CN111936522A - 新型抗胸苷激酶抗体 - Google Patents

新型抗胸苷激酶抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN111936522A
CN111936522A CN201980026416.1A CN201980026416A CN111936522A CN 111936522 A CN111936522 A CN 111936522A CN 201980026416 A CN201980026416 A CN 201980026416A CN 111936522 A CN111936522 A CN 111936522A
Authority
CN
China
Prior art keywords
htk
antibody
thr
leu
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980026416.1A
Other languages
English (en)
Inventor
H·迪费尔
A·恩格尔
F·克罗纳
T·迈尔
S·鲁茨
M·施雷姆尔
G·塔巴雷斯
U·库尔特卡亚
B·平楚克
C·齐默曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN111936522A publication Critical patent/CN111936522A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及特异性结合人胸苷激酶1(hTK‑1;SEQ ID NO:1)上的构象依赖性表位的新型单克隆抗体，用于采用所述抗体定量hTK‑1的方法及抗hTK‑1抗体在定量hTK‑1中的用途。

Description

新型抗胸苷激酶抗体
本发明涉及特异性结合人胸苷激酶1 (hTK-1; SEQ ID NO:1)的新型单克隆抗体，用于采用所述抗体定量hTK-1的方法及抗hTK-1抗体在定量hTK-1中的用途。
尽管在近几十年中取得所有进展，但癌症仍是第二大死亡原因(Siegel等人，2013)。为了更好地理解癌症生物学和更好地评价重要的临床相关问题(诸如恶性肿瘤的诊断或复发的检测)(仅提及两个关键主题)，生物标志物是至关重要的。
一类在肿瘤学领域中特别感兴趣的生物标志物是一类增殖生物标志物，包括Ki-67，增殖细胞核抗原(PCNA)和胸苷激酶(TK-1)。任何肿瘤都包含相对较高分数的增殖细胞，并且增殖的标志物应该能够鉴定那些增殖的恶性细胞。现有文献表明胸苷激酶是在组织水平上，即如果通过免疫组织化学测量，相当有用的标志物。
血清TK1活性测量已用于几种不同的恶性疾病的监测和预后目的，但主要是在白血病和淋巴瘤的情况下。然而，用于测量来自体液(如血清)的循环胸苷激酶的免疫测定是惊人的，并且血清TK-1蛋白的免疫测定尚未广泛用于常规临床诊断中。
胸苷激酶1(缩写：TK1或TK-1)(ATP：胸苷5'-磷酸转移酶，EC 2.7.1.21)是一种参与DNA前体合成的酶。人胸苷激酶1(hTK-1或hTK1)的序列是已知的，并在SEQ ID NO:1中给出。
血清TK1活性可以使用放射性底物1251-dUrd (the PROLIFIGEN® TK-REA,DiaSorin Inc.)测量。近年来已经可以使用非放射定量的TK1活性测定(TK LIAISON®测定, DiaSorin Inc.)。这是灵敏且稳健的测定，并且已经在具有血液恶性病的人和狗中提供了有价值的临床信息，尤其是用于监测疗法和预测复发。
在本说明书中，引用了许多文件，包括专利申请和生产商的手册。尽管不被认为与本发明的专利性有关，但这些文件的公开内容以其整体通过引用并入本文。更具体地，所有参考文件都通过引用并入，达到如同明确地且单独地指出每篇单独文件通过引用并入相同的程度。
在过去的几十年中，已经进行许多尝试来产生针对hTK-1的有用的、灵敏和特异性的抗体。然而，迄今为止描述和可用的抗体不能满足开发用于从体液样品测量hTK-1的可靠且灵敏的免疫测定的要求。
因此，本公开的发明人的任务是开发新型的单克隆抗体，其一旦用于标准免疫测定方法中，就允许可靠检测和定量来自体液样品的hTK-1。
本发明通过提供如权利要求书中所限定的实施方案来解决该需求。
令人惊讶地，已经发现并可以显示，针对人胸苷激酶1(hTK-1；SEQ ID NO:1)的单克隆抗体解决了本发明的基本问题，所述单克隆抗体结合hTK-1的构象依赖性表位，但不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，并且不结合由hTK-1的15个连续氨基酸组成的任何多肽。
发明概述：
在一个实施方案中，本公开涉及特异性结合人胸苷激酶1 (hTK-1; SEQ ID NO:1)的单克隆抗体，所述抗体的特征在于其
a) 结合hTK-1的构象依赖性表位，
b) 不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，且
c) 不结合由hTK-1的15个连续氨基酸组成的任何多肽。
在一个实施方案中，本公开涉及用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：
a) 将应当定量其中的hTK-1的样品与特异性结合人胸苷激酶1 (hTK-1; SEQ ID NO:1)的抗体孵育，由此生成所述抗体和hTK-1之间的复合物，所述抗体的特征在于其(i) 结合hTK-1的构象依赖性表位，(ii) 不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，且(iii) 不结合权利要求1或2的由hTK1的15个连续氨基酸组成的任何多肽，和
b) 定量步骤a)中形成的复合物，由此定量hTK-1。
进一步，证明了如本公开中所公开的针对hTK-1的抗体在定量hTK-1中的用途。
详述：
在第一个实施方案中，本说明书涉及特异性结合人胸苷激酶1 (hTK-1; SEQ ID NO:1)的单克隆抗体，所述抗体的特征在于其a)结合hTK-1的构象依赖性表位，b)不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，且c)不结合由hTK-1的15个连续氨基酸组成的任何多肽。
人胸苷激酶1是由如SEQ ID NO:1中所示的234个氨基酸组成的酶。在人类生物中，TK-1以各种形式(诸如二聚体、四聚体和高分子量的聚合物)存在。这些形式似乎取决于某些分子的存在，例如三磷酸腺苷(ATP)的存在或不存在；hTK-1蛋白本身的浓度，蛋白的类型，即天然或重组TK 1；和蛋白的位点/位置，即在血清或细胞质中。
通常，胞质和重组人TK1在ATP存在或高浓度的情况下主要作为四聚体出现，并且在ATP不存在或低浓度的情况下作为二聚体出现。胞质和重组人TK1的四聚体形式具有高TK1活性，而二聚体形式具有较低的TK1活性。
与之形成鲜明对比的是，人血清TK1可以呈高分子量复合物的形式，诸如具有血清TK1活性的寡聚体或包含此类寡聚体的复合物，以及具有非常低或甚至缺乏血清TK1活性的二聚体和四聚体形式。
为了生成针对hTK-1的单克隆抗体，许多尝试已经进行并且在现有技术中进行描述。这些抗体中的一些是市售的，如来自Abcam的3B3.E11；来自Abnova的兔单克隆抗体EPR3194和EPR3193，但与血清TK1的反应不够好。这些抗TK1抗体已经基于人重组TK1生成。因此，已经假定(WO 2015/094106)，基于人重组TK1的单克隆抗TK1抗体的生成通常低效，并且通常将不产生能够以足够的结合强度结合血清形式的TK1的抗TK1抗体。
与负面经验相反，并且与现有技术中的一般假设相反，现在令人惊讶地发现，可能使用重组hTK-1作为免疫原以获得根据本发明的抗体。
根据本发明的抗体结合构象依赖性表位，因为跨越hTK-1的整个序列并移位一个氨基酸的15-聚体线性肽无一被本发明中公开的任何抗体结合。
抗体的整体结构包含通过二硫键连接的两条重链和两条轻链。重链和轻链各自由一个恒定结构域和一个可变结构域组成。对抗原的结合特异性由形成抗体的轻链和重链的可变结构域提供。更具体地，决定其特异性并与特定配体接触的抗体部分被称为互补性决定区(CDR)。CDR是分子的最可变部分，并且促成这些分子的多样性。每个可变结构域中存在三个CDR区域CDR1、CDR2和CDR3，其嵌入四个框架区(FW)中。如本文所用，CDR-HC (或CDR(HC))描绘了可变重链的CDR区域，且CDR-LC (或CDR(LC))涉及可变轻链的CDR区域。类似地，FW-HC (或FW(HC))描绘了可变重链的框架区，且FW-LC (或FW(LC))涉及可变轻链的框架区。
如根据本发明使用的术语“包含”表示，除特别列举的序列和/或组分之外还可以包括另外的序列/组分。然而，该术语还涵盖所请求保护的主题正是由所列举的序列和/或组分组成。
在其中本发明的抗体包括不止所列举的氨基酸序列的那些实施方案中，额外的氨基酸可以存在于N-末端或C-末端，或两者。额外的序列可以包括例如引入的序列例如用于纯化或检测，如以下在本文中详细讨论。此外，在单个序列“包含”所列举的序列的情况下，它们还可以在N-末端或C-末端或两者处包括额外的氨基酸。
根据本发明，抗体特异性结合SEQ ID NO:1的人胸苷激酶1 (hTK-1)。应当理解，在本发明的抗体包含额外氨基酸的情况下，如上所详述，所述抗体也一定必须特异性结合hTK-1。
根据本发明，术语“特异性结合”(在本文中也被称为“特异性相互作用”)意味着，该抗体仅特异性结合hTK-1，但不与或基本上不与不同的蛋白，特别是相似结构的不同蛋白(诸如例如胸苷激酶2 (SEQ ID NO:5))交叉反应。
例如，在Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press和Harlow & Lane (1999) Using Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述了用于分析抗体的特异性的相应方法。合适研究的非限制性实例是例如在结构上和/或在功能上密切相关的分子的结合研究、阻断和竞争研究。这些研究可以通过诸如例如以下的方法实施：FACS分析、流式细胞计数滴定分析(FACS滴定)、表面等离振子共振(SPR，例如用BIAcore®)、等温滴定量热法(ITC)、荧光滴定或通过放射性标记的配体结合测定。另外的方法包括例如Western印迹、ELISA (包括竞争ELISA)-、RIA-、ECL-和IRMA-测试。
在本发明的上下文中，术语“抗体”涉及完整的免疫球蛋白分子以及其抗原结合片段，如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv。此外，该术语涉及修饰的和/或改变的抗体分子，以及重组地或合成地生成的/合成的抗体。术语“抗体”也包含双功能抗体、三功能抗体、全人抗体、嵌合抗体和抗体构建体，如单链Fv (scFv)或抗体-融合蛋白。
如本文所用的“Fab片段”由一条轻链以及一条重链的CH1和可变区构成。Fab分子的重链不可与另一个重链分子形成二硫键。“Fab'片段”含有一条轻链和一条重链的一部分，该部分含有VH结构域和C H1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段构成，它们通过两条重链之间的二硫键保持在一起。
Fab/c片段含有Fc和Fab决定簇两者，其中“Fc”区域含有两个重链片段，其包含抗体的CH2和CH3结构域。两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。
“Fv区域”包含来自重链和轻链两者的可变区，但缺乏恒定区。在本发明的上下文中，“单链Fv”(也缩写为“scFv”)是具有抗体的VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使scFv能够形成期望的结构用于抗原结合。例如Plückthun在The Pharmacology of MonoclonalAntibodies, Rosenburg和Moore编.Springer-Verlag, N.Y.113 (1994), 269-315中描述了用于产生单链抗体的技术。
术语“嵌合抗体”是指包含人类或非人类物种的可变区的抗体，所述可变区与来自另一人类或非人类(例如，小鼠、马、兔、狗、牛、鸡)物种的抗体区域(例如，恒定区)融合或嵌合。
如上所述，术语“抗体”也涵盖抗体构建体，诸如抗体-融合蛋白，其中除了本文中由特定氨基酸序列定义的结构域以外，所述抗体包含一个或多个额外的结构域，例如用于分离和/或制备重组产生的构建体。
可以产生本发明的抗体，使得它是重组抗体，例如重组兔抗体或异源-杂合抗体，但仍包含本发明所公开和定义的CDR。
术语“重组抗体”包括通过重组方式制备、表达、建立或分离的所有抗体。重组抗体是例如通过B-细胞PCR获得的抗体或从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体, 使用转染进宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他方式制备、表达、建立或分离的抗体。如通过B-细胞PCR产生的重组兔抗体具有源自兔种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(如果存在的话)。即，B-细胞PCR的直接结果是抗体的结合相关片段，并且技术人员对于例如构建全长抗体、嵌合抗体没有任何问题，或者对于将期望/需要的“抗体”没有任何问题。
术语“异源-杂合抗体”是指具有源自不同生物的轻链和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链缔合的人重链的抗体是异源-杂合抗体。异源-杂合抗体的实例包括嵌合的和人源化的抗体。
根据本发明的抗体或其抗原结合片段a)结合人胸苷激酶1 (hTK-1; SEQ ID NO:1)上的构象依赖性表位，b)不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，且c)不结合由hTK-1的15个连续氨基酸组成的任何多肽。
