CN113773389A

CN113773389A - 鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体及其制药用途

Info

Publication number: CN113773389A
Application number: CN202010520453.2A
Authority: CN
Inventors: 刘永萍; 李惠军; 陈湖; 李作生; 李劲; 艾伦·何; 斯文·斯库格; 周际
Original assignee: Shenzhen Sino Swed Tongkang Bio Tech Ltd
Current assignee: Shenzhen Sino Swed Tongkang Bio Tech Ltd
Priority date: 2020-06-10
Filing date: 2020-06-10
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2040-06-10
Also published as: CN113773389B

Abstract

本发明涉及鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体和产生该单克隆抗体的SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M，以及它们的制药用途。本发明还涉及相应的核酸、载体、重组细胞、药物组合物和制备抗体的方法。本发明的单克隆抗体能够与人肿瘤细胞中胸苷激酶1发生免疫应答反应，阻断肿瘤细胞的生存活力，增加肿瘤细胞凋亡率，但不阻断正常细胞的正常生存活力，可用于治疗肿瘤，尤其是胃肿瘤。

Description

鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体及其制药用途

技术领域

本发明涉及单克隆抗体领域，尤其是鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体(来源于SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）。该单克隆抗体与人肿瘤细胞结合发生免疫应答反应，阻断肿瘤细胞生存活力，增加肿瘤细胞凋亡率，但不阻断正常细胞生存活力，可用于治疗肿瘤，尤其是胃肿瘤。

背景技术

癌症的治疗主要基于手术，放射治疗和化学治疗。手术切除肿瘤，而放疗和/或化疗杀伤肿瘤细胞，导致肿瘤死亡。近年来，已被确立的其他类型的治疗方法有免疫疗法，在过去的10年中，肿瘤免疫学新的理论和认识发展出很多肿瘤治疗的新策略，并运用到临床实践中，将作为最终攻克肿瘤的希望之一，其中包括肿瘤相关抗原的发现和重要研究进展，肿瘤相关抗原作为临床免疫治疗的靶分子的研究进展，例如抗体治疗，主要是单克隆抗体，肿瘤疫苗及其它主动免疫治疗。虽然这些治疗短时间内不会杀死肿瘤细胞，但与放疗和化学疗法比较，确实能够控制肿瘤细胞增殖。它可以通过抑制肿瘤生长，有效地控制肿瘤进展。

在过去的40年中大量研究证明，抗原与细胞表面受体结合，引发免疫系统生成对应的抗体，从而靶向杀死细胞，因此靶向癌细胞中某个受体的抗体药物，能靶向杀死癌细胞，同时激活免疫应答。单克隆抗体是目前肿瘤免疫治疗中最广泛应用的方法，主要采用大量合成的人造抗体来引发免疫应答，由于并非是自身所产生的抗体，因此从狭义上被认为是被动免疫的一种。不同类型的抗体已经在各种类型的恶性肿瘤患者中进行了测试。目前在乳腺癌和结肠癌治疗方面，利用这种方法研制的新型抗肿瘤药物已经发挥出了越来越重要的作用，例如，使用最广泛的就是用于治疗HER2阳性乳腺癌的trastuzumab(Herceptin)，以及用于治疗某些特殊淋巴瘤和白血病的rituximab (Rituxan)。现抗皮肤癌（人类黑色素瘤）的单克隆抗体显示出可靠的效果，这种药物能阻挡针对黑色素瘤的免疫应答关闭，帮助机体建立长期针对癌症的保护作用。针对宫颈癌的疫苗已经开发出来，现在已经在年轻女性中用于常规使用，预防宫颈癌发生。虽然免疫治疗取得了跨时代的进步，但尚无针对肿瘤细胞增殖密切相关的靶标，因此，研究与肿瘤细胞增殖密切相关的新型抗体用于临床肿瘤治疗是免疫学研究至关重要的课题。

肿瘤是一种慢性漫长的异常增殖性疾病。与细胞生长调节相关的多个基因突变导致正常细胞生长失控，细胞异常增殖，最终进展为恶性肿瘤，历时可达10-30年。找到与肿瘤增殖相关的靶标是关键点。大量临床研究表明，TK1是一种评定肿瘤细胞增殖的可信的标志物，在评估人肿瘤增殖速率方面具有重要价值。

