CN102516390B - 一种多表位tk1抗体的制备及其在评估肿瘤患者治疗效果中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种人宫颈癌细胞TK1单体N端23肽、C端20肽和C端28肽组成的抗原决定簇制备的一种高特异性、高灵敏度的配位组合抗人TK1抗体以及其在肿瘤诊断中的应用。抗原决定簇所包含的氨基酸序列为：N端23肽(3-25)：CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL、C端20肽(206-225)：CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ、C端28肽(198-225)：AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。本发明同时提供了应用该抗原制备抗体的方法，所提供的抗体试剂盒具有灵敏度高，特异性高，成本低廉等特点，通过增强化学发光点印迹检测法和免疫组化检测及检测试剂盒对治疗中的肿瘤患者的治疗效果进行评估。
Description
技术领域：
本发明涉及一种抗体及其应用，具体讲涉及一种高特异性、高灵敏度多表位TK1抗体的制备及其在肿瘤患者治疗效果的评估中的应用。
背景技术：
癌症是人类的死亡杀手，尽管有许多影像检测方法和治疗手段，例如化学治疗，内分泌治疗，放射治疗和手术等，虽然已经有了很大的进步，但远远不可能达到完美的程度，伴有复发和转移的可能。
癌症是一种细胞异常增殖的慢性疾病。癌细胞异常和失控的增殖是由于正常细胞中与增殖相关的基因发生了某种或多种突变所引起，因而准确了解肿瘤细胞增殖变化规律是评价和分析肿瘤发展方向，判断治疗效果和制定患者个体化治疗方案的重要参数，但是准确检测和动态分析肿瘤患者体内肿瘤细胞的增殖动力却是当前肿瘤治疗阶段亟待解决的难题。肿瘤的治疗手段主要是通过手术切除/杀伤治疗/抑制治疗等方法控制肿瘤组织的浸润和转移，例如手术治疗、放射线治疗、化学药物治疗、内分泌治疗等方法都有清除/杀伤/干预肿瘤细胞的作用，但达不到完美的程度，需要与癌症中细胞的增殖度来联合评估治疗效果，如DNA流式细胞分析，因设备昂贵，技术操作要求高，不能动态分析等缺陷不能实现临床普及应用。临床上缺乏一种能直接检测肿瘤细胞增殖状况，并能与手术切除/杀伤治疗/抑制治疗等方法同步评估肿瘤细胞增殖的直接指标和方法。现阶段应用影像，超声和肿瘤标志物检测和评估的方法均存在分析滞后和间接判断的问题。
对于现有许多肿瘤标志物进行回顾研究，例如CEA，CA15-3，CA199和AFP等一系列标志物，由于这类标志物不能直接反应肿瘤细胞的增殖，虽然可以监视治疗效果，但它们通常是不可能用单独一种肿瘤标志物的水平来检测和诊断癌症，不能准确评价肿瘤治疗过程中肿瘤细胞增殖变化的状态。
二十世纪五十年代末，研究者发现胸苷激酶(TK，ATP：thymidine 5′-phosphotransferase，EC.2.7.1.21，简称TK)，一种嘧啶补救途径的酶，催化胸苷磷酸化为胸苷酸。人细胞中TK以两种同功酶的形式出现：细胞质胸苷激酶(简称TK1)和线粒体胸苷激酶(简称TK2)。胸苷激酶1(简称TK1，也称为细胞质胸苷激酶)是与细胞周期调控密切相关的细胞周期类标志物，随后的大量基础研究和实验肿瘤学证明了TK1表达是与细胞生长状态紧密联系的，因此TK1可以作为一种好的细胞增殖标志物来检测增殖细胞的增殖活性，因此将适用恶性肿瘤的增殖度检测。