通过使用N-末端生物素化的SEQ ID NO:2的肽来确定抗hTK-1抗体与SEQ ID NO:2的肽的结合，或者不与之结合。这种肽与链霉抗生物素蛋白包被的固相结合，并且根据标准程序确定结合或不结合。以基本上相同的方式确定抗hTK-1抗体与由hTK-1的15个连续氨基酸组成的任何多肽的结合或不结合。为了后者的目的，合成N-末端生物素化的由hTK-1的15个连续氨基酸组成的每个15-聚体多肽，并且测试抗体的结合或不结合。每种肽与链霉抗生物素蛋白包被的固相结合，并根据标准程序确定结合或不结合。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体与包含SEQ ID NO:3的可变重链(vHC)和SEQ ID NO:4的可变轻链(vLC)的抗体结合相同的表位。这种抗体可以是给定的特定抗体的变体，并且例如可以包含氨基酸取代，或者在可选方案中可以具有不同的vHC或不同的vLC或两者。
根据本发明，术语“取代”是指氨基酸被另一种氨基酸替换。因此，氨基酸的总数保持相同。术语“取代”明确地不涵盖在特定位置的氨基酸的缺失和在不同位置的一个(或多个)氨基酸的引入。根据本发明，取代可以是保守的氨基酸取代或非保守的氨基酸取代。术语“保守的氨基酸取代”是本领域中众所周知的，并且是指用具有相似结构和/或化学特性的不同氨基酸替换氨基酸。此类相似性包括例如所涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性。如果以下组之一的一种氨基酸被同一组的另一种氨基酸取代，则该氨基酸取代是保守的氨基酸取代：非极性(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性的)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；且带负电荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
抗体的“结合亲和力”根据以下方程式测量靶标抗原上的表位和抗体的结合位点之间的相互作用的强度：
KD = kd/ka
其中：
KD = 解离平衡常数[M]
kd = 解离速率常数[s-1]
ka = 结合速率常数[M-1 s-1]。
抗体的结合亲和力的另外的相关参数如下：
t/2 = 解离复合物半衰期= ln2/kd/60 [min]
Rmax = 分析物最大应答[RU]
MR: 摩尔比=分析物的最大应答(Rmax)的比率。
在一个实施方案中，如上文公开的针对hTK-1的单克隆抗体在37℃以10分钟或更长时间的t/2-diss结合hTK-1。
在一个实施方案中，根据本公开的单克隆抗体的特征在于其具有10-9 M或更好的与hTK-1的结合亲和力。在一个实施方案中，根据本公开的单克隆抗体的特征在于其具有5x10-10 M或更好，或2x10-10 M或更好的与hTK-1的结合亲和力。从现有技术已知的抗体或者没有这样好的亲和力或者结合hTK-1上的线性表位或者两者兼有。
根据实施例部分中公开的方法产生特异性结合人胸苷激酶1 (hTK-1; SEQ IDNO:1)的几种非常好的单克隆抗体，每种这样的抗体的特征在于其a)结合hTK-1的构象依赖性表位，b)不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，且c)不结合由hTK-1的15个连续氨基酸组成的任何多肽。令人惊讶地，所有三种示例性抗体都结合非常相似或相同的表位。不希望受到理论的束缚，看起来，由根据本发明的抗体结合的构象表位在建立可用于临床常规中的灵敏的免疫测定中是绝对关键的。现在已经鉴定该关键的表位，将相当容易找到结合该表位的其他单克隆抗体。可以遵循本文公开的程序或通过修饰本文公开的抗体的序列容易地产生此类抗体。
已经令人惊讶地发现，所有三种抗体都结合相同的表位。由于它们的生成方式，这些重组兔单克隆抗体的结合最好经由在B-细胞PCR中获得的序列(即经由B-细胞PCR获得的重链可变结构域和轻链可变结构域的部分)来定义。已选择MAB 6C6作为原型抗体用于定义共同表位。MAB 6C6的特征在于SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域。
在一个实施方案中，本发明提供了与本发明的单克隆抗体或其结合片段结合人TK-1上的相同的表位的抗体，所述本发明的单克隆抗体或其结合片段具有SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域。结合hTK-1上的相同的表位的抗体是与具有SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的抗体竞争结合hTK-1的抗体。
可以在标准hTK-1结合测定中基于它们与单克隆兔抗体MAB 6C6(即包含SEQ IDNO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的抗体)竞争的能力来鉴定此类竞争抗体。例如，可以使用BIAcore分析、ELISA测定法或流式细胞术来证明与具有SEQ IDNO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的单克隆抗体或其结合片段的竞争。
测试抗体抑制单克隆兔抗体MAB 6C6与人TK-1结合的能力证明，该测试抗体可以与单克隆兔抗体MAB 6C6竞争结合hTK-1上的相同的表位并且与单克隆兔抗体MAB 6C6结合hTK-1上的相同的表位。
如所提及，可以使用几种不同的竞争测定法来鉴定与具有SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的兔单克隆抗体MAB 6C6或其结合片段竞争的抗体。
在示例性竞争测定中，将固定的hTK-1在包含结合hTK-1的第一标记抗体(例如，具有SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的抗hTK-1单克隆抗体或其结合片段)和第二未标记的抗体的溶液中孵育，其中测试所述第二未标记的抗体与第一抗体竞争结合hTK-1的能力。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定的hTK-1在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与hTK-1结合的条件下孵育后，除去过量的未结合抗体，并测量与固定的hTK-1缔合的标记物的量。如果相对于对照样品，测试样品中与固定的hTK-1缔合的标记物的量显著减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合hTK-1。参见，例如，Harlow等人 Antibodies: ALaboratory Manual. Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY, 1988)。
最好经由实时的基于生物传感器的分子相互作用测量(如表面等离振子共振光谱法，Biacore技术已成为其同义词)来确定抗体(例如，抗hTK-1抗体)的结合特性。在Biacore系统中，还可以分析抗体与相同表位的竞争结合(即与相同表位或重叠表位的结合)。实验细节在实施例3中给出，并且动力学数据显示于表1中。在一个实施方案中，表征抗体与如本文所鉴定的构象依赖性表位的结合的竞争实验在BIAcore仪器上进行，如实施例部分中所述。
几种用于测量hTK-1蛋白的非自动化测定法是可用的。影响最大的测定法可能是Arocell的hTK-1测定法，其基于微量滴定板形式，需要几个手动操作步骤和相当长的孵育时间。然而，如上所提及 – 最可能是由于缺乏适当的抗体 – 迄今为止没有在自动化免疫测定分析仪上运行的针对hTK-1的免疫测定法可用。然而，根据本发明的抗体克服了该问题。其在hTK-1的体外测量中的使用可以具有很大的优势。
在一个实施方案中，本公开涉及用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：a)将应当定量其中的hTK-1的样品与特异性结合人胸苷激酶1 (hTK-1; SEQ ID NO:1)的抗体孵育，由此生成所述抗体和hTK-1之间的复合物，所述抗体的特征在于其(i)结合hTK-1的构象依赖性表位，(ii)不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，且(iii)不结合权利要求1或2的由hTK1的15个连续氨基酸组成的任何多肽，和b)定量步骤a)中形成的复合物，由此定量hTK-1。
可以利用本发明的抗体的免疫测定的实例是直接或间接形式的免疫测定。此类免疫测定的实例是酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)或基于发光、荧光、化学发光或电化学发光的检测的免疫测定。
在一个实施方案中，在hTK-1的测量中采用夹心免疫测定。
本文还公开了用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：a)将应当定量其中的hTK-1的样品与作为根据本公开的抗体的第一抗体和针对hTK-1的第二抗体孵育，由此生成所述第一抗体、hTK-1和所述第二抗体之间的夹心复合物，b)定量步骤a)中形成的夹心复合物，由此定量hTK-1。
有趣的是，根据本发明的单克隆抗体可以用于在对这种样品预处理或不预处理的情况下检测血清或血浆样品中存在的hTK-1。这意味着本发明的抗体还结合血清或血浆样品中存在的寡聚hTK-1。在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的抗体在检测hTK-1中的用途，其中所述样品未用还原剂预处理。
在现有技术中，通常对血清或血浆样品进行预处理，以生成hTK-1的四聚和酶促高活性形式。样品的预处理和从这种预处理的样品测量hTK-1代表了一种非常有吸引力的方法，因为以这种方式，例如可以实现与hTK-1酶促活性的非常好的相关性。
适当的预处理试剂的选择完全在本领域技术人员的能力之内。这种预处理试剂将至少包含还原剂，以将寡聚hTK-1转化为四聚hTK-1。如例如Sharif等人, (BMCBiochemistry (2012), 13:12)所述，经由凝胶过滤实验容易评价还原剂是否有效，以及hTK-1在处理后是否主要作为四聚体存在。对于技术人员而言，几种不同的还原剂是关键的，例如，二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)或二硫代丁基胺(DTBA)。此外，以如下方式将选择预处理试剂的浓度，使得在适当的孵育时间后或在稀释步骤后，其将不对用于测量hTK-1蛋白的任何抗体产生负面影响。在使用二硫代丁基胺(DTBA)作为还原剂的情况下，样品预处理步骤(样品和预处理试剂的混合物)中的适当的最终浓度在5 mM的范围内。在预稀释和/或添加阻断DTT的试剂之后，和/或通过用包含第一抗体的缓冲液稀释之后，氧化形式的DTT的浓度优选为1.5mM或更低。这样，就没有还原剂对所用的任何免疫试剂的影响。
如上所述，ATP稳定hTK-1的四聚体形式。ATP的后一种功能使其成为例如预处理缓冲液的有吸引力的添加剂。在一个实施方案中，预处理缓冲液包含如上所讨论的还原剂和ATP。样品预处理步骤中的ATP的浓度不应低于1.25 mM。预处理步骤中的ATP浓度的一个良好的选择将在2 mM至20 mM的范围内。
在一个实施方案中，本公开涉及用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：a)将应当定量其中的hTK-1的样品与包含还原剂和ATP的预处理溶液孵育；b)将步骤a)中获得的预处理样品与根据本发明的抗体孵育，由此生成所述抗体和hTK-1之间的复合物，c)定量步骤b)中形成的复合物，由此定量hTK-1。
夹心免疫测定法广泛用于检测目标分析物。在这种测定中，将分析物“夹在”第一抗体和第二抗体之间。通过适当的手段，测量这种夹心复合物，且由此定量分析物。
在一个实施方案中，本公开涉及用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：a)将应当定量其中的hTK-1的样品与包含还原剂和ATP的预处理溶液孵育；b)将步骤a)中获得的预处理样品与作为根据本发明的抗体的第一抗体和针对hTK-1的第二抗体孵育，由此生成所述第一抗体、hTK-1和所述第二抗体之间的夹心复合物，c)定量步骤b)中形成的夹心复合物，且由此定量hTK-1。
在一个实施方案中，本发明的方法以夹心测定形式实施。
在典型的夹心型测定中，与固相结合或能够与之结合的第一抗体和可检测地标记的第二抗体各自在不同且不重叠的表位处结合分析物。第一分析物-特异性结合剂(例如抗体)与固体表面共价或被动结合。固体表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。固体支持物可以呈管、珠粒、微板的圆盘或任何其他适合于进行免疫测定的表面的形式。结合过程是本领域中众所周知的，并且通常由交联共价结合或物理吸附组成，洗涤聚合物-抗体复合物以制备测试样品。然后将待测样品的等分试样添加至固相复合物，并持续足够的时间段(例如2-40分钟或如果更方便，则过夜)和在适当的条件下(例如，室温至40℃，诸如在25℃和37℃之间(包括端值))孵育以允许第一抗体或捕获抗体和相应抗原之间的结合。在孵育时段之后，可以洗涤包含第一或捕获抗体和与之结合的抗原的固相，并与结合抗原上的另一表位的第二或标记抗体一起孵育。第二抗体与报告分子连接，所述报告分子用于指示第二抗体与第一抗体和目标抗原的复合物的结合。
