CN109270275A - 卵巢癌腹腔移植瘤的尿液蛋白标志物及其诊断用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及卵巢癌腹腔移植瘤的尿液蛋白标志物及其诊断用途。具体而言，本发明涉及利用大鼠卵巢癌细胞腹腔移植瘤模型和质谱分析获得的尿蛋白标志物，在人卵巢癌腹腔移植瘤的诊断、病程监测中的用途，所述尿蛋白标志物选自细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)‑二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β等。本发明中获得的尿液差异蛋白为卵巢癌腹腔移植瘤的早期诊断、病程监测提供一种更简单、快捷、无创的选择。

Description

卵巢癌腹腔移植瘤的尿液蛋白标志物及其诊断用途

技术领域

本发明涉及临床医学；具体涉及人卵巢癌腹腔移植瘤相关的尿液蛋白标志物。具体而言，本发明涉及利用上皮性卵巢癌的腹腔移植瘤大鼠疾病模型和质谱分析蛋白组学技术获得的人卵巢癌腹腔移植瘤诊断和/或监测相关的尿液蛋白标志物及其用途。

背景技术

疾病生物标志物是与病理生理过程相关的可测量的变化，用于诊断疾病、监测病程、预测疾病预后和评估治疗效果等。

尿液作为机体经由泌尿系统及尿路排出体外的液体排泄物，不受稳态机制的调控，能够富集全身的变化，而且早期、敏感，尿液是理想的疾病标志物来源。因其变化早又敏感，可以反映各种疾病早期的变化。这些变化就是潜在的疾病标志物^[1]。尿液蛋白质组技术(urinary proteomics)作为一种快速发展的分析工具，可以在尿液里挖掘疾病相关的早期生物标志物，目前尿蛋白组分析深度可鉴定到6000多个蛋白^[2]。在疾病标志物的研究中具有重大的临床应用前景。

卵巢癌(ovarian cancer)是女性妇科常见的恶性肿瘤之一，卵巢癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位。有研究统计，卵巢癌死亡率占女性癌症总死亡率的5％^[3]。卵巢癌治疗效果差、发生转移和死亡率高的主要原因是该病发病隐蔽，早期无特殊症状和体征，因为卵巢位于下腹部的隐蔽部位，早期肿块(I-II期)较小不易觉察，病人也仅感觉精神较差、易疲劳、食欲不佳等非典型症状。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难，大约60-70％的卵巢癌患者确诊时已经处于III-IV期或诊断时伴有腹腔转移，腹腔转移的部位常有对侧卵巢、大网膜、膈肌、小肠、肝。仅有25％患者在I期发现，此阶段经治疗后5年生存率达95％以上，而III、IV期患者的5年生存率则只有20％左右，且因治疗而生活质量差。术后不及时监测，极易复发并危及生命。目前临床的诊断方法有B超检查、X线检查、CT及磁共振检查等，主要的筛查方法是经阴道超声检查，血清CA-125等，一直以来，虽然血液卵巢癌标志物、腹部超声和阴道超声检查皆因敏感性和特异性不高问题而备受困扰，手术、放疗、化疗、生物靶向治疗等治疗手段有所改善，但治疗效果预后差^[4]。尽管近年来卵巢癌的诊断技术在不断发展，但仍然有很多病人未能以现有的诊断技术在卵巢癌的早期阶段进行诊断。为了减少卵巢癌的发病率和死亡率，需要考虑针对卵巢癌的新的筛查和早期诊断和过程检测的方法^[5]。

卵巢癌腹腔移植瘤又称卵巢癌转移性腹膜肿瘤(peritoneal metastaticcarcinoma)，是癌细胞经血路腹膜转移或腹膜直接种植生长所致，多继发于腹腔内大网膜、肝、结肠等器官的的恶性肿瘤，转移性腹膜肿瘤主要发病部位是腹腔内器官，腹腔内游离癌细胞和残余微小病灶的存在，是腹腔内恶性肿瘤术后复发和腹膜转移的关键因素，极易种植于手术解剖损伤的腹膜表面、裸露的间皮下结缔组织上，从而引起术后局部复发和转移病人。此阶段的患者病情发展快、预后差，临床治疗难度大，多需采用联合治疗措施，更需要早发现，及时监测，尽可能早治疗。