胸苷激酶1（TK1）（ATP：胸苷-5'-磷酸转移酶，EC2.7.1.21）是唯一通过替补途径将胸苷（TdR）磷酸化成单磷酸胸苷（dTMP）的激酶，单磷酸胸苷进一步磷酸化为二磷酸胸苷（dTDP）和三磷酸胸苷（dTTP），为合成DNA提供所需要的dTTP，确保DNA的合成。因此，TK1是调控DNA合成密切相关的关键酶之一，与细胞的增殖速度密切相关，也称为细胞周期的S期的特殊酶。胸苷（TdR）是DNA合成的重要前体之一。已显示TdR在细胞内的浓度与细胞活力相关。细胞中TK1酶的活性/浓度是可以通过TdR/TTP浓度方法进行检测。TK1基因已被认为是自杀基因。

TK1是一细胞周期依赖酶，与细胞增殖密切相关。在哺乳动物细胞中，TK1的 C 端是细胞生长依赖性调节所必需的肽段。当删除C 端40个或30个氨基酸残基后，TK1 -这个细胞周期依赖酶调控细胞的生长密切相关的功能完全被消除。在本发明中，选择人TK1靠近C端的195-225位氨基酸（GQPAGPDNKENCPVP GKPGEAVAARKLFAPQ）做免疫抗原，经严格筛选和鉴定，成功地制备得到特异性的鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体(来源于SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）。可用于治疗肿瘤，尤其是胃肿瘤和乳腺癌。可用于临床肿瘤免疫组化评估患者预后的验证。TK1的染色指数真实地提供了患者的肿瘤增殖速率，是评定肿瘤患者复发和生存的重要预后因素。例如TK1染色指数在良性乳腺组织、乳腺非典型性导管增生、原位导管癌和浸润性导管癌中的表达与患者疾病进程相关性，TK1在pT1 期肺腺癌间质浸润中的表达与肿瘤患者的生存预后相关性，TK1是宫颈癌前病变患者预后和监测疗效评估的一优选的细胞增殖生物标志物，评估肿瘤患者的生存预后，TK1是一新的肿瘤细胞增殖标志物对卵巢浆液性腺癌患者复发风险和生存率的预后优于Ki-67。

本发明人首次发现，鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体(来源于SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）是一新型靶向药物，它阻断人肿瘤细胞增殖，但不阻断正常细胞的正常生存活力，将是治疗胃肿瘤有效靶向治疗有效药物。

发明内容

本发明提供了一种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链三个CDR的序列依次为：CDR1: GFTFSDYY；CDR2: IRNKEYGNTA；CDR3: ARDGAFDY；其轻链三个CDR的序列依次为：CDR1: KSVSTSGYSY；CDR2: LAS；CDR3: QESREFPT。

本发明提供了一种鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链和轻链可变区序列分别为：EVKLVESGGGLAQPGGSLRLSCATSGFTFSDYYMNWVRQPPGKAFEWLGFIRNKEYGNTAEYNPSLKGRFTISRDDSQSILYLQMNTLRVEDSAIYYCARDGAFDYWGQGTSLTVSS；和

DIVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQESREFPTVGGGTNLEIK。

本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，编码重链和轻链可变区的基因序列分别为：GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGCACAGCCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCAGTGATTATTATATGAATTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGAAAGGCTTTTGAGTGGTTGGGTTTTATTAGAAACAAAGAATATGGCAACACAGCAGAGTACAATCCATCTCTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGAGTTGAGGACAGTGCCATTTATTATTGTGCAAGAGATGGCGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACTTCTCTCACAGTCTCCTCA；和

GACATTGTGATGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGGACAGTAGGGAGTTTCCGACGGTCGGTGGAGGCACCAACCTGGAAATCAAA。

本发明提供了上述单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fd’、Fv、dAb、单链片段。

本发明提供了一种单克隆抗体或其抗原结合片段，其由SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M产生，该杂交瘤细胞株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：C2019268。

本发明提供了一种分离的核酸，其编码上述单克隆抗体或其抗原结合片段。

本发明提供了一种载体，包含上述分离的核酸的核苷酸序列。

本发明提供了一种宿主细胞，含有上述核酸或载体。

本发明提供了一种制备抗体的制备方法，将上述宿主细胞在其中的核酸能够表达产生抗体的条件下进行培养，并由此收获抗体。

本发明提供了一种SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：C2019268。

本发明提供的鼠抗人TK1单克隆抗体，其制备方法是选择人TK1靠近C端的195-225位氨基酸（GQPAGPDNKENCPVP GKPGEAVAARKLFAPQ），制备8聚体为免疫抗原。华瑞同康生物技术（深圳）有限公司（以下简称华瑞同康）委托云南大学单克隆抗体工程技术中心完成鼠抗人TK1单克隆抗体的制备。继后，华瑞同康经过反复筛选和鉴定，成功筛选得到小鼠杂交瘤细胞株057M，开发了特异性的鼠抗人TK1单克隆抗体。