一种非常通用的替代夹心测定形式包括使用由结合对的第一配偶体包被的固相，例如顺磁性链霉抗生物素蛋白包被的微粒。将此类微粒与结合至结合对的第二配偶体的分析物-特异性结合剂(例如，生物素化抗体)、怀疑包含或包含分析物的样品(其中结合对的所述第二配偶体与所述分析物-特异性结合剂结合)和可检测地标记(例如，用如本文所用的电化学发光标记物)的第二分析物-特异性结合剂一起混合和孵育。如对技术人员显而易见，将这些组分在适当的条件和时间段下孵育，所述条件和时间段足以使标记的抗体经由分析物、分析物-特异性结合剂(其结合至)结合对的第二配偶体，以及结合对的第一配偶体与固相微粒结合。适当时，这种测定可以包括一个或多个洗涤步骤。
在一个实施方案中，本公开涉及夹心测定法，其中第一或第二抗体结合固相或能够结合固相，且其中第二或第一抗体分别被可检测标记，且其中这些抗体中的至少一种是如本发明中所公开的抗体。
通常，夹心测定要求捕获和检测抗体结合目标分析物上的不同、不重叠的表位。在血清/血浆hTK-1的情况下，优选测量如上所述生成的酶的四聚体形式。在用于定量hTK-1的夹心测定方法中，在一个实施方案中，根据本发明的抗体与结合hTK-1的C-末端部分(如由范围为位置195至C-末端(即位置234)的氨基酸(SEQ ID NO:5)所代表)上的表位的抗体或与结合由范围为位置195至位置225的氨基酸组成的多肽(SEQ ID NO:2)中包含的表位的抗体组合使用。在一个实施方案中，在夹心测定中使用根据本发明的抗体和结合hTK-1的氨基酸211至230(SEQ ID NO:6)中包含的表位的抗体，用于测量hTK-1。
如可根据本发明的发明人显示，甚至可能使用根据本发明的抗体用于两者，即作为捕获抗体(作为夹心复合物一部分)和检测抗体(作为夹心复合物的另一部分)。因此，在一个实施方案中，使用根据本发明的抗体作为捕获抗体和检测抗体两者，通过夹心测定法进行hTK-1的定量。
在用于定量hTK-1的夹心免疫测定方法中，至少一种针对hTK-1的抗体包含可检测的标记物。
术语“可检测标记的”涵盖可以直接或间接检测的标记物。
可直接检测的标记物或者提供可检测的信号，或者它们与第二标记物相互作用以修改由第一或第二标记物提供的可检测信号，例如，产生FRET (荧光共振能量转移)。标记物诸如荧光染料和发光(包括化学发光和电化学发光)染料(Briggs等人 "Synthesis ofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and AminoAcids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans.1 (1997) 1051-1058)提供可检测信号，并且通常适用于标记。在一个实施方案中，“可检测标记的”是指提供或可诱导以提供可检测信号的标记物，即分别是指荧光标记物、发光标记物(例如化学发光标记物或电化学发光标记物)、放射性标记物或基于金属-螯合物的标记物。
通常可以分为以下类别的许多标记物(也被称为染料)是可用的，它们全部一起以及它们的每一种代表根据本公开的实施方案：
(a) 荧光染料
荧光染料例如由Briggs等人 "Synthesis of Functionalized Fluorescent Dyesand Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1(1997) 1051-1058)描述。
荧光标记物或荧光团包括稀土螯合物(铕螯合物)、荧光素型标记物，包括FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明型标记物，包括TAMRA；丹磺酰基；丽丝胺；花菁类；藻红蛋白类；德克萨斯红；及其类似物。可以使用本文公开的技术，将荧光标记物缀合至靶标分子中包含的醛基团。荧光染料和荧光标记物试剂包括由Invitrogen/Molecular Probes(Eugene, Oregon, USA)和Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Ill.)市售的那些。
(b) 发光染料
发光染料或标记物可以进一步细分为化学发光的和电化学发光的染料。
不同类别的化学发光标记物包括鲁米诺、吖啶鎓化合物、腔肠素和类似物、二氧杂环丁烷类、基于过氧草酸及其衍生物的系统。对于免疫诊断程序，主要使用基于吖啶鎓的标记物(详细概述于Dodeigne C.等人, Talanta 51 (2000) 415-439中给出)。
用作电化学发光标记物的主要相关的标记物分别是基于钌和铱的电化学发光复合物。电化学发光(ECL)被证明作为高度灵敏和选择性的方法在分析应用中非常有用。其组合化学发光分析的分析优势(无背景光学信号)与易于通过施加电极电位进行反应控制。通常使用以液相或液-固界面中的TPA(三丙胺)再生的钌络合物，特别是[Ru (Bpy)3]2+ (其在~620 nm处释放光子)作为ECL-标记物。
电化学发光(ECL)测定提供了目标分析物的存在和浓度的灵敏和精确的测量。此类技术使用当在适当的化学环境中电化学氧化或还原时，可以被诱导发光的标记物或其他反应物。此电化学发光由以特定时间和特定方式施加在工作电极上的电压触发。测量由标记物产生的光且所述光指示分析物的存在或量。为了更全面描述此类ECL技术，可以参考美国专利号5,221,605、美国专利号5,591,581、美国专利号5,597,910、PCT公开申请WO90/05296、PCT公开申请WO92/14139、PCT公开申请WO90/05301、PCT公开申请WO96/24690、PCT公开申请US95/03190、PCT申请US97/16942、PCT公开申请US96/06763、PCT公开申请WO95/08644、PCT公开申请WO96/06946、PCT公开申请WO96/33411、PCT公开申请WO87/06706、PCT公开申请WO96/39534、PCT公开申请WO96/41175、PCT公开申请WO96/40978、PCT/US97/03653和美国专利申请08/437,348 (美国专利号 5,679,519)。还参考1994年Knight等人的ECL分析应用的综述(Analyst, 1994, 119:879-890)和其中引用的参考文献。在一个实施方案中，使用电化学发光标记物来实施根据本说明书的方法。
最近还已经描述了基于铱的ECL标记物(WO2012107419(A1))。
在一个实施方案中，可直接检测的标记物是化学发光标记物或电化学发光标记物。测量由标记物产生的光且所述光直接或间接指示分析物的存在或量。
(c) 放射性标记物利用放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、11C、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Gn、86Y、89Zr、99TC、111In、123I、124I、125I、131I、133Xe、177Lu、211At或131Bi。
(d) 适合作为用于成像和治疗目的的标记物的金属-螯合物络合物是本领域众所周知的(US 2010/0111856; US 5,342,606; US 5,428,155; US 5,316,757; US 5,480,990; US 5,462,725; US 5,428,139; US 5,385,893; US 5,739,294; US 5,750,660; US5,834,456; Hnatowich等人, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157; Meares等人,Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78; Mirzadeh等人, Bioconjugate Chem. 1 (1990)59-65; Meares等人, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26; Izard等人, BioconjugateChem. 3 (1992) 346-350; Nikula等人, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90; Camera等人, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62; Kukis等人, J. Nucl. Med. 39 (1998)2105-2110; Verel等人., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Camera等人, J.Nucl. Med. 21 (1994) 640-646; Ruegg等人, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226;Verel等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670; Lee等人, Cancer Res. 61 (2001)4474-4482; Mitchell,等人, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112; Kobayashi等人Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111; Miederer等人, J. Nucl. Med. 45 (2004)129-137; DeNardo等人, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90; Blend等人,Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363; Nikula等人 J.Nucl. Med. 40 (1999) 166-76; Kobayashi等人, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36;Mardirossian等人, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74; Roselli等人, CancerBiotherapy & Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20)。
令人费解的发现是，尽管hTK-1事实上已知数十年，并且尽管进行了许多许多尝试来产生良好的免疫测定，但仍然没有可结合构象表位且可用于hTK-1的灵敏检测中的高质量的针对hTK-1的抗体。不想被理论所束缚，但是，可以想象这种缺乏/失败与hTK-1可能在某种程度上被通过免疫诱导的抗体阻断的事实有关。不应忘记，标准杂交瘤技术依靠HAT-培养基(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)来选择杂交瘤，即杂交瘤必须能够使用添加至选择培养基中的胸苷以克服氨基蝶呤的毒性作用。现在成功产生的hTK-1单克隆抗体经由B-细胞PCR技术获得。在B-细胞PCR技术中，不使用HAT培养基，并且经由该技术产生的抗体对hTK-1的阻断可能不太相关或完全不相关。
在本公开的相应部分中显示的实施例中，已经将兔用作实验动物，其用hTK-1免疫，并将其B-细胞用于兔B-细胞PCR技术中。如显而易见，B-细胞PCR技术还可以用于其他实验动物，如小鼠，或者如果有需求，可以对于其他实验动物类似地确立。因此，尽管兔中的B-细胞PCR代表一个实施方案，但使用B-细胞PCR技术用于生成抗hTK-1抗体不限于该物种。
在一个实施方案中，根据本发明的针对hTK-1的抗体通过B-细胞PCR技术获得。
如上文更详细描述，如本发明中所公开的针对HTK-1的抗体可以在hTK-1的检测中以很大优势使用。因此，在一个实施方案中，本发明涉及如本文公开的抗体在定量hTK-1中的用途。
熟练的技术人员显而易见，在检测hTK-1的方法中使用根据本发明的抗体将是有利的。
在一个实施方案中，本公开涉及检测样品中的hTK-1的方法，所述方法包括以下步骤：a)在足以形成抗hTK-1抗体/hTK-1复合物的时间和条件下使该样品与根据本公开的抗hTK-1抗体接触；和b)测量抗hTK-1抗体/hTK-1复合物，其中该复合物的量指示样品中hTK-1的浓度。使用术语“/”例如在“抗hTK-1抗体/hTK-1复合物”中来指示，在作为一方面的抗hTK-1抗体和作为另一方面的hTK-1之间形成非共价复合物。
在一个实施方案中，本发明涉及检测样品中的hTK-1的方法，所述方法包括以下步骤：a)在足以形成第一抗hTK-1抗体/hTK-1/第二抗hTK-1抗体复合物的时间和条件下使样品与针对hTK-1的第一抗体和针对hTK-1的第二抗体接触，其中所述第二抗体被可检测地标记；和b)测量在(a)中形成的复合物，其中该复合物的量指示样品中hTK-1的浓度，并且其中第一或第二抗体是根据本发明的抗体。
熟练的技术人员显而易见，可以在足以形成第一抗hTK-1抗体/hTK-1/第二抗hTK-1抗体复合物的时间和条件下使样品以任何期望的顺序与第一抗体和第二抗体接触，即先接触第一抗体，再接触第二抗体；第二抗体早于第一抗体；或同时。
熟练的技术人员容易理解，确定适合或足以形成在特异性抗hTK-1抗体和hTK-1抗原/分析物之间的复合物(=抗hTK-1抗体/hTK-1复合物)或者形成包含针对hTK-1的第一抗体、hTK-1 (分析物)和第二抗hTK-1抗体复合物的第二或夹心复合物(=第一抗hTK-1抗体/hTK-1/第二抗hTK-1抗体复合物)的时间和条件，仅是常规的实验。
抗hTK-1抗体/hTK-1复合物的检测可以通过任何适当的方式进行。本领域技术人员绝对熟悉此类方式/方法。
术语“样品”或“目标样品”或“测试样品”在本文中可互换地使用。所述样品是体外样品，其将在体外进行分析，且不转移回体内。样品的实例包括、但不限于流体样品，诸如血液、血清、血浆、滑液、尿液、唾液和淋巴液，或固体样品，诸如组织提取物、软骨、骨、滑膜和结缔组织。在一个实施方案中，所述样品选自血液、血清、血浆、滑液和尿。在一个实施方案中，所述样品选自血液、血清和血浆。在一个实施方案中，所述样品是血清或血浆。
