膜蛋白1、白蛋白、巢蛋白-2、谷胱甘肽水解酶1酶、载脂蛋白A-I、核运输因子2、分泌和跨膜蛋白1A、肿瘤坏死因子受体超家族成员19L、蛋白聚糖4、血清转铁蛋白和抵抗素样α的组合。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物进一步包含选自表2中的任一种或多种。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物，优选为猫、犬、羊、马、小鼠、大鼠或人。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述鉴定试剂为特异性检测尿液蛋白标志物的含量的任何试剂，优选为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。
7.一种用于诊断动脉粥样硬化的试剂盒，其包含与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂，其中所述与动脉粥样硬化相关的尿液蛋白标志物为泛酰巯基乙胺酶、碳酸酐酶1、α-1-抗胰蛋白酶1-4、β-2-微球蛋白、溶酶体保护蛋白、溶酶体相关膜糖蛋白2、前列腺素-H2 D-异构酶、组织蛋白酶Z、神经节苷脂GM2激活剂、H-2I类组织相容性抗原、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、β-防御素1、钙蛋白、基质重塑相关蛋白8、纤溶酶原、巯基氧化酶1、淋巴管内皮透明质酸受体1、CMRF35样分子3、聚合免疫球蛋白受体、凝血酶原、膜突蛋白、磷酸肌醇-3-激酶相互作用蛋白1、维生素D结合蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、CCN家庭成员4、糖蛋白整合膜蛋白1、白蛋白、巢蛋白-2、谷胱甘肽水解酶1酶、载脂蛋白A-I、核运输因子2、分泌和跨膜蛋白1A、肿瘤坏死因子受体超家族成员19L、蛋白聚糖4、血清转铁蛋白和抵抗素样α的组合。
8.根据权利要求7所述的用于诊断动脉粥样硬化的试剂盒，其进一步包含选自表2中的任一种或多种的蛋白的鉴定试剂。
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