对血清胸苷激酶1值(STK1)进行分析，重要的是，体内正常细胞增殖不会导致血清胸苷激酶1水平的增加，因为正常的细胞分裂是按照细胞凋亡调控规律进行的，细胞内胸苷激酶1在细胞分裂之前已经被降解，但肿瘤细胞是逃逸了细胞凋亡的调控规律，导致细胞异常分裂增殖，肿瘤细胞(包括S和G2期的细胞)中的胸苷激酶1被释放至体液。因此，在细胞过度增生的情况下，STK1水平与肿瘤细胞增殖速度相关，并与肿瘤疾病的轻重程度和治疗效果有关，可用于患者的治疗监视。由于在总的STK中，STK1高于95％，TK2低于5％，一种STK的活性检测同样用于血清学，作为一优选的肿瘤细胞增殖标志物，与STK1增强发光免疫点印迹法检测相比现用非同位素STK的活性检测程序，还是比较繁琐和耗时。
采用人TK1抗体检测STK1浓度水平更能真实代表体内是否存在异常增殖的细胞，因此，在近10多年里，按照抗体制备原理，一种TK1抗体已经试用于临床实践中。多个团队制备了不同的抗TK1抗体用于肿瘤疾病的鉴定和监控，但灵敏度需要提高，也并不适用于常规人群体检筛查。
在这基础上，我们于2002年进一步筛选研究，选择了暴露在TK1蛋白质的表面的抗原决定簇C端部分的这一关键免疫序列31肽(195-225)制备了抗人TK1-IgY抗体(中国发明专利号WO204100760A1，国际专利号W O 204100760A1.25/11-2004)。采用人TK1的C端31肽制备抗人TK1-IgY抗体及利用其制备的血清免疫学和组织免疫学的肿瘤检测试剂盒，这抗体将同时检测有活性的TK1蛋白和非活性的TK1蛋白，也能检测TK1蛋白质与其他的分子形成的复合物。尽管这血清试剂盒-增强发光免疫点印迹法检测系统试用于体检筛查中，检测范围在0.3-2pM之间，但检测范围在0.1-1pM时，误差有时会大于30％，采用人群常规体检STK1和癌症患者STK1进行ROC值分析，ROC值曲线下面积为0.96，特异性为0.991，最大似然法比例(+)为56.04，证明抗体的特异性很好，可以用于人群体检筛查，但灵敏度在0.51％，需进一步制备检测灵敏度高、特异性和稳定性好的抗体来完善检测系统，以便更好的提高在0.1-1pM范围内的检测精度，为肿瘤患者的治疗效果监视提供更为真实的动力学分析数据，评估治疗效果。
发明内容：
在采用人宫颈癌细胞的TK1上C端31肽(195-225)作为抗原的基础上，经多年实践，筛选出了暴露在TK1蛋白表面的多点位特别抗原决定族，包括N端部分的关键性免疫多肽序列23肽，C端20肽和C端部分的关键免疫序列28肽，应用上述关键免疫序列做特别抗原，采用母鸡免疫最终纯化并组合制备了抗人TK1-IgY抗体。与现有的国际商用抗TK1-IgG抗体相比，所制备的抗体具有纯度高(＞99％)、产量高、高灵敏度、高特异性且无非特异性免疫交叉反应，并可于+4-8度冰箱保存一年以上且活性稳定，便于商业运输、保存和操作等优点。
本发明的抗人TK1多表位抗体和TK1检测系统，能真实的反映细胞的增殖度，治疗前后的TK1的高低变化与肿瘤细胞的增殖进度，因而能在早于影像学检测的情况下，对治疗中的肿瘤患者的治疗效果进行评估，医生将有可能使用不同的治疗方案或制定更有效的治疗方案，增加治疗的成功机率，延长患者的生存和生活质量，同样可避免没有成效和不必要的治疗。
本发明提供的技术方案包括：
1、设计和筛选抗原
选择暴露的蛋白表面上N、C端的肽段。
2、制备抗体
利用上述关键免疫序列与KLH交联组成23肽-KLH，20肽-KLH，28肽-KLH的抗原分别去免疫母鸡制得。而利用母鸡免疫的优点在于：(1)鸡的IgY和人的IgG之间存在分子遗传差异性；(2)鸡的TK1和人的TK1有种族差异性；(3)与传统的兔免疫制备的多克隆抗体比较，IgY具有内源分子均一性(只产生一种类型的抗体分子，即IgY)；(4)IgY抗体不激活人补体系统，从而部分地阻断人血清中非特异抗原结合位点的激活；(5)类风湿因子(RF)不与IgY抗体反应。这种RF是许多免疫测定中非特异反应的主要来源，因为RF与哺乳动物抗体IgG的Fc部分反应，可导致病人和健康人血清的假阳性；(6)现在大多数乳腺癌患者，需要辅助治疗，许多患者接受化疗，例如：赫赛仃、靶向治疗药、单克隆抗体，以后也还需抗激素治疗，特别是抗体治疗情况下，TK1-IgY抗体显示出比单抗体检测更具有优势。
