CN102504027B - 一种多表位tk1抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用 - Google Patents

Abstract

发明提供了一种人宫颈癌细胞TK1单体N端23肽、C端20肽和C端28肽组成的抗原决定簇制备的一种高特异性、高灵敏度的配位组合抗人TK1抗体以及其检测诊断系统在肿瘤诊断中的应用。抗原决定簇所包含的氨基酸序列为：N端23肽(3-25)：CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL、C端20肽(206-225)：CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ、C端28肽(198-225)：AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。本发明同时提供了应用该抗原制备抗体的方法，所提供的抗体试剂盒具有灵敏度高，特异性高，成本低廉等特点通过增强化学发光点印迹检测法和免疫组化检测及检测试剂盒能够在人群体检筛查中检测早期肿瘤和进行风险预警。

Description

一种多表位TK1抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用

技术领域：

本发明涉及一种抗体及其应用，具体讲涉及一种高特异性、高灵敏度多表位TK1抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用。 

背景技术：

癌症是人类的死亡杀手，尽管有许多影像检测方法和治疗手段，例如：化学治疗、内分泌治疗、放射治疗和手术等，虽然已经有了很大的进步，但远远不可能达到完美的程度，伴有复发和转移的可能。因此，早期的发现，特别是早于癌前病变期的发现和早期的治疗是给予患者康复的最佳福音。 

癌症是一种细胞异常增殖的慢性疾病。癌细胞异常和失控的增殖是由于正常细胞中与增殖相关的基因发生了某种或多种突变所引起的，虽然基因表达异常，但尚未癌变，因此被称为癌前状态或癌前疾病。癌前疾病是指患这些疾病的人比其他人得癌症的机会要大大的增加，因而也被称为癌前疾病或癌前状态。而按照细胞病理学概念，一类具有细胞不典型性和分化异常的增生性病变，称为癌前病变。细胞癌变过程是分阶段发展和逐渐演变的。从致癌因子攻击正常组织细胞到产生癌症，一般需要10年以上甚至更长的时间，进展速度与病程长短主要取决于肿瘤类型和个体差别。癌前疾病发展成癌症疾病的这个漫长的过程中，也分为轻，中，重等不同阶段。重度癌前病变是恶性肿瘤发生前的最后一个、也是最危险的时期。显然，防治癌前病变是预防肿瘤和肿瘤治愈最为关键的环节，为全世界所关注。然而，癌前病变发生的时间和部位都具有不确定性，而且病变尚处于细胞水平，无殊症状和体征，现行的检测手段难以及时检查发现。而现有体检中使用的常规血液检验(血液中的有形成分即红细胞、白细胞及血小板这三个系统的质和量进行检测与分析)和尿液检测，可提供血清或尿液蛋白质或酶等异常指标和相关疾病的信息；现有的常规物理学影像检测方法(B-超，X-光)，可观察到组织器官中的息肉或息肉增大，囊肿或可疑肿瘤的相关信息，但这些方法尚不能知道被检者组织器官中显示的息肉，囊肿或肿块的肿瘤细胞的异常增殖情况，很难评估是否有可能进程为恶性肿瘤。 

特别指出的是，但到目前为止，很少有可信的肿瘤生长相关标志物应用于体检筛查。2008年，美国信诺保健公司将现用肿瘤标志物(Tumor Markers)如何用于癌症的诊断和监督进行汇编，提出公认的准则和实践指南，对于肿瘤相关的血清标志物，进行了评估。对于现有许多肿瘤标志物进行回顾研究，例如CEA，CA15-3，CA199和AFP等一系列标志物，由于这类标 志物不与肿瘤细胞的增殖直接相关，它们通常是不可能用单独一种肿瘤标志物的水平来检测和诊断癌症疾病，这类型标志物升高，可能预示有癌症，但它们的存在并不能诊断是癌症，这些标志物检测是需要结合其他诊断方式(例如：活检、放射/成像)才能确认为癌症。 

二十世纪五十年代末，研究者发现胸苷激酶(TK，ATP：thymidine5′-phosphotransferase，EC.2.7.1.21，简称TK)，一种嘧啶补救途径的酶，催化胸苷磷酸化为胸苷酸。人细胞中TK以两种同功酶的形式出现：细胞质胸苷激酶(简称TK1)和线粒体胸苷激酶(简称TK2)。胸苷激酶1(简称TK1，也称为细胞质胸苷激酶)是与细胞周期调控密切相关的细胞周期类标志物，随后的大量基础研究和实验肿瘤学证明了TK1表达是与细胞生长状态紧密联系的，因此TK1可以作为一种好的细胞增殖标记物来检测增殖细胞的增殖活性，因此将适用恶性肿瘤的增殖度检测。 