本发明提供了一种药物组合物，包含上述的单克隆抗体或其抗原表位4和5的特别功能

表位。抗体识别抗原表位（性质、数目和空间构象）是决定免疫应答特异性的物质基础。选

择的这人TK1的C末端区域-TK1调控的细胞周期的关键序列，是暴露在TK1抗原分子表表

面，属于一类依赖于TK1蛋白质空间构象而形成的五个功能构象表位。人TK1的C-端31肽

（195-225序列 GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ）中 5个构象表位，见下：

表位1：GEAVAARKLF，序列213-222

表位2：NCPVPGKPGE，序列205-214

表位3：PVPGKPGEAV 序列207-216

表位4：NCPVPGKPGEAV 序列205-216

表位5: GQPAGPDKEN 序列195-216

*其中功能构象表位2和 3 与4的氨基酸序列有重叠，为属于覆盖性表位(overlappingepitope)。

本发明还提供了单克隆抗体或其抗原表位结合结合片段 4和5特别功能表位，使用适

宜的SSTK杂交瘤细胞株057M制备的抗体的浓度，将阻断体外生长的人胃癌细胞的增殖，有统计学意义地阻断肿瘤细胞的生存活力，增加肿瘤细胞凋亡，但不阻断正常细胞的正常生存活力，是一新的阻断肿瘤细胞增殖的有效靶向治疗药物，尤其是，所述肿瘤是胃肿瘤。

为确认使用于该抗体的特异性，我们采用培养的人淋巴肿瘤TK1阳性株（CEM TK1 ⁺）和TK1阴性细胞株CEM TK1^-）的细胞裂解液，通过凝胶电泳/蛋白质印迹鉴定，验证CEM TK1 ⁺株的细胞裂解液，显示有TK1 特异的一条明显的电泳带，没有非特异性的免疫交叉反应，但CEM TK1^-的细胞裂解液不显示任何TK1的电泳带（图1A）。TK1细胞免疫组化学染色鉴定方法，验证CEM TK1⁺株中细胞，显示有TK1 在肿瘤细胞质中有不同程度的特异的TK1棕黄染色，但CEM TK1^-株的细胞，没有特异的TK1棕黄染色（图1B），并采用TK1组织免疫组化学染色鉴定方法，鉴定了恶性肿瘤细胞，正常增生细胞和非增生正常细胞的区域的特征差别 (图1C）。特征化了本发明用的小鼠杂交瘤细胞株057M制备的抗体的高特异性。

所述实施方案所涉一种实施方案，抗体识别抗原表位（性质、数目和空间构象）是

决定免疫应答特异性的物质基础。我们选择的这人TK1的C末端区域-TK1调控的细胞周期的关键序列，是暴露在TK1抗原分子表表面，属于一类依赖于TK1蛋白质空间构象而形成的五个功能构象表位。

人TK1的C-端31肽（195-225序列 GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ）中 5个构

象表位表位，见下：

表位1：GEAVAARKLF，序列213-222

表位2：NCPVPGKPGE，序列205-214

表位3：PVPGKPGEAV 序列207-216

表位4：NCPVPGKPGEAV 序列205-216

表位5: GQPAGPDKEN 序列195-216

*其中功能构象表位2和 3 与4的氨基酸序列有重叠，为属于覆盖性表位(overlapping

epitope)。

小鼠杂交瘤细胞株057M 的基因扩增，IgG-VH-M的基因和氨基酸序列鉴定方法，IgG-VL-M的基因序列和氨基酸序列的序列鉴定方法，是参考Toleikis L和 Frenzel（2012）编写的Antibody Engineering Methods and Protocols进行。

在本发明中，通过在培养基（体外）中生长的肿瘤细胞和正常细胞，采用细胞成活率计数试剂盒-8（CCK-8）和 Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（目录号KGA108）进行比较，确定活细胞的数量并确定细胞凋亡的频率。描述了我们开发的鼠抗人TK1单克隆，如何抑制人胃肿瘤细胞（NCI-N87/NCI-N87（STEM）；KATO-III/KATO-III STEM）的增殖率和肿瘤细胞凋亡的时间进程，重要发现是不影响正常细胞生长。

