CN106852148A - 针对细胞内抗原的单域抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在不使用外源靶向序列或化学组合物的情况下治疗病症或疾病的组合物和方法。本发明涉及针对导致病症或疾病的细胞内组分的单域抗体(sdAb)，包含所述sdAb的蛋白质和多肽。本发明还包括编码sdAb的核酸、蛋白质和多肽、和包含sdAb的组合物。本发明包括所述组合物、sdAb和编码sdAb的核酸在预防、治疗或诊断目的上的应用。

Description

针对细胞内抗原的单域抗体
相关申请的交叉引用
本国际专利申请要求于2014年10月23日提交的美国临时专利申请62/067,908号，于2015年4月16日提交的美国临时专利申请62/148,656号，于2015年7月2日提交的美国临时专利申请62/188,353号，及于2015年8月27日提交的美国临时专利申请62/210,795号的权益，将其内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。该序列表以题为“Sequence_Listing_STP25.txt”的文件提供，其在2015年9月30日创建，最后修改时间为2015年10月22日，大小为83,000字节。将电子格式的序列表的信息以其整体通过引用并入本文。
背景技术
单域抗体(sdAb)作为单抗原结合蛋白或作为较大蛋白质或多肽中的抗原结合域的应用与应用常规抗体或抗体片段相比提供了许多显著的优点。sdAb的优点包括：仅需要单个域就可以高亲和性和高选择性结合抗原；sdAb可以从单个基因表达且不需要翻译后修饰；sdAb对热、pH、蛋白酶和其他变性剂或条件是高度稳定的；sdAb的制备成本低；并且sdAb可以接近常规抗体不可及的靶标和表位。
有许多疾病或病症，诸如癌症，是由诸如核苷酸和蛋白质等异常细胞内或跨膜组分引起的。可利用异常组分的消除来预防或治疗疾病或病症。有许多可用于治疗的药物化合物，但是这些化合物可能无效、不可递送或对未受影响的细胞有毒性。
其他治疗包括使用含有外源靶向序列的治疗性蛋白质或试剂，这样治疗剂可被细胞膜中的受体识别，使得治疗剂能够穿过细胞膜并进入细胞。一旦治疗剂在细胞内，治疗剂可以与靶标组分相互作用以治疗疾病。然而，外源靶向序列的应用可限制治疗剂所靶向的细胞类型，并且增加了制造治疗剂的成本。
由于前述原因，需要不依赖于外源靶向序列或化学组合物来进入细胞的治疗或预防疾病的组合物和方法，并且其在身体内仅有效靶向受影响的细胞。
本发明涉及单域抗体(sdAb)，包含该sdAb的蛋白质和多肽。sdAb针对引起病症或疾病的细胞内组分。本发明还包括编码sdAb、蛋白质和多肽的核酸、和包含sdAb的组合物。本发明包括组合物、sdAb、蛋白质或多肽在预防、治疗或诊断目的上的应用。本发明还包括针对本发明的sdAb的单克隆抗体的应用。
发明内容
本发明的一个实施方式是针对细胞内组分的单域抗体(sdAb)。所述细胞内组分可以例如是蛋白质、核酸、脂质、糖、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、TNF-α、和KRAS。
在另一个实施方式中，本发明涉及抗STAT3 sdAb。可选地，该抗STAT3 sdAb包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，本发明涉及包含编码抗STAT sdAb的氨基酸序列的分离的多肽，例如，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多肽。
在另一个实施方式中，本发明涉及宿主细胞，所述宿主细胞表达sdAb的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
本发明的一个实施方式是包含sdAb或多肽，和药学上可接受的载体的药物组合物。可选地，所述sdAb包括含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的抗STAT3sdAb，且所述多肽包括含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的分离的多肽。
本发明另一个实施方式是诊断受试者中由STAT3介导的病症的方法，所述方法包括以下步骤：a)使生物样品与sdAb或多肽接触；b)测定所述生物样品中STAT3的量；和c)将步骤(b)中测定的量与标准品比较，其量的差异指示所述病症的存在。
本发明的另一个实施方式是预防或治疗由STAT3介导的疾病或病症，或者预防所述疾病的复发，或者用于治疗癌症，或者由异常细胞增殖引起的疾病的方法，其包括对有需要的受试者施用抗STAT3 sdAb或多肽。可选地，所述sdAb包括含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的抗STAT3 sdAb，且所述多肽包括含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的分离的多肽。
本发明的一个实施方式是抗TNF-αsdAb。可选地，所述抗TNF-αsdAb包括SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。本发明还包括含SEQ ID NO:5、SEQID NO:6或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的分离的多肽。
本发明的另一个实施方式是表达SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的宿主细胞。
在另一个实施方式中，本发明还是含sdAb或多肽、和药学上可接受的载体的药物组合物。可选地，所述sdAb包括含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的抗TNF-αsdAb，且所述多肽包括含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的分离的多肽。
本发明的另一个实施方式是诊断受试者中由TNF-α介导的病症的方法，所述方法包括以下步骤：a)使生物样品与sdAb或多肽接触；b)测定所述生物样品中TNF-α的量；和c)将步骤(b)中测定的量与标准品比较，其量的差异指示所述病症的存在。
在一个实施方式中，本发明描述了预防或治疗由TNF-α介导的疾病或病症，或者所述疾病或病症的复发，或者用于治疗癌症或由异常细胞增殖引起的疾病的方法，其包括对有需要的哺乳动物施用抗TNF-αsdAb、或多肽。可选地，所述抗TNF-αsdAb包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，且所述多肽包括分离的多肽，所述分离的多肽包含SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
本发明的一个实施方式是抗KRAS sdAb。可选地，所述抗KRAS sdAb包括SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。一方面，本发明包括分离的多肽，其中，所述分离的多肽包含SEQID NO:2所示的氨基酸序列。另一方面，本发明包括表达SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的宿主细胞。
本发明的另一个实施方式是一种药物组合物，其包括sdAb或多肽，和药学上可接受的载体。可选地，所述sdAb包括含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的抗KRAS sdAb，且所述多肽包括含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的分离的多肽。
本发明的另一个实施方式是诊断受试者中由KRAS介导的病症的方法，所述方法包括以下步骤：a)使生物样品与sdAb或多肽接触；b)测定所述生物样品中KRAS的量；和c)将步骤(b)中测定的量与标准品比较，其量的差异指示所述病症的存在。可选地，所述sdAb包括含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的抗KRAS sdAb，且所述多肽包括含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的分离的多肽。
本发明还包括使用抗KRAS sdAb治疗疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的抗KRAS sdAb。
在一个实施方式中，本发明描述了预防或治疗由KRAS介导的疾病或病症，或者所述疾病或病症的复发，或者用于治疗癌症或由异常细胞增殖引起的疾病的方法，其包括对有需要的哺乳动物施用抗KRAS sdAb或多肽。可选地，所述抗KRAS sdAb包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，且所述多肽包括含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的分离的多肽。
在一个实施方式中，本发明描述了施用本发明sdAb的方法，所述方法包括静脉内施用、肌内施用、口服施用、直肠施用、眼内施用、肠内施用、胃肠外施用、皮下施用、透皮施用、作为滴眼剂施用、作为鼻喷雾剂施用、通过吸入或雾化施用、局部施用，以及作为可植入药物施用。
在另一个实施方式中，本发明描述了使用本发明的sdAb与一种或多种化合物组合治疗疾病、预防疾病或预防疾病复发的方法。可选地，所述一种或多种化合物是转录抑制剂。
在另一个实施方式中，本发明描述了测量sdAb水平的方法，所述方法包括以下步骤：a)产生针对sdAb的一个或多个域的小鼠单克隆抗体；b)进行免疫测定以测定受试者中sdAb的量；和c)对受试者中sdAb的量进行定量。
附图说明
参考以下描述、所附权利要求和附图，将更好地理解本发明的这些和其他特征、方面和优点，其中：
图1是VHH13抗STAT3 sdAb表达载体pTT21-stt VHH13的示意图；
图2是VHH14抗STAT3 sdAb表达载体pTT21-stt VHH14的示意图；
图3描述了使用抗STAT3细菌VHH13STAT3(SEQ ID NO:3)和抗STAT3细菌VHH14STAT3(SEQ ID NO:4)的免疫沉淀测定的结果；
图4描述了使用抗STAT3细菌VHH13STAT3(SEQ ID NO:3)的免疫沉淀测定的结果；
图5示出了在MDA-MB-231异种移植模型中，以0.5mg/kg/日给药的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的生长抑制；
图6示出了在MDA-MB-231异种移植模型中，以1mg/kg每日两次～2mg/kg每日两次或2mg/kg/日的剂量范围给药的抗STAT3细菌VHH13(SEQ.ID.NO.3)sdAb的生长抑制；
图7示出了在MDA-MB-231异种移植模型中，以5mg/kg/每日两次给药的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的生长抑制；
图8示出了在DU145异种移植模型中，以5mg/kg/每日两次给药的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的生长抑制；
图9示出了在PANC-1异种移植模型中，以5mg/kg/每日两次给药的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的生长抑制；
图10示出了在MCF-7异种移植模型中，以1mg/kg/每日三次给药的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的生长抑制；
图11示出了在BT-474异种移植模型中，以1mg/kg/每日三次给药的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的生长抑制；
图12示出了TNF-α在U937细胞中的细胞毒性；
图13示出了星形孢菌素(Staurosporine)在U937细胞中的细胞毒性；和
图14示出了抗TNF-αsdAb对TNF-α细胞毒性的抑制。
具体实施方式
本文使用的以下术语及其变体具有以下给出的含义，除非在使用该术语的语境中明确指出不同含义。
除非在本文语境的用法另有指示，本文使用的术语“一个”、“一种”和“该”及类似的指示语应被解释为覆盖单数和复数。
术语“抗原决定簇”是指由抗原结合分子(诸如本发明的sdAb或多肽)识别的抗原上的表位，更具体是由抗原结合分子的抗原结合位点识别的抗原上的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”也可以互换使用。能够结合特定抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质、对它们具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列被称为“抗”或“针对”该抗原决定簇、表位、抗原或蛋白质。
如本文所使用的术语“包括”和该术语的变体，例如“包含”和“含有”，不意在排除其他添加剂、组分、整体或步骤。
预期本文所述的sdAb、多肽和蛋白质可以包含所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可被描述为这样的氨基酸取代：其中一种氨基酸残基被类似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且对多肽的功能、活性或其他生物学性质几乎没有或基本上没有影响。保守氨基酸取代是本领域众所周知的。保守性取代是下列(a)-(e)组中的一个氨基酸被同组内的另一个氨基酸取代的取代：(a)小的脂肪族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性带正电荷的残基：His、Arg和Lys；(d)大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；和(e)芳族残基：Phe、Tyr和Trp。其他的保守性取代包括：Ala转变为Gly或转变为Ser；Arg转变为Lys；Asn转变为Gln或转变为His；Asp转变为Glu；Cys转变为Ser；Gln转变为Asn；Glu转变为Asp；Gly转变为Ala或转变为Pro；His转变为Asn或转变为Gln；Ile转变为Leu或转变为Val；Leu转变为Ile或转变为Val；Lys转变为Arg、转变为Gln或转变为Glu；Met转变为Leu、转变为Tyr或转变为Ile；Phe转变为Met、转变为Leu或转变为Tyr；Ser转变为Thr；Thr转变为Ser；Trp转变为Tyr；Tyr转变为Trp；和/或Phe转变为Val、转变为Ile或转变为Leu。
本文所使用的“域”通常是指抗体链的球状区域，特别是指重链抗体的球状区域，或指基本上由这样的球状区域组成的多肽。
sdAb的氨基酸序列和结构通常由四个框架区或“FR”组成，其被称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3；和“框架区4”或“FR4”。框架区被分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”的三个互补决定区或“CDR”所中断。
如本文使用的术语“人源化sdAb”是指在天然存在的VHH序列的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基被来自人的常规4-链抗体的VH域中相应位置处存在的一个或多个氨基酸残基替代的sdAb。其可以通过本领域众所周知的方法进行。例如，sdAb的FR可以由人可变FR替代。
如本文使用的“分离的”核酸或氨基酸已经与通常与其结合的至少一种其他组分分离，所述其他组分诸如其来源或介质、另一种核酸、另一种蛋白质/多肽、另一种生物学组分或大分子或污染物、杂质或次要组分。
术语“哺乳动物”被定义为属于哺乳纲的个体，其包括但不限于，人类、家畜和农场动物、以及动物园、运动和宠物动物，例如牛、马、绵羊、狗和猫。
如本文使用的“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。合适的载体在最新版本的Remington's Pharmaceutical Sciences中描述，其为本领域的标准参考文献。这种载体或稀释剂的优选实例包括但不限于，水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体、阳离子脂质和非水性载剂，例如不挥发油。所述介质和试剂用于药物活性物质的应用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与如上定义的治疗剂不相容，否则考虑将其用于本发明的组合物中。
“定量免疫测定”是指通过使用抗体测量样品中存在的抗原的量的任何方法。进行定量免疫测定的方法包括但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、特异性分析物标记和再捕获测定(SALRA)、液相色谱、质谱法、荧光激活细胞分选等。
术语“溶液”是指包含溶剂和溶质的组合物，并且包括真溶液和悬浮液。溶液的实例包括溶解在液体中的固体、液体或气体和悬浮在液体中的颗粒或胶束。
术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。抗原结合蛋白的特异性可以基于亲和性和/或亲和力来确定。由抗原与抗原结合蛋白(KD)的解离的平衡常数表示的亲和性是抗原决定簇与抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间的结合强度的量度：KD值越小，抗原决定簇与抗原结合分子之间的结合强度越强(或者说，亲和性也可以表达为亲和常数(KA)，其为1/KD)。对于本领域技术人员将会是清楚的是，可以根据感兴趣的特异性抗原确定亲和性。亲和力是抗原结合分子和抗原之间的结合强度的量度。亲和力与抗原决定簇及其抗原结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性以及抗原结合分子上存在的相关结合位点的数目有关。抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过任何已知的方式测定，诸如Scatchard分析和/或竞争性结合测定，例如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定。