如本文所用的术语“参考样品”是指以与目标样品基本相同的方式进行分析并且将其信息与目标样品的信息进行比较的样品。由此，参考样品提供了一种标准，其允许评估从目标样品获得的信息。参考样品可以源自健康的或正常的组织、器官或个体，由此提供组织、器官或个体的健康状态的标准。正常参考样品的状态和目标样品的状态之间的差异可能指示疾病发展的风险或此类疾病或病症的存在或进一步进展。参考样品可以源自异常的或患病的组织、器官或个体，由此提供组织、器官或个体的患病状态的标准。异常参考样品的状态和目标样品的状态之间的差异可能指示疾病发展的低风险或这种疾病或病症的不存在或改善。
术语“升高的”或“增加的”指示剂水平是指样品中的这种指示剂的水平与参考或参考样品中这种指示剂的水平相比更高。例如，与未患有所述疾病的个体的相同流体样品相比，在患有给定疾病的一个个体的流体样品中以更高的量可检测的蛋白具有升高的水平。
在某些实施方案中，将形成包含针对hTK-1的第一抗体、hTK-1 (分析物)和针对hTK-1的第二抗体的夹心，其中所述第二抗体被检测地标记。
在一个实施方案中，将形成包含针对hTK-1的第一抗体、hTK-1 (分析物)和针对hTK-1的第二抗体的夹心，其中所述第二抗体被可检测地标记，并且其中第一抗hTK-1抗体能够结合固相或结合固相。
在一个实施方案中，本发明中公开的抗hTK-1抗体用于免疫测定中以测量hTK-1。在一个实施方案中，上文公开的抗hTK-1抗体用于夹心型免疫测定中。在一个实施方案中，本发明公开的抗hTK-1抗体被用作检测抗体。在一个实施方案中，本文公开的抗hTK-1抗体被发光染料(尤其是化学发光染料或电化学发光染料)可检测地标记。
本发明的描述和实施例公开并涵盖了这些和其他实施方案。使用例如电子设备，可以从公共图书馆和数据库中检索与根据本发明待采用的方法、用途和化合物中的任一种有关的其他文献。例如，可以利用在因特网上可得的公共数据库“Medline”，例如在万维网中在ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html下。本领域技术人员已知在万维网中可得到的其他数据库和地址，诸如ncbi.nlm.nih.gov/、fmi.ch/biology/research_tools.html、tigr.org/或infobiogen.fr/，并且也可以使用万维网中在lycos.com下的地址获得。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同含义。在冲突的情况下，以专利说明书(包括定义)为准。
如在本领域中通常进行的，本文提供的所有氨基酸序列的呈现均从最N-末端残基开始并以最C-末端残基结束(N→C)，并且贯穿本发明用来鉴定氨基酸的单字母或三字母代码缩写对应于通常用于氨基酸的那些。
关于在本说明书中、特别是在权利要求中表征的实施方案，在从属权利要求中提及的每个实施方案意图与所述从属权利要求所引用的每个权利要求(独立或从属权利要求)的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1描述3个可选方案A、B和C、从属权利要求2描述3个可选方案D、E和F、且权利要求3从属于权利要求1和2并描述3个可选方案G、H和I的情况下，应当理解，说明书毫无疑义地公开了与以下组合对应的实施方案：A、D、G；A，D，H；A，D，I；A，E，G；A，E，H；A，E，I；A，F，G；A，F，H；A，F，I；B，D，G；B，D，H；B，D，I；B，E，G；B，E，H；B，E，I；B，F，G；B，F，H；B，F，I；C，D，G；C，D，H；C，D，I；C，E，G；C，E，H；C，E，I；C，F，G；C，F，H；C，F，I，除非另外特别提及。
类似地，且也在独立权利要求和/或从属权利要求没有描述可选方案的那些情况下，应当理解，如果从属权利要求回引多个前述权利要求，由其覆盖的主题的任意组合被视作明确地公开。例如，在独立权利要求1、从属权利要求2回引权利要求1且从属权利要求3回引权利要求2和1二者的情况下，则由此权利要求3和1的主题的组合被清楚地且明白地公开，权利要求3、2和1的主题的组合也是如此。在引用权利要求1-3中的任一项的另一个从属权利要求4存在的情况下，则由此权利要求4和1的主题、权利要求4、2和1的主题、权利要求4、3和1的主题、以及权利要求4、3、2和1的主题的组合被清楚地且明白地公开。
以上考虑经适当修改后适用于所有所附权利要求。为了给出一个非限制性实例，考虑到权利要求结构，清楚且明确地设想了权利要求8、5和1的组合。这同样适用于例如权利要求8、7和2的组合等。
还通过附图示出了本发明的某些方面。
附图说明：
图1：用于确定hTK-1表位可及性的Biacore测定配置的示意图。描绘了各个孵育步骤的顺序。
图2：分别用原型A)(=图2a)和原型B)(=图2b)获得的免疫测定数据的图形表示。分别在图2a和图2b的左手部分，给出Box-Whisker-图(箱线图)。在y-轴上(以对数标度)，显示以ng/ml计的浓度。在这两个图的右手部分中，显示曲线下面积(AUC)。(缩写：Ctr =对照样品；DLBCL =来自具有弥漫性大B-细胞淋巴瘤的患者的样品)。
图3：LIAISON®胸苷激酶(活性)测定数据的图形表示。在图3的左手部分，给出Box-Whisker-图(箱线图)，其中每ml单位数在y-轴上(以对数标度)。在该图的右手部分中，显示曲线下的面积(AUC)。(缩写：Ctr =对照样品；DLBCL =来自具有弥漫性大B-细胞淋巴瘤的患者的样品)。
图4：方法比较
对于LIAISON®胸苷激酶(活性)测定数据x-轴分别和图4a的免疫测定原型A) y-轴和图4b的原型B) y-轴之间的相关性两者显示Deming回归拟合。
以下实施例举例说明本发明：
实施例1：材料和一般方法
重组DNA技术
使用标准方法来操作DNA，如Sambrook, J.等人, Molecular Cloning: A laboratorymanual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,1989中所述。根据制造商的说明使用分子生物学试剂。
DNA序列确定
通过在Microsynth AG (Balgach, 瑞士)进行的双链测序来确定DNA序列。
DNA和蛋白序列分析和序列数据管理
将Vector NT1 Advance套装11.5.0版用于序列建立、映射、分析、注解和说明。
蛋白化学和标记技术
标准的蛋白化学和标记技术提供在例如Hermanson, G.“Bioconjugate Techniques”第3版(2013) Academic Press。
生物信息学
生物信息学方法提供在例如Keith J.M.(编)“Bioinformatics”Vol.I和Vol.II,Methods in Molecular Biology第1525卷和第1526卷(2017) Springer, 以及Martin,A.C.R.& Allen, J.“Bioinformatics Tools for Analysis of Antibodies”in: DübelS.& Reichert J.M.(编)“Handbook of Therapeutic Antibodies”Wiley-VCH (2014)。
电化学发光免疫测定
免疫测定和有关的方法提供在例如Wild D. (编)“The Immunoassay Handbook”第4版(2013) Elsevier。作为电化学发光标记的钌复合物提供在例如Staffilani M. 等人.Inorg. Chem. 42 (2003) 7789-7798。通常地，关于基于电化学发光(ECL)的免疫测定的性能，使用Elecsys 2010分析仪或后继系统，例如Roche分析仪(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim德国)，诸如E170、cobas e 601模块、cobas e 602模块、cobas e 801模块和cobase 411，和为这些分析仪设计的Roche Elecsys测定，如果没有另外指出的话，每种在标准条件下使用。
实施例2：抗hTK-1抗体的生成
首先已经进行许多尝试以根据标准方案在小鼠中产生抗hTK-1单克隆抗体。在这些实验中，还已经使用各种免疫原(在大肠杆菌中产生的重组hTK-1；在HEK细胞中产生的重组hTK-1；几种肽免疫原)。以这种方式仅获得非常少的单克隆抗体，并且在这些初始实验中获得的抗体无一显示与人血清样品中包含的TK-1的良好结合。
在用于生成抗hTK1抗体的最终成功的尝试中，将兔用作实验动物。
免疫：
为了生成针对人胸苷激酶(hTK1)的抗体，用源自大肠杆菌的rec hTK1或源自HEK293细胞的rec天然hTK1免疫兔。对所有兔子进行重复免疫。在第一个月，每周免疫动物。从第二个月开始，每月一次免疫动物。对于第一次免疫，将500 µg rec hTK1(大肠杆菌或HEK293)溶解于1 mL 0.9 % (w/v) NaCl中，并在3.5 ml CFA中进行乳化，对于所有随后的免疫，使用1.75 mL IFA代替CFA。在免疫开始后第45天和第105天评估滴度的发展。当针对免疫原的滴度通过ELISA可检测到时，如下所述通过B-细胞克隆获得抗体。为了产生全长兔IgG，将源自重组IgG克隆过程的重链和轻链编码质粒用于瞬时转染HEK293细胞。
通过B-细胞PCR技术开发和表达针对hTK1的单克隆抗体：
使用根据Seeber等人(2014), PLoS One 4, 9(2)的B-细胞PCR方法，获得针对重组人胸苷激酶(hTK1)的抗体。从在不同时间点源自免疫兔的外周血制备PBMC和B-细胞用于单细胞沉积。最终，在HEK293细胞中重组表达单个hTK1兔抗体。为了产生全长兔抗hTK1 IgG，源自重组IgG克隆过程的重链和轻链编码质粒用于瞬时转染HEK293细胞。使HEK293细胞在37%下在含有8% CO2的气氛中在125 rpm的振动装置中在F17培养基(Gibco)中生长。转染前一天将细胞分开并以0.7 - 0.8 x 106个细胞/ml的密度接种。转染当天，将2 ml的体积的1 -1.5 x 106个HEK293细胞用0.5 mg重链质粒加0.5 mg轻链质粒转染，悬浮于80 mlOptiMEMH培养基(Gibco)中，并在48-孔深孔板中用1 ml PEIpro转染试剂(Polyplus-Transfection)补充。将培养物在37℃下和8% CO2中以180 rpm孵育7天。在孵育7天后，收获培养物上清液并分析抗体含量和特异性。
重组抗体对于抗hTK-1结合的初始测试：
首先以ELISA形式测试与hTK-1的结合。为此，将生物素化的重组天然hTK1的变体(源自HEK293)偶联至在链霉抗生物素蛋白预包被的96-孔微量滴定板(MTP)的孔中包含的链霉抗生物素蛋白。将生物素化的蛋白以250 ng/mL的生物素化hTK-1的浓度固定在50 µl MTP的孔中。将30 µl每种抗体的转染上清液添加至MTP的孔，并在室温下孵育30 min。洗涤后，用HRP-标记的F(ab`)2山羊抗兔Fcγ片段(Dianova)和ABTS(Roche)作为底物检测结合的抗体。
以该方式，已经分别获得四种重组兔抗体，被称为4H4；4H11、6C6和23C11。
对于所有重组兔抗体，根据标准程序确定可变轻链以及重链的结合相关部分(即包含三个CDR、框架区和恒定区1的一部分的可变重链)的序列。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Figure 831204DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Figure 420448DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE005
Figure 574086DEST_PATH_IMAGE006
如显而易见，全长免疫球蛋白或其任何结合片段 - 如果期望/需要 - 可以由本领域的任何技术人员基于上文公开的序列容易地解释。
实施例3：表位表征
如实施例2中所述，可以生成四种不同的单克隆抗体，其表现出它们用于免疫测定开发中所需的结合特性。
在表征由新生成的抗体结合的表位的首次尝试中，进行PepScan分析。对于该分析，合成了合成肽，其各自由15个氨基酸组成，其各自移位1个氨基酸(1-15：2-16等)，并跨越hTK-1的整个序列(SEQ ID NO:1)。将这些PepScan肽点至显微镜载片上。在阻断非特异性结合之后，将各种MAB的细胞培养物上清液在显微镜载片上孵育。洗去未结合的MAB，并根据常规方法使用HRP-标记的山羊抗兔IgG检测结合的MAB。
通过实施例2的方法获得的四种MAB中只有一种(抗体4H11)确实与线性表位反应。如可以显示，该抗体结合的表位包含在跨越hTK-1的氨基酸残基211至230的序列(SEQ IDNO:6)中。
与对应于由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)的合成肽反应的多克隆以及单克隆抗体是现有技术中已知的，参见例如WO 2015/094106。三种MAB 4H4；6C6；和23C11分别不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，它们也不显示与任何测试的PepScan肽的显著结合。这表明这三种MAB都结合hTK-1上的构象依赖性表位。由于这三个MAB从一开始就看起来相当有希望用于进一步的测定开发，因此进行额外的努力以便获得关于这三种MAB结合的表位的更多知识。