3、纯化抗体
利用所述N端23肽，C端20肽，C端28肽序列分别与KLH交联，分别免疫母鸡，提取卵黄液体，采用水萃取制备抗体溶液，分别用本发明中的抗原决定簇制备的亲和层析柱来纯化抗体。
所述纯化包括下述步骤：
第一步，初筛出免疫母鸡生产出的抗体是否具有高特异性和高灵敏度，即对每个免疫母鸡的卵黄液体进行分离，采用水萃取后得到抗体粗品，经亲和层析纯化得到初筛的高特异性和高灵敏度的抗人TK1抗体。根据免疫抗原的类型对亲和柱进行选择，混合后的粗品液是来源于23肽-KLH，20肽-KLH，28肽-KLH的抗原免疫的抗TK1-IgY抗体，亲和柱制备必须为N端23肽，C端20肽和C端28肽的亲和柱。
第二步，制备组合免疫抗原的亲和柱，对初筛出的3种抗体进行组合的配比测试，其特征在于组合抗原亲和柱配比选择。制备亲和柱要求按照所选择的3种抗体的混合比例，计算出相对应的抗原决定簇，即23肽，20肽和28肽量的百分比。经亲和柱层析纯化测试后，选择最佳的配比组合方案。
4、多位点抗体组合制备抗人TK1-IgY抗体，除另有说明外，本申请中的百分比为质量百分比。
配比范围：23肽免疫的单一抗体占30％～50％，20肽免疫的单一抗体占25％～40％，28肽免疫的单一抗体占20％～30％。
5、鉴定抗人TK1-IgY抗体的灵敏度和特异性
1)确认制备抗体是否仅与人的TK1有特异性反应，第一步采用TK1阳性和阴性细胞株，西部印染法来鉴定抗体的特异性：利用淋巴瘤阳性株CEM TK1+和阴性株CEM TK1-来鉴定。经天然胶电泳后进行TK1抗体西部免疫印染，CEM TK1阳性株有一条明显的TK1电泳带，CEM TK1阴性株没有显现任何带。确认抗体的是仅与TK1酶有免疫反应，是特异性抗体。
2)确认制备抗体是否仅与肿瘤患者的血清TK1有特异性反应，第二步采用选择已确认为健康无疾病者的血清和肿瘤患者阳性值的血清标本，用增强发光免疫点印迹方法检测，肿瘤患者阳性值的血清标本应显示不同程度的阳性值，健康者应该低于检测阈值2pM或不显示免疫反应。确认了抗体与健康无疾病人的血清无免疫交叉反应，是特异性抗体，并比较肿瘤患者血清中STK1的强度反应，对初筛出的不同抗体进行鉴定，筛选出灵敏度高和特异性好的抗体。
3)确认制备抗体是否仅与肿瘤患者血清中TK1有特异性反应，从2)步中筛选出灵敏度高和特异性好的抗体，采用初诊但未治疗肿瘤患者的血清和健康无疾病者的血清标本点样，进行天然胶电泳后，再用抗TK1抗体西部免疫印染，肿瘤患者的血清标本显示一条明显的TK1电泳带，健康无疾病者的血清标本没有显现任何带。确认抗体的是仅与肿瘤患者的血清TK1酶有免疫反应，是特异性抗体。
本发明是利用上述组合抗体在十万级的洁净环境下，将抗体进行分装，组装TK1免疫检测试剂盒，并与化学发光分析仪结合，通过反应治疗前后的TK1的高低变化，因而能在早于影像学检测的情况下，对治疗中的肿瘤患者的治疗效果进行评估，
临床肿瘤治疗患者，检测患者个体治疗前后的STK1水平，需要有多次的定期检测，取治疗前的样品和定期治疗后的样品进行分析，如是手术患者，则取治疗后1，3或者6个月到治疗后1年的样品进行分析；如化疗患者，可取治疗后2-3天，一个星期，一个疗程和多个疗程进行比较分析。医生将可能使用不同的治疗方案或改变治疗方案以增加治疗的成功机率。癌症患者的治疗效果评估是按照治疗前后的两者的STK1水平做比较，例如治疗前的STK1与1和3个月的STK1比较，如果STK1的水平降低，第3个月的STK1降低到正常人水平，评估为治疗有效：反之，治疗前的STK1与1和3个月的STK1比较，如果STK1的水平没有降低或在升高，如果第2次的STK1水平与治疗前STK1水平比例，超过2pM或不下降，评估为治疗效果不佳。这检测癌症患者STK水平，需要与与同年龄和同性别范围的健康正常人的TK1水平比较。采用这方法对患者进行定期检测，可以监控在整个治疗的1-5年中，以至十年中。因此，这发明给予医生治疗患者的早期信息。医生将有可能使用不同治疗方案，或改变治疗方案，增加治疗成功的机率，延长患者的生存和生活质量。采用这方法评估患者的STK1的水平，同样可能避免没有成效的治疗和不需要的治疗。