如本文使用的术语“重组”是指使用遗传工程方法(例如，克隆和扩增)来产生本发明的sdAb。
“单域抗体”、“sdAb”或“VHH”通常可被定义为包含由被三个互补决定区中断的四个框架区组成的氨基酸序列的多肽或蛋白质。其以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4表示。本发明的sdAb还包括含sdAb氨基酸序列的多肽或蛋白质。通常，sdAb在诸如美洲驼等骆驼科中产生，但也可以使用本领域众所周知的技术合成产生。如本文使用的，于天然存在的重链抗体中存在的可变域也将被称为“VHH域”，以将其与存在于常规4链抗体中的被称为“VH域”的重链可变域，及与存在于常规4链抗体中的被称为“VL域”的轻链可变域区分开。“VHH”和“sdAb”在本文中可互换使用。sdAb或多肽的氨基酸残基的编号依照由Kabat等人(“Sequence of proteins of immunological interest，”US Public Health Services，NIH Bethesda，MD，出版号91)给出的VH域的一般编号方式。根据该编号，sdAb的FR1包含位置1-30的氨基酸残基，sdAb的CDR1包含位置31-36的氨基酸残基，sdAb的FR2包含位置36-49的氨基酸，sdAb的CDR2包含位置50-65的氨基酸残基，sdAb的FR3包含位置66-94的氨基酸残基，sdAb的CDR3包含位置95-102的氨基酸残基，且sdAb的FR4包含位置103-113的氨基酸残基。
术语“合成的”是指通过体外化学或酶促合成产生。
如本文所用的术语“靶标”是指被sdAb识别的任何组分、抗原或部分。术语“细胞内靶标”是指存在于细胞内的任何组分、抗原或部分。“跨膜靶标”是位于细胞膜内的组分、抗原或部分。“细胞外靶标”是指位于细胞外的组分、抗原或部分。
如本文使用的“治疗组合物”是指旨在具有治疗效果的物质，例如药物组合物、遗传物质、生物制剂和其他物质。遗传物质包括旨在具有直接或间接遗传治疗效果的物质，例如遗传载体、遗传调节元件、遗传结构元件、DNA、RNA等。生物制品包括是活物质或来源于旨在具有治疗效果的活物质。
如本文使用的短语“治疗有效量”和“预防有效量”是指在疾病或疾病的明显症状的治疗、预防或控制中提供治疗益处的量。治疗有效量可以治疗疾病或病症、疾病症状、或对疾病的倾向，其目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改良、改善或影响疾病、疾病的症状、或疾病的倾向。治疗有效的具体量可以由普通医生容易地确定，并且可以根据本领域已知的因素而变化，例如疾病类型、患者的病史和年龄、疾病的阶段、以及其他治疗剂的施用。
本发明涉及针对细胞内组分的单域抗体(sdAb)，以及包含所述sdAb的蛋白质和多肽，和编码所述蛋白质和多肽的核苷酸。本发明还涉及针对细胞间、跨细胞和细胞外靶标或抗原的sdAb。本发明还包括编码sdAb、蛋白质和多肽的核酸、和包含sdAb的组合物。本发明包括用于预防、治疗或诊断目的的组合物、sdAb、蛋白质或多肽的应用。
sdAb具有许多独特的结构特征和功能特性，使得sdAb高度有利于用作功能性抗原结合域或蛋白质。sdAb在不存在轻链可变域的情况下功能性结合抗原，并且可以作为单个相对小的功能性抗原结合结构单元、域或蛋白质。这将sdAb与常规抗体的域区分开，所述常规抗体本身不用作抗原结合蛋白或域，而需要与诸如Fab片段或ScFv's片段等常规抗体片段组合以结合抗原。
sdAb可以使用本领域众所周知的方法获得。例如，获得sdAb的一种方法包括(a)用一种或多种抗原免疫骆驼科动物，(b)从被免疫的骆驼科动物中分离外周淋巴细胞，获得总RNA并合成相应的cDNA，(c)构建编码VHH域的cDNA片段的文库，(d)使用PCR将步骤(c)中获得的编码VHH域的cDNA转录至mRNA，将mRNA转化为核糖体展示形式，并通过核糖体展示选择VHH域，和(e)在合适的载体中表达VHH域，可选地，纯化表达的VHH域。
获得本发明的sdAb的另一种方法是使用用于核酸合成的技术制备编码sdAb的核酸，随后在体内或体外表达该核酸。作为另一种选择，本发明的sdAb、多肽和蛋白质可以使用用于制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列的合成或半合成技术来制备。
本发明的sdAb通常会结合靶标的所有天然存在的或合成的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，或至少结合含有与本发明的sdAb在野生型靶标中结合的抗原决定簇或表位基本上相同的一个或多个抗原决定簇或表位的靶标的类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段靶标。本发明的sdAb可以以与本发明的sdAb结合至野生型靶标具有的亲和性和特异性相同、或者更高或更低的亲和性和/或特异性结合所述类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段。还在本发明的范围内考虑本发明的sdAb结合靶标的某些类似物、变体、突变体、等位基因、部分和片段，但不结合其他。此外，本发明的sdAb可以是人源化的，并且可以是单价或多价的，和/或多特异性的。此外，本发明的sdAb可以结合靶标蛋白质的磷酸化形式以及靶标蛋白质的非磷酸化形式。sdAb可以连接到其他分子，例如白蛋白或其他大分子。
此外，在本发明的范围内，sdAb是多价的，即sdAb可以具有针对两个以上不同靶标表位的两个以上蛋白质或多肽。在这样的多价sdAb中，蛋白质或多肽可以例如针对相同的表位、基本上等价的表位、或不同的表位。不同的表位可以位于相同的靶标上，或者它可以位于两个以上不同的靶标上。
还预期本发明的一个或多个sdAb的序列可以与一个或多个接头序列连接或接合。接头可以例如是含有丝氨酸、甘氨酸和丙氨酸的组合的蛋白质序列。
应用本发明的sdAb的部分、片段、类似物、突变体、变体、等位基因和/或衍生物也在本发明的范围内，只要它们适合于所述的应用。
因为本发明的sdAb主要用于治疗和/或诊断应用，所以它们针对哺乳动物，优选人类靶标。然而，本文所述的sdAb可能与来自其他物种的靶标交叉反应，例如与来自一个或多个其他物种的灵长类动物或其他动物(例如小鼠、大鼠、兔、猪或狗)的靶标交叉反应，特别是在与靶标相关的疾病相关的动物疾病和病症模型中。
另一方面，本发明涉及编码本发明的sdAb的核酸。这样的核酸可以例如是遗传构建体的形式。
另一方面，本发明涉及表达或能够表达本发明的sdAb，和/或含有编码本发明的sdAb的核酸的宿主或宿主细胞。sdAb的序列可用于插入任何生物体的基因组，以产生经遗传修饰的生物体(GMO)。其实例包括但不限于，植物、细菌、病毒和动物。
本发明进一步涉及用于制备或产生sdAb、编码sdAb的核酸、表达或能够表达这种sdAb的宿主细胞、含有本发明的sdAb的产品和组合物的方法。
本发明进一步涉及本文所述的sdAb、编码sdAb的核酸、宿主细胞、产品和组合物的应用和用途。所述产品或组合物可以例如是用于治疗或预防疾病的药物组合物，或者用于诊断应用的产品或组合物。sdAb可用于多种测定，例如ELISA测定和质谱测定，以测量sdAb的血清和组织水平。
另一方面，可以将编码本发明的一种或多种sdAb的核酸插入生物体的基因组中以治疗或预防疾病。
本发明通常涉及sdAb，以及包含或基本上由一种或多种所述sdAb组成的蛋白质或多肽，其可用于预防、治疗和/或诊断目的。
在本发明中详述的方法和组合物可用于治疗本文所述的疾病，并且可以以本文所述或以其他已知的任何剂量和/或制剂，以及以本文所述的或本领域技术人员已知的其他任何施用途径进行使用。
本发明的sdAb，特别是本发明的抗STAT3 VHH、抗KRAS VHH、和抗TNF-αVHH可用于治疗和预防恶性疾病，其包括但不限于：多发性骨髓瘤、白血病(HTLV-1依赖性、红白血病、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)和大颗粒淋巴细胞性白血病(LGL))、淋巴瘤(EBV相关/伯基特氏病、蕈样真菌病、皮肤T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL))、乳腺癌、三阴性乳腺癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、尤文氏肉瘤、肝细胞癌、胶质瘤、神经母细胞瘤、星形细胞瘤、结肠直肠癌、Wilm's肿瘤、肾癌、膀胱癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、食道癌、皮肤鳞状细胞癌、基底细胞癌、和任何转移性癌症。sdAb可用于癌症患者以帮助预防或减轻由于癌症引起的体重减轻或恶病体质。
本发明的sdAb，特别是抗STAT-3和抗TNF-αsdAb也可用于治疗和预防疾病，例如但不限于：自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、细菌性结肠炎、哮喘、硬皮病、狼疮、脑脊髓炎、动脉炎、血管炎、肾小球肾炎、葡萄膜炎、葡萄膜视网膜炎、多发性硬化)、多囊性肾病、皮肤病(例如牛皮癣、斑秃、特应性皮炎、瘢痕疙瘩/增生性瘢痕、脂肪瘤、佩吉特氏病、和光化性角化病)、化脓性汗腺炎、移植(例如实体器官、骨髓、手、面部、四肢、任何身体部位)、与癌症和衰老相关的肌营养不良和肌肉萎缩、子宫内膜异位、黄斑变性、视网膜变性、中风、癫痫、创伤性脑和脊髓损伤、高血压、心脏肥大、阿尔茨海默病、肺动脉高血压、2型糖尿病、和强直性脊柱炎。此外，sdAb可以针对孤儿疾病。这些罕见孤儿疾病的实例包括但不限于，三阴性乳腺癌、胰腺癌、AML(急性粒细胞性白血病)、头颈癌、多发性骨髓瘤和化疗耐药性癌症。
可以通过靶向感染细胞中的细胞内病毒蛋白来治疗病毒感染。诸如HIV逆转录酶等病毒蛋白可以阻断病毒的生命周期。本发明的sdAb还可以靶向诸如埃博拉VP24等细胞内病毒蛋白，从而阻断埃博拉关闭宿主抗病毒免疫应答的能力。本发明的sdAb可用于靶向存在细胞内分子的过表达的疾病。可以用sdAb治疗亨廷顿氏病。
本发明的sdAb可以与一种或多种化合物一起使用。例如，本发明的sdAb可以与JAK/STAT抑制剂一起使用，例如姜黄素、白藜芦醇、葫芦素A、葫芦素B、葫芦素E、葫芦素I、葫芦素Q、黄酮吡啶醇、脱氧秋兰霉素、环戊烯酮衍生物、N-酰基高丝氨酸内酯、靛玉红衍生物、甲异靛、酪氨酸磷酸化抑制剂(Tyrphostins)、含铂化合物(例如IS3-295)、肽模拟物、反义寡核苷酸、S3I-201、磷酸酪氨酸三肽衍生物、HIV蛋白酶抑制剂(例如奈非那韦、茚地那韦、沙奎那韦、和利托那韦)、JSI-124、XpYL、Ac-pYLPQTV-NH2、ISS 610、CJ-1383、乙胺嘧啶、二甲双胍、阿米莫德、S3I-M2001、STX-0119；N-[2-(1,3,4-噁二唑基)]-4喹啉甲酰胺衍生物、S3I-1757、LY5；5,8-二氧代-6(吡啶-3-基氨基)-5,8-二氢-萘-1-磺酰胺、阿那白霉素(withacinstin)、司泰替(Stattic)、STA-21、LLL-3、LLL12、XZH-5、SF-1066、SF-1087、17o、隐丹参酮、FLL32、FLL62、C188-9、BP-1108和BP-1075、肉盘菌内酯、JQ1,5,15DPP、WP1066、氯硝柳胺、SD1008、硝呋酚酰肼、隐丹参酮、BBI醌和Ruxolitnib磷酸盐。所述一种或多种化合物可以增加治疗反应并增大本发明的sdAb的有效性。此外，可以通过将与肽、肽模拟物和其他药物(例如但不限于，西咪替丁、阿托伐他汀、塞来昔布、二甲双胍和西咪替丁)组合来提高sdAb的有效性。此外，对于放射治疗，抗STAT3 sdAb可将放射抗性癌症转化为放射敏感性癌症。
还预期本发明的一种或多种sdAb可以组合，或本发明的sdAb可以与其他sdAb组合。
预期本发明的某些sdAb可以穿过细胞膜并进入细胞内，而不需要sdAb上的额外靶向蛋白序列的辅助，并且不需要指导sdAb结合细胞表面受体和跨细胞膜的外源化合物的辅助。
在穿过细胞膜后，这些sdAb可靶向跨膜或细胞内分子或抗原。这些细胞内或跨膜靶标可以例如是蛋白质、糖、脂质、核酸、突变蛋白、病毒蛋白和朊病毒。sdAb靶标可以作为酶、细胞的结构蛋白、细胞膜分子的细胞内部分、细胞器膜内的分子、任何类型的RNA分子、DNA或染色体的任何区域、甲基化或非甲基化核酸、在细胞的合成机制中部分组装的分子、第二信使分子、和细胞信号机制内的分子。靶标可以包括细胞质、细胞核、细胞器、和细胞膜中的所有分子。用于分泌或放置在细胞膜中的分子可以在离开细胞之前在细胞质内被靶向。
sdAb靶标可以在人类、动物、植物、真菌、寄生虫、原生生物、细菌、病毒、朊病毒、原核细胞和真核细胞中。可由本发明的sdAb靶向的细胞间和细胞内信号分子和蛋白质基团的一些实例是：癌基因产物、激素、细胞因子、生长因子、神经递质、激酶(包括酪氨酸激酶、丝氨酸激酶、和苏氨酸激酶)、磷酸酶、泛素、环核苷酸、环化酶(腺苷酰基和鸟嘌呤基)、G蛋白、磷酸二酯酶、GTP酶超家族、免疫球蛋白(抗体、Fab片段、结合剂、sdAb)、免疫球蛋白超家族、肌醇磷酸脂质、类固醇受体、钙调蛋白、CD组(CD4、CD8、CD28等)、转录因子、TGF-β、TNF-α和β、TNF配体超家族、缺刻(notch)受体信号分子、hedgehog受体信号分子、Wnt受体信号分子、toll样受体信号分子、胱天蛋白酶(caspase)、肌动蛋白、肌球蛋白、肌肉生长抑制素、12-脂肪氧化酶、15-脂氧合酶、脂氧合酶超家族、逆转录酶、病毒及其蛋白质、淀粉样蛋白、胶原、G蛋白偶联受体、突变的正常蛋白、朊病毒、Ras、Raf、Myc、Src、BCR/ABL、MEK、Erk、Mos、Tpl2、MLK3、TAK、DLK、MKK、p38、MAPK、MEKK、ASK、SAPK、JNK、BMK、MAP、JAK、PI3K、环氧合酶、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6、Myc、p53、BRAF、NRAS、KRAS、HRAS和趋化因子。
KRAS是来自哺乳动物ras基因家族的Kirsten ras癌基因同源物。KRAS编码作为小GTP酶超家族成员的蛋白质。该蛋白参与到包括肺腺癌、粘液腺瘤、胰腺导管癌、和结肠直肠癌的各种恶性肿瘤中。在正常条件下，Ras家族成员在亚细胞膜区室化信号系统中影响细胞的生长和分化事件。然而，致癌Ras可以解除控制细胞增殖和凋亡的过程。
开发靶向野生型和突变KRAS(G12D)的抗KRAS sdAb，是为了破坏其在恶性细胞中的作用，所述恶性细胞例如是参与到结肠直肠癌、胰腺癌、胆道癌、肺癌、白血病、和其他转移性恶性肿瘤中的细胞。不受特定机制的限制，认为抗KRAS sdAb在恶性细胞中结合KRAS并阻断KRAS的下游信号传导。另外，抗KRAS sdAb可以成功治疗对抗EGFR生物制剂(例如西妥昔单抗和帕尼单抗)有抗性的恶性肿瘤。
使用本领域众所周知的方法，使用重组人突变体KRAS(G12D)蛋白产生针对或可以结合KRAS或突变体KRAS(G12D)或其他KRAS突变体的表位的sdAb。此外，可以产生针对其他KRAS突变体的sdAb。为了产生抗KRAS sdAb，在大肠杆菌中表达重组全长人KRAS(基因ID：3845)。
获得并筛选几种sdAb。一种命名为KRAS_13的抗KRAS(G12D)sdAb的DNA序(SEQ IDNO:1)列如下所示：
5’Gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcagactggagggtctctgagactctcctgtgcagtttctggaaatatcggcagcagctactgcatgggctggttccgccaggctccagggaagaagcgcgaggcggtcgcacgtattgtacgtgatggtgccactggctacgcagactacgtgaagggccgattcaccatctcccgagacagcgccaagaacactctgtatctgcaaatgaacaggctgatacctgaggacactgccatctactactgtgcggcagacctgcccccaggttgtttgactcaggcgatttggaattttggttatcggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca-3’
KRAS_13的抗KRAS(G12D)sdAb的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下所示，CDR用下划线表示：
EVQLVESGGGSVQTGGSLRLSCAVSGNIGSSYCMGWFRQAPGKKREAVARIVRDGATGYADYVKGRFTISRDSAKNTLYLQMNRLIPEDTAIYYCAADLPPGCLTQAIWNFGYRGQGTLVTVSS
此外，本发明包括一种或多种针对本发明的抗KRAS sdAb的一个或多个域的小鼠单克隆抗体。小鼠单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法产生，例如，小鼠单克隆抗体可以通过小鼠杂交瘤产生。小鼠单克隆抗体可用于诊断测定，例如，该抗体可用于诸如ELISA或质谱测定等免疫测定，以测量患者血清中存在的抗KRAS sdAb的量。如下所述测试KRAS(G12D)sdAb对PANC-1人胰腺癌细胞的细胞毒性。
STAT3是携带信号转导和转录功能激活的信号转导物和转录激活物(STAT)的蛋白家族成员。STAT3广泛表达，并响应于诸如EGF、IL-6、PDGF、IL-2和G-CSF等各种细胞因子和生长因子通过作为DNA结合蛋白的酪氨酸和/或丝氨酸的磷酸化而被激活。STAT3磷蛋白形成同源二聚体或与STAT家族的其他成员形成异源二聚体，并转移到细胞核以调节各种基因的转录，并且因此在许多细胞过程中起关键作用，例如细胞生长、细胞凋亡、血管生成、免疫逃避和存活。
可以将抗STAT3 sdAb给予患者和其他生物体以治疗由磷酸化和非磷酸化的STAT3引起的疾病，以及预防疾病的发展或疾病的复发。例如，由于其所服用的免疫抑制药物，经历器官移植和骨髓移植的患者具有更高的皮肤SCCA和BCCA的风险。施用抗STAT3 sdAb可以降低或消除这种风险。对于具有复发风险的恶性肿瘤治疗的患者将受益于抗STAT3 sdAb的治疗。基于家族病史和HLA型，某些个体将面临某些类型的自身免疫性疾病的风险增加，并且可以受益于sdAb的治疗，以降低发展该自身免疫性疾病的风险。如在最近的NCI研究中所证实的，可以通过施用诸如GLG-302等抗STAT3药物来降低乳腺癌风险。