目前，已有报道利用动物模型模拟疾病进展，通过质谱鉴定尿液蛋白寻找早期疾病标志物，包括肾小球疾病^[6]、梗阻性肾病^[7]、肺纤维化^[8]、肝纤维化^[9]、多发性硬化^[10]、心肌炎^[11]、胰腺炎^[12]、以及皮下肿瘤^[13]和脑胶质瘤^[14]等疾病，这些研究通过尿液蛋白质组的方法寻找疾病早期的潜在生物标志物。

因此，在早期用非侵入性的方法寻找的生物标志物对于卵巢癌腹腔转移的早期诊断、病程监测和预后有重要意义。

发明内容

鉴于在本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方案提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断受试者的卵巢癌腹腔移植瘤的试剂中的用途：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、补体C3、Igγ-2A链C区、前列腺素-H2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、神经元膜糖蛋白M6、及其任意组合。

在具体的实施方案中，卵巢癌腹腔移植瘤是指卵巢癌细胞经血路腹膜转移或腹膜直接种植生长所致，继发于腹腔内各器官的恶性肿瘤。

在一些具体的实施方案中，所述诊断是指受试者的卵巢癌腹腔移植瘤的早期诊断，所述蛋白选自：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、及其任意组合。

在具体的实施方案中，卵巢癌转移性腹膜瘤的早期是指卵巢癌细胞腹腔注射后或原位卵巢癌细胞转移至腹腔后，腹腔器官病理均未发现转移，对应临床上卵巢癌分型的Ⅱ期，认为是卵巢癌转移性腹膜瘤的早期。

在一个具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在卵巢癌腹腔移植瘤的早期损伤：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、及其组合。

在一个具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在卵巢癌腹腔移植瘤的早期损伤：血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白，10kDa热休克蛋白、及其组合。

在具体的实施方案中，健康对照是指未患有卵巢癌腹腔移植瘤的个体。

在另一些实施方案中，所述诊断是指受试者的卵巢癌腹腔移植瘤的进展中期的诊断或监测，所述蛋白选自：45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、血浆蛋白酶C1抑制剂、补体C3、触珠蛋白、及任意其组合。

在具体的实施方案中，卵巢癌腹腔移植瘤的中期是指卵巢癌细胞腹腔注射后或原位卵巢癌细胞转移至腹腔后，部分器官大网膜发现转移，未见腹水产生，认为是卵巢癌转移性腹膜瘤的中期。对应临床上卵巢癌分型的Ⅲ期。

在一个具体的实施方案中，对受试者进行取样，和健康对照中的蛋白水平相比较，根据患者尿液中蛋白标志物的变化情况来判断患者卵巢癌腹腔移植瘤的病程进展阶段。

在一个具体的实施方案中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者卵巢癌腹腔移植瘤处于肿瘤进展中期：45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、及其组合。

在具体的实施方案中，相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者卵巢癌腹腔移植瘤处于肿瘤进展中期：锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、血浆蛋白酶C1抑制剂、补体C3、触珠蛋白、及其组合。

在另一些实施方案中，所述诊断是指受试者的卵巢癌腹腔移植瘤的晚期的诊断或监测，所述蛋白选自：Igγ-1链C区、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、谷胱甘肽S-转移酶P、三肽基肽酶1、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、核连蛋白-1、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、前纤维蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、钙结合蛋白、腺苷脱氨酶、神经元膜糖蛋白M6、吡哆醛激酶、及其任意组合。