和现有技术比，本发明的优点如下：
(1)本发明所制备的抗体具有纯度高(＞99％)、产量高、高特异性无非特异性免疫交叉反应且检测精度在可达到0.1pM。受试者工作曲线，ROC曲线下面积值＝0.96(p＜0.0001)，最大似然法比例(+)明显升高为236.49，特异性高达0.997，灵敏度高达0.737。
(2)TK1多表位抗体和TK1检测系统，能真实的反映细胞的增殖度，治疗前后的STK1的高低变化与肿瘤细胞的增殖进度有关，因而能在早于影像学检测的情况下，对治疗中的肿瘤患者的治疗效果进行评估。
(3)稳定性好，可于+4-8度冰箱保存一年以上且活性稳定，更便于商业运输和保存并能降低试剂的潜在成本。
附图说明：
图1：ABmart抗体分析测试TK1蛋白图谱。
图2：(a)TK1抗体试剂盒点样结果图
(b)STK1点印迹实验分析软件测试TK1抗体试剂盒点样数据
(c)STK1点印迹实验分析软件测试TK1抗体试剂盒点样数据曲线图
图3：(a)为CEM TK1+和CEM TK1-的西部印染结果。
(b)为鉴定治疗前淋巴癌患者，治疗前/后的头颈癌患者，健康人血清的西部印染结果。
图4：CEM TK1+、CEM TK1-、宫颈内膜癌和结肠癌的TK1抗体染色结果
图5：生物素-TK1-IgY抗体(2步法)与三步法的比较图
图6：华瑞同康的抗TK1-IgY抗体与市售商用抗TK1-mAb抗体的实验比较图
图7：前列腺患者治疗前和治疗3-6个月的STK1水平的变化图
具体实施方式：本发明将通过以下实施例作进一步的描述：
具体实施方式：
用以下实施例对本发明作详细描述：
实施例1：选择特异性多表位抗原
如图1所示，用软件预测TK1无信号肽，无跨膜结构。图示单链TK1蛋白234氨基酸分布，指出氨基酸的亲疏水性氨基酸分布较均匀。图谱提供了可选方案：1)从抗原性角度考虑，在蓝色曲线峰值高的地方选择的多肽较好；2)按照亲水性氨基酸的分布，选择亲水区域；3)选择负值所示疏水性较强的芳香族氨基酸。
实例2：选择高灵敏度、高特异性多位点组合抗人TK1-IgY抗体的抗原
选择制备高灵敏度、高特异性多位点组合抗人TK1-IgY抗体的抗原的选择：由于人宫颈癌TK1的部分序列有与其它蛋白具有相同的表位，得到的抗体可能与其它非特异性蛋白有交叉反应，纯化困难，按照已公布公知的TK1序列(蛋白质文库)，选择暴露在蛋白质表面的特别肽，按照用软件预测得到的多肽的特异性程度大于85％的多肽片段列于下表，筛选的TK1特异性强的抗原片段，设计了TK1N端23肽，C端20肽和C端28肽作为半抗原。
实施例3：筛选特异性多表位抗原
特异性多表位抗原的选择：按照公知的TK1空间结构，选择暴露在TK1蛋白质的表面的抗原决定簇，按照实例2筛选TK1免疫性强的抗原片段，筛选TK1的N端23肽，C端20肽，和C端28肽是免疫性强的抗原片段，三段氨基酸序列分别如下(见序列表)：1)N端23肽(3-25)：CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL，2)C端20肽(206-225)：CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ，3)C端28肽(198-225)：AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。
实施例4：用母鸡免疫制备特异性多表位配位组合抗人TK1-IgY抗体