除了抑制STAT3，由于这些分子之间的高度同源性，抗STAT3 sdAb还可以抑制STAT1、STAT2、STAT4、STAT5a、STAT5b、和STAT6。
使用重组人STAT3蛋白来产生针对STAT3的表位的或可以结合STAT3的表位的抗STAT sdAb。为了产生抗STAT3 sdAb，在Sf9昆虫细胞中通过杆状病毒表达重组全长人STAT3(基因ID：6774)。将抗STAT sdAb克隆到可在细菌和哺乳动物细胞中表达的载体中，如图1和图2所示。
本发明的抗STAT3 sdAb可用于靶向细胞内的STAT3和所有其他STAT分子，以抑制细胞生长，例如抑制癌细胞生长。此外，抗STAT3 sdAb可在诸如银屑病和经由VEGF的黄斑变性等其他增殖性疾病中抑制细胞生长。
不受特定作用机制的限制，认为抗STAT3 sdAb可通过降低抗原呈递细胞(例如宿主树突细胞)中的STAT3水平来消除癌症诱导的免疫抑制。STAT3抑制促进患者的先天和适应性免疫系统(即树突细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T细胞、NK细胞、和B细胞)的抗癌反应。
如下所述，使用本领域众所周知的方法，获得几种抗STAT sdAb，并筛选其在癌细胞系中抑制癌细胞生长和诱导凋亡的能力。测试抗STAT3 sdAb的细胞毒性和抗增殖活性。此外，在体外和体内测试抗STAT3 sdAb的耐受性。下面描述了针对抗STAT sdAb的一个或多个域的小鼠单克隆抗体的产生。
命名为VHH13的一种抗STAT3 sdAb的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)如下所示：
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSGISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSRFDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS
用下划线表示了三个CDR。
命名为VHH14的第二种抗STAT3 sdAb的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)如下所示：
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAALSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAAREGWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS
用下划线表示了三个CDR。获得的其他抗STAT3 sdAb的蛋白质序列如下：
STAT3_10(SEQ ID NO.5):
(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSS
STAT3_34(SEQ ID NO.6):
(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSS
STAT3_19(SEQ ID NO.7):
(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTQVTVSS
STAT3_14(SEQ ID NO.8):
(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS
STAT3_35(SEQ ID NO.9):
(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS
STAT3_9(SEQ ID NO.10):
(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS
STAT3_30(SEQ ID NO.11):
(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS
STAT3_23(SEQ ID NO.12):
(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGSHTYWGQGTLVTVSS
STAT3_24(SEQ ID NO.13):
(1)EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA
(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS
STAT3_36(SEQ ID NO.14):
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(48)LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98)GWECGETWLDRTAGGHTYWGQGTLVTVSS
STAT3_12(SEQ ID NO.15):
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(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS
STAT3_16(SEQ ID NO.16):
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(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTNNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS
STAT3_11(SEQ ID NO.17):
(1)EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG
(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS
STAT3_20(SEQ ID NO.18):
(1)DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG
(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVSS
STAT3_2(SEQ ID NO.19):
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(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
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STAT3_15(SEQ ID NO.20):
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(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
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STAT3_6(SEQ ID NO.21):
(1)HVQLVESEGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG
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STAT3_33(SEQ ID NO.22):
(1)QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG
(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS
STAT3_17(SEQ ID NO.23):
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STAT3_25(SEQ ID NO.24):
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STAT3_32(SEQ ID NO.25):
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STAT3_13(SEQ ID NO.26):
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(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS
STAT3_39(SEQ ID NO.27):
(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG
(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS
STAT3_4(SEQ ID NO.28):
(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG
(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS
STAT3_29(SEQ ID NO.29):
(1)HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG
(51)ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101)FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTQVTVSS
相应的抗STAT3DNA序列如下：
Stat3_VHH-10(SEQ ID NO.30):5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-14(SEQ ID NO.31):
5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-12(SEQ ID NO.32):
5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-13(SEQ ID NO.33):
5’-catgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaacggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcactgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-20(SEQ ID NO.34):
5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-23(SEQ ID NO.35):
5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagcagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggagccatacctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-24(SEQ ID NO.36):
5’-gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccgaaccgccgggggccatacctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-25(SEQ ID NO.37):5’-gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggtcgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgagcagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-19(SEQ ID NO.38):5’-catgtgcagctggtggagtctggggggggctcggtgcaggctggaggctctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-32(SEQ ID NO.39):5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-33(SEQ ID NO.40):
5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-36(SEQ ID NO.41):5’- gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagactctctgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctcttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccggaccgccgggggccatacctactggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’
Stat3_VHH-11(SEQ ID NO.42):
5’-gtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgtgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’
Stat3_VHH-6(SEQ ID NO.43):
5’-gtgcagctggtggagtctgagggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-1(SEQ ID NO.44):
5’-gtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaataacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’
此外，本发明包括一种或多种针对本发明的抗STAT3 sdAb的一个或多个域的小鼠单克隆抗体。小鼠单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法产生，例如，小鼠单克隆抗体可以通过小鼠杂交瘤产生。小鼠单克隆抗体可用于诊断测定，例如，抗体可用于诸如ELISA等免疫测定，以测量患者血清中存在的抗STAT3 sdAb的量。应当理解的是，该方法不限于抗STAT3 sdAb，并且可以用于产生针对本发明的任何sdAb的小鼠抗体。
TNF-α基因编码属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族的多功能促炎细胞因子。这种细胞因子主要由巨噬细胞分泌。该细胞因子参与到调节广谱的生物过程，其包括生长调节、分化、炎症、病毒复制、肿瘤发生和自身免疫疾病；及调节在病毒、细菌、真菌和寄生虫感染中的生物过程。除了诱导肿瘤的出血性坏死，TNF被发现参与到肿瘤发生、肿瘤转移、病毒复制、脓毒性休克、发热、炎症、恶病体质、和包括克罗恩氏病和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病以及移植物抗宿主病中。
本发明提供针对TNF-α，特别是针对细胞或细胞膜内的人TNF-α的sdAb、蛋白质和多肽，以防止细胞分泌TNF-α。
预期本发明的抗TNF-αsdAb和多肽可用于预防和/或治疗与TNF-α相关和/或由TNF-α介导的疾病和病症，例如炎症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、炎症性肠综合征、多发性硬化症、阿狄森氏病、自身免疫性肝炎、自身免疫性腮腺炎、1型糖尿病、附睾炎、肾小球肾炎、格雷夫斯氏病、格林巴利综合征、桥本氏病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、脊椎关节病(spondyloarthropathy)、甲状腺炎、血管炎、和由癌症和恶病体质引起的体重减轻。
TNF-α以不同的形式存在；有单体和包括三聚体形式的多聚体形式。在本发明的范围内，本发明的sdAb、蛋白质和多肽结合不同形式(即单体形式或多聚体形式)的TNF-α。因此，当本发明的sdAb、蛋白质和多肽针对TNF-α时，应当理解的是，这也包括针对三聚体形式的TNF-α的sdAb、蛋白质和多肽。
已知TNF的信号转导涉及通过TNF分子三聚体的TNF受体的交联，其包含三个受体结合位点(例如参见Peppel等.，J.Exp.Med.，174(1991)，1483-1489)。
使用重组人TNF-α蛋白产生针对或可结合TNF-α表位的sdAb。为了产生抗TNF-αsdAb，在大肠杆菌中表达重组全长人TNF-α(基因ID：7124)并用作靶标抗原。
获得了针对TNF-α蛋白的35个sdAb。基于序列同源性将这些抗TNF-α抗体分成三组。
命名为TNF-αVHH66sdAb的第一抗TNF-αsdAb的氨基酸序列(SEQ ID NO.45)如下所示：
HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRG-QGTLVTVSS
用下划线表示了三个CDR。
命名为TNF-αVHH69sdAb的第二抗TNF-αsdAb的氨基酸序列(SEQ ID NO.46)如下所示：
EVQLVESGGGSVLAGGSLRLSCVASGFTSRYNYMAWFRQAPGKEREGVATIGTASGSADYYGSVKDRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAARTYGTISLTPSDYRYWGQGTLVTVSS
用下划线表示了三个CDR。
命名为TNF-αVHH62sdAb的第三抗TNF-αsdAb的氨基酸序列(SEQ ID NO.47)如下所示：
QVQLVESGGGPVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTLVTVSS
用下划线表示了三个CDR。发现的其他抗TNF-αsdAb包括以下序列，也用加下划线表示CDR：