对血清胸苷激酶1值(STK1)进行分析，重要的是，体内正常细胞增殖不会导致血清胸苷激酶1水平的增加，因为正常的细胞分裂是按照细胞凋亡调控规律进行的，细胞内胸苷激酶1在细胞分裂之前已经被降解，但肿瘤细胞逃逸了细胞凋亡规律的调控，导致细胞异常分裂增殖，肿瘤细胞(包括S和G2期的细胞)中的胸苷激酶1被释放至体液。因此，在细胞过度增生的情况下，STK1水平与肿瘤细胞增殖速度相关，并与疾病的轻重程度有关。由于在总的血清TK中，TK1高于95％，TK2低于5％，因此STK1的活性检测同样适用于血清学，作为一优选的肿瘤细胞增殖标记物。 

采用人TK1抗体检测血清TK1浓度水平更能真实代表集体内是否存在异常增殖的细胞，因此，在近10多年里，按照抗体制备原理，一种TK1抗体已经试用于临床实践中。多个团队制备了不同的TK1抗体用于肿瘤疾病的鉴定和监控，但不适用于常规人群体检筛查。 

在这基础上，我们于2002年进一步筛选研究，选择了暴露在TK1蛋白质表面的抗原决定簇C端部分的这一关键免疫序列-31肽(195-225)制备了抗人TK1-IgY抗体(中国发明专利号WO204 100760A1，国际专利号W O 204100760A1.25/11-2004)。采用人TK1C端31肽制备的抗人TK1-IgY抗体及利用其制备的血清免疫学和组织免疫学肿瘤检测试剂盒，这抗体将同时检测有活性的TK1蛋白和非活性的TK1蛋白，也能检测TK1蛋白质与其他的分子形成的复合物。尽管这血清试剂盒-增强发光免疫点印迹法检测系统试用于体检筛查中，检测范围在0.3-2pM之间，但在0.1-1pM时，误差有时会大于30％，采用人群常规体检血清TK1和癌症患者血清TK1进行ROC值分析，ROC值曲线下面积为0.96，特异性为0.991，最大似然法比例(+)为56.04，证明抗体的特异性很好，可以用于人群体检筛查，但灵敏度在0.51％，需进一步制备检测灵敏度高、特异性和稳定性好的抗体来完善检测系统，以便更好的提高在 0.1-1pM范围内的检测精确度。 

发明内容：

在采用人宫颈癌细胞的TK1单体上C端31肽(195-225)作为抗原的基础上，经多年实践，筛选出了暴露在TK1蛋白表面的多点位特别抗原决定族，包括N端部分的关键性免疫多肽序列23肽，C端20肽和C端部分的关键免疫序列28肽，应用上述关键免疫序列做特别抗原，采用母鸡免疫最终纯化并组合制备了抗人TK1-IgY抗体。与现有的国际商用抗人TK1-IgG抗体相比，所制备的抗体具有纯度高(＞99％)、产量高、高灵敏度、高特异性且无非特异性免疫交叉反应，并可于+4-8度冰箱保存一年以上且活性稳定，便于商业运输、保存和操作等优点。本发明的抗人TK1多表位抗体和TK1检测系统，能真实的反映细胞的增殖度，因而能在早于影像学检测的情况下，在体检人群中预警早期潜在的异常细胞增殖，警示被检者可能进程为恶性肿瘤的风险。 

本发明提供的技术方案包括： 

1、设计和筛选抗原 

选择暴露的蛋白表面上N、C端的肽段。 

2、制备抗体 

利用上述关键免疫序列与KLH交联组成23肽-KLH，20肽-KLH，28肽-KLH的抗原分别去免疫母鸡制得。而利用母鸡免疫的优点在于：(1)鸡的IgY和人的IgG之间存在分子遗传差异性；(2)鸡的TK1和人的TK1有种族差异性；(3)与传统的兔免疫制备的多克隆抗体比较，IgY具有内源分子均一性(只产生一种类型的抗体分子，即IgY)；(4)IgY抗体不激活人补体系统，从而部分地阻断人血清中非特异抗原结合位点的激活；(5)类风湿因子(RF)不与IgY抗体反应。这种RF是许多免疫测定中非特异反应的主要来源，因为RF与哺乳动物抗体IgG的Fc部分反应，可导致病人和健康人血清的假阳性；(6)现在大多数乳腺癌患者，需要辅助治疗，许多患者接受化疗，例如：赫赛仃、靶向治疗药、单克隆抗体，以后也还需抗激素治疗，特别是抗体治疗情况下，TK1-IgY抗体显示出比单抗体检测更具有优势。 