在具体的实施方案中，卵巢癌腹腔移植瘤的晚期是指卵巢癌细胞腹腔注射后或原位卵巢癌细胞转移至腹腔后，各个腹腔器官病理上均发现转移，有血性腹水产生，认为是卵巢癌转移性腹膜瘤的晚期。对应临床上卵巢癌分型的VI期。

在本说明书中，提及的卵巢癌分型的Ⅱ期、Ⅲ期、VI期等参照国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obestetrics,FIGO)2013年《FIGO2013卵巢癌、输卵管、腹膜癌分期》。

在具体的实施方案中，对受试者进行取样，和健康对照中的蛋白水平相比较，根据患者尿液中蛋白标志物的变化情况来判断患者是否处于卵巢癌腹腔移植瘤的肿瘤晚期。

在具体的实施方案中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于肿瘤晚期阶段：Igγ-1链C区、Igγ-2A链C区、前列腺素-H2D-异构酶、及其组合。

和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于肿瘤晚期阶段：丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、谷胱甘肽S-转移酶P、三肽基肽酶1、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、核连蛋白-1、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、前纤维蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、钙结合蛋白、腺苷脱氨酶、神经元膜糖蛋白M6、吡哆醛激酶、及其组合。

在具体的实施方案中，适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。

在具体的实施方案中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。

在具体的实施方案中，所述蛋白是通过筛选卵巢癌腹腔移植瘤相关的尿蛋白标记物的动物模型所获得的。在任选的实施方案中，所述动物模型由腹腔注射卵巢癌细胞获得的患有卵巢癌腹腔移植瘤的大鼠模型所制备。在具体的实施方案中，所述卵巢癌细胞是NuTu-19大鼠上皮性卵巢癌细胞。其中，NuTu-19细胞来源于同种Fischer344大鼠的卵巢上皮癌细胞系,针对模拟的是临床上常年的上皮性卵巢癌，而腹腔注射NuTu-19细胞到同种Fischer344大鼠模拟上皮性卵巢癌腹腔移植瘤的发生过程。

在本公开中，所述卵巢癌按组织类型分类是上皮性卵巢癌。具体地，上皮性卵巢癌包括：浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样癌、透明细胞癌、未分化癌、转移性细胞肿瘤、混合上皮肿瘤和未分类上皮性肿瘤。因此，本公开中，卵巢癌腹腔移植瘤为上皮性卵巢癌的转移性腹膜肿瘤，或称为上皮性卵巢癌的腹腔移植瘤。

在具体的实施方案中，表达水平选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。

在具体的实施方案中，表达水平是在尿液样本中测定的。

在具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。

另一方面，本发明还提供了一种用于诊断卵巢癌腹腔移植瘤的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、补体C3、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、神经元膜糖蛋白M6、及其组合。

在一些实施方案中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。在另一些实施方案中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。在一些实施方案中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。

在具体的实施方案中，提供了一种卵巢癌腹腔移植瘤早期诊断的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、RabGDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、及其组合。

在另一些具体的实施方案中，提供了一种用于受试者卵巢癌腹腔移植瘤的肿瘤中期诊断和监测的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、血浆蛋白酶C1抑制剂、补体C3、触珠蛋白、及其组合。

在另一些具体的实施方案中，提供了一种用于诊断或监测受试者卵巢癌腹腔移植瘤的肿瘤晚期的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：Igγ-1链C区、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、谷胱甘肽S-转移酶P、三肽基肽酶1、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、核连蛋白-1、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、前纤维蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、钙结合蛋白、腺苷脱氨酶、神经元膜糖蛋白M6、吡哆醛激酶、及其组合。

根据一些实施方案，提供了一种用于诊断受试者中卵巢癌腹腔移植瘤的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，

3)确定所述受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、补体C3、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、神经元膜糖蛋白M6、及其组合，

4)将受试者中所述蛋白的表达水平和健康对照中所述蛋白的表达水平进行比较，

5)确定所述受试者是否患有卵巢癌腹腔移植瘤。

在具体的实施方案中，使用质谱方法、ELISA方法、Western方法确定表达水平。

当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方案中，用蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。