TNF_2(SEQ ID NO.48):
QVQLVESGGGSVEAGRSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS
TNF_46(SEQ ID NO.49):
QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNVKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS
TNF_71(SEQ ID NO.50):
QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS
TNF_21(SEQ ID NO.51):
QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS
TNF_38(SEQ ID NO.52):
EVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS
TNF_18(SEQ ID NO.53):
EVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS
TNF_37(SEQ ID NO.54):
DVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS
TNF_66(SEQ ID NO.55):
HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS
TNF_68(SEQ ID NO.56):
HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKEREGVATIDIDGLATHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS
TNF_78(SEQ ID NO.57):
HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADRKEREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTQVTVSS
TNF_67(SEQ ID NO.58):
HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKVREGVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTAMYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS
TNF_6(SEQ ID NO.59):
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQAPGKEREGVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSAMYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGQGTQVTVSS
TNF_7(SEQ ID NO.60):
DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQTPGKEREGVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSAMYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGQGTQVTVSS
TNF_13(SEQ ID NO.61):
DVQLVESGGGSVQVGGSLTLSCAVSGYTDSYGVMAWFRQAPGKEREGVASIYRNSGITYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVLLQMNSLKPEDSATYYCAVRSFGSVSTWAGYVYWGQGTQVTVSS
TNF_60(SEQ ID NO.62):
DVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQAPGKEREGVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSAMYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGRGTQVTVSS
TNF_73(SEQ ID NO.63):
DVQLVESGGGSVRAGGSLRLSCTASGDTSKSDCMAWFRQAPGKERERVGAIYTRNGYTHYADSVNGRFTISQDNAKNALYLQMSGLKPEDTAMYYCAARFRIYGQCVEDDDIDYWGQGTLVTVSS
TNF_69(SEQ ID NO.64):
EVQLVESGGGSVLAGGSLRLSCVASGFTSRYNYMAWFRQAPGKEREGVATIGTASGSADYYGSVKDRFTISQDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAMYYCAARTYGTISLTPSDYRYWGQGTLVTVSS
TNF_76(SEQ ID NO.65):
QVQVVEYGGGSVQAGETVRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHEWELVSNITTEGITSEASSSYADSVRGRFTIFDNAKNMVYLQMNSLKHEDTA VYYCAPDPYAYSTYREYCTWAQGTQGTLVTVSS
TNF_62(SEQ ID NO.66):
QVQLVESGGGPVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTLVTVSS
TNF_43(SEQ ID NO.67):
QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS
TNF_15(SEQ ID NO.68):
QVQPVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGAQGTLVTVSS
TNF_11(SEQ ID NO.69):
QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSS
TNF_17(SEQ ID NO.70):
QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS
TNF_63(SEQ ID NO.71):
QVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS
TNF_20(SEQ ID NO.72):
HVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS
TNF_58(SEQ ID NO.73):
EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGALVTVSS
TNF_27(SEQ ID NO.74):
EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS
TNF_28(SEQ ID NO.75):
EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSS
TNF_4(SEQ ID NO.76):
EVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS
TNF_14(SEQ ID NO.77):
DVQLVESRGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS
TNF_3(SEQ ID NO.78):
DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHVCELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSS
TNF_1(SEQ ID NO.79):
DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGLECELVSTITTEGITSEASSYADSVRG RFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSEYCTWAQGTQGTLVTVSS
TNF_45(SEQ ID NO.80):
DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSEASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS
TNF_22(SEQ ID NO.81):
DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECELVSTITTEGITSVASSYYADSVR GRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTAVYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTQVTVSS
如下所述，测试几种TNF-αsdAb的体外生长抑制。此外，本发明包括一种或多种针对本发明的抗TNF-αsdAb的一个或多个域的小鼠单克隆抗体。如上所述，小鼠单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法产生。小鼠单克隆抗体可用于诊断测定，例如诸如ELISA等免疫测定，以测量患者血清中存在的抗TNF-αsdAb的量。
RAF蛋白是丝氨酸/苏氨酸特异性激酶家族，其充当将细胞外信号传递至控制细胞生长、分化和存活的丝裂原活化蛋白激酶级联的中枢中间体。BRAF是RAF家族的成员，其在生长因子诱导刺激下由Ras家族的成员激活。活性Ras可以诱导cRaf和BRAF的异源二聚化，其可以解释观察到的响应生长因子信号的细胞中cRaf和BRaf的协作性。BRAF基因中的激活突变存在于大百分比的人恶性黑色素瘤中和一定比例的结肠癌中。这些突变的绝大多数导致在BRAF的活化片段内的残基599处缬氨酸变为谷氨酸。
开发靶向野生型和突变的BRAF的抗BRAF sdAb，以破坏其在恶性细胞中的作用，例如参与到结肠癌和其他恶性肿瘤的细胞中的作用。
使用本领域众所周知的方法，使用重组人BRAF蛋白产生针对或可以结合BRAF表位的sdAb。
此外，本发明包括一种或多种针对本发明的抗BRAF sdAb的一个或多个域的小鼠单克隆抗体。小鼠单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法产生。小鼠单克隆抗体可用于诊断测定，例如，该抗体可用于诸如ELISA等免疫测定，以测量患者血清中存在的抗BRAF sdAb的量。
实施例
实施例1：抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)SDAB结合STAT3
在该实施例中，使用基于Octet的无标记结合测定法测量两个VHH靶标对STAT3的亲和性。在此测定中使用抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb、抗KRAS(阴性对照)和GST-STAT3(16kDa的单价抗原，Creative BioMart#STAT3-1476H)作为抗原探针。使用特别是针对疏水蛋白的氨基丙基硅烷(APS)浸液和读取生物感受器，在PBS中以20μg/ml捕获GST-STAT3蛋白。然后将探针浸在具有所示浓度的GST-STAT3蛋白、抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb或抗KRAS的孔中。测量抗原的结合速率(上板速率,on rate)。用具有1％BSA的水淬灭感受器。将探针浸入测定缓冲液(PBS)中并测量解离速率(下板速率，off rate)。
如表1中所示，由所获得的亲和常数(KA)确定由抗原与抗原结合蛋白的解离的平衡常数(KD)表示的亲和性，KD使用1：1全局拟合分析Fortebio软件。通过对R2值>0.95的曲线的KD值取平均值，确定亲和性。省略250nM抗STAT3 VHH13数据点，因为它是异常值。确定了抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)sdAb的亲和性为1.16×10-7。未确定抗KRAS VHH的亲和性。
表1
局部拟合分析，用突出值确定亲和性为1.16x 10‐7
实施例2：免疫沉淀研究
在人乳腺癌细胞中测定STAT3 sdAb的特异性。在此实施例中，MDA-MB-231人乳腺癌细胞生长至50％～70％的汇合度。然后将细胞在新鲜制备的冰冷的裂解缓冲液(20mMHEPES，pH 7.9、400mM NaCl、0.1％NP-40、10％甘油、1mM钒酸钠、1mM氟化钠、1mM二硫苏糖醇、1mL苯甲基磺酰氟、10μg/mL抑肽酶、10μg/mL亮肽素)中在冰上裂解45分钟。然后离心裂解物，收集上清液，并使用改进的Lowry方法(Bio Rad，Hercules，CA)测定蛋白质浓度。将总蛋白(1mg)与1.5mg具有针对STAT3的sdAb、阳性对照(STAT3，cat#SC-482，Santa CruzBiotechnology，Dallas，TX)、或阴性对照(STAT-1，cat#9172，Cell Signaling，Danvers，MA)的磁珠(Invitrogen)在4℃温育1小时。然后洗涤珠。在最终洗涤后，加入60μl裂解缓冲液，对所得上清液进行Western印迹分析。简单来说，在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离样品并转移到硝酸纤维素膜上。将膜封闭，然后与适当的第一抗体和第二抗体温育。用作阳性对照的抗STAT3抗体来自Cell Signaling(Cat#4904，Danvers，MA)。使用来自Santa CruzBiotechnology(Dallas，TX)的ECL系统进行化学发光反应。
如图3所示，用以不同量测试的全部sdAb免疫沉淀内源性STAT3。M是含有标记的标记物泳道，泳道1含有从哺乳动物细胞产生和分离的STAT3 VHH13(SEQ ID NO:3)，泳道2含有从哺乳动物细胞产生和分离的STAT3 VHH14(SEQ ID NO:4)，泳道3含有从细菌细胞产生和分离的STAT3 VHH13(SEQ ID NO:3)，泳道4含有从哺乳动物细胞产生和分离的STAT3VHH14(SEQ ID NO:4)，泳道5是阳性STAT3抗体，使用STAT-1作为阴性对照的泳道6无条带显示。
实施例3：抗STAT3细菌VHH13以高亲和性结合到包含组成性激活STAT3的细胞系
使用在人(PANC-1和DU145)和鼠(4T1)细胞系中组成性激活的STAT3测定细菌抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO:3)的特异性。也用干扰素γ(INFγ)处理商业HeLa细胞以诱导磷酸化的STAT3。将PC-3STAT3无效细胞系用作阴性对照。
使细胞生长至50％～70％的汇合度，然后如上所述在新鲜制备的冰冷的裂解缓冲液中在冰上裂解45分钟。然后离心裂解物，收集上清液，并如上所述测定蛋白质浓度。将总蛋白(1mg)与1.5mg的含有细菌抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO:3)或阴性对照(KRAS，CreativeBiolabs，Shirley，NY)的磁珠(Invitrogen)在4℃温育1小时。然后洗涤珠。在最终洗涤后，加入60μl裂解缓冲液，对所得上清液如实施例2所述进行Western印迹分析。
如图4所示，在组成性激活的STAT3细胞系：PANC-1(泳道1)、DU145(泳道2)和4T1(泳道2)中内源性STAT3被细菌VHH13STAT3(SEQ ID NO:3)免疫沉淀。此外，细菌VHH13STAT3(SEQ ID NO:3)结合到HeLa裂解物中的磷酸化-STAT3(泳道3)。对于PANC-1KRAS(泳道3)和PC-3(阴性对照，泳道6)没有观察到条带。
实施例4：MDA-MB-231癌细胞系中抗STAT3 sdAb的细胞毒性研究
在此实施例中，使用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231测定抗STAT3 sdAb的抗增殖作用。对于实验，MDA-MB-231细胞生长至它们达到90％的汇合度。此时，洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并使用Coulter计数器(Beckman，Brea，CA)计数。使用3-[4,5-二甲基噻唑基]-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)测定法进行增殖研究。为此，如制造商(Roche DiagnosticsCorporation，Indianapolis，IN)所指示将细胞以5×103/孔的密度接种在96孔板中。使细胞贴壁24小时，然后以适当的浓度(即，0μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml、或100μg/ml)加入sdAb。在第3天计数细胞。对于5天处理的细胞，在第3 天更换含有sdAb的新鲜培养基。在终止时，如制造商所指示，将10μl的MTT试剂(0.5mg/mL)加入各孔。在4小时的温育期后，加入100μl溶解溶液，并将板置于培养箱中过夜。使用Biotek读板器(Winooski，VT)在570nm波长读取所有的板。
使用GraphPad InStat 3(GraphPad Software，Inc.，La Jolla，CA)分析所有数据。使用单向ANOVA将处理组与载剂对照组进行比较。如果观察到显著性差异(p<0.05)，则进行Tukey-Kramer多重比较检验。
如下表2～5所示，基于MTT实验，发现细菌VHH13抗STAT3(SEQ ID NO.3)sdAb在处理后3天和5天有效抑制细胞生长。
表2
在MDA-MB-231细胞中用抗STAT3 sdAb处理3天后的平均吸光度(570nM)±S.E.