3、纯化抗体 

利用所述N端23肽，C端20肽，C端28肽序列分别与KLH交联，分别免疫母鸡，提取卵黄液体，采用水萃取制备抗体溶液，分别用本发明中的抗原决定簇制备的亲和层析柱来纯化抗体。 

所述纯化包括下述步骤： 

第一步，初筛出免疫母鸡生产出的抗体是否具有高特异性和高灵敏度，即对每个免疫母鸡 的卵黄液体进行分离，采用水萃取后得到抗体粗品，经亲和层析纯化得到初筛的高特异性和高灵敏度的抗人TK1抗体。根据免疫抗原的类型对亲和柱进行选择，混合后的粗品液是来源于23肽-KLH，20肽-KLH，28肽-KLH的抗原免疫的抗TK1-IgY抗体，亲和柱制备必须为N端23肽，C端20肽和C端28肽的亲和柱。 

第二步，制备组合免疫抗原的亲和柱，对初筛出的3种抗体进行组合的配比测试，其特征在于组合抗原亲和柱配比选择。制备亲和柱要求按照所选择的3种抗体的混合比例，计算出相对应的抗原决定簇，即23肽，20肽和28肽量的百分比。经亲和柱层析纯化测试后，选择最佳的配比组合方案。 

4、多位点抗体组合制备抗人TK1-IgY抗体，除另有说明外，本申请中的百分比为质量百分比。 

配比范围：23肽免疫的单一抗体占25％～45％，20肽免疫的单一抗体占20％～40％，28肽免疫的单一抗体占20％～55％。 

5、鉴定抗人TK1-IgY抗体的灵敏度和特异性 

1)确认制备抗体是否仅与人的TK1有特异性反应，第一步采用TK1阳性和阴性细胞株，西部印染法来鉴定抗体的特异性：利用淋巴瘤阳性株CEM TK1⁺和阴性株CEM TK1^-来鉴定。经天然胶电泳后进行TK1抗体西部免疫印染，CEM TK1阳性株有一条明显的TK1电泳带，CEM TK1阴性株没有显现任何带。确认抗体的是仅与TK1酶有免疫反应，是特异性抗体。 

2)确认制备的抗体是否仅与肿瘤患者的血清TK1有特异性反应，第二步采用选择已确认为健康无疾病者的血清和肿瘤患者阳性值的血清标本，用增强发光免疫点印迹方法检测，肿瘤患者阳性值的血清标本应显示不同程度的阳性值，健康者应该低于检测阈值2pM或不显示免疫反应。确认了抗体与健康无疾病者的血清无免疫交叉反应，是特异性抗体，并比较肿瘤患者血清中STK1的强度反应，对初筛出的不同抗体进行鉴定，筛选出灵敏度高和特异性好的抗体。 

3)确认制备抗体是否仅与肿瘤患者中TK1有特异性反应，从2)步中筛选出灵敏度高和特异性好的抗体，采用初诊但未治疗肿瘤患者的血清和健康无疾病者的血清标本点样，进行天然胶电泳后，再用抗TK1抗体西部免疫印染，肿瘤患者的血清标本显示一条明显的TK1电泳带，健康无疾病者的血清标本没有显现任何带。确认抗体是仅与肿瘤患者的血清TK1酶有免疫反应，是特异性抗体。 

本发明是利用上述组合抗体在十万级的洁净环境下，将抗体进行分装，组装TK1免疫检测试剂盒，并与化学发光分析仪结合，应用于人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警。 

该发明涉及早期预测，能在早于影像学检测癌症的情况下，用于检测多种类型的癌前疾病/早期潜伏肿瘤疾病/与肿瘤疾病相关的慢性疾病与异常细胞增殖，预警被检者可能进程为恶性肿瘤的风险。STK1检测进入体检套餐，筛选STK1升高的风险人群，与下列恶性肿瘤进程相关的疾病联合评估体内细胞异常增殖情况，包括：癌前病症风险人群的定期动态观察；例如组织中/重度增生，息肉病变，中/重度溃疡或糜烂，病毒性肝炎阳性，例如乙肝135/145，难治型贫血疾病等等；定期监控相关疾病可能渐变为癌疾病风险进程，例如良性肿瘤，中/重度脂肪肝，超重，与肿瘤疾病相关的长期慢性炎症等等；肿瘤康复患者人群定期监控，风险预警；预警体内有无细胞异常增殖：3-6个月STK1持续高水平者，但现无体征疾病.预警体内有细胞异常增殖，需与相关影像仪，肿瘤标志物，血清和尿液指标联合定期监控，观察细胞异常增殖变化。 