应用上述N端23肽，C端20肽，C端28肽序列做半抗原分别与KLH铰链，制备免疫抗原，利用该抗原制备灵敏度高、特异性好的抗人TK-IgY抗体新组合抗体。抗原用量：选择免疫性好健康的罗曼母鸡40只，用量为0.5毫克，KLH-N23肽，KLH-C20肽，KLH-C28肽，将上述免疫抗原用PBS缓冲液溶解再与福氏完全佐剂按1∶1混合，注射到产蛋母鸡的胸肌。经两次给鸡用福氏不完全佐剂与抗原混合液加强免疫，四周后每天收集鸡蛋，在4℃下储存。
实施例5：提取和纯化多位点组合抗体
抗体的粗品纯化过程如下：采用带网眼的漏斗将蛋黄与蛋白分离，完整的蛋黄用无离子水洗净后用摄子去蛋黄表皮，收集蛋黄液。用10倍体积的蒸馏水稀释蛋黄液，拌搅均匀后调pH值为5.0，在4℃下放置过夜。次日取出后调pH值至5.5，通过二次硫酸铵沉淀法，第一次按照1000ml溶液中加入硫酸铵固体351g，第2次按每1000ml加196g硫酸铵的比例，在10℃下冷冻离心，转速为4000转/分，时间为24分钟。弃去上清液，将沉淀蛋白用1∶4的无离子水稀释并用0.5mol/L的NaOH调节pH至8.0。采用G25柱脱除硫酸铵以后，混合的粗品溶液上制备好的亲和层析柱。
1)收集筛选出免疫效果好的母鸡生产的鸡蛋，将鸡蛋黄制备硫酸铵溶液，脱除硫酸铵以后，粗品TK1溶液混合上亲和层析柱。
2)制备亲和层析柱
选择亲和柱抗原的类型：混合后的粗品液来源于23肽-KLH+20肽-KLH+28肽-KLH的抗原免疫的抗TK1-IgY抗体，亲和柱制备为23肽+20肽+28肽混合亲和柱，制备亲和柱要求按照所选择的3种抗体混合比例，计算出相对应抗原用量，即23肽，20肽和28肽的量的百分比，将计算好的N端23肽，C端20肽和C端28肽的量交链接到亲和层析柱。
3)纯化抗体：于2-8℃下将混合粗品液加入亲和柱，5次循环，每ml亲和柱第1次过柱时的速度为0.2ml/min-0.25ml/min。循环后用亲和柱平衡溶液冲洗杂蛋白，经过3次以上的重复测试，UV均小于0.010时，停止冲洗；用1.5倍亲和柱体积的Actisep洗脱抗体，洗脱再用G25柱除去Actisep，将收集好的抗体混合，测混合后的UV值；及时调pH至8.0，加入保护试剂，保存抗体于+4-8度冰箱。
实例6：检测和鉴定TK1检测组装试剂盒
在十万级的洁净环境下，将抗体进行分装。如图2(a)，(b)，(c)所示，采用增强化学发光点印迹法对STK1进行标准化检测和鉴定，快速和简便，检验合格。
实施例7：筛选抗体的灵敏度和特异性
鉴定抗体的灵敏度和特异性。1)筛选灵敏度：选择初评合格的母鸡，用鸡蛋黄制备硫酸铵溶液，再用制备的亲和柱纯化抗体，得到纯度大于99％的TK1抗体，采用增强发光免疫点印迹方法，用TK1标准品(20，6.6，2.2pM)做标准曲线，选择已确认为健康者的血清和初诊未治疗肿瘤患者阳性值的血清标本，用增强发光免疫点印迹方法检测，肿瘤患者阳性值的血清标本应显示不同程度的阳性值，健康人应该低于检测阈值2pM或不显示免疫反应，对不与人TK1有反应，对健康人血清有非特异免疫交叉反应，或不与肿瘤患者血凊TK1反应的抗体，为不合格抗体，删除。
鉴定抗体的特异性
细胞培养：采用常规细胞培养方法，将实验所用的CEM TK+，CEM TK-细胞进行用含10％小牛血清的1640培养液培养，当培养瓶中细胞数长到20×106时，将收获的细胞用裂解缓冲液萃取细胞液(裂解缓冲液：10mM Tris-HCl，250mM蔗糖，160mM KCl，5.6mM NaF，3.8mM MgCl2，5.0mM ATP，0.2％NP-40，pH＝7.5)。20微克/10微升的CEM TK1阳性株和CEM TK1阴性株细胞提取液与等量的电泳缓冲液混合，天然胶电泳(4-10％梯度)，试剂盒和操作由供应商Invitrogen公司提供。进行TK1抗体西部免疫印染(半干电泳转移操作方法由Bio-Rad提供)。IgY TK1Ab(100,000X 1mg/ml)采用人血清标本，IgY TK1Ab浓度(100,000X1mg/ml)。如图3(a)为TK抗体西部印染结果，CEM TK1阳性株有TK1一条明显的电泳带，CEM TK1阴性株没有显现任何带。验证了抗体仅与人TK1有特异性反应。