处理 对照 0.5μg/ml 1.0μg/ml 10.0μg/ml 100μg/ml p-值*
H.VHH13 0.444±0.030 0.504±0.043 0.545±0.060 0.603±0.025 0.272±0.011 0.001
H.VHH14 0.404±0.011 0.485±0.040 0.402±0.017 0.588±0.020 0.416±0.030 0.002
B.VHH13 0.550±0.036 0.685±0.018 0.716±0.023 0.355±0.033 0.059±0.001 <0.0001
B.VHH14 0.593±0.014 0.666±0.022 0.644±0.045 0.456±0.048 0.255±0.005 <0.0001
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
表3
处理3天后抗STAT3 sdAb处理对MDA-MB-231细胞增殖的影响
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
表4
在MDA-MB-231细胞中用抗STAT3 sdAb处理5天后的平均吸光度(570nM)±S.E.
处理 对照 0.5μg/ml 1.0μg/ml 10.0μg/ml 100μg/ml p-值*
H.VHH13 1.100±0.088 0.955±0.013 0.963±0.018 0.832±0.028 0.721±0.025 0.0012
H.VHH14 0.983±0.023 0.890±0.021 0.935±0.037 0.804±0.015 0.797±0.010 0.0007
B.VHH13 0.804±0.046 0.761±0.055 0.653±0.024 0.506±0.030 0.083±0.005 <0.0001
B.VHH14 0.677±0.015 0.733±0.038 0.794±0.023 0.640±0.011 0.549±0.023 <0.0001
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
表5
处理5天后抗STAT3 sdAb处理对MDA-MB-231细胞增殖的影响
处理 μg/ml ％抑制 p-值*
H.VHH13 0.5 13.2 NS
1.0 12.5 NS
10.0 24.4 P<0.01
100.0 34.5 P<0.001
H.VHH14 0.5 9.5 NS
1.0 4.9 NS
10.0 18.2 P<0.001
100.0 18.9 P<0.001
B.VHH13 0.5 5.4 NS
1.0 18.8 NS
10.0 37.1 P<0.001
100.0 89.7 P<0.001
B.VHH14 0.5 0 NS
1.0 0 NS
10.0 5.5 NS
100.0 18.9 P<0.05
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
实施例5：人乳腺癌(MDA-MB-231)和胰腺癌(PANC-1)细胞系中抗STAT3 sdAb的细胞毒性研究
在此实施例中，使用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和胰腺癌细胞系PANC-1测定抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)和VHH14(SEQ ID NO.4)sdAb的抗增殖作用。对于实验，MDA-MB-231细胞和PANC-1细胞生长至它们达到90％的汇合度。此时，洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并使用Coulter计数器(Beckman，Brea，CA)计数。使用上述MTT测定法进行增殖研究。对于5天处理的细胞，在第3天更换含有抗STAT3 sdAb的新鲜培养基。
使用GraphPad InStat 3分析所有数据。使用单向ANOVA将处理组与载剂对照组进行比较。如果观察到显著性差异(p<0.05)，则进行Tukey-Kramer多重比较检验。
如下表6～13所示，基于MTT实验，发现VHH13(SEQ ID NO.3)和VHH14(SEQ IDNO.4)在MDA-MB-231和PANC-1肿瘤细胞中均抑制细胞生长。
表6
在MDA-MB-231细胞中用sdAb处理3天后的平均吸光度(570nM)±SE
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
表7
在MDA-MB-231细胞中用抗STAT3 sdAb处理5天后的平均吸光度(570nM)±S.E.
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
表8
在PANC-1细胞中用抗STAT3 sdAb处理3天后的平均吸光度(570nM)±S.E.
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
表9
在PANC-1细胞中用抗STAT3 sdAb处理5天后的平均吸光度(570nM)±S.E.
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
表10
抗STAT3 sdAb处理对处理3天后的MDA-MB-231细胞增殖的平均生长抑制
a.单向方差分析(ANOVA)；b.测试后＝Tukey-Kramer多重比较测试
表11
抗STAT3 sdAb处理对处理5天后的MDA-MB-231细胞增殖的平均生长抑制
a.单向方差分析(ANOVA)；b.测试后＝Tukey-Kramer多重比较测试
表12
抗STAT3 sdAb处理对处理3天后的PANC-1细胞增殖的平均生长抑制
处理 实验 P-值a 10.0μg/ml P-值b 100μg/ml P-值b
B.VHH13 1 P＜0.0001 42.9 P＜0.001 59.4 P＜0.001
2 P＝0.03 63.5 P＜0.05 87.5 P＜0.01
3 P＜0.0001 51.9 P＜0.001 83.8 P＜0.001
总体平均抑制率％ 52.8 76.9
H.VHH13 1 P＝0.005 30.8 P＜0.05 52.5 P＜0.01
2 P＝0.002 16.0 ns 52.7 P＜0.01
3 P＝0.11 16.5 ns 34.8 ns
总体平均抑制率％ 21.1 46.7
H.VHH14 1 P＝0.42 23.0 ns 32.4 ns
2 P＝0.03 16.9 ns 30.2 P＜0.05
3 P＝0.13 10.1 ns 29.2 ns
总体平均抑制率％ 16.7 30.6
a.单向方差分析(ANOVA)；b.测试后＝Tukey-Kramer多重比较测试
表13
抗STAT3 sdAb处理对处理5天后的PANC-1细胞增殖的平均生长抑制
处理 实验 10.0μg/ml 100μg/ml
B.VHH13 1 P＝0.0004 37.0 P＜0.01 64.6 P＜0.001
2 P＝0.0004 48.0 P＜0.01 87.4 P＜0.001
3 P＜0.0001 54.9 P＜0.001 85.4 P＜0.001
总体平均抑制率％ 46.6 79.1
H.VHH13 1 P＝0.03 22.8 ns 42.6 P＜0.05
2 P＝0.01 25.2 ns 49.2 P＜0.01
3 P＝0.06 27.7 ns 48.9 ns
总体平均抑制率％ 25.2 46.9
H.VHH14 1 P＝0.08 26.8 ns 14.8 ns
2 P＝0.002 23.2 P＜0.01 22.9 P＜0.01
3 P＝0.02 31.5 P＜0.05 36.8 P＜0.05
总体平均抑制率％ 27.2 24.8
a.单向方差分析(ANOVA)；b.测试后＝Tukey-Kramer多重比较测试
实施例6：在人乳腺癌和人前列腺癌细胞系中STAT3sdAb的抗增殖作用
在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人前列腺癌细胞系DU145中测定STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)sdAb的抗增殖作用。对于实验，癌细胞生长至它们达到90％的汇合度。此时，洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并使用Coulter计数器(Beckman，Brea，CA)计数。使用上述MTT测定法进行增殖研究。
将抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO.3)sdAb对MDA-MB-231细胞的抗增殖性质与其对DU145细胞的作用进行比较。如表14所示，用50.0μg/ml和100μg/ml的抗STAT3(SEQ ID NO：3)sdAb处理的MDA-MB-231细胞分别显示出29.6和91.2的平均生长抑制率。在DU145细胞中，如表15所示观察到类似的生长抑制率(对于50.0μg/ml和100μg/ml分别为31.2％和92.1％)。
表14
抗STAT3细菌VHH13 sdAb对MDA-MB-231乳腺癌细胞的抗增殖作用
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
表15
抗STAT3细菌VHH13 sdAb对DU145前列腺癌细胞的抗增殖作用
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
实施例7：STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)sdAb对人癌细胞系的抗增殖效应
为了测试STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)sdAb的抗增殖作用，如表16所示，使用人癌细胞系：MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT474、和DU145。
全部人癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)。将细胞系在含有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和1％抗生素-抗真菌溶液(10单位/mL青霉素、10μg/mL链霉素和25μg/mL两性霉素B)的RPMI 1640培养基(MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、BT474)或MEM-E(DU145)中维持并培养。将细胞保持在37℃，5％CO2的潮湿环境中。细胞培养供应获自Life Technologies，Inc.，(Grand Island，NY)。MTT试剂购自Sigma Aldrich(St.Louis，MO)。
对于实验，癌细胞生长至它们达到90％的汇合度。此时，洗涤细胞，胰蛋白酶消化，并使用Coulter计数器(Beckman，Brea，CA)计数。使用上述MTT测定法进行增殖研究。
评估抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb对表示各种分类的五种乳腺癌细胞(表34)的抗增殖性质。如表17所示，全部细胞系在处理后72小时显示显著的生长抑制。对于全部细胞系，在100μg/ml和200μg/ml的剂量下观察到最大的生长抑制率。在所测试的细胞系中生长的半最大抑制浓度(IC 50)为：对于MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、和BT474细胞系分别为10.1±2.4、12.36±1.5、14.8±1.6、和25.2±14.7。这些数据表明，与雌激素/孕酮阳性细胞系(即MCF-7)或HER2扩增的细胞系(即，BT474)相比，三阴性乳腺癌细胞系需要最低浓度的VHH13(SEQ ID NO：3)sdAb以实现IC50。
表16
乳腺癌细胞系特征
细胞系 疾病 免疫谱 分类
MDA-MB-231 腺癌 基；低密度
MDA-MB-468 腺癌 基
MDA-MB-453 转移性癌 未分类
BT474 导管癌 Her2扩增 管腔B
MCF-7 腺癌 管腔A
表17
通过抗STAT3 VHH13(SEQ ID NO.3)sdAb抑制乳腺癌细胞系
还在人前列腺癌细胞系DU145中评估了抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的作用，如表18所示。抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在所测试的所有癌细胞中显示剂量依赖性生长抑制。
表18