体检中心检测被检者STK1水平，建立健康者个体STK1的基础水平，例如无肿瘤疾病健康被检者，需取初次第1个月内的样品，分析STK1的水平，3个月中，进行3次重复检测，将3次的检测结果计算出平均值，得出健康者个体STK1的基础水平，无肿瘤疾病健康被检者一般在低于1pM，以后每年的常规体检期间，用检测的STK1值与个体的STK1的基础水平进行比较。 

可能进程为癌疾病风险的被检者的预测是按照个体的TK1的基础值与以后年检TK1值，对两者的STK1水平比较。例如，现年检STK1值与个体STK1的基础比较，如果该个体已确认有癌前疾病/良性肿瘤疾病/与肿瘤疾病相关的慢性疾病，但TK1的水平仍低于风险阈值，被检者评估为细胞异常增殖水平低，进程为癌疾病的风险低；如果该个体已确认有癌前疾病/良性肿瘤疾病/与肿瘤疾病相关的慢性疾病，STK1的水平升高1-2倍，超过2pM，被检者评估为细胞异常增殖水平升高，预警进程为癌疾病的风险升高。 

采用这方法对被检者进行定期检测，可以监控个体数年，以至数十年，判断被检者是否处在癌疾病低风险或高风险情况。因此，这发明给予被检者和体检中心医生的早期信息。如果是STK1升高，预警被检者有癌疾病进程的高风险；给医生将有可能建议相关的干预治疗方案，给予被检者远避风险和治愈的最佳机会 

和现有技术比，本发明的优点如下： 

(1)本发明所制备的抗体具有纯度高(＞99％)、产量高、高特异性无非特异性免疫交叉反应且检测精度在可达到0.1pM。受试者工作曲线表示：ROC曲线下面积值＝0.96(p＜0.0001)，最大似然法比例(+)明显升高为236.49，特异性高达0.997，灵敏度高达0.737。 

(2)适用于人群体检筛查，可按照体检者不同的个体情况和血清TK1(STK1)水平的变 化大于2pM，预示异常细胞增殖度，给个人和医生提供信息，进行合理的保健防范/干预治疗，远避风险，将可能极大提高患者治愈效果。 

(3)稳定性好，可于+4-8度冰箱保存一年以上且活性稳定，更便于商业运输和保存并能降低试剂的潜在成本。 

附图说明：

图1：ABmart抗体分析测试TK1蛋白图谱。 

图2：(a)TK1抗体试剂盒点样结果图 

(b)STK1点印迹实验分析软件测试TK1抗体试剂盒点样数据 

(c)STK1点印迹实验分析软件测试TK1抗体试剂盒点样数据曲线图 

图3：（a）为CEM TK1⁺和CEM TK1^-的西部印染结果。 

（b）为鉴定治疗前淋巴癌患者，治疗前/后的头颈癌患者，健康人血清的西部印染结果。 

图4：CEM TK1⁺、CEM TK1^-、宫颈内膜癌和结肠癌的TK1抗体染色结果 

图5：生物素-TK1-IgY抗体(2步法)与三步法的比较图 

图6：体检中心提供的血清TK1检测的ROC图表 

图7：华瑞同康的抗TK1-IgY抗体与市售商用抗TK1-mAb抗体的实验比较图 

具体实施方式：

用以下实施例对本发明作详细描述： 

实施例1：选择特异性多表位抗原 

如图1所示，用软件预测TK1无信号肽，无跨膜结构。图示单链TK1蛋白234氨基酸分布，指出氨基酸的亲疏水性氨基酸分布较均匀。图谱提供了可选方案：1)从抗原性角度考虑，在蓝色曲线峰值高的地方选择的多肽较好；2)按照亲水性氨基酸的分布，选择亲水区域；3)选择负值所示疏水性较强的芳香族氨基酸。 

实例2：选择高灵敏度、高特异性多位点组合抗人TK1-IgY抗体的抗原 

选择制备高灵敏度、高特异性多位点组合抗人TK1-IgY抗体的抗原的选择：由于人宫颈癌TK1的部分序列有与其它蛋白具有相同的表位，得到的抗体可能与其它非特异性蛋白有交叉反应，纯化困难，按照已公布公知的TK1序列(蛋白质文库)，选择暴露在蛋白质表面的特别肽，按照用软件预测得到的多肽的特异性程度大于85％的多肽片段列于下表，筛选的TK1特异性强的抗原片段，设计了TK1N端23肽，C端20肽和C端28肽作为半抗原。 