图3(b)为西部印染法鉴定：其中的样品来源于1例治疗前淋巴癌患者，1例治疗前/后的头颈癌患者，1例健康人(无疾病)，经点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)鉴定，分别为44，20，0.5和0.1pM。2微升血清稀释为10微升与等量的电泳缓冲液混合，过天然胶电泳(4-10％梯度)后进行TK1抗体西部免疫印染。结果显示，治疗前淋巴癌患者与治疗前的头颈癌患者有一明显的电泳带，治疗后的头颈癌患者和健康人的血清TK1几乎不可以观察。验证抗体与人血清无非特异性免疫交叉反应。
实施例8：鉴定TK1抗体的特异性和灵敏度
石蜡包埋的厚为4μm切片标本，经脱蜡水化，将切片浸入标靶修复液。按照供应商(
System试剂盒)提供的操作步骤，进行组织化学染色。切片浸入3％H2O2溶液，10分钟以后灭活内源性酶，用封闭试剂处理30分钟，加入TK1抗体，并在室温下孵育2小时；用PBS溶液清洗切片；加EnVisiong复合物，并在室温下孵育40分钟；二氨基联苯胺显色并用苏木精对载玻片进行复染色。TK1阳性和阴性的人淋巴瘤CEM细胞采用丙酮固定法，其后的染色和操作步骤同前所述。评估各个切片的TK1表达，通过＞10的显微视野以200-400放大倍数观察每一组织切片，以＞1000个细胞中含TK1阳性细胞的数量计算，最后按阳性染色细胞的百分比计算。
如图4，采用一种淋巴肿瘤细胞株：CEM TK1阳性株和CEM TK1阴性株为标准进行鉴定。图谱显示在CEM TK1阳性株细胞中的细胞质中呈不同程度的阳性染色(A)，但在CEM TK1阴性株染色不染色，呈阴性反应(B)。恶性肿瘤患者组织标本-宫颈内膜癌(C)和结肠癌(D)。图谱显示染色特点：在恶性肿瘤宫颈内膜癌和结肠癌细胞中的细胞质中呈不同程度的阳性染色，部分细胞也显示细胞核中染色。结论：TK1抗体是具有特异性和灵敏度。
实施例9：应用TK1-IgY抗体
(1)硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)的缩时检测方法(称为3步法)
基于2002年专利的增强发光-免疫点印染法(ECL dot blot Assay)。建立了快速检测方法。其程序是：取早饭前供试者的生物体液，例如：1)取清晨空腹血样品，离心4000转/8-10分钟，分离血清。将3微升的血清样品精确点样到硝酸纤维素膜(HybandTMC，GE，UK)上，同时，用不同浓度TK1(20，6.6，2.2pM)做标准品点样(132)。风干30分钟，用pH为7.5的TBS(20mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl)漂洗(2分钟/2次)；2)加入用TBS缓冲液配置的6％的脫脂奶粉，室温下封闭1小时，除去封闭试剂；3)加入用TBS配置的最佳稀释浓度的TK1抗体，免疫反应1.5小时。反应完成以后，用TBST(TBST中加入0.1％吐温20)迅速漂洗2次，震摇洗涤3次(5分钟/1次)；4)加生物素化第2抗体(按最佳浓度稀释)，室温下震摇反应40分钟。反应完成以后，同上方法洗涤；5)加入亲和素-辣根过氧化物酶(streptavidin-HorseRadish Peroxidase)。同上方法洗涤以后，用ECL发光试剂精确反应1分钟，甩干后，该膜密封于薄膜袋，放入CCD检测仪器，这发光信号的强弱将通过CCD(Charged Coupled Device)成像系统分析仪捕获信号和扫描定量分析。按照标准比较，TK1的浓度大于正常健康人标准阈值2pM为风险值。采用这标准曲线，计算被检者TK1的变化水平，对应于被检者的肿瘤细胞的增殖速度。采用抗体免疫结合的检测方法其检测精度可达0.1pM以下。
实施例10：应用生物素直接标记的TK1-IgY抗体