根据一些实施方案，提供了一种用于早期诊断受试者中卵巢癌腹腔移植瘤的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、RabGDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、及其组合，

3)将受试者中所述蛋白的表达水平和健康对照中所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者是否具有卵巢癌腹腔移植瘤的早期损伤。

在具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在卵巢癌腹腔移植瘤的早期损伤：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、及其组合。

在具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在卵巢癌的早期损伤：血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、及其组合。

根据一些实施方案，提供了一种用于诊断或监测受试者中卵巢癌腹腔移植瘤的肿瘤进展中期的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、血浆蛋白酶C1抑制剂、补体C3、触珠蛋白、及其组合，

3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者的卵巢癌腹腔移植瘤是否处于中期阶段。

在具体的实施方案中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于卵巢癌中期阶段：45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、及其组合。

在具体的实施方案中，相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于卵巢癌中期阶段：单锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、血浆蛋白酶C1抑制剂、补体C3、触珠蛋白、及其组合。

根据一些实施方案，提供了一种用于诊断或监测受试者卵巢癌腹腔移植瘤晚期的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：Igγ-1链C区、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、谷胱甘肽S-转移酶P、三肽基肽酶1、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、核连蛋白-1、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、前纤维蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、钙结合蛋白、腺苷脱氨酶、神经元膜糖蛋白M6、吡哆醛激酶、及其组合，

3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者的是否处于肿瘤晚期状态。

在具体的实施方案中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于肿瘤晚期状态：Igγ-1链C区、Igγ-2A链C区、前列腺素-H2D-异构酶、及其组合。

和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于肿瘤晚期状态：Igγ-1链C区、Igγ-2A链C区、前列腺素-H2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、谷胱甘肽S-转移酶P、三肽基肽酶1、己酮糖激酶，L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、核连蛋白-1、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、前纤维蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、钙结合蛋白、腺苷脱氨酶、神经元膜糖蛋白M6、吡哆醛激酶、及其组合。

附图说明

图1：卵巢癌腹腔移植瘤模型实验组大鼠和假手术对照组大鼠体重监测结果。●代表对照组；■代表实验组。*表示p<0.05。

图2：卵巢癌腹腔移植瘤模型对照组大鼠6周时腹腔器官解剖图(左)和实验组大鼠腹腔注射后6周腹腔血性腹水图(右)。

图3A-1至图3E-5分别代表卵巢癌造模双侧卵巢、大网膜、膈肌、小肠、肝等肿瘤组织HE染色放大倍数为40×的病理结果，其中

图3A-1至图3A-5分别代表卵巢癌实验大鼠大网膜组织的对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果；

图3B-1至图3B-5分别代表卵巢癌实验大鼠双侧卵巢的对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果；

图3C-1至图3C-5分别代表卵巢癌实验大鼠膈膜对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果；

图3D-1至图3D-5分别代表卵巢癌实验大鼠小肠对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果；

图3E-1至图3E-5分别代表卵巢癌实验大鼠肝组织对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。

实施例

实施例1.肿瘤动物模型的建立

1.Nutu-19大鼠卵巢癌细胞来源于同种Fischer344大鼠的卵巢上皮癌细胞系，组织学类型是临床最常见的上皮性卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌，其肿瘤生长方式、疾病进展过程亦与临床卵巢癌相似，均是盆腔、腹腔播散生长，以大量腹水、消瘦、远方转移而致死，符合临床的上皮性卵巢癌的诊断标准。

利用该Nutu-19大鼠卵巢癌细胞腹腔注射入Fischer344大鼠体内的动物模型，模拟卵巢癌腹腔移植瘤的发生转移过程，观察卵巢癌腹腔移植瘤从早期肿瘤、肿瘤进展及肿瘤晚期的整体变化，对临床上，术后早期诊断卵巢癌腹腔转移情况、监测卵巢癌腹腔移植瘤的病情进展重要的指导意义。