通过竞争实验的表位表征在GE Healthcare Biacore 4000仪器上在25℃下进行。将Biacore生物素捕获试剂盒，系列S传感器(目录号28-9202-34)安装至仪器中，并根据制造商的说明进行流体动力学处理和预调节。系统缓冲液是HBS-N (10 mM HEPES pH 7.4,150 mM NaCl)。样品缓冲液是系统缓冲液。将由制造商GE Healthcare提供的生物素捕获试剂在系统缓冲液中1:50稀释，并以10 µl/min持续60秒注射至流动室1、2、3和4上，以处理斑点1、2和4、5。斑点3充当参考。将10 nM生物素化的一抗以30 µl/min注射，持续120秒接触时间，以处理所有四个流动室中的斑点1和5。斑点2和4充当对照。将10 nM人重组胸苷激酶-1(hTK-1，Roche，114 kDa，四聚体)以30 µl/min注射至所有流动室中，持续180秒接触时间，以处理斑点1、2和4、5。再次以30 µl/min注射100 nM非生物素化的一抗以处理所有流动室上的斑点1、2和4、5，持续180秒接触时间，以阻断一抗的其余可及表位。将100 nM的二抗以30 µl/min注射至所有流动室中，持续180秒钟接触时间，以处理斑点1、2和4、5。最后，使用制造商GE Healthcare提供的再生溶液，通过在所有流动室和所有斑点上的120秒接触时间的再生步骤，完全除去传感器表面上形成的复合物。
以此方式研究四种重组单克隆兔IgG抗体的hTK-1表位可及性特性：抗体4H11(结合SEQ ID NO:6上的线性表位的抗体)和兔MAB 23C11、6C6和4H4。
在每次样品注射之前和之后，设置报告点。通过使用Biacore评估V.1.1软件来进行以响应单位[RU]计的报告点的读出。
向初始的生物素化的一抗捕获信号(bi-Ab1，[RU])中添加非生物素化的一抗的第二结合响应信号(阻断Ab1 [RU])。计算摩尔比表位可及性MREA = Ab2 [RU] / (bi-Ab1[RU] + 阻断Ab1 [RU])，并用作测定中使用的相应抗体的表位可及性的估计。
为了验证hTK分析物的四聚体状态，通过使用公式MR = hTK [RU] / bi-Ab1 [RU]* bi-Ab1分子量(150 kDa) / hTK分子量(114 kDa)，从hTK结合信号相比于生物素化一抗的捕获水平计算第二摩尔比。
例如，抗体4H11显示1:1的结合化学计量(=摩尔比)抗体4H11/hTK-1 MR。在该生物传感器测定中，单个四聚体hTK-1分子结合单个抗体4H11分子。在所描述的抗体中，只有抗体4H11当用作阻断Ab时显示同源的hTK-1复合物形成。因此，通过使用两次使用抗体4H11的依次测定方案，可能进行夹心测定。对于兔单克隆抗体MAB 23C11、6C6和4H4，不能检测到同源复合物形成。这意味着MAB 23C11、6C6和4H4结合相同的表位区域。抗体23C11、6C6和4H4与作为二抗的抗体4H11形成夹心。根据该测定，性能最佳的夹心对是作为生物素化的一抗的6C6，其与抗体4H11形成复合物，显示摩尔比MREA = 0.4，这意味着hTK分析物的表位可达性为40%。
如从下面显示的表显而易见，抗体4H11(结合SEQ ID NO:6中包含的C-末端线性表位)能够与23C11、6C6和4H4形成免疫复合物。另一方面，很明显，兔单克隆抗体MAB 23C11、6C6和4H4共享相同的表位。
表1：表位可及性矩阵
Figure DEST_PATH_IMAGE007
显示的是使用重组h-TK-1作为溶液中的分析物，四种抗hTK-1抗体的夹心形成。表中的0.0的值表明所用的第一抗体和第二抗体结合相同的表位。0.1或更高的值指示夹心形成，尽管有中间阻断步骤，即所研究的两种抗体结合不同的表位。
实施例4：用于Elecsys免疫测定实验中的MAB-缀合物的生产
简而言之，实施以下程序/步骤以获得抗体缀合物用于免疫学测定的捕获和检测侧。
如从通过B-细胞PCR生成的细胞(参见上文)获得的细胞培养上清液(其中包含的重组抗体)用作起始材料。
通过对蛋白A的亲和色谱纯化组织培养上清液中包含的重组抗体。
用胃蛋白酶将用作捕获抗体的抗体切割成F(ab')2片段，并通过亲和色谱和大小排阻色谱进一步纯化F(ab')2片段。然后将F(ab')2片段还原为Fab'，并经由硫醇-化学法进行位点特异性生物素化，由此获得单生物素化的Fab'-片段。
通过使用磺基-BPRu NHS酯(= CAS登记号482618-42-8，在本领域中也称为钌酸盐(2-)，双[[2,2'-联吡啶]-4,4'-二甲磺酸根基(2-)-κN1,κN1'][1-[4-(4'-甲基[2,2'-联吡啶]-4-基-κN1,κN1')-1-氧代丁氧基]-2,5-吡咯烷二酮]-，钠(1:2), (OC-6-31))，将用作检测抗体的抗体化学偶联至磺基-钌(WO 2003/002974)，并且通过大小排阻色谱法除去未结合的标记物。
实施例5：样品和hTK-1测量
5.1 样品
研究“黑色-和-白色”板。一方面，在各种测定中，已经使用来自50个(对于一些实验，只有49个仍是可用的)健康供体的血清样品来定量hTK-1。另一方面，在来自具有弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)的患者的48个(对于一些实验，只有47个仍是可用的)样品中测量hTK-1。
5.2 原型电化学发光免疫测定
基于分别如实施例3中所述获得、如实施例4中所述纯化和缀合的单克隆兔抗体，已经建立几种原型免疫测定。
原型化学发光免疫测定的典型设置利用生物素化的捕获抗体(或其抗原结合片段)和检测抗体(或其抗原结合片段)，其被钌络合物标记。
在大多数情况下，免疫测定数据使用根据常规程序生物素化的常规Fab'片段生成。在来自Roche的cobas® E170分析仪上以夹心测定形式进行测量。Cobas® E170分析仪中的信号检测基于电化学发光。在该夹心测定中，将生物素-缀合物(即捕获抗体)固定在链霉抗生物素蛋白包被的磁珠的表面上。检测-抗体携带络合的钌阳离子作为信号部分。在分析物存在的情况下，将显色钌络合物桥接至固相，并在cobas® E170分析仪的测量室中包含的铂电极处激发后发射620 nm处的光。信号输出为任意光单位。
例如，用掺有来自HEK-细胞的重组hTK-1的校准物以及用上面提及的人血清样品进行测量。
实验性hTK-1测定如下进行。将25μl人血清样品或掺入的校准物、25μl预处理试剂(包含10 mM DTBA)混合并孵育9分钟；其后将60μl捕获抗体-生物素缀合物和60μl检测抗体钌标记缀合物一起再孵育9分钟，随后添加30μl链霉抗生物素蛋白包被的顺磁微粒。将最终混合物再孵育9分钟。之后，像往常一样检测hTK-1 (即经由在这些实验中产生的电化学发光信号)。
有趣的是，与针对C-末端的MAB (4H11)组合的针对构象依赖性表位的MAB中的每一种确实产生相当好的夹心组合。即这些组合中的每一种均可用于建立用于测量hTK-1的高质量免疫测定。
还已经作出尝试以使用一种和相同的抗体作为捕获抗体和检测抗体。用作生物素化的捕获抗体且用作钌化的检测抗体的4H11的组合确实产生相当低的信号计数，即没有令人满意的结果。令人惊讶地，针对构象依赖性表位的抗体，如果用作生物素化捕获抗体且用作钌化的检测抗体，则确实产生高的信号计数，但与针对线性表位的一种抗体(4H11)与针对依赖性表位的抗体中的任一种(4H4；6C6；或23C11)的组合相比稍微更低。
也可以使用4H11作为捕获抗体，并且使用针对构象表位的抗体作为检测抗体，或改变抗hTK-1抗体的取向，即使用针对构象表位的抗体作为捕获抗体，并且使用4H11抗体作为检测抗体。
以下给出的是对于a)生物素化的4H11(用作Fab'-Bi)与钌化的23C11(用作IgG)的组合和b)生物素化的6C6(用作Fab'-Bi)与钌化的4H11(用作IgG)的组合获得的结果。
下表2中分别给出原型a)和b两者的校准结果。
表2：用两种测定原型对hTK-1的测量
Figure 906979DEST_PATH_IMAGE008
在表2中，给出在使用各种量的重组hTK-1作为分析物的两种不同的免疫测定原型中获得的信号。已进行双重测量。可以看出，两种测定原型在双重测定/计数和浓度(=conc)的一致性，计算/发现的hTK-1的浓度(MW conc)和总信号幅度的方面都给出非常好的结果。
在两种原型测定中，测量了黑色和白色板。已计算Box-Whisker-图，已分析受试者工作特征(ROC)，并测定曲线下面积(AUC)。对于原型a)的测定，AUC为0.971，并且对于原型b)的测定，其为0.965，几乎相同。对于两种原型测定，在图2中显示具有测定的hTK-1浓度的Box-Whisker-图(BoxPlots)和AUC。
5.3 DiaSorin TK1活性测定
由DiaSorin制备的LIAISON®胸苷激酶测定法是一种间接的、改良的两步竞争性、化学发光免疫测定法(CLIA)，其用于定量测定人血清和EDTA血浆中的TK。用50个对照样品和48个来自具有DLBCL的患者的样品，根据由制造商提供的说明进行LIAISON®胸苷激酶测定。其利用初始的酶促反应，其中样品中的TK将AZT (3'-叠氮基3'-脱氧胸苷)转化为AZTMP(3'-叠氮基3'-脱氧胸苷单磷酸酯)，这随后为用于定量测定AZTMP的竞争性免疫测定。转换为AZTMP的AZT的量是样品中存在的TK的量的量度。在测定中，将50μL样品与100μL测定缓冲液1、20μL测定缓冲液2和20μL由抗AZTMP多克隆抗体包被的顺磁性颗粒孵育。将兔抗山羊IgG、然后抗AZTMP山羊多克隆包被至固相。将此孵育40分钟，且然后添加100μL示踪剂，缀合至异鲁米诺衍生物的AZTMP类似物。在第一次孵育期间，AZTMP结合固相。在第二次孵育中，示踪剂缀合物与溶液中的AZTMP竞争结合。孵育20分钟后，将未结合的物质通过洗涤周期除去。然后添加起始试剂，并开始快速化学发光反应。光信号由光电倍增管测量为相对光单位(RLU)，并与校准物、对照或样品中存在的TK的浓度成正比。
已计算Box-Whisker-图，已分析受试者工作特征(ROC)，并测定曲线下面积(AUC)。对于LIAISON®胸苷激酶测定，发现AUC为0.958。图3中显示Box-Whisker图(Boxplot)和AUC。
实施例6：如用活性测定/免疫测定所测定的TK-1值的比较
将一方面用LIAISON®胸苷激酶测定获得的值和另一方面用两种原型免疫测定获得的值与彼此进行比较。考虑到一种测定测量胸苷激酶活性，而另外两种测量免疫反应性hTK-1的量，发现两种不同测定法之间的令人惊讶的高相关性(在0.95或甚至更高的范围内 - 取决于所使用的统计方法)。这些不同的hTK-1的测定之间的良好相关性从图4也相当显而易见。
序列表
<110> Roche Diagnostics GmbH
F. Hoffmann-La Roche AG
<120> 新型抗胸苷激酶抗体
<130> P34776-WO
<150> EP 18168009.1
<151> 2018-04-18
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 234
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Ser Cys Ile Asn Leu Pro Thr Val Leu Pro Gly Ser Pro Ser Lys
1 5 10 15
Thr Arg Gly Gln Ile Gln Val Ile Leu Gly Pro Met Phe Ser Gly Lys
20 25 30
Ser Thr Glu Leu Met Arg Arg Val Arg Arg Phe Gln Ile Ala Gln Tyr
35 40 45
Lys Cys Leu Val Ile Lys Tyr Ala Lys Asp Thr Arg Tyr Ser Ser Ser
50 55 60
Phe Cys Thr His Asp Arg Asn Thr Met Glu Ala Leu Pro Ala Cys Leu
65 70 75 80
Leu Arg Asp Val Ala Gln Glu Ala Leu Gly Val Ala Val Ile Gly Ile
85 90 95
Asp Glu Gly Gln Phe Phe Pro Asp Ile Val Glu Phe Cys Glu Ala Met
100 105 110
Ala Asn Ala Gly Lys Thr Val Ile Val Ala Ala Leu Asp Gly Thr Phe
115 120 125
Gln Arg Lys Pro Phe Gly Ala Ile Leu Asn Leu Val Pro Leu Ala Glu
130 135 140
Ser Val Val Lys Leu Thr Ala Val Cys Met Glu Cys Phe Arg Glu Ala
145 150 155 160
Ala Tyr Thr Lys Arg Leu Gly Thr Glu Lys Glu Val Glu Val Ile Gly
165 170 175
Gly Ala Asp Lys Tyr His Ser Val Cys Arg Leu Cys Tyr Phe Lys Lys
180 185 190
Ala Ser Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn Cys Pro Val
195 200 205
Pro Gly Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro
210 215 220
Gln Gln Ile Leu Gln Cys Ser Pro Ala Asn
225 230
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Gly Gln Pro Ala Gly Pro Asp Asn Lys Glu Asn Cys Pro Val Pro Gly
1 5 10 15
Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro Gln
20 25 30
<210> 3
<211> 185
<212> PRT
<213> 兔MAB 6C6重链
<400> 3