如图5，磺酸基琥珀酰亚胺-LC-生物素直接标记TK1-IgY抗体(2143试剂盒
Sulfo-NHS-LC-Biotinylation，Pierce，USA)。从-20度冰箱取出的磺酸基琥珀酰亚胺-的LC生物素瓶，按照说明书指出的方法计算，20倍摩尔比的生物素试剂与1倍摩尔的IgG抗体，称重2.2毫克生物素溶解到400微升的超纯无任何胺离子的水中，取24.1微升的生物素试剂加入到用975.9微升的PBS中，配置2毫克纯化TK1-IgY抗体。冰浴孵育两小时或在室温下反应30-60分钟。采用HABA Assay检测标记的生物素的分子数，立即采用脱盐柱清除多余的生物素。采用实验例5方法，加生物素化TK1抗体(按最佳浓度稀释)，室温下震摇反应1.5小时，反应完成以后，再按照实验例8操作，方法洗涤以后，进入第5步。结果与3步法相同，操作更为简单方便。
实施例11：鉴定抗体的灵敏度
对多表位抗原制备组合抗人TK1-IgY抗体的特异性和灵敏度进行分析，多表位抗原制备组合抗人TK1-IgY抗体(23肽+28肽+20肽多表位抗原制备组合抗人TK1-IgY抗体按照1∶1∶1比例)与28肽免疫的单一抗体，23肽免疫的单一抗体和20肽免疫的单一抗体进行比较。对11个已经确诊为恶性肿瘤患者阳性的血清，采用增强发光免疫点印迹方法进行分析，结果指出多表位抗原制备组合抗体与28肽免疫的单一的抗体比较，在50％的血清标本中，血清TK1值升高20％50％。多表位抗原制备组合抗体与23或20肽免疫的单一抗体比较，在95％的血清标本中，血清TK1值升高20％50％。利用10个健康人的血清进行分析，多表位抗原制备组合抗体与28肽免疫的单一抗体，23肽免疫的单一抗体和20肽免疫的单一抗体进行比较，没有明显的变化。说明多表位抗原制备组合抗体提高了灵敏度，更好的区分出个体细胞是否处在异常增殖及其增值度的高或低。
实施例12：各肽配比范围为23肽45-50％，20肽30-35-％，28肽25-30％，目的是进一步提高特异性，提高治疗监控中的抗干扰性用于监控治疗效果
实施例13：比较商用型单克隆TK1抗体与华瑞同康生物技术有限公司制备的抗TK1-IgY抗体
采用硝酸纤维素膜点印染/增强化学发光检测系统(ECL)的快速检测方法。
其程序是：取早饭前供试者生物体液进行检测。按照标准比较，TK1的浓度大于正常健康人标准阈值2pM为风险值。采用这标准曲线，将方便计算治疗中被检者的TK1的水平变化，与对应于被检者的肿瘤细胞的增殖速度的关系。采用抗体免疫结合的检测方法可达到足够低的检测精度，特别是可检测不同健康个体TK1的水平差异。最低检测量可达到0.1pM。如图6检测结果：采用华瑞同康制备的抗TK1-IgY抗体检测健康无疾病人的血清，其血清TK1基本不可检测，但商用型单克隆TK1抗体(QED Bioscience Inc，San Diego，USA)与健康人的血清有明显的非特异性免疫交叉反应，重复检测结果相似。结论：商用型单克隆TK1抗体(QEDBioscience Inc，San Diego，USA)不可以用于健康人群体检筛查。
实施例14：跟踪利用血清TK1(简称STK1)检测系统对个体手术的治疗效果
如图7，分析26例前列腺癌患者手术前和后STK1水平，其中5例已经完成了3到6个月跟踪和治疗效果评估，3个月后4例患者的STK1下降到正常健康人的STK1水平，与临床治疗效果相符。1例术前STK1水平低，术后保持稳定，预测患者预后好。
实施例15：前列腺增生进程为恶性肿瘤典型的病例，STK1检测对手术治疗效果的评估。
男，85岁，长期前列腺增生疾病，STK1检测为1.46pM，低于STK1风险阈值2pM。3个月后复查，STK1显著升高到4.47pM，病理检测已进程为前列腺癌，进行了前列腺癌手术，术后3个月，复查STK1为2.57pM，下降了42.5％，术后6个月，复查STK1为0.63pM，下降了85.2％，已经为STK1正常值范围，临床评估为治疗效果佳。