2.材料与试剂

1)仪器：

大鼠代谢笼：购自北京佳源兴业科技有限公司。Thermo orbitrap fusion lumos质谱仪：购自Thermo Fisher Scientific公司；Thermo EASY-Nlc1200高效液相色谱仪：购自Thermo Fisher Scientific公司；MillliQ RG超纯水系统：购自Millipore公司；C18反相分析柱(RP柱,0.1×150mm,3μm,)：购自Michrom Bioresources公司。

2)主要试剂：

去离子水来源于MillliQ RG超纯水系统；色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Fisher公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Merck公司购买；测序级胰酶从Sigma公司购买。

3)动物：

雌性Fischer344大鼠(体重110-120g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在标准饲养环境中饲养。

3.实验方法

1)肿瘤细胞的传代：将冻存的Nutu-19卵巢癌细胞(购自上海美轩生物科技公司)在37℃快速复苏后，进行体外贴壁培养，按照1：3传代比进行传代培养、经过2周扩大培养后收集卵巢癌细胞。

2)肿瘤的接种：模型组用无菌生理盐水将体外培养的肿瘤细胞5×10⁶个/ml，将0.5ml肿瘤细胞悬液通过一次性注射器注射到大鼠腹腔中。对照组在大鼠注射0.5ml生理盐水。

3)样本收集流程：在造模之前，将大鼠置于代谢笼中收集正常尿液，在造模之后分别于第3、7、14、28、42天将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。同时每次收尿前测量造模后模型组大鼠和正常大鼠的体重。

4)指标检测：

体重监测：每天测量造模后模型组大鼠和对照组大鼠的体重。

组织病理学：在造模第7、14、28、42天，本实施例中的部分大鼠安乐死并取大鼠双侧卵巢、大网膜、膈膜、小肠、肝等组织。将组织从每个动物中取出，并在4℃下在4％甲醛通过浸入固定，切片，后用H&E染色观察各组织发生的病理变化。

测试例

测试例1.组织病理学检查

在大鼠肿瘤造模42天，将实施例1中的大鼠安乐死并取大鼠皮下肿瘤组织用福尔马林固定，蜡块包埋后进行HE染色。

测试例2.蛋白质分析

1.尿蛋白提取与保存：各时段尿液于4℃以2000g离心20分钟，取上清，置于新EP管内，继续在4℃以12000g离心20分钟；取上清，-80℃保存。

2.乙醇沉淀尿液蛋白，用Bradford法测蛋白浓度后进行膜上酶切，参见Wisniewski JR,Zougman A,Nagaraj N,Mann M.Universal sample preparation methodfor proteome analysis.Nature methods 2009；6:359-62。BCA法测量多肽浓度。

3.LC-MS/MS串联质谱分析：

将多肽样本用0.1％甲酸稀释成0.5μg/μl。多肽样本通过Thermo液相系统EASY-nLC 1200上样系统分离。洗脱时间90分钟，色谱柱流速为0.3μl/min。洗脱梯度为5％至40％流动相B(流动相A为：0.1％甲酸；流动相B为：89.9％乙腈)。洗脱下的肽段使用ThermoOrbitrap Lumos质谱仪进行分析。采用阳离子模式，母离子和子离子的分辨率为120000。

4.数据库检索：

所有质谱结果用mascot软件进行数据库检索。所用数据库为Swissprot_rat。检索条件为：胰酶酶切；允许有2个漏切位点；半胱氨酸+57Da的固定修饰；质谱数据检索容许误差为：母离子0.05Da，子离子0.05Da。

5.蛋白相对定量：

所有质谱结果通过初级LC-MS/MS软件进行相对定量结果分析。软件操作根据文献中所示方法使用(参见Hauck SM,Dietter J,Kramer RL等人.Deciphering membrane-associated molecular processes in target tissue of autoimmune uveitis bylabel-free quantitative mass spectrometry.Molecular&cellular proteomics:MCP2010；9:2292-305)。