实施例3：筛选特异性多表位抗原 

特异性多表位抗原的选择：按照公知的TK1空间结构，选择暴露在TK1蛋白质的表面的抗原决定簇，按照实例2筛选TK1免疫性强的抗原片段，筛选TK1的N端23肽，C端20肽，和C端28肽是免疫性强的抗原片段，三段氨基酸序列分别如下(见序列表)：1)N端23肽(3-25)：CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL，2)C端20肽(206-225)：CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ，3)C端28肽(198-225)：AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ。 

实施例4：用母鸡免疫制备特异性多表位配位组合抗人TK1-IgY抗体 

应用上述N端23肽，C端20肽，C端28肽序列做半抗原分别与KLH铰链，制备免疫抗原，利用该抗原制备灵敏度高、特异性好的抗人TK-IgY抗体新组合抗体。抗原用量：选择免疫性好健康的罗曼母鸡40只，用量为0.5毫克，KLH N23肽，KLH-C20肽，KLH-C28肽，将上述免疫抗原用PBS缓冲液溶解再与福氏完全佐剂按1∶1混合，注射到产蛋母鸡的胸肌。经两次给鸡用福氏不完全佐剂与抗原混合液加强免疫，四周后每天收集鸡蛋，在4℃下储存。 

实施例5：提取和纯化多位点组合抗体 

抗体的粗品纯化过程如下：采用带网眼的漏斗将蛋黄与蛋白分离，完整的蛋黄用无离子 水洗净后用摄子去蛋黄表皮，收集蛋黄液。用10倍体积的蒸馏水稀释蛋黄液，拌搅均匀后调pH值为5.0，在4℃下放置过夜。次日取出后调pH值至5.5，通过二次硫酸铵沉淀法，第一次按照1000ml溶液中加入硫酸铵固体351g，第2次按每1000ml加196g硫酸铵的比例，在10℃下冷冻离心，转速为4000转/分，时间为24分钟。弃去上清液，将沉淀蛋白用1∶4的无离子水稀释并用0.5mol/L的NaOH调节pH至8.0。采用G25柱脱除硫酸铵以后，混合的粗品溶液上制备好的亲和层析柱。 

1)收集筛选出免疫效果好的母鸡生产的鸡蛋，将鸡蛋黄制备硫酸铵溶液，脱除硫酸铵以后，粗品TK1溶液混合上亲和层析柱。 

2)制备亲和层析柱 

选择亲和柱抗原的类型：混合后的粗品液来源于23肽-KLH+20肽-KLH+28肽-KLH的抗原免疫的抗TK1-IgY抗体，亲和柱制备为23肽+20肽+28肽混合亲和柱，制备亲和柱要求按照所选择的3种抗体混合比例，计算出相对应抗原用量，即23肽，20肽和28肽的量的百分比，将计算好的N端23肽，C端20肽和C端28肽的量交链接到亲和层析柱。 

3)纯化抗体：于2-8℃下将混合粗品液加入亲和柱，5次循环，每ml亲和柱第1次过柱时的速度为0.2ml/min-0.25ml/min。循环后用亲和柱平衡溶液冲洗杂蛋白，经过3次以上的重复测试，UV均小于0.010时，停止冲洗；用1.5倍亲和柱体积的Actisep洗脱抗体，洗脱再用G25柱除去Actisep，将收集好的抗体混合，测混合后的UV值；及时调pH至8.0，加入保护试剂，保存抗体于+4-8度冰箱。 

实例6：检测和鉴定TK1检测组装试剂盒 

在十万级的洁净环境下，将抗体进行分装。如图2(a)，(b)，(c)所示，采用增强化学发光点印迹法对STK1进行标准化检测和鉴定，快速和简便，检验合格。 

实施例7：筛选抗体的灵敏度和特异性 

鉴定抗体的灵敏度和特异性。1)筛选灵敏度：选择初评合格的母鸡，用鸡蛋黄制备硫酸铵溶液，再用制备的亲和柱纯化抗体，得到纯度大于99％的TK1抗体，采用增强发光免疫点印迹方法，用TK1标准品(20，6.6，2.2pM)做标准曲线，选择已确认为健康者的血清和初诊未治疗的肿瘤患者阳性值的血清标本，用增强发光免疫点印迹方法检测，肿瘤患者阳性值的血清标本应显示不同程度的阳性值，健康人应该低于检测阈值2pM或不显示免疫反应，对不与人TK1有反应，对健康人血清有非特异免疫交叉反应，或不与肿瘤患者血凊TK1反应的抗体，为不合格抗体，删除。 