实施例16：跟踪随访STK1水平与临床的治疗效果
1)研究STK1在头颈部恶性肿瘤的验证诊断价值及治疗前后临床效果的跟踪随访和探讨胸苷激酶。
2)STK1检测技术在头颈部恶性肿瘤和自身免疫性疾病中的诊断的价值以及二者之间的有可能存在的干扰假阳性问题。
3)横向比较了几种血清肿瘤标志物检测的灵敏度差别。重点观察STK1与目前广泛应用的几种肿瘤标志物之间的灵敏性和特异性的差别。
结果发现：
1)运用STK1检测对146例头颈部恶性肿瘤患者检测的阳性率为76.7％，特异性为93.3％。恶性肿瘤组STK1浓度与健康对照组、良性肿瘤组的STK1浓度比较有明显的升高，其差别具有统计学意义(p＜0.01)。
2)恶性肿瘤组患者手术STK1水平比前明显降低；治疗有效的病例可以观察到STK1浓度的明显下降，复发的病例可以观察到STK1浓度的升高(p＜0.01)。
3)头颈部肿瘤组患者的STK1浓度水平明显高于良性肿瘤患组、自身免疫性患者及健康体检人群(P＜0.01)，而自身免疫性患者，头颈良性肿瘤患者与健康体检人群的STK1浓度之间无明显差异，其间没有发现假阳性干扰的问题。
4)普通消化道肿瘤相关标志物检测和MTMPC检测两系统--在头颈部恶性肿瘤的检测中灵敏度较低，分别为10.6％和26.7％。
结论：STK1对头颈部恶性肿瘤的检测有较好的灵敏度和特异性，是一种有效且可靠的治疗效果的监测手段。
Claims (6)
1.一种高特异性、高灵敏度的多表位抗人TK1‐IgY组合抗体的制备方法，其特征在于，
分别将人宫颈癌细胞TK1单体N端23肽（3-25）：CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL、C端20肽（206-225）：CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ和C端28肽（198-225）：AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKL FAPQ与KLH交联，分别免疫母鸡，提取卵黄液体,采用水萃取制备抗体溶液,分别用所述的N端23肽、C端20肽，C端28肽制备的亲和层析柱纯化抗体，初筛出高特异性、高灵敏度的单一抗体；
所述的抗人TK1‐IgY组合抗体由按质量百分数计下述抗体组成：所述23肽免疫的单一抗体为30%～50%，所述20肽免疫的单一抗体为25%～40%，28肽免疫的单一抗体为20%～30%，所述3种抗体的质量百分数之和为100%。
2.一种利用权利要求1所述的方法所得的多表位抗人TK1‐IgY组合抗体，其特征在于所述的抗人TK1‐IgY组合抗体由按质量百分数计下述抗体组成：所述23肽免疫的单一抗体为45%～50%，所述20肽免疫的单一抗体为30%～35%，28肽免疫的单一抗体为25%～30%，所述3种抗体的质量百分数之和为100%。
3.一种权利要求2所述的抗人TK1‐IgY组合抗体，其特征在于所述的抗人TK1‐IgY组合抗体选择的TK1蛋白包括：具有酶活性/非活性的单体、2或4聚体TK1蛋白质，或TK1蛋白质与其他分子形成的蛋白复合物或抑制物。
4.一种对权利要求2中所述的抗人TK1‐IgY组合抗体的检测方法：所述检测方法包括硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统（ECL）的缩时检测方法、抗体直接标记生物素方法。
5.一种利用权利要求2所述的抗人TK1‐IgY组合抗体制备的试剂盒，其特征在于利用所述抗人TK1‐IgY组合抗体与化学发光检测系统结合制得。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于肿瘤患者治疗效果的评估中。
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