6.统计分析：

将不同时间点的蛋白组数据进行统计分析，筛选出于造模前0天相比谱图数变化倍数在1.5倍以上或0.67倍以下，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白。

实验结果

1.体重变化：

如图1所示，与对照组相比，从第28天起模型实验组的体重上升但实验组与对照组体重有明显的统计学差异。

2.病理检测结果：

如图3A-1至图3E-5，HE染色结果显示：对照组，显示正常的组织结构(图3A-1、图3B-1、图3C-1、图3D-1和图3E-1)；Nutu-19卵巢癌细胞腹腔移植瘤的大鼠模型实验组，造模后第7天，各腹腔器官未发现肿瘤的侵袭，第14天大网膜开始出现略微有肿瘤侵袭，第28天大网膜进一步侵袭，在双侧卵巢和膈膜的开始有肿瘤侵袭，说明处于卵巢癌进展中期。第42天双侧卵巢发现癌细胞，大网膜、膈膜、双侧卵巢侵袭严重，小肠、肝发生癌细胞的转移，说明是处于卵巢癌晚期。病理显示肿瘤细胞排列混乱，大小形态不一，核大深染，异型性明显，可见核分裂像，胞质异常。组织类型是低分化浆液性乳头状囊腺癌上皮性卵巢癌。说明肿瘤模型造模成功(图3A-1至图3E-5)。

3.蛋白鉴定结果：

对照组和Nutu-19卵巢癌腹腔移植瘤模型实验组大鼠(n＝4)的尿液经过质谱鉴定5个时间点(0天、3天、7天、14天和42天)，分别进行2次技术重复。在FDR(假阳性筛查)小于1％的水平，基于两肽以上鉴定的蛋白为516个。

与0天蛋白定量的显示谱图数进行比对，筛选出其他时间点变化倍数在1.5倍以上或0.67倍以下，p值小于0.05的差异蛋白，同时使用Uniprot数据库将大鼠蛋白转化为相应的人同源蛋白。

与对照组的相比，卵巢癌腹腔移植瘤大鼠模型3天组尿中的大鼠差异蛋白为19个、卵巢癌腹腔移植瘤大鼠模型7天组尿中的大鼠差异蛋白为22个、卵巢癌腹腔移植瘤大鼠模型14天组尿中的大鼠差异蛋白为11个、卵巢癌腹腔移植瘤大鼠模型42天组尿中的大鼠差异蛋白为37个。

将不同时间点的卵巢癌腹腔移植瘤动物模型模型与对照组大鼠尿蛋白进行比较，经过ANOVA统计学分析以及变化倍数筛选，可靠的差异蛋白人同源的有76个，分别为：细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、补体C3、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、神经元膜糖蛋白M6。

相较于对照，卵巢癌腹腔移植瘤模型实验组中表达水平提高的尿蛋白共22个，分别为细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶。

相较于对照，卵巢癌腹腔移植瘤模型实验组中表达水平降低的尿蛋白的54个，分别为血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、补体C3、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、神经元膜糖蛋白M6。

由于在建模后第3天，卵巢癌腹腔移植瘤实验模型组和对照组大鼠病理检测，与对照组相比，其他组织的未出现侵袭。第7天，卵巢癌腹腔移植瘤实验模型组和对照组大鼠病理检测，腹腔器官未见肿瘤侵袭，病理显示处于卵巢癌早期，因此，在卵巢癌腹腔移植瘤实验模型组早期(造模3天和7天)筛选出差异蛋白38个(表1)，这些蛋白可以作为卵巢癌腹腔移植性瘤早期诊断的生物标志物，转化为人同源蛋白后，在具体的实施方案中，细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、RabGDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白表达量降低。