鉴定抗体的特异性 

细胞培养：采用常规细胞培养方法，将实验所用的CEM TK⁺，CEM TK^-细胞进行用含10％小牛血清的1640培养液培养，当培养瓶中细胞数长到20×10⁶时，将收获的细胞用裂解缓冲液萃取细胞液(裂解缓冲液：10mM Tris-HCl，250mM蔗糖，160mM KCl，5.6mM NaF，3.8mM MgCl2，5.0mM ATP，0.2％NP-40，pH＝7.5)。20微克/10微升的CEM TK1阳性株和CEM TK1阴性株细胞提取液与等量的电泳缓冲液混合，天然胶电泳(4-10％梯度)，试剂盒和操作由供应商Invitrogen公司提供。进行TK1抗体西部免疫印染(半干电泳转移操作方法由Bio-Rad提供)。IgY TK1Ab(100,000X 1mg/ml)采用人血清标本，IgY TK1Ab浓度(100,000X 1mg/ml)。如图3(a)为TK抗体西部印染结果，CEM TK1阳性株有TK1一条明显的电泳带，CEM TK1阴性株没有显现任何带。验证了抗体仅与人TK1有特异性反应。 

图3(b)为西部印染法鉴定：其中的样品来源于1例治疗前淋巴癌患者，1例治疗前/后的头颈癌患者，1例健康人(无疾病)，经点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)鉴定，分别为44，20，0.5和0.1pM。2微升血清稀释为10微升与等量的电泳缓冲液混合，过天然胶电泳(4-10％梯度)后进行TK1抗体西部免疫印染。结果显示，治疗前淋巴癌患者与治疗前的头颈癌患者有一明显的电泳带，治疗后的头颈癌患者和健康人的血清TK1几乎不可以观察。验证抗体与人血清无非特异性免疫交叉反应。 

实施例8：鉴定TK1抗体的特异性和灵敏度 

石蜡包埋的厚为4μm切片标本，经脱蜡水化，将切片浸入标靶修复液。按照供应商( System试色素剂盒)提供的操作步骤，进行组织化学染色。切片浸入3％H₂O₂溶液，10分钟以后灭活内源性酶，用封闭试剂处理30分钟，加入TK1抗体，并在室温下孵育2小时；用PBS溶液清洗切片；加EnVisiong复合物，并在室温下孵育40分钟；二氨基联苯胺显色并用苏木精对载玻片进行复染色。TK1阳性和阴性的人淋巴瘤CEM细胞采用丙酮固定法，其后的染色和操作步骤同前所述。评估各个切片的TK1表达，通过＞10的显微视野以200-400放大倍数观察每一组织切片，以＞1000个细胞中含TK1阳性细胞的数量计算，最后按阳性染色细胞的百分比计算。 

如图4，采用一种淋巴肿瘤细胞株：CEM TK1阳性株和CEM TK1阴性株为标准进行鉴定。图谱显示在CEM TK1阳性株细胞中的细胞质中呈不同程度的阳性染色(A)，但在CEM TK1阴性株染色不染色，呈阴性反应(B)。恶性肿瘤患者组织标本-宫颈内膜癌(C)和结肠癌(D)。图谱显示染色特点：在恶性肿瘤宫颈内膜癌和结肠癌细胞中的细胞质中呈不同程度的阳性染色，部分细胞也显示细胞核中染色。结论：TK1抗体是具有特异性和灵敏度。 

实施例9：应用TK1-IgY抗体 

(1)硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统(ECL)的缩时检测方法(称为3步法) 

基于2002年专利的增强发光-免疫点印染法(ECL dot blot Assay)。建立了快速检测方法。其程序是：取早饭前供试者的生物体液，例如：1)取清晨空腹血样品，离心4000转/8-10分钟，分离血清。将3微升的血清样品精确点样到硝酸纤维素膜(HybandTMC，GE，UK)上，同时，用不同浓度TK1(20，6.6，2.2pM)做标准品点样(132)。风干30分钟，用pH为7.5的TBS(20mmol/L Tris，0.15mol/L NaCl)漂洗(2分钟/2次)；2)加入用TBS缓冲液配置的6％的脫脂奶粉，室温下封闭1小时，除去封闭试剂；3)加入用TBS配置的最佳稀释浓度的TK1抗体，免疫反应1.5小时。反应完成以后，用TBST(TBST中加入0.1％吐温20)迅速漂洗2次，震摇洗涤3次(5分钟/1次)；4)加生物素化第2抗体(按最佳浓度稀释)，室温下震摇反应40分钟。反应完成以后，同上方法洗涤；5)加入亲和素-辣根过氧化物酶(streptavidin-Horse Radish Peroxidase)。同上方法洗涤以后，用ECL发光试剂精确反应1分钟，甩干后，该膜密封于薄膜袋，放入CCD检测仪器，这发光信号的强弱将通过CCD(Charged Coupled Device)成像系统分析仪捕获信号和扫描定量分析。按照标准比较，TK1的浓度大于正常健康人标准阈值2pM为风险值。采用这标准曲线，计算被检者TK1的变化水平，对应于被检者的肿瘤细胞的增殖速度。采用抗体免疫结合的检测方法其检测精度可达0.1pM以下。 