本发明的SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M，已经于2019年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称：CCTCC；保藏编号：CCTCC No：C2019268，地址：中国武汉，武汉大学。

本发明提供了使用一种新型阻断肿瘤细胞增殖的有效靶向药物——鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体（单克隆抗体057M）。有效阻断肿瘤细胞增殖，增加肿瘤细胞凋亡，但不阻断正常细胞的正常生存活力。本发明开辟了使用鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体，为临床肿瘤患者个性化靶向治疗提供了一种新有效工具。

上述鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体是一新的有效阻断肿瘤细胞增殖，增加肿瘤细胞凋亡，但不阻断正常细胞的正常生存活力，是一新的阻断肿瘤细胞增殖的有效靶向治疗药物，是一新的阻断肿瘤细胞增殖的有效靶向治疗药物治疗的新工具。

附图说明

图1.说明CEM TK1 +和CEM TK1-细胞的蛋白质印迹（A）。CEM-TK1阳性细胞和阴性细胞免疫化学图（B）和显微镜下观察一恶性胃肿瘤患者手术后的组织的不同部位的TK1染色：包括恶性肿瘤细胞，正常增生细胞和非增生正常细胞的区域的TK1组织免疫化学图（C）。

图2. 说明人TK1的C-端31肽（195-225序列GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ）中 5个构象表位（表位1. GEAVAARKLF，序列213-222；表位2：NCPVPGKPGE，序列205-214；表位3：PVPGKPGEAV 序列207-216；表位4：NCPVPGKPGEAV 序列205-216；表位5: GQPAGPDKEN 序列195-216），分别与小鼠杂交瘤细胞株057M抗体进行特异性表位免疫功能检测。 ELISA检测方法。发现特异性功能表位主要是表位4和5。

图3.说明在用不同浓度的胸苷激酶1单克隆抗体（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）处理72小时后，培养的胃肿瘤细胞NCI-N87(图A) 和NCI-N87（STEM）(图B) 的肿瘤细胞生存活力有统计学意义的降低（p﹤0.05）。

图4.说明用不同浓度的TK1 mAb（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）处理72小时后, 培养的胃肿瘤细胞KATO-III (图A)和KATO-III（STEM）(图B)的肿瘤细胞生存活力有统计学意义的降低（p﹤0.05）。

图5.说明用胸苷激酶1单克隆抗体（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）72小时后, 培养的四种胃肿瘤细胞： NCI-N87，NCI-N87（STEM）(图A)，KATO-III和KATO-III（STEM）(图B)细胞凋亡的频率有统计学意义的增加（p﹤0.05）。

图6.说明在用不同浓度的胸苷激酶1单克隆抗体（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）处理72小时后，培养的正常的小鼠睾丸细胞保存正常的生存活力，生存活力无统计学意义的降低（p≈1.0）。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

所述实施方案中，抗体识别抗原表位（性质、数目和空间构象）是决定免疫应答特异性的物质基础。我们选择的这人TK1酶C接近末端区域-TK1调控的细胞周期的关键序列，是暴露在TK1抗原分子表表面，属于一类依赖于TK1蛋白质空间构象而形成的五个功能构象表位。人TK1的C-端31肽（195-225序列 GQPAGPDNKENCPVPGKPGEAVAARKLFAPQ）中 5个构象表位表位，见下：

表位1：GEAVAARKLF，序列213-222

表位2：NCPVPGKPGE，序列205-214

表位3：PVPGKPGEAV 序列207-216

表位4：NCPVPGKPGEAV 序列205-216

表位5: GQPAGPDKEN 序列195-216

*其中功能构象表位4的氨基酸序列与2和 3有重叠，为属于覆盖性表位(Overlappingepitope)。

所有胃肿瘤细胞系购自中国科学院细胞库【NCI-N87，目录号TCHu130；NCI-N87（STEM），目录号SCSP-534）；KATO-Ⅲ，目录号Cat No TCHu 229；KATO（STEM），目录号SCSP-573】STEM表示该细胞系对培养瓶壁具有一些有限的粘附特性，但与非STEM细胞系相比，没有统计学差异。

将胃肿瘤细胞系NCI-N87，NCI-N87（STEM），KATO-Ⅲ和KATO-Ⅲ（STEM）与不加入和加入含本发明SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M的不同浓度单克隆抗体培养72小时（图3, 4 和5）。