表1.卵巢癌腹腔移植瘤早期的尿液蛋白标志物

由于在建模后第14天时，卵巢癌腹腔移植瘤动物模型组相比对照组大鼠病理HE染色显示，大网膜出现癌细胞侵袭，大网膜是免疫细胞集结地方，靠近腹膜，比盆腔器官如子宫更容易发生转移，认为它发生转移，是腹腔移植性肿瘤的中期。同时，也符合修订的2013版中Ⅲ期中部分腹膜转移。因此，对第14天的卵巢癌腹腔移植瘤动物模型组被鉴定到质谱差异蛋白进行汇总，可以用于指示卵巢癌腹腔移植瘤的肿瘤进展中期(表2)。

表2.卵巢癌腹腔移植瘤中期的尿液蛋白标志物

由于在建模后第42天时，卵巢癌腹腔移植瘤动物模型组相比对照组大鼠病理HE染色显示；、大网膜侵袭进一步严重、双侧卵巢、膈膜、肝，肠出现侵袭转移。属于卵巢癌晚期，因此，对第42天的卵巢癌腹腔移植瘤动物模型组被鉴定到质谱差异蛋白进行汇总，可以用于指示卵巢癌腹腔移植瘤的肿瘤进展晚期，这一阶段特异出现的差异蛋白作为卵巢癌腹腔移植瘤晚期的诊断标记物(表3)。

表3.卵巢癌腹腔移植瘤晚期的蛋白标志物

参考文献：

1.Youhe G.Can urine be the gold mine for biomarker discovery？SciChina Life Sci 2013；43.

2.Zhao,M et al.A comprehensive analysis and annotation of humannormal urinary proteome[J].Scientific Reports,2017,7(1):3024.

3.Siegel,R.L.,K.D.Miller and A.Jemal.2017.Cancer statistics,2017.CACancer J.

4.Jacobs I J,Menon U,Ryan A，et al.，Ovarian cancer screening andmortality in the UK Collaborative Trial of Ovarian Cancer Screening(UKCTOCS):a randomised controlled trial[J].Lancet,2016,387(10022):945-956.)

5.Sandow J J,Rainczuk A,Infusini G,et al.,Discovery and Validation ofNovel Protein Biomarkers in Ovarian Cancer Patient Urine[J].PROTEOMICS-Clinical Applications,2018:1700135.

6.Wang Y,Chen Y,Zhang Y,et al.Differential ConA-enriched urinaryproteome in rat experimental glomerular diseases[J].Biochem Biophys ResCommun,2008,371(3):385-90.

7.Wang Y,Chen Y,Zhang Y,et al.Differential ConA-enriched urinaryproteome in rat experimental glomerular diseases[J].Biochem Biophys ResCommun,2008,371(3):385-90.

8.Wu J,Li X,Zhao M,et al.Early Detection of Urinary ProteomeBiomarkers for Effective Early Treatment of Pulmonary Fibrosis in a Rat Model[J].Proteomics Clin Appl,2017,11(11-12).

9.Zhang F,Ni Y,Yuan Y,et al.Urinary proteome changes were detectedearlier than serum biochemical parameters and histopathology changes in a ratthioacetamide-induced hepatic fibrosis model[J].The FASEB Journal,2017,31(1Supplement):908.17-908.17.

10.Zhao M,Wu J,Li X,et al.Early urinary candidate biomarkers in a ratmodel of experimental autoimmune encephalomyelitis[J].bioRxiv,2017:205294.

11.Zhao M,Wu J,Li X,et al.Urinary candidate biomarkers in anexperimental autoimmune myocarditis rat model[J].J Proteomics,2018.

12.Zhang Linpei,Li Yuqiu and Gao Youhe.Early changes in the urineproteome in a diethyldithiocarbamate-induced chronic pancreatitis rat model.[J]JProteomics.2018Aug30；186:8-14.doi:10.1016/j.jprot.2018.07.015.Epub2018Jul 22.

13.Wu J,Guo Z,Gao Y.Dynamic changes of urine proteome in a Walker256tumor-bearing rat model[J].Cancer Med,2017,6(11):2713-2722.

14.Ni Y,Zhang F,An M,et al.Early candidate biomarkers found fromurine of glioblastoma multiforme rat before changes in MRI[J].Sci China LifeSci,2018.