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Glu Gln Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys
20 25 30
Pro Glu Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Arg Phe Ser Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Asp Ser Gly Ser Ser Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser
85 90 95
Thr Thr Val Thr Leu Gln Thr Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Ser Val Gly Ala Ala Tyr Asp Tyr Phe
115 120 125
Ala Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro
130 135 140
Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro
145 150 155 160
Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu
165 170 175
Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
180 185
<210> 4
<211> 236
<212> PRT
<213> 兔MAB 6C6轻链
<400> 4
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Leu Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
20 25 30
Val Glu Ala Ala Met Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Glu Asp Val Ser Ser His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
50 55 60
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Ala Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Ala
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly
100 105 110
Tyr Tyr Tyr Ile Ser Asp Ser Pro Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Glu
115 120 125
Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro
130 135 140
Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val
145 150 155 160
Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly
165 170 175
Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser
180 185 190
Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr
195 200 205
Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr
210 215 220
Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 5
<211> 265
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Leu Leu Trp Pro Leu Arg Gly Trp Ala Ala Arg Ala Leu Arg Cys
1 5 10 15
Phe Gly Pro Gly Ser Arg Gly Ser Pro Ala Ser Gly Pro Gly Pro Arg
20 25 30
Arg Val Gln Arg Arg Ala Trp Pro Pro Asp Lys Glu Gln Glu Lys Glu
35 40 45
Lys Lys Ser Val Ile Cys Val Glu Gly Asn Ile Ala Ser Gly Lys Thr
50 55 60
Thr Cys Leu Glu Phe Phe Ser Asn Ala Thr Asp Val Glu Val Leu Thr
65 70 75 80
Glu Pro Val Ser Lys Trp Arg Asn Val Arg Gly His Asn Pro Leu Gly
85 90 95
Leu Met Tyr His Asp Ala Ser Arg Trp Gly Leu Thr Leu Gln Thr Tyr
100 105 110
Val Gln Leu Thr Met Leu Asp Arg His Thr Arg Pro Gln Val Ser Ser
115 120 125
Val Arg Leu Met Glu Arg Ser Ile His Ser Ala Arg Tyr Ile Phe Val
130 135 140
Glu Asn Leu Tyr Arg Ser Gly Lys Met Pro Glu Val Asp Tyr Val Val
145 150 155 160
Leu Ser Glu Trp Phe Asp Trp Ile Leu Arg Asn Met Asp Val Ser Val
165 170 175
Asp Leu Ile Val Tyr Leu Arg Thr Asn Pro Glu Thr Cys Tyr Gln Arg
180 185 190
Leu Lys Lys Arg Cys Arg Glu Glu Glu Lys Val Ile Pro Leu Glu Tyr
195 200 205
Leu Glu Ala Ile His His Leu His Glu Glu Trp Leu Ile Lys Gly Ser
210 215 220
Leu Phe Pro Met Ala Ala Pro Val Leu Val Ile Glu Ala Asp His His
225 230 235 240
Met Glu Arg Met Leu Glu Leu Phe Glu Gln Asn Arg Asp Arg Ile Leu
245 250 255
Thr Pro Glu Asn Arg Lys His Cys Pro
260 265
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Lys Pro Gly Glu Ala Val Ala Ala Arg Lys Leu Phe Ala Pro Gln Gln
1 5 10 15
Ile Leu Gln Cys
20
<210> 7
<211> 187
<212> PRT
<213> 兔MAB 4H4重链
<400> 7
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
20 25 30
Glu Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser
35 40 45
Ser Gly Tyr Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Ala Cys Ile Ser Val Asp Ser Asp Gly Val Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Glu Ser Ser Ser Gly Val Tyr Ile Pro
115 120 125
Tyr Phe Thr Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
130 135 140
Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp
145 150 155 160
Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu
165 170 175
Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
180 185
<210> 8
<211> 238
<212> PRT
<213> 兔MAB 4H4轻链
<400> 8
Met Asp Met Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala
20 25 30
Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Gln Ser Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
His Tyr Tyr Tyr Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile
130 135 140
Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val
145 150 155 160
Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val
165 170 175
Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln
180 185 190
Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr
195 200 205
Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln
210 215 220
Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235
<210> 9
<211> 179
<212> PRT
<213> 兔MAB 23C11重链
<400> 9
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro
20 25 30
Gly Thr Pro Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser
35 40 45
Asn Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
50 55 60
Trp Ile Gly Ile Ile Tyr Gly Asp Asp Asn Thr Tyr Cys Ala Asn Trp
65 70 75 80
Thr Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu
85 90 95
Thr Ile Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Arg Gly Pro Asp Tyr Ile Ala Ala Lys Met Asp Ile Trp Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Leu Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
165 170 175
Asn Ser Gly
<210> 10
<211> 239
<212> PRT
<213> 兔MAB 23C11轻链
<400> 10
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser
20 25 30
Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Ser Gly Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
50 55 60
Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Cys
100 105 110
Thr Tyr Gly Ser Ser Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Asn Ala Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu
130 135 140
Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile
145 150 155 160
Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu
165 170 175
Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro
180 185 190
Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu
195 200 205
Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
225 230 235