肿瘤细胞(1×10⁵)在含有10％胎牛血清（Gibco，目录号10099-141）培养基中生长，但不含抗生素或其他试剂的RPMI 1640细胞培养基（HyClone，目录SH30809.01）。

为找到本发明TK1单克隆抗体的使用的最佳浓度，将TK1单克隆抗体（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）溶解于含有1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液中，补加到细胞培养基中，我们在24,48和72小时时间段测试了四种不同的浓度抗体（0.1,1,10和100μg/ml）与培养的肿瘤细胞中的TK1的免疫效能，对照组为不加入抗体。显示了72小时的时间进程的结果（图3， 4和5）。

正常细胞来源于我们培养的两只正常BALB-C雄鼠，摘取睾丸经研磨过滤成单个细胞悬浊液，是正常的小鼠睾丸细胞。然后计数，按照每孔20000个铺板于96孔的细胞培养板中。按照上面所述，加入的不同浓度单克隆抗体。经过培养72小时后观察，正常小鼠睾丸细胞的生长数量已铺满至96孔的细胞培养板中，为单个圆的单层贴壁正常细胞。观察正常小鼠睾丸细胞的生长速度，与肿瘤细胞生长速度相比，降低约4倍左右。

通过使用细胞生存活力测试（细胞计数试剂盒-8，（CCK-8试剂盒，DojindoMolecular Technologies，Inc.，MA，USA，USA）研究本发明鼠抗人TK1单克隆抗体（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）对肿瘤细胞生存活力的影响。目录号LH649）该试剂盒用于测试新化合物的毒性已有10多年的历史，目前已用于600多种细胞系，已被证实具有可靠的细胞生存活力测试效能，在该试验中，四唑盐，WST-8，被脱氢酶还原，在培养基中产生黄色染色，与活性代谢细胞的数量成比例，黄色的强度（吸光度）通过ELISA读数器（Bio-Rad，USA ）。

使用以下公式计算活力：胃肿瘤细胞活力（％）=实验孔的吸光度/未处理的对照孔的吸光度×100％。

培养的胃肿瘤细胞系NCI-N87，NCI-N87（STEM）在不加和加入0.1和100μg/mL的TK1单克隆抗体（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M），比较结果如图2所示，随着时间进程到72小时，增加抗体浓度到100μg/mL，肿瘤细胞生存活力有统计学意义的降低，分别为85%和66.6%（p <0.05）。

结果如图4所示，培养的胃肿瘤细胞系KATO-Ⅲ和KATO-Ⅲ（STEM）在不加和加入0.1和100μg/mL的TK1单克隆抗体（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M），比较结果如图3所示，随着时间进程到72小时，增加抗体浓度到100μg/ml，肿瘤细胞生存活力有统计学意义的降低，分别为56.3%和66.6%（p <0.05）。

通过Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（目录号KGA108）检测，我们计算了抗体浓度与细胞凋亡时间的进程。结果显示如图5所示，培养胃肿瘤细胞在不加和补加10μg/ml的TK1单克隆抗体（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）之间比较，后者在72小时的细胞肿瘤细胞凋亡频率的有统计学意义的增加，NCI-N87，NCI-N87（STEM），KATO-Ⅲ和KATO-Ⅲ（STEM）细胞肿瘤细胞凋亡频率分别增加到1.46,2.21, 3.49, 2.59倍（P<0.05）。

培养的肿瘤细胞在使用适宜的胸苷激酶1单克隆抗体浓度（10-100μg/ml 的PBS缓冲液，pH7.4）免疫反应至72 小时，肿瘤细胞生存活力降低（图3和4）与肿瘤细胞凋亡频率的增加（图5）的相关性一致。

使用相同的细胞生存活力的细胞计数试剂盒-8和检测方法，将正常的小鼠睾丸细胞加入含10-100ug/ml胸苷激酶1单克隆抗体的PBS缓冲液pH7.4，培养72小时后计数分析细胞生存活力，发现培养的正常的小鼠睾丸细胞保存正常的生存活力，生存活力无统计学意义的降低（p≈1.0）（图6）。使用相同Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒（目录号KGA108）检测，正常细胞凋亡频率，没有发现细胞凋亡，细胞保存正常的生存活力与图6相同（图未显示）。

本发明发现培养的胃肿瘤细胞，使用适宜的胸苷激酶1单克隆抗体浓度（10-100μg/ml 的PBS缓冲液，pH7.4）（SSTK小鼠杂交瘤细胞株057M）,免疫反应至72 小时，有意义地降低体外生长的人胃肿瘤细胞增殖的速率，增加了细胞凋亡频率；这发明的新发现是，使用不同浓度的胸苷激酶1单克隆抗体，不阻断体外生长的正常的小鼠睾丸细胞的正常增殖，即生存活力正常。