实施例10：应用生物素直接标记的TK1-IgY抗体 

如图5，磺酸基琥珀酰亚胺-LC-生物素直接标记TK1-IgY抗体(2143试剂盒 

Sulfo-NHS-LC-Biotinylation，Pierce，USA)。从-20度冰箱取出的磺酸基琥珀酰亚胺-的LC-生物素瓶，按照说明书指出的方法计算，20倍摩尔比的生物素试剂与1倍摩尔的IgG抗体，称重2.2毫克生物素溶解到400微升的超纯无任何胺离子的水中，取24.1微升的生物素试剂加入到用975.9微升的PBS中，配置2毫克纯化TK1-IgY抗体。冰浴孵育两小时或在室温下反应30-60分钟。采用HABA Assay检测标记的生物素的分子数，立即采用脱盐柱清除多余的生物素。采用实验例5方法，加生物素化TK1抗体(按最佳浓度稀释)，室温下震摇反应1.5小时，反应完成以后，再按照实验例8操作，方法洗涤以后，进入第5步。结果与3步法相同，操作更为简单方便。 

实施例11：鉴定抗体的灵敏度 

对多表位抗原制备组合抗人TK1-IgY抗体的特异性和灵敏度进行分析，多表位抗原制备组合抗人TK1-IgY抗体(23肽+28肽+20肽多表位抗原制备组合抗人TK1-IgY抗体按照1∶1∶1比例)与28肽免疫的单一抗体，23肽免疫的单一抗体和20肽免疫的单一抗体进行比较。对11个已经确诊为恶性肿瘤患者阳性的血清，采用增强发光免疫点印迹方法进行分析，结果指 出多表位抗原制备组合抗体与28肽免疫的单一的抗体比较，在50％的血清标本中，血清TK1值升高20％-50％。多表位抗原制备组合抗体与23或20肽免疫的单一抗体比较，在95％的血清标本中，血清TK1值升高20％-50％。利用10个健康人的血清进行分析，多表位抗原制备组合抗体与28肽免疫的单一抗体，23肽免疫的单一抗体和20肽免疫的单一抗体进行比较，没有明显的变化。说明多表位抗原制备组合抗体提高了灵敏度，更好的区分出个体细胞是否处在异常增殖及其增值度的高或低。如图6采用ROC(受试者工作曲线，Analysis-It统计学软件计算)证实了该抗体灵敏度的提高。按照上述方法，被检者由体检中心提供参加常规体检的非恶性肿瘤疾病共计4103人的数据与国内常规临床治疗前恶性肿瘤瘤患者721人进行ROC作图，ROC作图分析指出，按设定风险阈值为2pM，ROC曲线下面积值＝0.96(p＜0.0001)，最大似然法比例(+)明显升高为236.49，特异性为0.997，灵敏度为0.737，指出这种特异性TK1多表位抗原制备组合的抗人TK1-IgY抗体具有高灵敏度和高特异性，适用于体检筛查。 

实例12：分析比较特异性TK1单表位抗原制备的抗TK1-IgY抗体与特异性TK1多表位抗原制备组合的抗TK1-IgY抗体的灵敏度和特异性 

ROC分析方法指出，特异性TK1多表位抗原制备组合抗TK1-IgY抗体，最大似然法比例(+)明显升高，灵敏度有意义升高，采用CHISQ方法分析，p＝0.028(586/453，97/50)。表格：分析比较特异性TK1单表位抗原制备的IgY抗体与特异性TK1多表位抗原制备的组合IgY抗体的灵敏度和特异性 

实施例13：各肽配比范围：23肽25-30％，20肽20-25％，28肽50-55％，目的是进一步提高检测灵敏度和抗体抗干扰能力用于早期风险筛查 

实施例14：比较商用型单克隆TK1抗体与华瑞同康生物技术有限公司制备的抗TK1-IgY抗体 

采用硝酸纤维素膜点印染/增强化学发光检测系统(ECL)的快速检测方法。 

其程序是：取早饭前供试者生物体液进行检测。按照标准比较，TK1的浓度大于正常健康人标准阈值2pM为风险值。采用这标准曲线，将方便计算治疗中被检者的TK1的水平变化，与对应于被检者的肿瘤细胞的增殖速度的关系。采用抗体免疫结合的检测方法可达到足够低的检测精度，特别是可检测不同健康个体TK1的水平差异。最低检测量可达到0.1pM。如图7检测结果：采用华瑞同康制备的抗TK1-IgY抗体检测健康无疾病人的血清，其血清TK1基本不可检测，但商用型单克隆TK1抗体(QED Bioscience Inc，San Diego，USA)与健康人的血清有明显的非特异性免疫交叉反应，重复检测结果相似。结论：商用型单克隆TK1抗体(QED Bioscience Inc，San Diego，USA)不可以用于健康人群体检筛查。 