Claims (10)

1.特异性结合人胸苷激酶1 (hTK-1; SEQ ID NO:1)的单克隆抗体，所述抗体的特征在于其
a) 结合hTK-1的构象依赖性表位，
b) 不结合由hTK-1的氨基酸194至225组成的多肽(SEQ ID NO:2)，且
c) 不结合由hTK-1的15个连续氨基酸组成的任何多肽。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体具有10-9 Mol或更好的对hTK-1的结合亲和力。
3.根据权利要求1所述的抗体，其进一步特征在于，所述单克隆抗体与具有SEQ ID NO:3的重链可变结构域和SEQ ID NO:4的轻链可变结构域的抗体或其抗原结合片段竞争结合hTK-1。
4.用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：
a) 将应当定量其中的hTK-1的样品与权利要求1、2或3的抗体孵育，由此生成所述抗体和hTK-1之间的复合物，
b) 定量步骤a)中形成的复合物，由此定量hTK-1。
5.用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：
a) 将应当定量其中的hTK-1的样品与作为权利要求1、2或3的抗体的第一抗体和针对hTK-1的第二抗体孵育，由此生成所述第一抗体、hTK-1和所述第二抗体之间的夹心复合物，
b) 定量步骤a)中形成的夹心复合物，由此定量hTK-1。
6.用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：
a) 将应当定量其中的hTK-1的样品与包含还原剂和ATP的预处理溶液孵育；
b) 将步骤a)中获得的预处理样品与根据权利要求1、2或3所述的抗体孵育，由此生成所述抗体和hTK-1之间的复合物，
c) 定量步骤b)中形成的复合物，由此定量hTK-1。
7.用于定量hTK-1的体外方法，所述方法包括：
a) 将应当定量其中的hTK-1的样品与包含还原剂和ATP的预处理溶液孵育；
b) 将步骤a)中获得的预处理样品与作为权利要求1、2或3的抗体的第一抗体和针对hTK-1的第二抗体孵育，由此生成所述第一抗体、hTK-1和所述第二抗体之间的夹心复合物，
c) 定量步骤b)中形成的夹心复合物，且由此定量hTK-1。
8.根据权利要求5或7所述的方法，其中第一或第二抗体结合固相或能够结合固相，且其中第二或第一抗体被可检测标记。
9.权利要求1、2或3的抗体，其中所述抗体已经通过B-细胞PCR技术获得。
10.根据权利要求1、2、3或9中任一项所述的抗体在定量hTK-1中的用途。
CN201980026416.1A 2018-04-18 2019-04-16 新型抗胸苷激酶抗体 Pending CN111936522A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18168009 2018-04-18
EP18168009.1 2018-04-18
PCT/EP2019/059775 WO2019201901A1 (en) 2018-04-18 2019-04-16 Novel anti-thymidine kinase antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111936522A true CN111936522A (zh) 2020-11-13