序列表

<110> 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司

<120> 鼠抗人胸苷激酶1单克隆抗体及其制药用途

<130> 华瑞同康-patent2020-01

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 2

Ile Arg Asn Lys Glu Tyr Gly Asn Thr Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 3

Ala Arg Asp Gly Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 4

Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 5

Leu Ala Ser

1

<210> 6

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 6

Gln Glu Ser Arg Glu Phe Pro Thr

1 5

<210> 7

<211> 117

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 7

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Phe Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asn Lys Glu Tyr Gly Asn Thr Ala Glu Tyr Asn Pro

50 55 60

Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Val Glu Asp Ser Ala Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 8

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ser Arg

85 90 95

Glu Phe Pro Thr Val Gly Gly Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 351

<212> DNA

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 9

gaggtgaagc tggtggagtc tggaggaggc ttggcacagc ctgggggctc tctgagactc 60

tcctgtgcaa cttctgggtt caccttcagt gattattata tgaattgggt ccgccagcct 120

ccaggaaagg cttttgagtg gttgggtttt attagaaaca aagaatatgg caacacagca 180

gagtacaatc catctctgaa gggtcgattc accatctcca gagatgattc ccaaagcatc 240

ctctatcttc aaatgaacac cctgagagtt gaggacagtg ccatttatta ttgtgcaaga 300

gatggcgcct ttgactactg gggccaaggc acttctctca cagtctcctc a 351

<210> 10

<211> 330

<212> DNA

<213> 小鼠(mouse/Balb/c)

<400> 10

gacattgtga tgacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60

atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120

caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180

ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcactct caacatccat 240

cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat tactgtcagg acagtaggga gtttccgacg 300

gtcggtggag gcaccaacct ggaaatcaaa 330

Claims

1.鼠抗人胸苷激酶1-IgG单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链三个CDR的序列依次为：CDR1: GFTFSDYY；CDR2: IRNKEYGNTA；CDR3: ARDGAFDY；其轻链三个CDR的序列依次为：CDR1: KSVSTSGYSY；CDR2: LAS；CDR3: QESREFPT。

2.权利要求1的单克隆抗体或其抗原结合片段，其重链和轻链可变区序列分别为：EVKLVESGGGLAQPGGSLRLSCATSGFTFSDYYMNWVRQPPGKAFEWLGFIRNKEYGNTAEYNPSLKGRFTISRDDSQSILYLQMNTLRVEDSAIYYCARDGAFDYWGQGTSLTVSS；和

3.权利要求2的单克隆抗体或其抗原结合片段，编码重链和轻链可变区的基因序列分别为：GAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGCACAGCCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAACTTCTGGGTTCACCTTCAGTGATTATTATATGAATTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGAAAGGCTTTTGAGTGGTTGGGTTTTATTAGAAACAAAGAATATGGCAACACAGCAGAGTACAATCCATCTCTGAAGGGTCGATTCACCATCTCCAGAGATGATTCCCAAAGCATCCTCTATCTTCAAATGAACACCCTGAGAGTTGAGGACAGTGCCATTTATTATTGTGCAAGAGATGGCGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACTTCTCTCACAGTCTCCTCA；和GACATTGTGATGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGGACAGTAGGGAGTTTCCGACGGTCGGTGGAGGCACCAACCTGGAAATCAAA。

4.权利要求1-3任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、Fd’、Fv、dAb、单链片段。

5.权利要求1-4任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段，其由杂交瘤细胞株057M产生，该杂交瘤细胞株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：C2019268。

6.分离的核酸，其编码权利要求1-5任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段。

7.载体，包含权利要求6的核酸的核苷酸序列。

8.宿主细胞，含有权利要求6的核酸或权利要求7的载体。

9.杂交瘤细胞株057M，其已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：C2019268。

10.一种制备抗体的制备方法，将权利要求8的宿主细胞在其中的核酸能够表达产生抗体的条件下进行培养，并由此收获单克隆抗体。

11.药物组合物，包含权利要求1-5任一项的单克隆抗体或其抗原表位4和5的特别功能表位。

12.权利要求1-5任一项的单克隆抗体或其抗原表位结合片段，或者权利要求9的杂交瘤细胞株057M在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

13.权利要求12的用途，所述的肿瘤是胃肿瘤。