抗STAT3 VHH13 sdAb对前列腺癌细胞系的影响
处理(mg/ml) 平均Abs 抑制％ p-值
DU145 0 0.771
DU145 0.39 0.906 0
DU145 0.78 1.023 0
DU145 1.56 0.967 0
DU145 3.13 0.783 0
DU145 6.25 0.770 0
DU145 12.5 0.560 27.4 P<0.05
DU145 25 0.359 53.5 P<0.001
DU145 50 0.161 79.1 P<0.001
DU145 100 0.039 95.0 P<0.001
DU145 200 0.039 95.0 P<0.001
实施例8：BALB/C小鼠中抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)的最大耐受剂量
在此实施例中，使用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231在试验动物中测定抗STAT3 细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的耐受性。对于实验，将总共9只BALB/C裸雌性小鼠(6～7周龄)根据体重分成三组(表19)。小鼠(n＝3)接受载剂(PBS)或250μg/kg或500μg/kg体重/天的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb五天。在研究期间，死亡率/发病率每日进行两次。在研究的第1天、第4天和第6天以及在研究终止的当天(第13天)记录体重。与载剂对照小鼠相比，通过体重测量和小鼠行为评价毒性。在完成处理阶段后，再跟踪动物一周以观察任何体重异常和/或处理后的一般健康状况。
表19
最大耐受剂量研究的实验设计
分组 #小鼠 处理 剂量 途径 频率
1 3 PBS载剂 --- IP 5天
2 3 细菌VHH13 250μg/kg b.w. IP 5天
3 3 细菌VHH13 500μg/kg b.w. IP 5天
如表20所示，各组之间体重没有显著性差异，并且抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在任一给药水平上与任何药物相关的死亡无关。此外，与对照小鼠相比，在用抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb处理的动物中没有观察到行为改变。
表20
平均体重±S.E
分组 随机化 第1天 第4天 第6天 第13天
载剂 17.1±0.06 17.1±0.07 17.8±0.12 18.1±0.09 18.8±0.20
250μg/kg 17.1±0.06 17.2±0.03 17.2±0.15 17.5±0.15 18.1±0.21
500μg/kg 17.1±0.17 17.1±0.09 17.8±0.18 18.0±0.20 18.5±0.18
p-值* >0.9999 0.52 0.05 0.07 0.11
*单向方差分析(ANOVA)；Tukey-Kramer多重比较测试
实施例9：在裸BALB/C小鼠异种移植和人乳腺癌和人胰腺癌细胞中的细菌抗STAT3VHH13(SEQ ID NO:3)的活性
在此实施例中，使用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231在小鼠中评估抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的活性。简单来说，使用：MDA-MB-231人乳腺癌异种移植模型和PANC-1人胰腺癌异种移植模型评估抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的活性。给药方案如下：第1组(n＝6；PBS；IP)，每日一次持续14天[QD×14]；组2(n-12；500μg/kg bw；IP)，每日一次持续14天[QD×14]。药物施用后5天为观察期。
人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231和PANC-1)得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)。MDA-MB-231细胞在补充有10％FBS(Atlanta Biologicals，FloweryBranch，GA)和青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Life Technologies，Grand Island，NY)的MEM(Life Technologies，Grand Island，NY)中生长。PANC-1细胞在补充有10％FBS和青霉素-链霉素-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(Life Technologies，Grand Island，NY)中生长。所有细胞在37℃，5％CO2的存在下在培养箱中生长。
4～5周龄的无胸腺裸Foxnlnu雄性小鼠购自Harlan Laboratories(Indianapolis，IN)。将动物隔离一周，每笼养5只小鼠，具有12小时光暗周期和50％的相对湿度。向动物随意提供饮用水和饮食。将所有动物安置在无病原体条件下，并根据IIT研究所动物使用和护理委员会进行实验。对于MDA-MB-231异种移植物研究，将100μL终体积的MEM培养基中的细胞(4×106)皮下注射到小鼠的右侧腹。对于PANC-1异种移植研究，将100μL终体积的RPMI培养基中的细胞(5×106)皮下注射到小鼠的右侧腹。一旦肿瘤可触摸，就开始两种模型的肿瘤测量。此后，每周测量肿瘤两次。当肿瘤达到75mm3～175mm3的范围大小时，对动物进行随机化，使用分层随机取样算法对对照组(n＝6)和处理组(n＝12)进行随机化。随机化后的第二天开始处理(抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb)或载剂(PBS)。处理是良好耐受的并且与药物相关的死亡无关。没有观察到显著的体重损失。
对于MDA-MB-231异种移植研究，对照组和处理组的随机化平均(±SE)肿瘤大小分别为：103.01±11.89和102.61±9.60。对于组1和组2，随机化的平均体重(±SE)分别为：32.08±0.76和30.27±0.75。表21显示了整个研究的平均体重(±SE)。
表21
平均体重±S.E.
处理 第1天 第6天 第9天 第12天 第16天 第20天
载剂 31.0±0.83 32.1±0.76 31.9±0.66 32.1±0.68 32.0±0.71 32.5±0.88
抗STAT3 VHH13 29.2±0.71 30.3±0.75 30.4±0.79 29.9±0.72 30.6±0.74 30.6±0.77
p-值* 0.16 0.18 0.27 .09 0.28 0.17
*双尾T检验
在给药的第14天，对照组的平均肿瘤大小(±SE)为179.11±19.39，而处理组为118.86±15.94。对于组1和组2，终止时的平均体重(±SE)分别为：31.98±0.71和30.55±0.74。表22总结了整个研究的肿瘤体积(±SE)。处理组中平均肿瘤生长抑制率％为33.64％。肿瘤倍增时间如下：组1：44.27天；组2：61.06天。图5示出了MDA-MB-231异种移植模型中抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的生长抑制。抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb显示显著的生长抑制(p＝0.047)。因此，抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在MDA-MB-231人乳腺癌模型系统中具有化学治疗活性。
表22
MDA-MB-231异种移植模型的个体肿瘤测量(mm3)
对于PANC-1异种移植研究，随机化平均(±SE)肿瘤大小在对照组中为107.01±4.54，在处理组中为110.58±6.18。对于组1和组2，随机化的平均体重(±SE)分别为：29.0±0.81和28.5±0.70。对于组1和组2，终止时的平均体重(±SE)分别为31.2±0.99和30.1±0.75。表23总结了整个研究的平均体重(±SE)。在给药的第14天，对照组的平均肿瘤大小(±SE)为287.30±33.94，而处理组为318.74±29.76。表24总结了整个研究的肿瘤体积(±SE)。
表23
平均体重±S.E.
处理 2/19 2/24 2/27 3/2 3/6 3/10
载剂对照 31.0±0.83 32.1±0.76 31.9±0.66 32.1±0.68 32.0±0.71 32.5±0.88
抗STAT3 29.2±0.71 30.3±0.75 30.4±0.79 29.9±0.72 30.6±0.74 30.6±0.77
肿瘤倍增时间如下：组1：22.44天；组23.02天。抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在PANC-1人胰腺癌模型系统中没有显示出显著的生长抑制。
表24
PANC-1异种移植模型的个体肿瘤测量(mm3)
实施例10：MDA-MB-231异种移植研究
在此实施例中，进一步评估了抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在MDA-MB-231人乳腺异种移植模型中的效果。给药方案如下：组1(n＝4；PBS；IP)，每日两次持续14天[BID×14]；组2(n＝4；1mg/kg bw；IP)，每日两次持续14天[BID×14]；组3(n＝4；2mg/kgbw；IP)，每日两次持续14天[BID×14]；组4(n＝4；2mg/kg bw；IP)，每日一次持续14天[QD×14]。施用后7天为观察期。
人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和无胸腺裸Foxn1nu雌性小鼠如上所述。
将100μL终体积的MEM培养基中的MDA-MB-231细胞以5×106的密度皮下注射到小鼠的右侧腹。一旦肿瘤可触摸，就开始肿瘤测量。此后，每周测量肿瘤两次。当肿瘤达到55mm3～150mm3的范围大小时，使用分层随机取样算法对动物进行随机化。随机化后的第二天开始处理(抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb)或载剂(PBS)。
对于组1、2、3和4，随机化平均(±SE)肿瘤大小分别为：92.08±13.24、82.38±5.17、77.47±7.17、和104.71±14.64。如表25所示，对于组1、2、3和4，随机化的平均体重(±SE)分别为：23.65±0.72、23.45±0.66、23.10±0.20、和22.45±1.25。
如表26所示，在给药的第14天，对照组的平均肿瘤大小为221.51±57.32，而对于处理组2、3和4，分别为67.12±10.66、58.27±22.54、和131.44±22.86。在终止时(第42天)，对于组1、2、3和4，平均肿瘤大小(±S.E.)分别为：255.42±65.46、55.98±6.94、41.15±13.21、和145.51±52.32。对于组1、2、3和4，终止时的平均体重(±SE)分别为：24.80±0.49、23.25±1.20、24.00±0.32、和23.2±1.46。对于组1、2、3和4，最大平均净重量减轻(日)％分别为：0.7(36)、1.5(23)、1.8(36)、和2.2(29)。
同样如表26所示，对于组2、3和4，处理组中的平均生长抑制分别为78.3、75.2、和55.9。肿瘤倍增时间为：组1：20.56天；组2：34.54天；组3：30.07天；组4：27.17天。组2、3和4分别具有13.99天、9.52天、和6.61天的生长延迟。处理组的处理/对照值％为：组2：-33.75(肿瘤停滞)；组：-54.4(肿瘤消退)；组4：10.28(肿瘤抑制)。图6示出了在MDA-MB-231异种移植模型中抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的生长抑制。
抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的施用与组2(p＝0.02)[1mg/kg；BID×14]和组3(p＝0.02)[2mg/kg；BID×14]的显著生长抑制相关。此外，四分之三的肿瘤显示显著的消退。基于这些数据，得出结论，抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在MDA-MB-231人乳腺癌模型系统中具有化学治疗活性。
表25
平均体重±S.E.