实施例15：按照对健康人群的血清浓度分布，95％的人群在1pM下，5％在1-2pM，我们建立了血清TK1(以下简称STK1)风险临界值为2pM，正常人组：STK1≤2pM，表示：细胞正常生长或低增殖，癌变风险低；风险人组：STK1＞2pM，表示细胞异常增殖升高，在数年中进程为癌疾病的风险升高。风险组与中国人癌症发生频率比例比较，6年的跟踪结果显示：正常组与升高组人群比较，进程为癌疾病风险升高到30倍，所有数据通过统计学分析，p＜0.005，具有统计学意义。 

对TK1升高组170人和TK1正常组群6,354人进行了5-72个月的跟踪，结论：TK1升高组进程为恶性肿瘤的风险升高30倍。 

根据被检者的STK1水平，建立健康者个体TK1的基础水平，例如无肿瘤疾病健康被检者，初次需取第1个月内的样品，分析STK1的水平，3个月中，进行3次重复检测，将3次的检测结果计算平均值，得出健康个体TK1的基础水平，无肿瘤疾病健康被检者一般低于1pM，以后每年的常规体检期间，利用检测的STK1值与个体的TK1的基础水平进行比较。 

对可能进程为癌疾病风险的被检者的预测是利用个体的STK1的基础值与以后年检的STK1值，对两者的STK1水平进行比较，包括：个体年龄，现年检STK1值与个体原STK1的基础比较，如果该个体已确认有癌前疾病/良性肿瘤疾病/与肿瘤疾病相关的慢性疾病，但STK1的水平仍低于风险阈值，被检者评估为细胞异常增殖水平低，进程为癌疾病的风险低；如果该个体已确认有癌前疾病/良性肿瘤疾病/与肿瘤疾病相关的慢性疾病，STK1的水平升高1-2倍，超过2pM，被检者评估为细胞异常增殖水平升高，预警进程为癌疾病的风险升高。 

Claims (6)

1.一种高特异性、高灵敏度的多表位抗人TK1‐IgY组合抗体的制备方法，其特征在于，

分别将人宫颈癌细胞TK1单体N端23肽（3‐25）：CINLPTVLPGSPSKTRGQIQVIL、C端20肽（206‐225）：CPVPGKPGEAVAARKLFAPQ和C端28肽（198‐225）：AGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ与KLH交联，分别免疫母鸡，提取卵黄液体,采用水萃取制备抗体溶液,分别用所述的N端23肽、C端20肽，C端28肽制备的亲和层析柱纯化抗体，初筛出高特异性、高灵敏度的单一抗体；

所述的抗人TK1‐IgY组合抗体由按质量百分数计下述抗体组成：所述23肽免疫的单一抗体为25%～45%，所述20肽免疫的单一抗体为20%～40%，28肽免疫的单一抗体为20%～55%，所述3种抗体的质量百分数之和为100%。

2.一种利用权利要求1所述的方法所得的多表位抗人TK1‐IgY组合抗体，其特征在于所述的抗人TK1‐IgY组合抗体由按质量百分数计下述抗体组成：所述23肽免疫的单一抗体为25%～30%，所述20肽免疫的单一抗体为20%～25%，28肽免疫的单一抗体为50%～55%，所述3种抗体的质量百分数之和为100%。

3.一种权利要求2所述的抗人TK1‐IgY组合抗体，其特征在于所述的组合抗体选择的TK1蛋白包括：具有酶活性/非活性的单体、2或4聚体TK1蛋白质，或TK1蛋白质与其他分子形成的蛋白复合物或抑制物。

4.一种对权利要求2中所述的抗人TK1‐IgY组合抗体的检测方法：所述检测方法包括硝酸纤维素膜点印染/免疫增强发光检测系统（ECL）的缩时检测方法、抗体直接标记生物素方法。

5.一种利用权利要求2所述的抗人TK1‐IgY组合抗体制备的试剂盒，其特征在于利用所述抗人TK1‐IgY组合抗体与化学发光检测系统结合制得。

6.如权利5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒用于人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中。

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