Claims (10)

1.选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断受试者的卵巢癌腹腔移植瘤的试剂中的用途：

细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、补体C3、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、神经元膜糖蛋白M6、及其组合。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述诊断是指受试者的卵巢癌腹腔移植瘤的早期诊断，所述蛋白选自：

细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、及其组合。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述诊断是指受试者的卵巢癌腹腔移植瘤的进展中期的诊断或监测，所述蛋白选自：

45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、血浆蛋白酶C1抑制剂、补体C3、触珠蛋白、及其组合。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述诊断是指受试者的卵巢癌腹腔移植瘤的晚期的诊断或监测，所述蛋白选自：

Igγ-1链C区、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、谷胱甘肽S-转移酶P、三肽基肽酶1、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、核连蛋白-1、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、前纤维蛋白-1、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、钙结合蛋白、腺苷脱氨酶、神经元膜糖蛋白M6、吡哆醛激酶、及其组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中所述蛋白是通过筛选卵巢癌腹腔移植瘤相关的尿蛋白标记物的动物模型所获得的，

任选地，所述动物模型由腹腔注射卵巢癌细胞获得的患有卵巢癌腹腔移植瘤的大鼠模型所制备；

任选地，所述卵巢癌细胞是NuTu-19卵巢癌细胞。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述卵巢癌腹腔移植瘤是上皮性卵巢癌的腹腔移植瘤。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段，

优选地，所述抗体是单克隆抗体。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，通过所述鉴定试剂，在所述受试者的尿液样本中测定的所述蛋白的表达水平，

任选地，所述表达水平是核酸表达水平或蛋白表达水平。

10.一种用于诊断卵巢癌腹腔移植瘤的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂：

细胞粘附分子4、酒精脱氢酶1、N(G)，N(G)-二甲基精氨酸酶1、甲硫醇氧化酶、磷酸三酯酶相关蛋白、Rab GDP解离抑制剂β、溶质载体家族23名成员1、中性神经酰胺酶、精氨琥珀酸合酶、醌氧化还原酶、溶质载体家族22名成员7、Na(+)/H(+)交换调节辅因子NHE-RF3、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、血浆蛋白酶C1抑制剂、白血病抑制因子受体、谷胱甘肽S-转移酶P、朊病毒蛋白、白细胞介素-1受体2型、巢蛋白、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、组织蛋白酶H前体、血管紧张素转换酶、脂蛋白脂肪酶、吡哆醛激酶、CD276抗原、膜联蛋白A5、核连蛋白-1、细胞间粘附分子1、心房钠尿肽转换酶、腺苷脱氨酶、C-反应蛋白、白细胞介素-1受体辅助蛋白、触珠蛋白、三肽基肽酶1、角蛋白、钙结合蛋白、10kDa热休克蛋白、45kDa钙结合蛋白、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、Igγ-1链C区、氨基酰化酶-1A、磷酸丙糖异构酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、锌-α-2-糖蛋白、前纤维蛋白-1、补体C3、Igγ-2A链C区、前列腺素-H 2D-异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3L、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3K、二肽基肽酶1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、Na(+)/H(+)交换调节辅因子、己酮糖激酶、L-乳酸脱氢酶A链、苹果酸脱氢酶、Xaa-Pro氨肽酶2、胰岛素样生长因子结合蛋白3、β-氨基己糖苷酶亚基β、膜联蛋白A2、胰岛素样生长因子结合蛋白5、斯钙素1、Rho GDP解离抑制剂1、柯萨奇病毒和腺病毒受体同源物、a-烯醇化酶、血小板衍生生长因子受体α、β-甘露糖苷酶、酪氨酸蛋白激酶、果糖-1,6-二磷酸酶1、酒精脱氢酶[NADP(+)]、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、高尔基体蛋白1、蛋白质/核酸糖酶DJ-1、神经元膜糖蛋白M6、及其组合。