表26
MDA-MB-231异种移植模型的个体肿瘤测量(mm3)
实施例11：抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)SDAB对三种人癌症异种移植模型的效果
在此实施例中，在MDA-MB-231人乳腺癌、PANC-1胰腺癌、和DU145前列腺癌异种移植物模型中评估抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb。
无胸腺裸Foxn1nu小鼠、MDA-MB-231乳腺癌细胞、PANC-1胰腺癌和DU145前列腺癌细胞系如上所述。在研究的第1天，小鼠的体重为17g～19g(34只雌性)和21g～23g(16只雄性)。
使用早期(4～10)传代中的细胞来植入小鼠中，并在对数期生长期间收获。将终体积为100μL的培养基中的MDA-MB-231(5×106)、DU145(5×106)、和PANC-1(1.5x106)皮下注射到小鼠的右侧腹。一旦肿瘤可触及，就开始肿瘤测量。此后，每周测量肿瘤两次。
当肿瘤达到74mm3～120mm3(MDA-MB-231)、89mm3～146mm3(DU145)、或60mm3～160mm3(PANC-1)的范围大小时，使用分层随机取样算法对动物进行随机化。随机化后第二天(被称为第1天)开始处理(含抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3) sdAb，此处也被称为SBT-100)或载剂(PBS)。
抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb作为预配制溶液以0.651mg/ml的浓度提供，并储存在-20℃直到准备使用。将储备溶液在无菌PBS(pH7.6)中稀释，以10mL/kg的给药体积提供5mg/kg。每7天制备工作溶液，等分到7个小瓶中并在4℃下储存。在处理的每一天，仅将所需的小瓶拿到室温。根据下一剂量的需要，将所有剩余的sdAb材料保持在4℃。在第8天，弃去任何剩余的sdAb材料，并制备新的批次。
根据表27所示的方案，对两组(对照和SBT-100)小鼠/肿瘤模型进行给药。给药方案如下：组1(n＝4；PBS)，每日两次持续14天[BID×14]；组2(n＝4；SBT-100，5mg/kg bw)，每日两次持续14天[BID×14]。载剂(PBS pH 7.6)和SBT100腹腔内施用(i.p.)，每日两次，相隔6小时，持续14天。根据个体动物重量进行给药。在施用后的7天为恢复期。
表27
异种移植研究的实验设计
Study Log Study Director动物研究管理软件(San Francisco，CA)用于随机化动物，收集数据(例如给药、体重、肿瘤测量、临床观察)，并进行数据分析。
在MDA-MB-231肿瘤异种移植模型中，在接种后第23天将动物随机化，组1和组2的平均(±SE)肿瘤大小分别为77.98±21.58和84.71±5.56。对于组1和组2，随机化时的平均体重(±SE)分别为：20.04±0.62和23.7±1.84。表28总结了整个研究的平均体重(±SE)。在给药的最后一天(第14天)，对照组的平均肿瘤大小(±SE)为168.28±51.57，而对于对于SBT-100处理的小鼠为83.81±22.65。表29总结了整个研究的肿瘤体积(±SE)。在终止时(第28天)，对于组1和组2，平均肿瘤大小(±SE)分别为：270.49±112.35和91.72±33.17。对于组1和组2，终止时的平均体重(±SE)分别为：25.36±1.07和24.25±1.68。在研究结束时，SBT-100处理组中的平均肿瘤生长抑制为85.8％(p＝0.006)。图7示出了平均肿瘤体积。对于组1和组2，肿瘤倍增时间分别为25.78天和111.6天。组2的处理/对照％为13.35(肿瘤抑制)。
表28
MDA-MB-231中小鼠的平均体重
表29
MDA-MB-231的肿瘤体积
在DU145肿瘤异种移植模型中，在接种后第17天对动物进行随机化，对于组1和组2，平均(±SE)肿瘤大小分别为：111.87±20.53和111.23±25.16。对于组1和组2，随机化的平均体重(±SE)分别为：29.10±1.94和30.68±1.56。表30总结了整个研究的平均体重(±SE)。在给药的最后一天(第14天)，对照组的平均肿瘤大小(±SE)为621.81±276.25，而SBT-100处理的小鼠的平均肿瘤大小(±SE)为364.14±51.64。表31总结了整个研究的肿瘤体积(±SE)。在终止时(第28天)，对于组1和组2，平均肿瘤大小(±S.E)分别为：819.42±351.88和601.83±131.51。对于组1和组2，终止时的平均体重(±SE)分别为：29.20±2.33和29.60±1.04。在研究结束时，SBT-100处理组中的平均肿瘤生长抑制率为26.6％(p＝0.29)。图8示出了平均肿瘤体积。对于组1和组2，肿瘤倍增时间分别为14.57天和18.19天。组2的处理/对照％为74.8。
表30
DU145中的小鼠平均体重
表31
DU145的肿瘤体积
在PANC-1肿瘤异种移植模型中，在接种后第22天对动物进行随机化，对于组1和组2，平均(±SE)肿瘤大小分别为：78.74±40.21和93.84±36.31。对于组1和组2，随机化的平均体重(±SE)分别为：22.50±1.47和24.23±1.63。表32总结了整个研究的平均体重(±SE)。在给药的最后一天(第14天)，对照组的平均肿瘤大小(±SE)为204.95±178.90，而SBT-100处理的小鼠的平均肿瘤大小(±SE)为159.03±28.01。表33总结了整个研究的肿瘤体积(±SE)。在终止时(第28天)，对于组1和组2，平均肿瘤大小(±S.E)分别为：284.77±288.88和203.02±30.34。对于组1和组2，终止时的平均体重(±SE)分别为：27.38±1.07和26.23±1.19。在研究结束时，SBT-100处理组中的平均肿瘤生长抑制率为41.78％(p＝0.35)。图9示出了平均肿瘤体积。对于组1和组2，肿瘤倍增时间分别为18.51天和35.70天。组2的处理/对照％为52.79。
表32
PANC-1中的小鼠平均体重
表33
PANC-1的肿瘤体积
实施例12：抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)SDAB在ER+/PR+(MCF-7)人乳腺癌异种移植模型中的效果
此实施例证明了在裸鼠中的MCF-7人乳腺癌异种移植模型中的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的效果。
12周龄的雌性无胸腺裸鼠(Crl:NU(Ncr)-Foxn1nu，Charles River)，在研究的第1天体重(BW)范围为23.0g～30.1g。如上所述喂养和饲养动物。
如上所述获得并培养MCF-7人乳腺癌细胞，并用于小鼠异种移植。在肿瘤细胞植入的前三天，使用灭菌的套管针将雌激素小丸(0.36mg雌二醇，60天释放，InnovativeResearch of America，Sarasota，FL)皮下植入每只试验动物的肩胛骨之间。
在对数期生长期间收获用于植入的肿瘤细胞，并以1×108个细胞/mL的浓度重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在植入当天，每只试验小鼠接受在右侧皮下植入的1×107个MCF-7细胞(0.1mL细胞悬浮液)，并且监测肿瘤生长至平均大小接近100mm3～150mm3的目标范围。21天后，将其指定为研究的第1天，将动物分成两组，每组由各肿瘤体积范围为108mm3～144mm3的四只小鼠组成，组平均肿瘤体积为117mm3～123 mm3。
抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb提供为在1mL等分试样中浓度0.41867mg/ml的预配制的即用给药溶液，并储存在-20℃直到使用。将0.41867mg/mL溶液以在23.88mL/kg的给药体积中提供1mg/kg剂量。在处理的每一天，仅将需要的抗STAT3细菌VHH13(SEQ IDNO:3)sdAb的小瓶解冻至室温。将所有剩余剂量的悬浮液保持在4℃，待下一次给药的需要。
根据表34中所示的方案对两组无胸腺裸小鼠进行给药。每天三次腹膜内(i.p.)施用全部载剂(对照)和抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb剂量，间隔6小时，持续14天，其中在第1天递送两个剂量，在第15天早上递送一个剂量(tid×14，第一天2个剂量)。载剂和抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的给药体积为0.478mL/20克体重(23.88mL/kg)，并按比例调整至每只动物的体重。组1接受载剂并作为肿瘤移植和进展的基准组以及对照。组2给予1mg/kg的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb。
表34
研究的方案设计
每周测量肿瘤两次，当其肿瘤达到预定终点体积(1000mm3)或在研究结束第39天时(无论哪个先到)，对每只动物实施安乐死。当肿瘤达到终点体积时，将动物记录为对于肿瘤进展(TP)的安乐死，其具有安乐死的日期。通过下式计算每只小鼠的终点时间(TTE)：
其中TTE以天表示，终点体积以mm3表示，b是截距，m是通过对数转化的肿瘤生长数据集的线性回归获得的线的斜率。该数据集包括超过分析中使用的终点体积的第一次观察以及紧接在达到该终点体积之前的三个连续观察。计算的TTE通常小于TP 日期(动物对于肿瘤大小实施安乐死的日期)。未达到终点体积的动物被分配等于研究的最后一天的TTE值(D39)。被分类为死于处理相关(TR)原因的任何动物被分配等于死亡日的TTE值。被分类为死于非处理相关(NTR)原因的任何动物被排除在TTE的计算之外。
从肿瘤生长延迟(TGD)测定处理效果，其被定义为与对照组相比，处理组以天数增加中值TTE：
TGD＝T–C
相对于对照组，中值TTE的增加百分比为
其中：
T＝处理组的中值TTE，和
C＝指定对照组的中值TTE。
每组中的处理效果可以通过中值肿瘤体积MTV(n)指示，MTV(n)被定义为研究最后一天(D39)的肿瘤未达到终点体积的剩余动物数(n)中的中值肿瘤体积。
处理效果还可以根据在研究期间观察到的消退反应的发生率和量级来确定。处理可引起动物中肿瘤的部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR反应中，在研究过程中三次连续测量的肿瘤体积为其D1体积的50％或更小，并且对于这三次测量中的一次或多次，等于或大于13.5mm3。在CR反应中，在研究过程中三次连续测量的肿瘤体积小于13.5mm3。在研究结束时将具有CR反应的任何动物另外分类为无肿瘤的存活者(TFS)。
在前五天每天对动物进行称重，然后在研究的剩余部分中每周两次进行称重。经常观察小鼠的健康和任何不良处理相关的TR副作用的明显迹象，并记录值得注意的临床观察。根据方案监测个体体重减轻，对于体重减轻一次测量超过30％或对于三次测量超过25％的任何动物，实施作为TR死亡的安乐死。如果组平均体重恢复，则可以在该组中恢复给药，但是以较低剂量或较低频率方案给药。可接受的毒性被定义为在研究期间小于20％的组平均BW损失，并且在10个处理的动物中不超过一个TR死亡，或10％。任何导致更大毒性的给药方案被认为高于最大耐受剂量(MTD)。如果死亡归因于临床体征和/或尸检所证明的处理副作用，则死亡被分类为TR，或者如果由于给药期期间的未知原因或在最后一剂的14天内，死亡被归类为TR。如果有证据表明死亡与肿瘤模型相关，而不是与处理相关，死亡被归类为NTR。NTR死亡进一步分为NTRa(由于事故或人为错误)，NTRm(由于通过侵入或转移的尸检证实的肿瘤扩散)和NTRu(由于未知原因)。
使用用于Windows的Prism 6.07(GraphPad)进行图形分析。由于样本量小，不采用统计学。
构建散点图以显示各组小鼠的TTE值；该图显示NTR死亡，将其从所有其他数字中排除。将个体动物、组中值和平均肿瘤体积作为时间的函数作图。当动物由于肿瘤大小或TR死亡而退出研究时，包括其最终记录的肿瘤体积和用于计算随后时间点的中值体积的数据。构建Kaplan-Meier图以显示研究中保留的每组中的动物相对于时间的百分比。在同一组中两次TR死亡发生后，肿瘤生长曲线被截断。在研究过程中的从第1天的组平均BW变化被绘制为变化百分比±SEM。在退出研究的组中，超过一半可评价小鼠后，肿瘤生长和BW变化曲线被截断。图10示出了研究中的平均肿瘤体积。
表35提供了小鼠的平均BW损失、TR和NTR死亡。观察时记录临床体征，如表36～38所示。研究期间没有发生TR死亡。每组中有一只动物的体重损失是可变的、严重的，并且由雌激素效应引起。两组中均出现包括体重减轻、增大的子宫角、和膀胱晶体的临床观察，并且也归因于雌激素的影响。雌激素毒性导致每组中两个非处理相关的死亡。在该研究中评估的处理是可接受地耐受的。
表35
反应总结
因为对照组四只小鼠中的两只以及处理组四只小鼠中的两只死于雌激素毒性，所以不能确定统计结论。利用可获得的数据，当与对照组相比时，处理组中的肿瘤生长中值和平均肿瘤体积降低。该差异在处理的14天期间存在，但也在研究的第25天存在。对照组经过25天达到1000mm3的肿瘤体积，而处理组经过36天达到1000mm3的肿瘤体积。这表明抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在体内减慢MCF-7肿瘤的生长。在整个研究中，对照组和处理组保持相似的重量。这表明抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在重量减轻方面没有引起毒性。
实施例13：在异种移植小鼠中用抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)SDAB处理人HER2+(BT474)乳腺癌
在此实施例中，在CB.17SCID小鼠中的BT474人乳腺肿瘤异种移植物中测定抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的效果。
对于两组8～12周龄在侧腹中含有1mm3BT474肿瘤片段的异种移植物的CB.17SCID小鼠，当肿瘤达到100mm3～150mm3的平均大小时，根据表39中所示的方案进行处理。根据表34中所示的方案对两组无胸腺裸小鼠进行给药。将所有载剂(PBS对照)和抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb(表39中显示为SB-01)每天三次腹膜内(i.p.)施用，间隔6小时，持续14天，其中在第1天递送两个剂量(tid×14，第一天2个剂量)。载剂和抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的给药体积为0.478mL/20克体重(23.88mL/kg)，并按比例调整至每只动物的体重。组1接受载剂并作为肿瘤移植和进展的基准组以及对照。组2给予1mg/kg的抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb。
表39
研究方案
在研究的前14天期间，处理组接受抗STAT3B VHH13，对照组仅接受载剂。如表40所示，在此期间，处理组在整个研究期间保持和增加体重，而对照组在整个研究中具有降低的重量。这表明，就体重减轻而言，处理组没有经历来自抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb的毒性。两组平均肿瘤体积和中值肿瘤体积相似，并且在研究的第15天完全相同。在研究的第59天，两组达到700mm3的肿瘤体积。这表明当与对照组相比时，抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb在体内不减少BT474肿瘤的生长。图11示出了组平均肿瘤体积。
表40
BT474反应总结
#-对照组
实施例14：产生针对抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)SDAB的小鼠单克隆抗体
在此实施例中，产生针对本发明的sdAb的小鼠单克隆抗体。使用的动物是8～10周龄的BALB/c雌性小鼠。使用水溶性佐剂(CBL)。所使用的HAT和HT来自Sigma-Aldrich。
使用抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb来免疫三只小鼠并制备杂交瘤细胞系。将小鼠用水溶性佐剂免疫三次。在一只小鼠中，血清滴度达到1/51200。处死小鼠，通过将脾细胞与骨髓瘤细胞系Sp2/0融合来制备杂交瘤细胞系。
通过有限稀释将融合的细胞接种到96孔板中。在HAT存在下培养融合细胞，测试651个单克隆。在651个单克隆中，鉴定了27个阳性克隆，其特异性结合抗STAT3细菌VHH13(SEQ ID NO:3)sdAb抗原。
实施例15：KRAS(G12D)单域抗体对PANC-1人胰腺癌细胞的细胞毒性
本实施例使用人胰腺癌细胞系PANC-1证明了抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO:2)sdAb的抗增殖作用。对于实验，PANC-1细胞生长直到它们达到90％的汇合度。此时，使用如上所述的MTT测定进行增殖研究。
在处理后3天，抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO:2)sdAB对PANC-1细胞的抗增殖性质示于表41中。用50.0μg/ml和100μg/ml抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO:2)sdAb处理的PANC-1细胞分别显示出19.9和37.7的平均生长抑制率。
表41
抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO:2)sdAb对PANC-1癌细胞的抗增殖作用
平均值Abs±SE 抑制％
对照 0.281±0.017
50μg/ml 0.225±0.006 19.9
100μg/ml 0.175±0.016 37.7
因此，抗KRAS(G12D)(SEQ ID NO:2)sdAb在PANC-1人胰腺癌细胞中显示剂量依赖性生长抑制。
实施例16：TNF-αSDAB的体外生长抑制
本实施例说明了开发测定TNF-α浓度和评估抑制TNF-α功能的方法。在U937人肺淋巴母细胞系中显示可测量的活性调节所需的TNF-α的浓度通过使用Promega的Cell发光细胞活力测定对表示代谢活性细胞存在的ATP的存在进行定量评估。
将U937细胞接种在干净的聚苯乙烯96孔微量培养板(96孔平底板，Cat.#3997)中，总体积为90μL/孔。在37℃，5％CO2和95％空气的潮湿培养箱中温育24小时后，将5μL 20×的在生长培养基中系列稀释的TNF-α以两次重复加入每个孔中(10μL剂量反应，最高浓度20ng/mL)。另外，将5μL 20×在生长培养基中稀释的星形孢菌素以两次重复添加到每个孔中(浓度1nM)。
在测试剂存在下培养24小时后，通过对存在的ATP进行定量，评估在U937细胞系中对TNF-α活性显示可测量的调节所需的化合物浓度。相对于未处理的对照孔计算细胞生长百分比。所有测试在每个浓度水平重复进行两次。
使用Prism 6.05通过使用以下四个参数对数式的曲线拟合数据来估计测试剂的EC50值：
其中，Top是对照吸光度的最大％，Bottom是在最高试剂浓度下相对于对照吸光度的最小％，Y是对照吸光度％，X是试剂浓度，IC50是与对照细胞相比，以50％抑制细胞生长的试剂浓度，n是曲线的斜率。
图12和13证明TNF-α对U937细胞具有细胞毒性。TNF-α对U937的IC50为95.10pg/ml。TNF-α曲线显示剂量滴定杀伤效应。
图14证明了TNF-α对U937的细胞毒性被三种不同的抗TNF-αVHH抑制。当将抗TNF-αVHH62(SEQ ID NO:47)sdAb、抗TNF-αVHH66(SEQ ID NO:45)sdAb和抗TNF-αVHH69(SEQ IDNO:46)sdAb与恒定剂量的TNF-α温育时，在EC50时，所有三种抗TNF-αVHH均抑制TNF-α对U937的杀伤。抗TNF-αVHH62(SEQ ID NO:47)sdAb的IC50为约713.6μg/ml。抗TNF-αVHH69(SEQ IDNO:46)sdAb的IC50大于208.055μg/ml。不能测定抗TNF-αVHH66(SEQ ID NO:45)sdAb的IC50，因为其从约1×102μg/ml～1×102μg/ml的抗TNF-αVHH66(SEQ ID NO:45)sdAb完全抑制TNF-α细胞毒性。在抗TNF-αVHH66(SEQ ID NO:45)sdAb的浓度范围内，U937细胞生长增加，因此完全抑制TNF-α活性。
尽管已经参照某些优选实施方式相当详细地描述了本发明，但是其他实施方式是可能的。例如，本方法公开的步骤不旨在是限制性的，也不旨在表示每个步骤对于本方法必须是必要的，而仅是示例性步骤。因此，所附权利要求的范围不应当限于本公开中包含的优选实施方式的描述。本文引用的所有参考文献以其整体通过引用并入本文。
SEQUENCE LISTING
<110> S·辛格
<120> 针对细胞内抗原的单域抗体
<130> 7304-51293-4PCT
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<150> US 62/148656
<151> 2015-04-16
<150> US 62/188353
<151> 2015-07-02
<150> US 62/210795
<151> 2015-08-27
<160> 81
<170> PatentIn version 3.5
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<400> 46
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<400> 47
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<220>
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<400> 49
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<220>
<223> 骆驼
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100 105 110
Tyr Cys Thr Trp Ala Gln Gly Thr Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 78
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼
<400> 78
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Glu Ala
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly His Val Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Glu Gly Ile Thr Ser Glu Ala Ser Ser Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
65 70 75 80
Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Pro Asp Pro Tyr Ala Tyr Ser Thr Tyr Ser Asp
100 105 110
Tyr Cys Ser Trp Ala Gln Gly Thr Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 79
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼
<400> 79
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Glu Ala
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Leu Glu Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Glu Gly Ile Thr Ser Glu Ala Ser Ser Tyr Ala
50 55 60
Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65 70 75 80
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85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Pro Asp Pro Tyr Ala Tyr Ser Thr Tyr Ser Glu Tyr
100 105 110
Cys Thr Trp Ala Gln Gly Thr Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼
<400> 80
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Glu
1 5 10 15
Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Glu Ala
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly His Glu Cys Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Thr Thr Glu Gly Ile Thr Ser Glu Ala Ser Ser Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
65 70 75 80
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Ser
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<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 骆驼
<400> 81
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Thr Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Glu Ala
20 25 30
Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly His Glu Cys Glu Leu Val
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85 90 95
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100 105 110
Tyr Cys Thr Trp Ala Gln Gly Thr Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser

Claims (58)

1.一种针对细胞内组分的单域抗体(sdAb)。
2.如权利要求1所述的sdAb，其中，所述细胞内组分包括蛋白质、核酸、脂质、糖、或它们的组合。
3.如权利要求1所述的sdAb，其中，所述细胞内组分包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。
4.如权利要求1所述的sdAb，其中，所述细胞内组分包括TNF-α。
5.如权利要求1所述的sdAb，其中，所述细胞内组分包括KRAS。
6.如权利要求1所述的sdAb，其中，所述细胞内组分包括KRAS(G12D)。
7.一种抗STAT3的sdAb。
8.一种在受试者的生物样品中诊断由STAT3介导的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述生物样品与权利要求7所述的sdAb接触；
b)测定所述生物样品中的STAT3蛋白的量；和
c)将步骤(b)中测定的量与STAT3蛋白的标准量比较，其中，标准品和所述生物样品之间STAT3蛋白量的差异指示存在所述病症。
9.一种使用权利要求9所述的抗STAT3的sdAb在受试者中治疗疾病、预防疾病发展、或预防疾病复发的方法，所述方法包括将有效量的抗STAT3的sdAb施用于有需要的受试者。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述哺乳动物是人类。
12.如权利要求9所述的方法，其中，将有效量的抗STAT3的sdAb施用于有需要的受试者包括静脉内施用、肌内施用、口服施用、直肠施用、肠内施用、胃肠外施用、眼内施用、皮下施用、透皮施用、作为滴眼剂施用、作为鼻喷雾剂施用、通过吸入或雾化施用、局部施用，以及作为可植入药物施用。
13.一种使用权利要求1所述的sdAb与一种或多种化合物组合在受试者中治疗疾病、预防疾病或预防疾病复发的方法。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述一种或多种化合物是转录抑制剂。
15.一种对受试者样品中的sdAb水平进行定量的方法，所述方法包括以下步骤：
a.产生针对sdAb的一个或多个域的小鼠单克隆抗体；
b.从受试者获得样品；
c.用所述小鼠单克隆抗体和所述样品进行定量免疫测定，以测定受试者中sdAb的量；和
d.对受试者中的sdAb量进行定量。
16.如权利要求15所述的方法，其中，定量免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、特异性分析物标记和再捕获测定(SALRA)、液相色谱法、质谱法、荧光激活细胞分选、或它们的组合。
17.一种抗STAT3的单域抗体(sdAb)，其包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
18.一种分离的多肽，所述分离的多肽包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
19.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。
20.一种药物组合物，所述药物组合物包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的多肽。
21.一种诊断受试者的由STAT3介导的病症的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述生物样品与包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽接触；
b)测定所述生物样品中的STAT3蛋白的量；和
c)将步骤(b)中测定的量与标准品比较，样品和标准品之间量的差异诊断所述病症。
22.一种治疗由STAT3介导的疾病或病症、或预防所述疾病或病症复发的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述哺乳动物是人类。
25.如权利要求22所述的方法，其中，施用多肽包括静脉内施用、肌内施用、口服施用、直肠施用、肠内施用、眼内施用、胃肠外施用、皮下施用、透皮施用、作为滴眼剂施用、作为鼻喷雾剂施用、通过吸入或雾化施用、局部施用，以及作为可植入药物施用。
26.如权利要求22所述的方法，其中，所述多肽与一种或多种化合物组合施用。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述一种或多种化合物是转录抑制剂。
28.一种针对包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽的抗体。
29.一种测量来自受试者的样品中的抗STAT3 sdAb水平的方法，所述方法包括以下步骤：
a.产生针对包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的多肽的一个或多个域的小鼠单克隆抗体；
b.从受试者获得样品；
c.用所述小鼠单克隆抗体和所述样品进行定量免疫测定以测定受试者中sdAb的量；和
d.对受试者中sdAb的量进行定量。
30.如权利要求29所述的方法，其中，所述定量免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、特异性分析物标记和再捕获测定(SALRA)、液相色谱法、质谱法、荧光激活细胞分选、或它们的组合。
31.一种抗TNF-α单域抗体(sdAb)，其包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
32.一种分离的多肽，所述分离的多肽包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
33.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的多肽。
34.一种药物组合物，所述药物组合物包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示的多肽。
35.一种诊断受试者的由TNF-α介导的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使生物样品与包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的多肽接触；
b)测定所述生物样品中的TNF-α的量；和
c)将步骤(b)中测定的量与标准品比较，其中，所述样品与标准品之间量的差异诊断所述病症。
36.一种治疗由TNF-α介导的疾病或病症，或预防所述疾病或病症复发的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的多肽。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
38.如权利要求37所述的方法，其中，所述哺乳动物是人类。
39.如权利要求36所述的方法，其中，施用多肽包括静脉内施用、肌内施用、口服施用、直肠施用、肠内施用、眼内施用、胃肠外施用、皮下施用、透皮施用、作为滴眼剂施用、作为鼻喷雾剂施用、通过吸入或雾化施用、局部施用，以及作为可植入药物施用。
40.如权利要求36所述的方法，其中，所述多肽与一种或多种化合物组合施用。
41.如权利要求40所述的方法，其中，所述一种或多种化合物是转录抑制剂。
42.一种针对包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47的多肽的抗体。
43.一种测量来自受试者的样品中抗TNF-αsdAb水平的方法，所述方法包括以下步骤：
a.产生针对包含SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的多肽的一个或多个域的小鼠单克隆抗体；
b.从受试者获得样品；
c.用所述小鼠单克隆抗体和所述样品进行定量免疫测定以测定受试者中sdAb的量；和
d.对受试者中sdAb的量进行定量。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述定量免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、特异性分析物标记和再捕获测定(SALRA)、液相色谱法、质谱法、荧光激活细胞分选、或它们的组合。
45.一种抗KRAS单域抗体(sdAb)，其包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
46.一种分离的多肽，所述分离的多肽包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
47.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
48.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求45所述的sdAb或如权利要求46所述的多肽，及药学上可接受的载体。
49.一种诊断受试者的由KRAS介导的疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使生物样品与包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽接触；
b)测定所述生物样品中的KRAS的量；和
c)将步骤(b)中测定的量与标准品比较，样品与标准品之间量的差异诊断所述病症。
50.一种治疗由异常形式的KRAS介导的疾病或病症、预防由异常形式的KRAS介导的疾病或病症、或者预防所述疾病或病症复发的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的包含SEQ ID NO:2的多肽。
51.如权利要求50所述的方法，其中，所述受试者是哺乳动物。
52.如权利要求51所述的方法，其中，所述哺乳动物是人类。
53.如权利要求50所述的方法，其中，所述施用包括静脉内施用、肌内施用、口服施用、眼内施用、直肠施用、肠内施用、胃肠外施用、皮下施用、透皮施用、作为滴眼剂施用、作为鼻喷雾剂施用、通过吸入或雾化施用、局部施用，以及作为可植入药物施用。
54.如权利要求50所述的方法，其中，包含SEQ ID NO:2的所述多肽与一种或多种化合物组合施用。
55.如权利要求54所述的方法，其中，所述一种或多种化合物是转录抑制剂。
56.一种针对包含SEQ ID NO:2的多肽的抗体。
57.一种测量来自受试者的样品中的抗KRAS sdAb水平的方法，所述方法包括以下步骤：
a.产生针对包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽的一个或多个域的小鼠单克隆抗体；
b.从受试者获得样品；
c.用所述小鼠单克隆抗体和所述样品进行定量免疫测定以测定受试者中sdAb的量；和
d.对受试者中sdAb的量进行定量。
58.如权利要求57所述的方法，其中，所述定量免疫测定包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、特异性分析物标记和再捕获测定(SALRA)、液相色谱法、质谱法、荧光激活细胞分选、或它们的组合。
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