Family

ID=62116193

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980026416.1A Pending CN111936522A (zh) 2018-04-18 2019-04-16 新型抗胸苷激酶抗体

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210061924A1 (zh)
EP (1) EP3781600A1 (zh)
JP (2) JP2021522192A (zh)
CN (1) CN111936522A (zh)
WO (1) WO2019201901A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113773389A (zh) * 2020-06-10 2021-12-10 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体及其制药用途

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4359800A1 (en) * 2021-06-23 2024-05-01 AroCell AB Predicting cancer relapse

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060110768A1 (en) * 2004-11-24 2006-05-25 Roche Palo Alto Llc Method for determining genotoxicity
CN101027085A (zh) * 2004-05-21 2007-08-29 杨伯翰大学 抗胸苷激酶单克隆抗体的抗癌活性
CN101186922A (zh) * 2007-12-21 2008-05-28 丁克祥 一种基因免疫制备人类ⅰ型胸苷激酶单克隆抗体的新方法
CN101275954A (zh) * 2008-05-09 2008-10-01 丁克祥 一种简便快速测定人类i型胸苷激酶基因蛋白的乳癌预警芯片
CN105980407A (zh) * 2013-12-19 2016-09-28 阿洛赛尔公司 单克隆抗tk1抗体
US20170067900A1 (en) * 2003-05-16 2017-03-09 Arocell Ab Predicting cancer progression
CN106556592A (zh) * 2015-09-24 2017-04-05 深圳市安群生物工程有限公司 定量检测人tk1的化学发光试剂盒及其制备方法
CN106554950A (zh) * 2015-09-24 2017-04-05 深圳市安群生物工程有限公司 人tk1抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒
CN107365753A (zh) * 2016-05-12 2017-11-21 杨国民 一种抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体
WO2018030946A1 (en) * 2016-08-10 2018-02-15 Alertix Veterinary Diagnostics Ab Determination of non-human mammal tk1 protein levels

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5316757A (en) 1984-10-18 1994-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Synthesis of polyazamacrocycles with more than one type of side-chain chelating groups
US5342606A (en) 1984-10-18 1994-08-30 Board Of Regents, The University Of Texas System Polyazamacrocyclic compounds for complexation of metal ions
US5221605A (en) 1984-10-31 1993-06-22 Igen, Inc. Luminescent metal chelate labels and means for detection
US5591581A (en) 1986-04-30 1997-01-07 Igen, Inc. Electrochemiluminescent rhenium moieties and methods for their use
KR960016340B1 (ko) 1986-04-30 1996-12-09 이겐 인코오포레이팃드 전기화학발광 분석법
WO1990005301A1 (en) 1988-11-03 1990-05-17 Igen, Inc. Electrochemiluminescent assays
DE68928492T2 (de) 1988-11-03 1998-08-20 Igen Inc Elektrochemilumineszente reaktion unter verwendung eines von einem amin abgeleiteten reduktionsmittels
IL100867A (en) 1991-02-06 1995-12-08 Igen Inc Method and device for improved luminescence testing
US5739294A (en) 1991-12-10 1998-04-14 The Dow Chemical Company Bicyclopol yazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as contrast agents
US5480990A (en) 1991-12-10 1996-01-02 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclocarboxylic acid complexes for use as contrast agents
US5428139A (en) 1991-12-10 1995-06-27 The Dow Chemical Company Bicyclopolyazamacrocyclophosphonic acid complexes for use as radiopharmaceuticals
ZA929351B (en) 1991-12-11 1993-06-04 Igen Inc Electrochemiluminescent label for DNA assays.
US5385893A (en) 1993-05-06 1995-01-31 The Dow Chemical Company Tricyclopolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
US5462725A (en) 1993-05-06 1995-10-31 The Dow Chemical Company 2-pyridylmethylenepolyazamacrocyclophosphonic acids, complexes and derivatives thereof, for use as contrast agents
JPH09505464A (ja) 1993-09-22 1997-06-03 イゲン，インコーポレーテッド 自立性配列複製電気化学発光核酸測定法
AU703344B2 (en) 1994-08-26 1999-03-25 Igen International, Inc. Biosensor for and method of electrogenerated chemiluminescent detection of nucleic acid adsorbed to a solid surface
US5786141A (en) 1994-08-26 1998-07-28 Bard; Allen J. Electrogenerated chemiluminescence labels for analysis and/or referencing
US5643713A (en) 1995-06-07 1997-07-01 Liang; Pam Electrochemiluminescent monitoring of compounds
US6852502B1 (en) 1995-06-06 2005-02-08 Bioveris Corporation Electrochemiluminescent enzyme biosensors
WO1996033411A1 (en) 1995-04-18 1996-10-24 Igen, Inc. Electrochemiluminescence of rare earth metal chelates
US5679519A (en) 1995-05-09 1997-10-21 Oprandy; John J. Multi-label complex for enhanced sensitivity in electrochemiluminescence assay
DE69637001T2 (de) 1995-06-07 2007-12-06 Bioveris Corp. Elektrochemilumineszenz-enzymimmunoassay
US5834456A (en) 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
US6808939B2 (en) 2001-06-29 2004-10-26 Igen International, Inc. ECL labels having improved non-specific binding properties, methods of using and kits containing the same
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
SG192675A1 (en) 2011-02-09 2013-09-30 Hoffmann La Roche New iridium-based complexes for ecl
CN102504027B (zh) * 2011-10-28 2013-10-30 周际 一种多表位tk1抗体的制备及其在人群体检筛查中早期肿瘤检测和风险预警中的应用
TW201401798A (zh) 2012-06-28 2014-01-01 Chunghwa Telecom Co Ltd ＦＴＴｘ光終端設備之用戶端動態多路由饋電系統
JP6072072B2 (ja) 2012-12-12 2017-02-01 株式会社東芝 クラウドシステム管理装置、クラウドシステム、再配置方法、及びプログラム
KR101928618B1 (ko) * 2013-05-17 2018-12-12 다이호야쿠힌고교 가부시키가이샤 Tk1 단백질의 발현이 항진된 결장직장암 환자에 대한 치료효과 예측 방법
JP5922639B2 (ja) 2013-12-07 2016-05-24 レノボ・シンガポール・プライベート・リミテッド 折り畳み式の電子機器、表示システム、および表示方法
US9716942B2 (en) 2015-12-22 2017-07-25 Bose Corporation Mitigating effects of cavity resonance in speakers

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170067900A1 (en) * 2003-05-16 2017-03-09 Arocell Ab Predicting cancer progression
CN101027085A (zh) * 2004-05-21 2007-08-29 杨伯翰大学 抗胸苷激酶单克隆抗体的抗癌活性
US20060110768A1 (en) * 2004-11-24 2006-05-25 Roche Palo Alto Llc Method for determining genotoxicity
CN101186922A (zh) * 2007-12-21 2008-05-28 丁克祥 一种基因免疫制备人类ⅰ型胸苷激酶单克隆抗体的新方法
CN101275954A (zh) * 2008-05-09 2008-10-01 丁克祥 一种简便快速测定人类i型胸苷激酶基因蛋白的乳癌预警芯片
CN105980407A (zh) * 2013-12-19 2016-09-28 阿洛赛尔公司 单克隆抗tk1抗体
EP3083698A1 (en) * 2013-12-19 2016-10-26 Arocell AB Monoclonal anti-tk1 antibodies
CN106556592A (zh) * 2015-09-24 2017-04-05 深圳市安群生物工程有限公司 定量检测人tk1的化学发光试剂盒及其制备方法
CN106554950A (zh) * 2015-09-24 2017-04-05 深圳市安群生物工程有限公司 人tk1抗原表位肽、抗原、抗体、应用及试剂盒
CN107365753A (zh) * 2016-05-12 2017-11-21 杨国民 一种抗细胞质胸苷激酶‑IgG抗体
WO2018030946A1 (en) * 2016-08-10 2018-02-15 Alertix Veterinary Diagnostics Ab Determination of non-human mammal tk1 protein levels

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113773389A (zh) * 2020-06-10 2021-12-10 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体及其制药用途

Also Published As

Publication number Publication date
EP3781600A1 (en) 2021-02-24
US20210061924A1 (en) 2021-03-04
JP2021522192A (ja) 2021-08-30
JP2024045268A (ja) 2024-04-02
WO2019201901A1 (en) 2019-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1759319B (zh) 生物液中肾上腺髓质素原中间区域部分肽在制备免疫诊断剂中的用途
JP4700626B2 (ja) 分子上のエピトープの免疫検出のための試薬、キット及び方法
JP2024045268A (ja) 新規抗チミジンキナーゼ抗体
CN104530234A (zh) 检测人vegf的组合试剂、试剂盒及其使用方法
JP2015505828A (ja) 抗グルカゴン抗体およびその使用
JP4683572B2 (ja) 組換え蛋白質の定量法
EP3132268B1 (en) Immunoassay for the detection of chromogranin a
US20210199659A1 (en) Thymidine kinase (tk-1) in prognostic indices for dlbcl
CN111918876B (zh) 抗pd-l1抗体及使用其检测pd-l1的方法
CN111133008A (zh) Pivka的新结合剂和测定
WO2022221877A2 (en) Lateral flow analysis and breast cancer
JP2019053068A (ja) 可溶型線維芽細胞増殖因子受容体の高感度多重イムノアッセイ
US10073099B2 (en) Methods and diagnostics for cancer detection and treatment monitoring
KR102128251B1 (ko) 아르기닌이 메틸화된 drd2에 특이적으로 결합하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물
CN104937419A (zh) 预测受试者患癌症的风险或诊断癌症的方法
KR102131860B1 (ko) 아르기닌이 메틸화된 ggt1에 특이적으로 결합하는 대장암 진단용 바이오마커 조성물
WO2001096599A2 (en) Methods for quantitative determination of b-fibronectin in biological fluids and tissues
Liang et al. In vitro evolution of diagnostic antibodies targeting native antigens in plasma by sandwich flow cytometry
WO2023154780A1 (en) Anti-her2/neu antibodies and methods of use
Henanger Development of an immunoassay for human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)
KR20200133229A (ko) 신규한 항-트로포닌 t 항체
JP2021517639A (ja) 補体ｃ３転換酵素のプロテアーゼ活性を測定するためのスループットの高い方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination