ES2900253T3 - Anticuerpos de dominio único dirigidos contra antígenos intracelulares - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido aislado, comprendiendo el polipéptido aislado un anticuerpo de dominio único anti-KRAS (sdAb) que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos de dominio único dirigidos contra antígenos intracelulares
Antecedentes
El uso de anticuerpos de dominio único (sdAb) como proteínas de unión a antígeno individuales o como dominio de unión a antígeno en proteínas o polipéptidos más grandes ofrece una serie de ventajas significativas sobre el uso de anticuerpos convencionales o fragmentos de anticuerpos. Las ventajas de los sdAb incluyen: solo se requiere un único dominio para unir un antígeno con alta afinidad y con alta selectividad; los sdAb pueden expresarse a partir de un solo gen y no requieren modificación posterior a la traducción; los sdAb son altamente estables al calor, pH, proteasas y otros agentes o condiciones desnaturalizantes; los sdAb no son caros de preparar; y los sdAb pueden acceder a dianas y epítopos no accesibles a los anticuerpos convencionales.
Hay una serie de enfermedades o afecciones, tales como el cáncer, que son provocada por componentes intracelulares o transmembrana aberrantes tales como nucleótidos y proteínas. La eliminación de los componentes aberrantes se puede usar para prevenir o tratar las enfermedades o afecciones. Hay varios compuestos farmacológicos disponibles para el tratamiento, pero los compuestos pueden ser ineficaces, imposibles de entregar o tóxicos a células no afectadas.
Otros tratamientos incluyen el uso de proteínas terapéuticas o agentes que contienen una secuencia de direccionamiento exógena para que el agente terapéutico pueda ser reconocido por los receptores en la membrana celular, permitiendo que el agente terapéutico cruce la membrana celular y entre en la célula. Una vez que el agente terapéutico está dentro de la célula, el agente terapéutico puede interactuar con el componente objetivo para tratar la enfermedad. Sin embargo, el uso de una secuencia de orientación exógena puede limitar el tipo de célula al que se dirige el agente terapéutico, y aumenta el coste de fabricación del agente terapéutico.
Por las razones anteriores, existe la necesidad de composiciones y métodos para tratar o prevenir una enfermedad que no se base en secuencias de direccionamiento exógenas o composiciones químicas para ingresar a la célula, y que sean efectivas para atacar solo a las células afectadas en el cuerpo.
La presente divulgación se refiere a anticuerpos de dominio único (sdAb), proteínas y polipéptidos que comprenden los sdAb. Los sdAb están dirigidos contra componentes intracelulares que provocan una afección o enfermedad. La divulgación también incluye ácidos nucleicos que codifican los sdAb, proteínas y polipéptidos, y composiciones que comprenden los sdAb. La divulgación incluye el uso de las composiciones, sdAb, proteínas o polipéptidos para fines profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico. La divulgación también incluye el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia los sdAb de la invención. TOMOYUKI TANAKA ET AL (The EMBO Journa, No 26, Vol 13, 2007) describieron moléculas de VHH que reconocen varios mutantes ras oncogénicos, incluido Kras, en los que los VHH se expresan con señales de localización subcelular.
Resumen
El alcance de la presente invención está definido por las reivindicaciones adjuntas.
El término "instancia", como se usa en este documento, se refiere a otra información que no cae dentro del alcance de las reivindicaciones, pero que puede ser útil en el contexto de comprender la presente invención o ponerla en práctica.
La divulgación proporciona un anticuerpo de dominio único (sdAb) dirigido contra un componente intracelular. El componente intracelular puede ser, por ejemplo, una proteína, ácido nucleico, lípido, carbohidrato, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STST5a, STAT5b, STAT6, TNF-alfa y KRAS.
En una instancia, la divulgación está dirigida hacia un sdAb anti-STAT3. Opcionalmente, el sdAb anti-STAT3 comprende una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
En otra instancia la divugación está dirigida hacia un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que codifica un sdAb anti-STAT, tal como, por ejemplo, el polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
En aún otra instancia, la divulgación está dirigida hacia una célula huésped, y la célula huésped expresa la secuencia de aminoácidos del sdAb tal como, por ejemplo, el aminoácido expuesto en la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4.
Una instancia de la divulgación es una composición farmacéutica que comprende un sdAb, o un polipéptido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, el sdAb comprende un sdAb anti-STAT3 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, y el polipéptido comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
Otra instancia de la divulgación es un método para diagnosticar un trastorno mediado por STAT3 en un sujeto, el método comprende las etapas de a) poner en contacto una muestra biológica con el sdAb, o un polipéptido; b) determinar la cantidad de STAT3 en la muestra biológica; y c) comparar la cantidad determinada en la etapa (b) con un estándar, una diferencia en la cantidad que indica la presencia del trastorno.
Otra instancia de la divulgación es un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno, o prevenir la recurrencia de una enfermedad mediada por STAT3, o para su uso en el tratamiento del cáncer, o enfermedades provocada por una proliferación celular anormal, que comprende administrar un sdAb anti-STAT3, o un polipéptido, a un sujeto que lo necesite. Opcionalmente, el sdAb comprende un sdAb anti-STAT3 que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4 y el polipéptido comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4.
Una instancia de la divulgación es un sdAb anti-TNF-alfa. Opcionalmente, el sdAb anti-TNF-alfa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7. La divulgación también comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.
Otra realización de la invención es una célula huésped que expresa la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.
En otra instancia de la divulgación también es una composición farmacéutica que comprende un sdAb o un polipéptido y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, el sdAb comprende un sdAb anti-TNF-alfa que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7 y el polipéptido comprende un polipéptido aislado que comprende un conjunto de secuencias de aminoácidos adelante en la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.
Otra instancia de la divulgación es un método para diagnosticar un trastorno mediado por TNF-alfa en un sujeto, el método comprende las etapas de a) poner en contacto una muestra biológica con un sdAb o un polipéptido; b) determinar la cantidad de TNF-alfa en la muestra biológica; y c) comparar la cantidad determinada en la etapa (b) con un estándar, una diferencia en la cantidad que indica la presencia del trastorno.
En una instancia, la divulgación describe un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno o recurrencia de una enfermedad o trastorno mediado por TNF-alfa, o para su uso en el tratamiento del cáncer, o enfermedades provocada por una proliferación celular anormal, que comprende administrar un sdAb anti-TNF-alfa, o un polipéptido, a un mamífero que lo necesite.
Opcionalmente, el sdAb anti-TNF-alfa comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7 y el polipéptido comprende un polipéptido aislado, el polipéptido aislado que comprende un conjunto de secuencias de aminoácidos adelante en la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7.
Una instancia de la divulgación es un sdAb anti-KRAS. Opcionalmente, el sdAb anti-KRAS comprende una secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 2. En un aspecto, la invención comprende un polipéptido aislado, en el que el polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. En otra instancia, la invención comprende una célula huésped que expresa la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
Otra instancia de la divulgación es una composición farmacéutica, que comprende un sdAb o un polipéptido, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, el sdAb comprende un sdAb anti-KRAS que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y el polipéptido comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la s Eq ID NO: 2.
Una instancia adicional de la divulgación es un método para diagnosticar un trastorno mediado por KRAS en un sujeto, el método comprende las etapas de a) poner en contacto una muestra biológica con un sdAb o un polipéptido; b) determinar la cantidad de KRAS en dicha muestra biológica; y c) comparar la cantidad determinada en la etapa (b) con un estándar, una diferencia en la cantidad que indica la presencia del trastorno. Opcionalmente, el sdAb comprende un sdAb anti-KRAS que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y el polipéptido comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
La divulgación también comprende un método para tratar una enfermedad usando un sdAb anti-KRAS, el método comprende administrar una cantidad eficaz de un sdAb anti-KRAS a un sujeto que lo necesite.
En una instancia, la divulgación describe un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno, o la recurrencia de una enfermedad o trastorno, mediado por KRAS, o para uso en el tratamiento del cáncer, o enfermedades provocada por una proliferación celular anormal., que comprende administrar un sdAb anti-KRAS o un polipéptido, a un mamífero que lo necesite. Opcionalmente, el sdAb anti-KRAS comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y el polipéptido comprende un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID No : 2.
En una instancia de la divulgación describe un método para administrar el sdAb de la invención, el método comprende administración intravenosa, administración intramuscular, administración oral, administración rectal, administración intraocular, administración enteral, administración parenteral, administración subcutánea, administración transdérmica, administrado como gotas para los ojos, administrado como aerosol nasal, administrado por inhalación o nebulización, administración tópica y administrado como un fármaco implantable.
En otra instancia de la divulgación describe un método para tratar una enfermedad, prevenir una enfermedad o prevenir la reaparición de una enfermedad usando el sdAb de la invención en combinación con uno o más compuestos. Opcionalmente, el uno o más compuestos es un inhibidor de la transcripción.
En otra instancia de la divulgación describe un método para medir los niveles de un sdAb de la invención, el método comprende las etapas de a) generar un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra uno o más dominios del sdAb; b) realizar un inmunoensayo para determinar la cantidad de sdAb en un sujeto; y c) cuantificar la cantidad de sdAb en el sujeto.
Dibujos
Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y los dibujos que se acompañan, en los que:
La fig. 1 es un mapa esquemático del vector de expresión de sdAb anti-STAT3 VHH13 pTT21-stt VHH13;
La fig. 2 es un mapa esquemático del vector de expresión sdAb anti-STAT3 de VHH14 pTT21-stt VHH14;
La fig. 3 representa los resultados de un ensayo de inmunoprecipitación usando VHH13 STAT3 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) y VHH14 STAT3 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 4);
La fig. 4 representa los resultados de un ensayo de inmunoprecipitación utilizando VHH13 STAT3 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3);
La fig. 5 ilustra la inhibición del crecimiento del sdAb VHH13 (SEQ ID NO: 3) bacteriano anti-STAT3 en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231, dosificado a 0.5 mg/kg/día;
La fig. 6 ilustra la inhibición del crecimiento del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ. ID. NO. 3) en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231 a dosis de 1 mg/kg dos veces al día a 2 mg/kg dos veces al día o 2 mg/kg/día;
La fig. 7 ilustra la inhibición del crecimiento del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231, dosificado a 5 mg/kg/dos veces al día;
La fig. 8 ilustra la inhibición del crecimiento del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto DU145, dosificado a 5 mg/kg/dos veces al día;
La fig. 9 ilustra la inhibición del crecimiento del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto de PANC-1, dosificado a 5 mg/kg/dos veces al día;
La fig. 10 ilustra la inhibición del crecimiento del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto MCF-7, dosificado a 1 mg/kg/tres veces al día;
La fig. 11 ilustra la inhibición del crecimiento del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto BT-474, dosificado a 1 mg/kg/tres veces al día;
La fig. 12 ilustra la citotoxicidad de TNF-alfa en células U937;
La fig. 13 ilustra la citotoxicidad de la estaurosporina en células U937; y
La fig. 14 ilustra la inhibición de la citotoxicidad del TNF-alfa por los sdAb anti-TNF-alfa.
Descripción
Tal como se usa en el presente documento, los siguientes términos y variaciones de los mismos tienen los significados que se dan a continuación, a menos que el contexto en el que se usa dicho término signifique claramente un significado diferente.
Se debe interpretar que los términos “un”, “uno, una” y “el, la” y similares que se usan en este documento cubren tanto el singular como el plural, a menos que su uso en el contexto indique lo contrario.
El término “determinante antigénico” se refiere al epítopo en el antígeno reconocido por la molécula de unión a antígeno (como un sdAb o polipéptido de la invención) y más en particular por el sitio de unión a antígeno de la molécula de unión a antígeno. Los términos “determinante antigénico” y “epítopo” también se pueden usar indistintamente. Una secuencia de aminoácidos que se puede unir a, que tiene afinidad y/o que tiene especificidad por un determinante antigénico específico, epítopo, antígeno o proteína se dice que está “contra” o “dirigida contra” el determinante antigénico, epítopo, antígeno o proteína.
Como se usa en este documento, el término “comprende” y las variaciones del término, tales como “que comprende” y “comprende”, no pretenden excluir otros aditivos, componentes, números enteros o etapas.
Se contempla que los sdAb, polipéptidos y proteínas descritos en el presente documento pueden contener las llamadas sustituciones de aminoácidos “conservadoras”, que en general se pueden describir como sustituciones de aminoácidos en las que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de similar estructura química y que tiene poca o esencialmente ninguna influencia sobre la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son bien conocidas en la técnica. Las sustituciones conservativas son sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos (a)-(e) está sustituido por otro aminoácido dentro del mismo grupo: (a) pequeños residuos alifáticos, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (b) residuos polares, cargados negativamente y sus amidas (no cargadas): Asp, Asn, Glu y Gln; (c) residuos polares, cargados positivamente: His, Arg y Lys; (d) Grandes residuos alifáticos, no polares: Met, Leu, Ile, Val y Cys; y (e) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp. Otras sustituciones conservativas incluyen: Ala en Gly o en Ser; Arg en Lys; Asn en Gln o en Su; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; Su en Asn o en Gln; Ile en Leu o en Val; Leu en Ile o en Val; Lys en Arg, en Gln o en Glu; encontrado en Leu, en Tyr o en Ile; Phe en Met, en Leu o en Tyr; Ser en Thr; Thr en Ser; Trp en Tyr; Tyr en Trp; y/o Phe en Val, en Ile o en Leu.
Un “dominio” como se usa en este documento generalmente se refiere a una región globular de una cadena de anticuerpo, y en particular a una región globular de un anticuerpo de cadena pesada, o a un polipéptido que consiste esencialmente en tal región globular.
La secuencia de aminoácidos y la estructura de un sdAb se compone típicamente de cuatro regiones marco o “FR”, que se denominan “región marco 1” o “FR1”; como “Región marco 2” o “FR2”; como “Región marco 3” o “FR3”; y como “Región marco 4” o “FR4”, respectivamente. Las regiones marco están interrumpidas por tres regiones determinantes de complementariedad o “CDR”, que se denominan “Región determinante de complementariedad 1” o “CDR1”; como “Región determinante de complementariedad 2” o “CDR2”; y como “Región determinante de complementariedad 3” o “CDR3”, respectivamente.
Como se usa en este documento, el término “sdAb humanizado” significa un sdAb que ha tenido uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de VHH natural reemplazada por uno o más de los residuos de aminoácidos que aparecen en la posición correspondiente en un dominio VH de un anticuerpo de cadena 4 convencional de un humano. Esto se puede realizar mediante métodos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las FR de los sdAb se pueden reemplazar por las FR de variables humanas.
Como se usa en este documento, un ácido nucleico o aminoácido “aislado” se ha separado de al menos otro componente con el que generalmente está asociado, como su fuente o medio, otro ácido nucleico, otra proteína/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula o contaminante, impureza o componente menor.
El término “mamífero” se define como un individuo que pertenece a la clase Mammalia e incluye, sin limitación, humanos, animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportes y mascotas, tales como vacas, caballos, ovejas, perros y gatos
Como se usa en este documento, “portador farmacéuticamente aceptable” está destinado a incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los portadores adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en este campo. Los ejemplos preferidos de tales vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa, PBS (solución salina tamponada con fosfato) y albúmina de suero humano al 5%. También se pueden usar liposomas, lípidos catiónicos y vehículos no acuosos tales como aceites fijos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con un agente terapéutico como se definió anteriormente, se contempla su uso en la composición de la presente invención.
Un “inmunoensayo cuantitativo” se refiere a cualquier medio para medir una cantidad de antígeno presente en una muestra utilizando un anticuerpo. Los métodos para realizar inmunoensayos cuantitativos incluyen, pero no se limitan a, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), mareaje de analitos específicos y ensayo de recaptura (SALRA), cromatografía líquida, espectrometría de masas, clasificación de células activadas por fluorescencia y similares.
El término “solución” se refiere a una composición que comprende un disolvente y un soluto, e incluye soluciones y suspensiones verdaderas. Los ejemplos de soluciones incluyen un sólido, líquido o gas disuelto en un líquido y partículas o micelas suspendidas en un líquido.
El término “especificidad” se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que se puede unir una molécula de unión a antígeno particular o una molécula de proteína de unión a antígeno. La especificidad de una proteína de unión a antígeno puede determinarse en función de la afinidad y/o la avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (KD), es una medida de la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a antígeno en la proteína de unión a antígeno: cuanto menor sea el valor de la KD, más fuerte es la fuerza de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión al antígeno (alternativamente, la afinidad también puede expresarse como la constante de afinidad (KA), que es 1/KD). Como será claro para un experto en la técnica, la afinidad se puede determinar dependiendo del antígeno específico de interés. La avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión a antígeno y el antígeno. La avidez está relacionada con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión a antígeno en la molécula de unión a antígeno y el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión a antígeno. La unión específica de una proteína de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse por cualquier medio conocido, como, por ejemplo, el análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición en sándwich.
Como se usa en el presente documento, el término “recombinante” se refiere al uso de métodos de ingeniería genética (por ejemplo, clonación y amplificación) utilizados para producir los sdAb de la invención.
Un “anticuerpo de dominio único”, “sdAb” o “VHH” puede definirse generalmente como un polipéptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende cuatro regiones marco interrumpidas por tres regiones determinantes de complementariedad. Esto se representa como FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 CDR3-FR4. Un sdAb de la invención también incluye un polipéptido o proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de sdAb. Típicamente, los sdAb se producen en camélidos como las llamas, pero también pueden generarse sintéticamente utilizando técnicas que son bien conocidas en la técnica. Como se usa en el presente documento, los dominios variables presentes en los anticuerpos de cadena pesada que se producen naturalmente también se denominarán “dominios VHH”, para distinguirlos de los dominios variables de cadena pesada que están presentes en los anticuerpos de cadena 4 convencionales, denominados “Dominios VH”, y de los dominios variables de cadena ligera que están presentes en los anticuerpos de cadena 4 convencionales, denominados “dominios VL”, “VHH” y “sdAb” se usan indistintamente en este documento. La numeración de los residuos de aminoácidos de un sdAb o polipéptido está de acuerdo con la numeración general para los dominios VH dada por Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest,” US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91). Según esta numeración, FR1 de un sdAb comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 1-30, CDR1 de un sdAb comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 31-36, FR2 de un sdAb comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un sdAb comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 50-65, FR3 de un sdAb comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 66-94, CDR3 de un sdAb comprende los residuos de aminoácidos en las posiciones 95-102, y FR4 de un sdAb comprende Residuos de aminoácidos en las posiciones 103-113.
El término “sintético” se refiere a la producción por síntesis química o enzimática in vitro.
El término “objetivo”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier componente, antígeno o fracción que sea reconocido por el sdAb. El término “objetivo intracelular” se refiere a cualquier componente, antígeno o fracción presente dentro de una célula. Una “diana transmembrana” es un componente, antígeno o fracción que se encuentra dentro de la membrana celular. Un “objetivo extracelular” se refiere a un componente, antígeno o fracción que se encuentra fuera de la célula.
Una “composición terapéutica” como se usa en el presente documento significa una sustancia que se pretende que tenga un efecto terapéutico tal como composiciones farmacéuticas, materiales genéticos, productos biológicos y otras sustancias. Los materiales genéticos incluyen sustancias destinadas a tener un efecto terapéutico genético directo o indirecto, como vectores genéticos, elementos reguladores genéticos, elementos estructurales genéticos, ADN, ARN y similares. Los productos biológicos incluyen sustancias que son materia viva o derivadas de materia viva con la intención de tener un efecto terapéutico.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “cantidad terapéuticamente eficaz” y “cantidad profilácticamente eficaz” se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, prevención o manejo de una enfermedad o un síntoma manifiesto de la enfermedad. La cantidad terapéuticamente efectiva puede tratar una enfermedad o afección, un síntoma de la enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, aliviar, alterar, remediar, mejorar, mejorar o afectar la enfermedad, los síntomas. de la enfermedad, o la predisposición a la enfermedad. La cantidad específica que es terapéuticamente efectiva puede determinarse fácilmente por un médico ordinario, y puede variar dependiendo de los factores conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el tipo de enfermedad, el historial y la edad del paciente, la etapa de la enfermedad y la administración de otros agentes terapéuticos.
La presente invención se refiere a anticuerpos de dominio único (sdAb) que se dirigen contra componentes intracelulares, así como a proteínas y polipéptidos que comprenden los sdAb y nucleótidos que codifican las proteínas y polipéptidos. La invención también puede relacionarse con los sdAb que se dirigen contra dianas o antígenos intercelulares, transcelulares y extracelulares. La invención también incluye ácidos nucleicos que codifican los sdAb, proteínas y polipéptidos, y composiciones que comprenden los sdAb. La invención incluye el uso de las composiciones, sdAb, proteínas o polipéptidos para fines profilácticos, terapéuticos o de diagnóstico.
Los SdAb tienen una serie de características estructurales y propiedades funcionales únicas que hacen que los sdAb sean altamente ventajosos para su uso como dominios o proteínas funcionales de unión a antígeno. Los SdAb se unen funcionalmente a un antígeno en ausencia de un dominio variable de cadena ligera, y pueden funcionar como una única unidad estructural, dominio o proteína de unión a antígeno funcional. Esto distingue a los sdAb de los dominios de los anticuerpos convencionales, que por sí mismos no funcionan como una proteína o dominio de unión a antígeno, pero deben combinarse con fragmentos de anticuerpos convencionales como los fragmentos Fab o el fragmento de ScFv para unirse a un antígeno.
Los SdAb se pueden obtener usando métodos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un método para obtener sdAb incluye (a) inmunizar un Camélido con uno o más antígenos, (b) aislar linfocitos periféricos del Camélido inmunizado, obtener el ARN total y sintetizar los ADNc correspondientes, (c) construir una biblioteca de fragmentos ADNc que codifican los dominios VHH, (d) transcribir los cADN codificadores del dominio VHH obtenidos en la etapa (c) al ARNm usando PCR, convirtiendo el ARNm al formato de presentación del ribosoma, y seleccionando el dominio VHH mediante visualización del ribosoma, y (e) expresar el dominio VHH en un vector adecuado y, opcionalmente, purificar el dominio VHH expresado.
Otro método para obtener los sdAb de la invención es preparar un ácido nucleico que codifica un sdAb usando técnicas para la síntesis de ácido nucleico, seguido de la expresión del ácido nucleico in vivo o in vitro. Además, el sdAb, los polipéptidos y las proteínas de la invención se pueden preparar utilizando técnicas sintéticas o semisintéticas para preparar proteínas, polipéptidos u otras secuencias de aminoácidos.
Los sdAb de la invención generalmente se unirán a todos los análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de la diana que se producen de forma natural, o al menos a esos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos del objetivo que contiene uno o más determinantes antigénicos o epítopos que son esencialmente los mismos que el determinante antigénico o epítopo al que se unen los sdAb de la invención en el objetivo de tipo silvestre. Los sdAb de la invención se pueden unir a tales análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos con una afinidad y/o especificidad que es igual o mayor o menor que la afinidad y especificidad con la que los sdAb de La invención se une al objetivo de tipo silvestre. También se contempla dentro del alcance de la invención que los sdAb de la invención se unen a algunos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de la diana, pero no a otros. Además, el sdAb de la invención puede ser humanizado, y puede ser monovalente o multivalente, y/o multiespecífico. Además, los sdAb de la invención pueden unirse a la forma fosforilada de la proteína diana, así como a la forma no fosforilada de la proteína diana. Los sdAb se pueden unir a otras moléculas como la albúmina u otras macromoléculas. los sdAb de la invención pueden unirse a la forma fosforilada de la proteína diana, así como a la forma no fosforilada de la proteína diana. Los sdAb se pueden unir a otras moléculas como la albúmina u otras macromoléculas. los sdAb de la invención pueden unirse a la forma fosforilada de la proteína diana, así como a la forma no fosforilada de la proteína diana. Los sdAb se pueden ligar a otras moléculas como la albúmina u otras macromoléculas.
Además, está dentro del alcance de la invención que los sdAb son multivalentes, es decir, el sdAb puede tener dos o más proteínas o polipéptidos que están dirigidos contra dos o más epítopos diferentes de la diana. En tal sdAb multivalente, la proteína o el polipéptido puede dirigirse, por ejemplo, contra los mismos epítopos, epítopos sustancialmente equivalentes, o diferentes epítopos. Los diferentes epítopos pueden estar ubicados en la misma diana, o podrían estar en dos o más dianas diferentes.
También se contempla que la secuencia de uno o más sdAb de la invención se puede conectar o unir con una o más secuencias enlazadoras. El enlazador puede ser, por ejemplo, una secuencia de proteínas que contiene una combinación de serinas, glicinas y alaninas.
También está dentro del alcance de la invención usar partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de los sdAb de la invención, siempre que estos sean adecuados para los usos descritos.
Dado que los sdAb de la invención están destinados principalmente para uso terapéutico y/o diagnóstico, están dirigidos contra dianas de mamífero, preferiblemente humanas. Sin embargo, es posible que los sdAb descritos en el presente documento tengan reactividad cruzada con objetivos de otras especies, por ejemplo, con dianas de una o más especies de primates u otros animales (por ejemplo, ratón, rata, conejo, cerdo o perro), y en particular en modelos animales para enfermedades y trastornos asociados con la enfermedad asociada con las dianas.
En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un sdAb de la invención. Dicho ácido nucleico puede estar, por ejemplo, en forma de un constructo genético.
En otro aspecto, la invención se refiere a un huésped o a una célula huésped que expresa o es capaz de expresar un sdAb de la invención, y/o que contiene un ácido nucleico que codifica un sdAb de la invención. Se pueden usar secuencias de los sdAb para insertar en el genoma de cualquier organismo para crear un organismo modificado genéticamente (OGM). Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, plantas, bacterias, virus y animales.
La invención se refiere además a métodos para preparar o generar los sdAb, ácidos nucleicos que codifican los sdAb, células huésped que expresan o son capaces de expresar dichos sdAb, productos y composiciones que contienen los sdAb de la invención.
La invención se refiere además a aplicaciones y usos del sdAb, los ácidos nucleicos que codifican los sdAb, células huésped, productos y composiciones descritos en el presente documento. Dicho producto o composición puede ser, por ejemplo, una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de una enfermedad, o un producto o composición para uso diagnóstico. Los sdAb se pueden usar en una variedad de ensayos, por ejemplo, ensayos ELISA y ensayos de espectrometría de masas para medir los niveles de suero y tejido de los sdAb.
En otro aspecto, un ácido nucleico que codifica uno o más sdAb de la invención puede insertarse en el genoma de un organismo para tratar o prevenir enfermedades.
La presente invención se refiere en general a los sdAb, así como a proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más de tales sdAb, que pueden usarse con fines profilácticos, terapéuticos y/o de diagnóstico.
Los métodos y composiciones detallados en la presente invención pueden usarse para tratar la enfermedad descrita en el presente documento, y pueden usarse con cualquier dosificación y/o formulación descrita en el presente documento o conocida de otra manera, así como con cualquier vía de administración descrita en este documento o de otro modo conocido por un experto en la técnica.
Los sdAb de la invención, en particular el VHH anti-STAT3, el VHH anti-KRAS y el VHH anti-TNF-alfa de la presente invención, se pueden usar para el tratamiento y la prevención de enfermedades malignas que incluyen, entre otros: mieloma múltiple, leucemias (dependiente de HTLV-1, eritroleucemia, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC) y leucemia linfocítica granular (LGG), linfomas (EBV relacionado/Burkitt, micosis fungoides, célula T cutánea linfoma no Hodgkins linfoma (LNH), linfoma de células grandes anaplásico (ALCL), cánceres de mama, cánceres de mama triple negativos, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, sarcomas, osteosarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, cáncer hepatocelular, glioma, neuroblastoma, astrocitoma, cánceres colorrectales, tumores de Wilm, cánceres renales, cánceres de vejiga, cánceres endometriales, cánceres cervicales, cánceres de esófago, cánceres de células escamosas cutáneas, cánceres de células basales y cualquier tipo de cáncer metastático. Los sdAb pueden usarse en pacientes con cáncer para ayudar a prevenir o reducir la pérdida de peso o caquexia por cáncer.
El sdAb, en particular el anti STAT3 y los sdAb anti-TNF-alfa de la presente invención, también se pueden usar para el tratamiento y la prevención de enfermedades como, entre otras, las enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, Enfermedad de Crohn, colitis inducida por bacterias, asma, esclerodermia, lupus, encefalomielitis, arteritis, vasculitis, glomerulonefritis, uveoretinitis, esclerosis múltiple), enfermedad del riñón poliquístico, enfermedades dermatológicas (por ejemplo, Psoriasis, alopecia areata, atopicóptica), lipoma, enfermedad de Padget y queratosis actínica, hidradenitis supurativa, trasplante (por ejemplo, órgano sólido, médula ósea, mano, cara, extremidades, cualquier parte del cuerpo), distrofia muscular y desgaste muscular asociado con cáncer y envejecimiento, endometriosis, degeneración macular, degeneración de la retina, derrame cerebral, epilepsia, traumatismo cerebral y lesiones de la médula espinal, hipertensión, hipertrofia cardíaca, enfermedad de Alzheimer, hipertensión de la arteria pulmonar Iones, diabetes mellitus tipo 2 y espondilitis anquilosante. Además, los sdAb pueden atacar enfermedades huérfanas. Los ejemplos de estas enfermedades huérfanas raras incluyen, pero no se limitan a, cánceres de mama triple negativos, cánceres pancreáticos, AML (leucemia mieloide aguda), cánceres de cabeza y cuello, mieloma múltiple y cánceres de quimiorresistencia.
Las infecciones víricas pueden tratarse dirigiéndose a proteínas víricas intracelulares en células infectadas. Las proteínas virales, como la transcriptasa inversa del VIH, pueden bloquear el ciclo de vida viral. El sdAb de la invención también puede dirigirse a proteínas virales intracelulares tales como Ebola VP24 y, por lo tanto, bloquear la capacidad del ébola para desactivar la respuesta inmunitaria antiviral del huésped. Los sdAb de la invención se pueden usar para atacar enfermedades cuando hay una sobreexpresión de una molécula intracelular. La enfermedad de Huntington se puede tratar con sdAb.
Los sdAb de la invención se pueden usar con uno o más compuestos. Por ejemplo, el sdAb de la invención se puede usar con inhibidores de JAK/STAT tales como, por ejemplo, curcumina, resveratrol, cucurbitacina A, B, E, I, Q, flavopiridol, desoxitetrangomicina, derivados de ciclopentenona, N-Acilhomoserina lactona, derivados de indirubina, meisoindigo, tirfostinas, compuestos que contienen platino (por ejemplo, IS3-295), peptidomiméticos, oligonucleótidos antisentido, S3I-201, derivados del tripéptido fosfotirosina, inhibidores de la proteasa del VIH (por ejemplo, nelfinavir, indinavir, saquinavir, y ritornavir), JSI-124, XpYL, Ac-pYLPQTV-NH2, ISS 610, CJ-1383, pirimetamina, Metformina, Atiprimod, S3I-M2001, STX-0119; derivados de N-[2-(1,3,4-oxadiazolil)]-4dequinolincarboxamida, S3I-1757, LY5; 5,8-dioxo-6(piridin-3-ilamino)-5,8, -dihidro-naftaleno-1-sulfonamida, con acetina, Stattic, STA-21, LLL-3, LLL12, XZH-5, SF-1066, SF-1087, 17o, Cryptotanshinone, FLL32, FLL62, C188-9, BP-1108 y BP-1075, Galiellalactona, JQ1, 5, 15 DPP, WP1066, Niclosamida, SD1008, Nifuroxazida, criptotanshinona, quinona BBI y fosfato de luxolitnib. El uno o más compuestos pueden aumentar la respuesta terapéutica y aumentar la eficacia del sdAb de la invención. Además, la eficacia del sdAb puede aumentarse combinándolo con péptidos, peptidomiméticos y otros fármacos, como, por ejemplo, pero sin limitarse a, cimetidina, atorvastatina, celecoxib, metformina y cimetidina. Además, los sdAb anti-STAT3 pueden convertir los cánceres radiorresistentes en cánceres radiosensibles con respecto a la radioterapia.
También se contempla que uno o más sdAb de la invención se pueden combinar, o los sdAb de la invención se pueden combinar con otros sdAb.
Se contempla que ciertos sdAb de la invención pueden cruzar la membrana celular y entrar en la célula sin la ayuda de secuencias de proteínas de direccionamiento adicionales en el sdAb, y sin la ayuda de compuestos exógenos que dirigen al sdAb a unirse a los receptores de superficie celular y cruzan la membrana celular.
Después de cruzar la membrana celular, estos sdAb pueden dirigirse a moléculas o antígenos transmembrana o intracelulares. Estas dianas intracelulares o transmembrana pueden ser, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, proteínas mutadas, proteínas virales y priones. Las dianas sdAb pueden funcionar como enzimas, proteínas estructurales de la célula, porciones intracelulares de moléculas de membrana celular, moléculas dentro de las membranas de organelos, cualquier tipo de molécula de ARN, cualquier región de ADN o cromosoma, ácidos nucleicos metilados o no metilados, moléculas parcialmente ensambladas. dentro del mecanismo de síntesis de la célula, las moléculas del segundo mensajero y las moléculas dentro de los mecanismos de señalización celular. Los objetivos pueden incluir todas las moléculas en el citoplasma, núcleo, orgánulos y membrana celular. Las moléculas destinadas a la secreción o la colocación en la membrana celular pueden dirigirse dentro del citoplasma antes de abandonar la célula.
Las dianas sdAb pueden ser en humanos, animales, plantas, hongos, parásitos, protistas, bacterias, virus, priones, células procarióticas y células eucariotas. Algunos ejemplos de moléculas de señalización inter e intracelular y grupos de proteínas a los que pueden dirigirse los sdAb de la invención son: productos oncogénicos, hormonas, citoquinas, factores de crecimiento, neurotransmisores, quinasas (incluida la tirosina quinasa, la serina quinasa y la treonina quinasa), fosfatasas, ubiquitina, nucleótidos cíclicos, ciclasas (adenililo y guanililo), proteínas G, fosfodiesterasas, superfamilia de GTPasa, inmunoglobulinas (anticuerpos, fragmentos Fab, aglomerantes, sdAb), superfamilia de inmunoglobulinas, lípidos de fosfato de inositol, esteroides, receptores, CD4, CD8, CD28, etc.), factores de transcripción, TGF-beta, TNF-alfa y beta, superfamilia de ligandos de TNF, moléculas de señalización del receptor de muesca, moléculas de señalización del receptor hedgehog, moléculas de señalización del receptor Wnt, moléculas de señalización del receptor de tipo toll, caspasas, actina, miosina, miostatina, 12 lipoxigenasa, 15-lipoxigenasa, superfamilia de lipoxigenasa, transcriptasa inversa, virus y sus proteínas, proteínas amiloides, colágeno, receptores acoplados a proteína G, proteínas normales mutadas, priones, Ras, Raf, Myc, Src, BCR/ABL, MEK, Erk, Mos, Tpl2, MLK3, TAK, DLK, MKK, p38, MAPK, MEKK, ASK, SAPK, JNK, BMK, MAP, JAK, PI3K, ciclooxigenasa, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6, Myc, p53, BRAF, NRAS, KRAS, HRAS y quimioquinas.
KRAS es un homólogo de oncogén ras de Kirsten de la familia de genes ras de mamíferos. KRAS codifica una proteína que es miembro de la pequeña superfamilia GTPasa. La proteína está implicada en varias neoplasias malignas, como el adenocarcinoma de pulmón, el adenoma mucinoso, el carcinoma ductal del páncreas y el carcinoma colorrectal. En condiciones normales, los miembros de la familia Ras influyen en el crecimiento celular y en los eventos de diferenciación en un sistema de señalización basado en compartimentación de membrana subcelular. Sin embargo, Ras oncogénico puede desregular procesos que controlan tanto la proliferación celular como la apoptosis.
Los sdAb anti-KRAS se desarrollaron para dirigir KRAS de tipo silvestre y mutado (G12D) con el fin de interrumpir su función en células malignas como, por ejemplo, células involucradas en cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer del tracto biliar, cáncer de pulmón, leucemias y otras neoplasias metastásicas. Sin estar limitado por un mecanismo particular, se cree que el sdAb anti-KRAS se une a KRAS y bloquea la señalización en la dirección descendente de la secuencia de KRAS en las células malignas. Además, el sdAb anti-KRAS puede tratar con éxito los tumores malignos que son resistentes a los productos biológicos anti-EGFR (por ejemplo, cetuximab y panitumumab).
Usando métodos que son bien conocidos en la técnica, se usó la proteína KRAS (G12D) mutante humana recombinante para generar sdAb que se dirigen contra un epítopo de KRAS o KRAS mutante (G12D), u otros mutantes KRAS. Además, los sdAb se pueden generar a otros mutantes KRAS. Para generar los sdAb anti-KRAS, se expresó KRAS humano recombinante de longitud completa (ID de gen: 3845) en Escherichia coli.
Se obtuvieron y seleccionaron varios sdAb. La secuencia de ADN de un anticuerpo anti-KRAS sdAb (G12D), nombrado KRAS_13 (SEQ ID NO: 1), se muestra a continuación:
5’Gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcagactggagggtctctgagactctcctgtgcagtttctggaaatatcggc agcagctactgcatgggctggttccgccaggctccagggaagaagcgcgaggcggtcgcacgtattgtacgtgatggtgccactggct acgcagactacgtgaagggccgattcaccatctcccgagacagcgccaagaacactctgtatctgcaaatgaacaggctgatacctgag gacactgccatctactactgtgcggcagacctgcccccaggttgtttgactcaggcgatttggaattttggttatcggggccagggaaccct
ggtcaccgtctcctca-3 ’
La secuencia de aminoácidos de la anti-KRAS (G12D) sdAb (SEQ ID NO: 2.), KRAS_13, se muestra a continuación, con las CDR subrayadas:
EVOLVESGGGSVOTGGSLRLSCAVSGNIGSSYCMGWFRQAPGKKREAVARIVRDGAT GY AD YVKGRFTISRDS AKNTL YLOMNRLIPEDTAIYY C A ADLPPGCLTQ AIWNFGYRG QGTLYTVSS
Además, la presente invención comprende uno o más anticuerpos monoclonales de ratón que están dirigidos contra uno o más dominios del sdAb anti-KRAS de la invención. El anticuerpo monoclonal de ratón puede generarse por métodos que son conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de ratón puede producirse por un hibridoma de ratón. El anticuerpo monoclonal de ratón se puede usar en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, el anticuerpo se puede usar en un inmunoensayo como un ELISA o un ensayo de espectrometría de masas para medir la cantidad de sdAb anti-KRAS presente en el suero de un paciente. La citotoxicidad de KRAS (G12D) sdAb en células de cáncer pancreático humano PANC-1 se probó, como se describe a continuación.
STAT3 es un miembro de la familia de proteínas de transductores de señal y activadores de transcripción (STAT) que llevan tanto la transducción de señal como la activación de las funciones de transcripción. STAT3 se expresa ampliamente y se activa a través de la fosforilación en tirosina y/o serina como una proteína de unión al ADN en respuesta a varias citoquinasy factores de crecimiento como EGF, IL-6, PDGF, IL-2yG-CSF. La fosfoproteína STAT3 forma homodímeros y heterodímeros con otros miembros de la familia STAT y se traslada al núcleo para modular la transcripción de varios genes, y como resultado desempeña un papel clave en muchos procesos celulares como el crecimiento celular, la apoptosis, la angiogénesis, evasión inmune, y supervivencia.
Se puede administrar un sdAb anti-STAT3 a pacientes y otros organismos para tratar enfermedades provocada por STAT3 fosforilado y no fosforilado, así como para prevenir el desarrollo de la enfermedad o la recurrencia de la enfermedad. Por ejemplo, los pacientes que se han sometido a un trasplante de órganos y un trasplante de médula ósea tienen un mayor riesgo de SCCA y BCCA cutáneos debido a los medicamentos inmunosupresores que toman. La administración de un sdAb anti-STAT3 puede reducir o eliminar este riesgo. Los pacientes tratados por una neoplasia maligna con riesgo de recurrencia se beneficiarán del tratamiento con el sdAb anti-STAT3. Según el historial médico familiar y el tipo de HLA, algunas personas tendrán un mayor riesgo de padecer algunos tipos de enfermedades autoinmunitarias y podrían beneficiarse del tratamiento con sdAb para reducir el riesgo de desarrollar esa enfermedad autoinmune. El riesgo de cáncer de mama puede reducirse con la administración de medicamentos anti-STAT3 como GLG 302, como se demostró en un estudio reciente del NCI.
Además de la inhibición de STAT3, el sdAb anti-STAT3 también puede inhibir STAT1, STAT2, STAT4, STAT5a, STAT5b y STAT6 debido al alto grado de homología entre estas moléculas.
Se usó la proteína STAT3 humana recombinante para producir los sdAb anti-STAT que se dirigían contra o pueden unirse a un epítopo de STAT3. Para generar los sdAb anti-STAT3, se expresó STAT3 humano de longitud completa recombinante (ID de gen: 6774) mediante baculovirus en células de insecto Sf9. Los sdAb anti-STAT se clonaron en vectores que pueden expresarse tanto en células bacterianas como en células de mamíferos, como se muestra en las Figs. 1 y 2.
El sdAb anti-STAT3 de la invención se puede usar para dirigir a STAT3 y a todas las demás moléculas STAT dentro de la célula para inhibir el crecimiento celular, tal como, por ejemplo, la supresión del crecimiento de células cancerosas. Además, el sdAb anti-STAT3 puede inhibir el crecimiento celular en otras enfermedades proliferativas como la psoriasis y la degeneración macular a través de VEGF.
Sin limitarse a un mecanismo de acción particular, se piensa que el sdAb anti-STAT3 puede eliminar la supresión inmunitaria inducida por cáncer al disminuir los niveles de STAT3 en células presentadoras de antígeno tales como, por ejemplo, células dendríticas hospedadoras. La inhibición de STAT3 promueve la respuesta contra el cáncer en los sistemas inmunitarios innatos y adaptativos del paciente (es decir, células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T, células NK y células B).
Usando métodos que son bien conocidos en la técnica, se obtuvieron varios sdAb anti-STAT y se examinaron para determinar la capacidad para suprimir el crecimiento de células cancerosas e inducir apoptosis en estirpes celulares de cáncer, como se describe a continuación. Se evaluaron la citotoxicidad y las actividades antiproliferativas de los sdAb anti-STAT3. Además, la tolerancia de los sdAb anti-STAT3 se probó in vitro e in vivo. La producción de anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra uno o más dominios de los sdAb anti-STAT se describe a continuación.
La secuencia de aminoácidos de un anti-STAT3 sdAb, llamada VHH13 (SEQ ID NO: 3), se muestra a continuación:
HVQL VES GGGS V O AGGSLRLS C A AS G A N GGRS CMGWFRQ VPGKEREG V S G ISTGGLITYY A P S VKGRFTIS QDNTKNTLYLQM NSLKPEDT AM Y YC ATSR FDCYRG SW FNRYM YNSW GOGTOVTVS S
Las tres CDR están subrayadas.
La secuencia de aminoácidos de un segundo anti-STAT3 sdAb, llamada VHH14 (SEQ ID NO: 4), se muestra a continuación:
O VO LVESGG G SVO AG G SLRLSCVASTYTGCMGW FROAPGKEREGVAA FSSRGFAG H YTDSVK G RFSISRDY VK NAV YFO M NTV K PEDA AM YYC AAR E GW ECGETW FDRTAGGHTYW GOGTFVTVSS
Una vez más, las tres CDR están subrayadas. Las secuencias de proteínas de otros sdAb anti-STAT3 que se obtuvieron son los siguientes:
STAT3_10 (SEQ ID NO: 5):
( 1)D V QEVESGGGS V QAGGSERESC V ASTYTGCMGWFRQAPGKEREGV AA
(48) ESSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYEQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98) GWEC GETWEDRTAGGHTYWGQGTQVTVS S
STAT3_34 (SEQ ID NO: 6):
(1) DVQEVESGGGSVQAGGSERESCV ASTYTGCMGWFRQAPGKEREGV AA
(48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98) GWEC GETWLDRT AGGHT YW GQGTQVT V S S
STAT3_19 (SEQ ID NO: 7):
(1) HVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCV ASTYTGCMGWFRQAPGKEREGV AA
(48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98) GWEC GETWLDRT AGGHT YW GQGTQVT V S S
STAT3_14 (SEQ ID NO: 8):
(1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCV ASTYTGCMGWFRQAPGKEREGV AA
(48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98) GWEC GETWLDRT AGGFITYWGQGTLVTVSS
STAT3_35 (SEQ ID NO: 9):
(1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCV ASTYTGCMGWFRQAPGKEREGV AA
(48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98) GWEC GETWLDRT AGGFITYWGQGTLVTVSS
STAT3_9 (SEQ ID NO: 10):
(1) QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCV ASTYTGCMGWFRQAPGKEREGV AA
(48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE
(98) GWEC GETWLDRT AGGFITYWGQGTLVTVSS
STAT3_30 (SEQ ID NO: 11):
(1) Q V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC V ASTYTGCMGWFRQ APGKEREG V A A (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGFITYWGQGTLVTVSS
STAT3_23 (SEQ ID NO: 12):
(1) Q V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC V ASTYTGCMGWFRQAPGKEREG V A A (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGSHTYWGQGTLVTVSS
STAT3_24 (SEQ ID NO: 13):
(1) EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCVASTYTGCMGWFRQAPGKEREGVAA (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGFITYWGQGTLVTVSS
STAT3_36 (SEQ ID NO: 14):
(1) D V QLVES GGGS VQ AGDS LRLSC V ASTYTGCMGWFRQAPGKEREG V A A (48) LSSRGFAGHYTDSVKGRFSISRDYVKNAVYLQMNTVKPEDAAMYYCAARE (98) GWECGETWLDRTAGGFITYWGQGTLVTVSS
STAT3_12 (SEQ ID NO: 15):
(1) Q V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS CAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTIS QDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR (101) FDCYRGSWFNRYMYNSWGQGTLVTVS S
STAT3_16 (SEQ ID NO: 16):
(1) Q V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS CAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G (51) ISTGGLITYYADS VKGRFTIS QDNTNNTLYLQMNSLKPEDT AM YY C ATSR (101) FDC YRGS WFNRYM YNSWGQGTLVTVSS
STAT3_11 (SEQ ID NO: 17):
(1) EV QLVES GGGS V QAGGSLRLSC AAS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADS VKGRFTIS QDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC ATSR (101 )FDC YRGS WFNRYM YNSW GQGTLVT V S S
STAT3_20 (SEQ ID NO: 18):
(1) D V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G (51) ISTGGLITYYADS VKGRFTIS QDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC ATSR (101) FDC YRGS WFNRYM YNSWGQGTLVTVSS
STAT3_2 (SEQ ID NO: 19):
(1) D V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G (51) ISTGGLITYYADS VKGRFTIS QDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC ATSR (101) FDC YRGS WFNRYM YNSWGQGTLVTVSS
STAT3_15 (SEQ ID NO: 20):
(1) D V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G (51) ISTGGLITYYADS VKGRFTIS QDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC ATSR (101) FDC YRGS WFNRYM YNSWGQGTLVTVSS
STAT3_6 (SEQ ID NO: 21):
(1) HV QLVESEGGS V QAGGSLRLSC AAS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG (51) ISTGGLITYYADS VKGRFTIS QDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC ATSR (101) FDC YRGS WFNRYM YN S W GQGTLVT V S S
STAT3_33 (SEQ ID NO: 22):
(1) Q V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G (51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101) FDCYRGS WFNRYMYNSWGQGTQYTYS S
STAT3_17 (SEQ ID NO: 23):
(1) Q V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G
(51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101) FDC YRGS WFNRYM YN S W GQGTQ VTV S S
STAT3_25 (SEQ ID NO: 24):
(1) EVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGANGGRSCMGWFRQVPGKEREGVSG
(51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMSSLKPEDTAMYYCATSR
(101) FDC YRGS WFNRYM YN S W GQGTQ VTV S S
STAT3_32 (SEQ ID NO: 25):
(1) D V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G
(51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101) FDC YRGS WFNRYM YN S W GQGTQ VTV S S
STAT3_13 (SEQ ID NO: 26):
(1) H V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G
(51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101) FDC YRGS WFNRYM YN S W GQGTQ VTV S S
STAT3_39 (SEQ ID NO: 27):
(1) H V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G
(51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101) FDC YRGS WFNRYM YN S W GQGTQ VTV S S
STAT3_4 (SEQ ID NO: 28):
(1) H V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G
(51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101) FDC YRGS WFNRYM YN S W GQGTQ VTV S S
STAT3_29 (SEQ ID NO: 29):
(1) H V QLVES GGGS VQ AGGS LRLSC A AS GAN GGRSCMGWFRQVPGKEREG V S G
(51) ISTGGLITYYADSVKGRFTISQDNTKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCATSR
(101) FDC YRGS WFNRYM YN S W GQGTQ VTV S S
Las correspondientes secuencias de ADN anti-STAT3 son como sigue:
Stat3_VHH-10 (SEQ ID NO. 30): 5 ’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctctg agactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctctt agtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgc aaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccg gaccgccgggggccatacctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-14 (SEQ ID NO. 31):5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctc tgagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagct cttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatct gcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggac cggaccgccgggggccatacctacLggggccaggggaccctggtcaccglctcctca-3'
Stat3_VHH-12 (SEQ ID NO. 32): S’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctct gagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgaggg ggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaaca cgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttg gttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-13 (SEQ ID NO. 33): 5’-catgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctct
gagactctcctgtgcagcctctggagccaacggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgaggg
ggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaaca
cgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttg
gttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcactgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-20 (SEQ ID NO. 34): 5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctct
gagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgaggg
ggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaaca
cgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttg
gttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-23 (SEQ ID NO. 35):5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctct
gagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctc
ttagcagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatct
gcaaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggac
cggaccgccgggagccatacctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-24 (SEQ ID NO. 36):5’-gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggaggctctct
gagactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctc
ttagtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctg
caaatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggacc
gaaccgccgggggccatacctactggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-25 (SEQ ID NO. 37):5’-gaggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctg
agactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggg
gtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggtcgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacg
ctgtatctgcaaatgagcagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggtt
caaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-19 (SEQ ID NO. 38):5’-catgtgcagctggtggagtctggggggggctcggtgcaggctggaggctctctga
gactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctctta
gtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgca
aatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccgg
accgccgggggccatacctactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3‘
Stat3_VHH-32 (SEQ ID NO. 39):5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtc
tctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgag
ggggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaa
cacgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctctt
ggttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3 ’
Stat3_VHH-33 (SEQ ID NO. 40):5’-caggtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtct
ctgagactctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagg
gggtttctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaac
acgctgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttg
gttcaaccgatatatgtataacagttggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-36 (SEQ ID NO. 41):5’-gatgtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagactctctga
gactctcctgtgtagcctctacatacaccggctgcatgggctggttccgccaggctcctggaaaggagcgcgagggagtcgcagctctta
gtagccgtggttttgccgggcactataccgactccgtgaagggccgattctccatctcccgagactacgtcaagaatgcggtgtatctgca
aatgaacactgtgaaacctgaggacgctgccatgtactactgtgcagcacgggagggatgggagtgcggtgagacctggttggaccgg
accgccgggggccatacctactggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’
Stat3_VHH-11 (SEQ ID NO. 42):5’-gtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgag
actctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgtgagggggttt
ctggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctg
tatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaa
ccgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’
Stat3_VHH-6 (SEQ ID NO. 43):5’-gtgcagctggtggagtctgagggaggctcggtgcaggctggagggtctctgaga ctctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttc tggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaagaacacgctgt atctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaac cgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcaccgtctcctca-3’
Stat3_VHH-1 (SEQ ID NO. 44):5’-gtgcagctggtggagtctgggggaggctcggtgcaggctggagggtctctgaga ctctcctgtgcagcctctggagccaatggtggtcggagctgcatgggctggttccgccaggttccagggaaggagcgcgagggggtttc tggtatttcaaccggtggtcttattacatactatgccgactccgtgaagggccgattcaccatctcccaagacaacaccaataacacgctgt atctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacactgccatgtactactgtgcgacgagtcggtttgactgctatagaggctcttggttcaac cgatatatgtataacagttggggccaggggaccctggtcactgtctcctca-3’
Adicionalmente, la presente invención comprende uno o más anticuerpos monoclonales de ratón que se dirigen contra uno o más dominios del sdAb anti-STAT3 de la invención. El anticuerpo monoclonal de ratón puede generarse por métodos que son conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de ratón puede producirse por un hibridoma de ratón. El anticuerpo monoclonal de ratón se puede usar en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, el anticuerpo se puede usar en un inmunoensayo como un ELiSa para medir la cantidad de sdAb anti-STAT3 presente en el suero de un paciente. Debería apreciarse que el método no se limita a los sdAb anti-STAT3, y podría usarse para producir un anticuerpo de ratón dirigido hacia cualquiera de los sdAb de la presente invención.
El gen de TNF-alfa codifica una citocina proinflamatoria multifuncional que pertenece a la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF). Esta citoquina es secretada principalmente por macrófagos. La citoquina está involucrada en la regulación de un amplio espectro de procesos biológicos, incluida la regulación del crecimiento, la diferenciación, la inflamación, la replicación viral, la tumorogénesis y las enfermedades autoinmunitarias; y en infecciones virales, bacterianas, fúngicas y parasitarias. Además de inducir necrosis hemorrágica de tumores, se encontró que el TNF estaba involucrado en la tumorogénesis, metástasis tumoral, replicación viral, shock séptico, fiebre, inflamación, caquexia y enfermedades autoinmunitarias, incluida la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide, así como la enfermedad de injerto contra huésped.
La presente invención proporciona sdAb, proteínas y polipéptidos que se dirigen contra el TNF-alfa, en particular contra el TNF-alfa humano dentro de la célula o membrana celular, para prevenir la secreción de TNF-alfa por las células.
Se contempla que los sdAb y polipéptidos anti-TNF-alfa de la invención se pueden usar para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados y/o mediados por TNF-alfa, tales como inflamación, artritis reumatoide., Enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, síndrome inflamatorio del intestino, esclerosis múltiple, enfermedad de Addison, hepatitis autoinmunitaria, parotitis autoinmune, diabetes tipo 1, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus sistémica del lupus, enfermedad de Hashimoto infertilidad masculina, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis y pérdida de peso debida a cáncer y caquexia.
El TNF-alfa existe en diferentes formas; Hay formas monoméricas y multiméricas, incluyendo una forma trimérica. Está dentro del alcance de la invención que los sdAb, proteínas y polipéptidos de la invención se unen a TNF-alfa en su forma diferente, es decir, forma monomérica o formas multiméricas. Así, cuando los sdAb, proteínas y polipéptidos de la invención se dirigen a TNF-alfa, debe entenderse que esto también comprende sdAb, proteínas y polipéptidos dirigidos contra TNF-alfa en su forma trimérica.
Se sabe que la transducción de señales por TNF implica la reticulación por receptores de TNF por un trímero de moléculas de TNF, que contiene tres sitios de unión a receptores (ver, por ejemplo, Peppel et al., J. Exp. Med., 174 (1991), 1483-1489).
La proteína TNF-alfa humana recombinante se usó para generar sdAb que se dirigen contra o pueden unirse a un epítopo de TNF-alfa. Para generar los sdAb anti-TNF-alfa, el TNF-alfa humano recombinante de longitud completa (ID de gen: 7124) se expresó en Escherichia coli y se usó como el antígeno diana.
Se obtuvieron treinta y cinco sdAb contra la proteína TNF-alfa. Estos anticuerpos anti-TNF-alfa se dividieron en tres grupos según la homología de secuencia.
La secuencia de aminoácidos de la primera sdAb anti-TNF-alfa, llamado TNF-alfa VHH66 (SEQ ID NO: 45). SdAb, se muestra a continuación:
HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE
GVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLOMNDLKPEDTA
MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRG-QGTLYTVSS
Las tres CDR están subrayadas.
En la secuencia de aminoácidos de la segunda sdAb anti-TNF-alfa, llamado VHH69 TNF-alfa (SEQ ID NO: 46) sdAb, se muestra a continuación:
EV QLVESGGGS VLAGGS LRLS C V AS GFTSR YN YM AWFRO APGKERE GVATIGTASGSADYYGSVKDRFTISODNAKNTVYLOMNSLKPEDTA MYY C AARTY GTISLTPSDYRYWGOGTLVTVSS
Las tres CDR están subrayadas.
La secuencia de aminoácidos de la tercera sdAb anti-TNF-alfa, llamado TNF-alfa VHH62 (SEQ ID NO: 47). SdAb, se muestra a continuación:
Figure imgf000016_0001
Las tres CDR están subrayadas. Otros sdAb anti-TNF-alfa que se encontraron incluyen las siguientes secuencias, nuevamente con las CDR subrayadas:
TNF_2 (SEQ ID NO: 48):
OVQLVESGGGSVEAGRSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGOTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLOMNDLKPEDTA MYY C A ADRDRCGSIWTY A YKYRGQGTQ VT V S S TNF_46 (SEQ ID NO: 49):
QVQFVESGGGSVEAGGSFRFSCAASGFRYAAYCMGWFRQ APGKERE GV ATIDID GOTTH AD S V KGRFTISRDN V KNTLSLQMNDLKPEDT A MYY C AADRDRC GS IWTY A YKYRGQGTQ VTV S S TNF_71 (SEQ ID NO: 50):
OVQLYESGGGSYEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRO APGKERE GVATIPIPGLTTHAPSVKGRFTISRPNAKNTLSLOMNPLKPEPTA MYYCAAPRPRCGSIWTYA YKYRGQGTQ VTVSS TNF_21 (SEQ ID NO: 51):
QVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQ APGKERE GVATIDIDGOTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLOMNDLKPEDTA MYYCAAPRPRCGSIWTYA YKYRGQGTQ VTVSS TNF_38 (SEQ ID NO: 52):
EVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRO APGKERE GVATIPIPGOTTHAPSVKGRFTISRPNAKNTLSLOMNPLKPEPTA MYY C AAPRPRCGSIWTY A YKYRGQGTQ VTVSS TNF_18 (SEQ ID NO: 53):
EVOLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRO APGKERE GVATIPIPGLTTHAPSVKGRFTISRPNAKNTLSLQMNPLKPEPTA MYY C AAPRPRCGSIWTY A YKYRGOGTLVT VSS TNF_37 (SEQ ID NO: 54):
PVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQ APGKERE GVATIPIPGOTTHAPSVKGRFTISRPNAKNTLSLOMNPLKPEPTA MYYCAAPRPRCGSIWTYA YKYRGQGTLVTVSS
TNF_66 (SEQ ID NO: 55):
HVOLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFROADGKERE GVATIDIDGLTTHADSVKGRFTISRDNAKNTLSLQMNDLKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTLVTVSS TNF_68 (SEQ ID NO: 56):
HVQLVESGGGSVEAGGSLRLSCAASGFRYAAYCMGWFRQADGKERE GVATIDIDGFATHADSVKGRFTISRDNAKNTFSFQMNDFKPEDTA MYYCAADRDRCGSIWTYAYKYRGQGTEVTVSS TNF_78 (SEQ ID NO: 57):
HVQFVESGGGSVEAGGSFRFSCAASGFRYAAYCMGWFRQADRKERE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTESFQMNDFKPEDTA MYY C AADRDRCGSIWTY AYKYRGQGTQ VTVSS TNF_67 (SEQ ID NO: 58):
HVOEVESGGGSVOAGGSERESCAASGFRYAAYCMGWFROADGKVRE GVATIDIDGQTTHADSVKGRFTISRDNAKNTFSFQMNDEKPEDTA MYY C AADRDRCGSIWTY AYKYRGQGTFVTVSS TNF_6 (SEQ ID NO: 59):
QVQLVESGGGSVQAGGSLRLSCAASGFIDSFGVMAWFRQAPGKERE GVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYEQMNSEKPEDSA MYYCAARTYGSVSSWTGYKYWGQGTQVTVSS TNF_7 (SEQ ID NO: 60):
DVQEVESGGGSVQAGGSFRESCAASGFIDSFGVMAWFRQTPGKERE GVAAYYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYEQMNSEKPEDSA MYY C AARTY GS VS S WTG YKYW GQGTQ VT V S S TNF_13 (SEQ ID NO: 61):
DVQFVESGGGS VQ VGGSFTFSC AVSGYTDS Y GVM AWFRQ APGKERE GVASIYRNSGITYYPDSVKGRFTISRDNAKNTVFFOMNSFKPEDSA TYYCAVRSFGSVSTWAGYVYWGOGTO VTVSS TNF_60 (SEQ ID NO: 62):
DVQFVESGGGS VQAGGSFRESC A ASGFIDSFGVM AWFRQ APGKERE GVAAVYRRAGDTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDSA MYY C AARTY GS VS S WTG YKYW GRGTQ VT V S S TNF_73 (SEQ ID NO: 63):
DVOLVESGGGSVRAGGSLRLSCTASGDTSKSDCMAWFRO APGKERE RVGAIYTRNGYTHYADSVNGRFTISODNAKNALYLOMSGLKPEDTA MYYCAARFRIYGQCVEDDDIDYWGQGTL VTVSS TNF_69 (SEQ ID NO: 64):
EVOLVESGGGSVLAGGSLRLSCVASGFTSRYNYMAWFROAPGKERE GVATIGTASGSADYYGSVKDRFTISODNAKNTVYLQMNSLKPEDTA MYY C AARTY GTISLTPSDYRYWGOGTL VTVSS TNF_76 (SEQ ID NO: 65):
O V O V VEY GGGS YO AGET VRLS CT AS GFTFAE ADM GW YRQ APGHEW E LVSNITTEGITSEASSSYADSVRGRFTIFDN AK NM VYLO M NSLK H EDTA V Y YCA PDPYAYSTYREYCTW AQGTQGTLVTVSS TNF_62 (SEQ ID NO: 66):
QVQLVESGGGPVQAGETI R1.SCTASGFTFAEADMGWYRO APGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAOGTOGTLVTVSS TNF_43 (SEQ ID NO: 67):
O V O L V E SG G G S V O AG ETLRL S CT A S G FT FA E A D M G W Y R Q A PG H E C E L V ST IT T E G IT SE A SSY Y A D SY R G R FT ISR D N A K N M V Y L O M N SL K P E D T A V Y Y C A P D P Y A Y S T Y S D Y C T W A O G T Q G T L V T Y SS TNF_15 (SEQ ID NO: 68):
O V QP VES GGGS YO AGETLRLS CT AS GFTFAE ADM GW YRQ APGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLOMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTW AOGAOGTLVTVS S TNF_11 (SEQ ID NO: 69):
O V O L V E SG G G S Y O AG ETLRL S CT A S G FT FA E A D M G W Y R Q A PG H E C E L V ST IT T E G IT SE A SSY Y A D SV R G R FT ISR D N A K N M V Y L Q M N SL K P E D T A V Y Y C A P D P Y A Y S T Y S D Y C S W A O G T O G T O V T V SS TNF_17 (SEQ ID NO: 70): OVOLVESGGGSVOAGETLRLSCTASGFTFAEADM GW YRO APGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNM VYLOM NSLKPEDTA VYYC APDPY A YSTYS DYCTW AOGTOGTOVTVS S TNF_63 (SEQ ID NO: 71):
O V O L V E SG G G S V O AG ETLRL S CT A S G FT FA E A D M G W Y R Q A PG H E C E L V ST IT T E G IT SE A SSY Y A D SV R G R FT ISR D N A K N M V Y L O M N SL K P E D T A V Y Y C A P D P Y A Y S T Y S D Y C T W A Q G T Q G T L V T V SS TNF_20 (SEQ ID NO: 72):
H V O L V E SG G G SV Q AG ETLRL S CT A S G FT FA E A D M G W Y R Q A PG H E C E L V ST IT T E G IT SE A SSY Y A D SV R G R FT ISR D N A K N M V Y L O M N SL K P E D T A V Y Y C A P D P Y A Y S T Y S D Y C T W A O G T O G T O V T V SS TNF_58 (SEQ ID NO: 73):
E V O L V E SG G G SV O A G E T L R L SC T A SG F T FA E A D M G W Y R O APG H EC E L V ST IT T E G IT SE A SSY Y A D SV R G R FT ISR D N A K N M V Y L Q M N SL K P E D T A V Y Y C A P D P Y A Y S T Y S D Y C T W A Q G T Q G A L V T V SS TNF_27 (SEQ ID NO: 74):
E V O L V E SG G G SV O A G E T L R L SC T A SG F T FA E A D M G W Y R O APG H EC E L V ST IT T E G IT SE A SSY Y A D SV R G R FT ISR D N A K N M V Y L O M N SL K P E D T A V Y Y C A P D P Y A Y S T Y S D Y C T W A O G T Q G T L V T V SS TNF_28 (SEQ ID NO: 75):
E V O L V E SG G G SV O A G E T L R L SC T A SG F T FA E A D M G W Y R Q APG H EC E L V ST IT T E G IT SE A SSY Y A D SV R G R FT ISR D N A K N M V Y L Q M N SL K P E D T A V Y Y C A P D P Y A Y S T Y S D Y C S W A O G T O G T O V T V SS
TNF_4 (SEQ ID NO: 76):
EVOLVESGGGSVOAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYROAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLOMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAOGTOGTOVTVS S TNF_14 (SEQ ID NO: 77):
DVQLVESRGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMGWYRQAPGHECE LVSTITTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAQGTQGTLVTVSS TNF_3 (SEQ ID NO: 78):
DVQLVESGGGSVQAGETLRLSCTASGFTFAEADMCiWYRQAPGHVCE LVSTrTTEGITSEASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLQMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCSWAQGTQGTQVTVSS
TNF_1 (SEQ ID NO: 79):
D VQLVES GGG S VQ AGETLRLS CT AS GFTFAE ADMGW YRQ APGLECE LVSTITTEGITSEAS S YADS VRGRFTISRDNAKNM VYLQMNSLKPEDT A VYYCAPDPYAYSTYSEYCTWAOGTOGTLVTYSS TNF_45 (SEQ ID NO: 80):
D VQLVES GGG S VQ AGETLRLS CT AS GFTFAE ADMGW YRQ APGLECE LVSTITTEGITSEAS S YADS VRGRFTISRDNAKNM VYLQMNSLKPEDT A VYYCAPDPYAYSTYSEYCTWAOGTOGTLVTVSS TNF_22 (SEQ ID NO: 81):
D V O LVES GGGS V O AGETLRLS CT AS GFTFAE ADM GW YRQ APGHECE LVSTITTEGITSVASSYYADSVRGRFTISRDNAKNMVYLOMNSLKPEDTA VYYCAPDPYAYSTYSDYCTWAOGTOGTOVTVS S
La inhibición del crecimiento in vitro de varios sdAb TNF-alfa se puso a prueba, como se describe a continuación. Además, la presente invención comprende uno o más anticuerpos monoclonales de ratón que están dirigidos contra uno o más dominios del sdAb anti-TNF-alfa de la invención. El anticuerpo monoclonal de ratón se puede generar por métodos que son conocidos por un experto en la técnica, como se describió anteriormente. El anticuerpo monoclonal de ratón se puede usar en ensayos de diagnóstico, como, por ejemplo, un inmunoensayo, como un ELISA, para medir la cantidad de sdAb anti-TNF-alfa presente en el suero de un paciente.
Las proteínas RAF son una familia de quinasas específicas de serina/treonina que sirven como intermediario central en la transmisión de señales extracelulares a la cascada de la proteína quinasa activada por mitógenos, que controla el crecimiento celular, la diferenciación y la supervivencia. BRAF es un miembro de la familia RAF que es activada por miembros de la familia Ras luego de la estimulación inducida por el factor de crecimiento. El Ras active puede inducir la heterodimerización de cRaf y BRAF y esto puede explicar la cooperatividad observada de cRaf y BRaf en células que responden a señales de factor de crecimiento. Las mutaciones activadoras en el gen BRAF están presentes en un gran porcentaje de melanomas malignos humanos y en una proporción de cánceres de colon. La gran mayoría de estas mutaciones dan como resultado un cambio de valina a ácido glutámico en el residuo 599 dentro del segmento de activación de BRAF.
Los sdAb anti-BRAF se desarrollaron para dirigir el BRAF de tipo silvestre y mutado con el fin de interrumpir su función en células malignas tales como, por ejemplo, células implicadas en cáncer de colon y otras neoplasias malignas. Utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica, se usó la proteína BRAF humana recombinante para generar sdAb que se dirigen contra un epítopo de BRAF o se pueden unir a él.
Además, la presente invención comprende uno o más anticuerpos monoclonales de ratón que están dirigidos contra uno o más dominios del sdAb anti-BRAF de la invención. El anticuerpo monoclonal de ratón puede generarse por métodos que son conocidos por un experto en la técnica. El anticuerpo monoclonal de ratón se puede usar en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, el anticuerpo se puede usar en un inmunoensayo como un ELISA para medir la cantidad de sdAb anti-BRAF presente en el suero de un paciente.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) sdAb se une a STAT3
En este ejemplo, la afinidad de dos dianas VHH contra STAT3 se midió utilizando un ensayo de unión sin marcaje basado en Octet. sdAb anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3), anti-KRAS (control negativo) y GST-STAT3 (antígeno monovalente de 16 kDa, Creative BioMart # STAT3-1476H) se usaron como sondas de antígeno en este ensayo. La proteína GST-STAT3 se capturó a 20 |jg/ml en PBS utilizando un baño de aminopropilsilano (APS) y leyó biosensores, específicamente diseñados para proteínas hidrófobas. Luego, las sondas se sumergieron en pozos con la proteína g St -STAT3, sdAb anti-STAT3 v Hh 13 (SEQ ID NO: 3) o anti-KRAS en una concentración como se indica. Se midió la tasa de asociación (en la tasa) del antígeno. Los sensores se apagaron con BSA al 1% en agua. Las sondas se sumergieron en tampón de ensayo (PBS) y se midió la tasa de disociación (tasa off).
La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión a antígeno (KD) se determinó a partir de la constante de afinidad obtenida (KA), y KD utilizando el software de análisis de ajuste global 1:1 de Fortebio como se muestra a continuación en la Tabla 1. La afinidad se determinó promediando los valores de KD para curvas con valores de R2 >0.95. El punto de datos de 250 nM anti-STAT3 VHH13 se omitió ya que es un valor atípico. Se determinó que la afinidad de sdAb anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) era 1.16 * 10-7 La afinidad de anti-KRAS VHH no fue determinada.
Tabla 1
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Ejemplo 2: Estudios de inmunoprecipitación
La especificidad de los sdAb de STAT3 se ensayó en células de cáncer de mama humano. En este ejemplo, las células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se hicieron crecer hasta un 50% a 70% de confluencia. Luego, las células se rompieron en un tampón de lisis enfriado en hielo recién preparado (HEPES 20 mM, pH 7.9, NaCl 400 mM, NP-40 al 0.1%, glicerol al 10%, vanadato de sodio 1 mM, fluoruro de sodio 1 mM, ditiotreitol 1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 10 pg/ml de aprotinina, 10 pg/ml de leupeptina) durante 45 minutos en hielo. Luego se centrifugaron los lisados, se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de proteína utilizando un método de Lowry modificado (Bio Rad, Hercules, CA). La proteína total (1 mg) se incubó con 1.5 mg de Dynabeads (Invitrogen) con sdAb contra STAT3, un control positivo (STAT3, cat. No. SC-482, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas) o control negativo (STAT-1, Cat # 9172, Señalización celular, Danvers, Mass.) durante 1 hora a 4°C. Luego se lavaron las perlas. Después del lavado final, se agregaron 60 pl de tampón de lisis, y el sobrenadante resultante se sometió a análisis de transferencia Western. Brevemente, las muestras se separaron en geles de poliacrilamida al 10% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon, luego se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios apropiados. El anticuerpo anti-STAT3, usado como control positivo, fue de Cell Signaling (Cat # 4904, Danvers, Mass.). La reacción de quimioluminiscencia se realizó utilizando el sistema ECL de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, Texas).
Como se ilustra en la FIG. 3, STAT3 endógeno inmunoprecipitado con todos los sdAb probados en cantidades variables. M es el carril Marcador que contiene el marcador, el carril 1 contenía STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) producido y aislado de células de mamífero, el carril 2 contenía STAT3 VHH14 (SEQ ID NO: 4) producido y aislado de células de mamífero, el carril 3 contenía STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) producida y aislada de células bacterianas, el carril 4 contenía STAT3 VHH14 (SEQ ID NO: 4) producida y aislada de células de mamíferos, el carril 5 fue el anticuerpo STAT3 positivo, carril 6, utilizado STAT-1 Como control negativo, no mostró banda.
Ejemplo 3: VHH13 bacteriano anti-STAT3 se une con alta afinidad a estirpes celulares STAT3 activada de forma constitutiva continua
Se ensayó la especificidad de VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) utilizando STAT3 constitutivamente activado en estirpes celulares humanas (PANC-1 y DU145) y murinas (4T1). Las células HeLa comerciales también se trataron con interferón gamma (INFT) para inducir STAT3 fosforilado. La estirpe celular nula PC-3 STAT3 se usó como control negativo.
Las células se cultivaron hasta un 50% a 70% de confluencia, luego se rompieron en un tampón de lisis enfriado en hielo recién preparado como se describió anteriormente durante 45 minutos en hielo. Luego se centrifugaron los lisados, se recogió el sobrenadante y se determinó la concentración de proteína como se describió anteriormente. La proteína total (1 mg) se incubó con 1.5 mg de Dynabeads (Invitrogen) que contenía el anti-STAT3 VHH13 bacteriano (SEQ ID NO: 3) o control negativo (KRAS, Creative Biolabs, Shirley, NY) durante 1 hora a 4°C. Luego se lavaron las perlas. Después del lavado final, se agregaron 60 pl de tampón de lisis y el sobrenadante resultante se sometió a un análisis de transferencia Western como se describe en el Ejemplo 2.
Como se ilustra en la FIG. 4, STAT3 endógeno fue inmunoprecipitado por VHH13 STAT3 (SEQ ID NO: 3) bacteriana en las estirpes celulares STAT3 activadas constitutivamente: PANC-1 (carril 1), DU145 (carril 2) y 4T1 (carril 4).
Además, VHH13 STAT3 bacteriano (SEQ ID NO: 3) se unió al Phospho-STAT3 en el lisado de HeLa (carril 3). No se observaron bandas para PANC-1 KRAS, carril 3, y PC-3 (control negativo), carril 6.
Ejemplo 4: Estudios de citotoxicidad de sdAb anti-stat3 en estirpes celulares de cáncer MDA-MB-231
En este ejemplo, los efectos antiproliferativos de los sdAb anti-STAT3 se analizaron utilizando la estirpe celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231. Para los experimentos, las células MDA-MB-231 se hicieron crecer hasta que alcanzaron una confluencia del 90%. En ese momento, las células se lavaron, se tripsinizaron y se contaron con un contador Coulter (Beckman, Brea, CA). Los estudios de proliferación se llevaron a cabo utilizando el ensayo de bromuro de 3-[4,5-dimetiltiaolil]-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Para esto, las células se sembraron en una placa de 96 pozos a una densidad de 5 ^ 103 por pozo, según lo indicado por el fabricante (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Ind ). Se dejó que las células se adhirieran durante 24 horas y luego se agregaron los sdAb en las concentraciones apropiadas (es decir, 0. 0.5, 1.0, 10.0 o 100 pg/ml). Las células se contaron el día 3. Para las células tratadas durante 5 días, los medios nuevos que contenían los sdAb se actualizaron el día 3. En el momento de la finalización, se agregaron 10 pl de reactivo MTT (0.5 mg/ml) a cada pozo, según lo indicado por el fabricante. Después de un período de incubación de 4 horas, se agregaron 100 pl de solución de solubilización y la placa se colocó en la incubadora durante la noche. Todas las placas se leyeron a una longitud de onda de 570 nm utilizando el lector de placas Biotek (Winooski, Vt.).
Todos los datos se analizaron utilizando GraphPad InStat 3 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, California). Los grupos de tratamiento se compararon con el grupo de control del vehículo utilizando ANOVA de una vía. Si se observó una diferencia significativa (p <0.05), se realizó la prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer.
Según el experimento MTT, se encontró que el sdAb bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) de VHH13 era eficaz para inhibir el crecimiento celular en los días 3 y 5 después del tratamiento, como se muestra en las Tablas 2-5 a continuación.
Tabla 2
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Tabla 3
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Tabla 4
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Tabla 5
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Ejemplo 5: Estudios de citotoxicidad de sdAb anti-STAT3 en líneas de cáncer de mama humana (MDA-MB-231) y pancreática (PANC-1)
En este ejemplo, se analizaron los efectos antiproliferativos de los sdAb anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) y VHH14 (SEQ ID NO: 4) utilizando la estirpe celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y La estirpe celular de cáncer pancreático humano PANC-1. Para los experimentos, se cultivaron células MDA-MB-231 y PANC-1 hasta que eran confluentes al 90%. En ese momento, las células se lavaron, se tripsinizaron y se contaron con un contador Coulter (Beckman, Brea, CA). Los estudios de proliferación se llevaron a cabo utilizando el ensayo MTT descrito anteriormente. Para las células tratadas durante 5 días, los medios frescos que contenían los sdAb anti-STAT3 se actualizaron el día 3.
Todos los datos se analizaron usando GraphPad InStat 3. Los grupos de tratamientos se compararon con el grupo de control del vehículo utilizando ANOVA de una vía. Si se observó una diferencia significativa (p<0.05), se realizó la prueba de comparación múltiple de Tukey-Kramer.
Según el experimento MTT, se encontró que tanto el VHH13 (SEQ ID NO: 3) como el VHH14 (SEQ ID NO: 4) inhibían el crecimiento celular en las células cancerosas MDA-MB-231 y PANC-1, como se muestra en las Tablas 6-13 a continuación.
Tabla 6
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Tabla 7
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Tabla 8
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Tabla 9
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Tabla 10
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Tabla 11
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Tabla 12
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Tabla 13
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Ejemplo 6: Acciones antiproliferativas de sdAb STAT3 en las estirpes celulares de cáncer de próstata humano y cáncer de mama humano
Los efectos antiproliferativos del sdAb STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) se analizaron en la estirpe celular de cáncer de mama humano MDA-MB -231 y las estirpes celulares de cáncer de próstata humano DU145. Para los experimentos, las células cancerosas se cultivaron hasta alcanzar el 90% de confluencia. En ese momento, las células se lavaron, se tripsinizaron y se contaron con un contador Coulter (Beckman, Brea, CA). Los estudios de proliferación se realizaron utilizando el ensayo MTT como se describió anteriormente.
Las propiedades antiproliferativas de sdAb VHH13 (SEQ ID NO:3) bacteriana anti-STAT3 en células MDA-MB-231 se compararon con sus acciones en células DU145. Como se muestra en la Tabla 14, las células MDA-MB-231 tratadas con los sdAb anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) mostraron una inhibición de crecimiento promedio de 29.6 y 91.2 a 50.0 y 100 pg/ml, respectivamente. En las células DU145, se observó una inhibición de crecimiento similar (31.2 y 92.1% para 50.0 y 100 pg/ml, respectivamente) como se muestra en la Tabla 15.
Tabla 14
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Tabla 15
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Ejemplo 7: Efectos antiproliferativos de sdAb STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) en estirpes de células de cáncer de humano
Para probar los efectos antiproliferativos de sdAb STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) utilizando las estirpes celulares de cáncer humano: MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF-7, BT474 y d U145 como se muestra en la Tabla 16.
Todas las estirpes celulares de cáncer humano se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las estirpes celulares se mantuvieron y se cultivaron en medios RPMI 1640 (MDA-MB-231, MDA-Mb -468, MCF-7, BT474) o MEM-E (DU145) que contenían suero bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM y 1% de solución antibióticoantimicótica (10 unidades/ml de penicilina, 10 pg/ml de estreptomicina y 25 pg/ml de anfotericina B). Las células se mantuvieron a 37°C en una atmósfera humidificada de CO2 al 5%. Los suministros de cultivo celular se obtuvieron de Life Technologies, Inc., (Grand Island, NY). El reactivo MTT se adquirió de Sigma Aldrich (St. Louis, MO).
Para los experimentos, las células cancerosas se cultivaron hasta que alcanzaron una confluencia del 90%. En ese momento, las células se lavaron, se tripsinizaron y se contaron con un Contador Coulter (Beckman, Brea, CA). Los estudios de proliferación se llevaron a cabo utilizando el ensayo MTT como se describió anteriormente.
Las propiedades antiproliferativas de los sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) se evaluaron en cinco células de cáncer de mama que representan varias clasificaciones (Tabla 34). Como se muestra en la Tabla 17, todas las estirpes celulares a las 72 horas después del tratamiento mostraron una inhibición significativa del crecimiento. La mayor inhibición del crecimiento se observó a dosis de 100 y 200 pg/ml para todas las estirpes celulares. La concentración inhibitoria máxima media (IC50) para el crecimiento en las estirpes celulares analizadas fue: 10.1 ± 2.4, 12.36 ± 1.5, 14.8 ± 1.6 y 25.2 ± 14.7 para la MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF-7, y estirpes celulares BT474, respectivamente. Estos datos sugieren que las estirpes celulares de cáncer de mama triple negativas requieren la concentración más baja de sdAb VHH13 (SEQ ID NO: 3) para lograr la IC50 en comparación con las estirpes celulares positivas de estrógeno/progesterona (es decir, MCF-7) o estirpes celulares amplificadas con HER2 (es decir, BT474).
Tabla 16
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Tabla 17
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Las acciones del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) también se evaluaron en la estirpe celular DU145 de cáncer de próstata humano, como se muestra en la Tabla 18. El VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) sdAb mostró una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis en todas las células cancerosas analizadas.
Tabla 18
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P< 0.001
Ejemplo 8: Dosis máxima tolerada de VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) en ratones BALB/C
En este ejemplo, se ensayó la tolerancia de sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en animales de prueba utilizando la estirpe celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231. Para el experimento, un total de 9 ratones hembras sin pelo BALB/C (de 6 a 7 semanas de edad) se dividieron en tres grupos según el peso corporal. (Tabla 19) Los ratones (n=3) recibieron sdAb de vehículo (Pb S) o VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) a 250 o 500 pg/kg de peso corporal/día durante cinco días. Durante el estudio, la mortalidad/morbilidad se realizó dos veces al día. Los pesos corporales se registraron en los días 1, 4 y 6 del estudio, así como en el día de finalización del estudio (día 13). La toxicidad se evaluó mediante mediciones del peso corporal y el comportamiento del ratón en comparación con los ratones de control del vehículo. Al finalizar la fase de tratamiento, los animales fueron seguidos durante una semana adicional para observar cualquier anomalía en el peso corporal y/o en el tratamiento de salud general.
Tabla 19
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Como se ilustra en la Tabla 20, no hubo diferencias significativas en el peso corporal entre los grupos, y el sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) no se asoció con ninguna muerte relacionada con el fármaco en ninguna de las dosis. Además, no se observaron cambios de comportamiento en los animales tratados con el sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) en comparación con los ratones de control.
Tabla 20
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Ejemplo 9: Actividad de anti-STAT3 VHH13 bacteriano (SEQ ID NO: 3) en xenoinjerto de ratones BALB/C sin pelo y cáncer de mama humano y células de cáncer pancreático humano
En este ejemplo, se evaluó la actividad del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en ratones utilizando la estirpe celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231. Brevemente, se evaluó la actividad del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) utilizando: el modelo de xenoinjerto de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y el modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas humano PANC-1. Los horarios de dosificación fueron los siguientes: Grupo 1 (n=6; PBS; IP) diariamente durante 14 días [QDx14]; y Grupo 2 (n=12; 500 pg/kg de peso corporal; IP), todos los días durante 14 días [QDx14]. Un período de observación de 5 días siguió a la administración del fármaco.
Las estirpes celulares de cáncer de mama humano (MDA-MB-231 y PANC-1) se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Las células MDA-MB-231 crecieron en MEM (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con FBS al 10% (Atlanta Biologicals, Flowery Branch, Ga.) y penicilina-estreptomicina-glutamina (Life Technologies, Grand Island, NY). Las células PANC-1 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con FBS al 10% y penicilina-estreptomicina-glutamina. Todas las células se cultivaron en presencia de CO2 al 5% a 37°C en una incubadora.
Se compraron ratones macho nude-Foxn1nu atímicos de 4 a 5 semanas de Harlan Laboratories (Indianapolis, Indiana). Los animales se pusieron en cuarentena durante una semana y se alojaron cinco ratones por jaula, con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y una humedad relativa del 50%. Se suministró agua potable y dieta a los animales a voluntad. Todos los animales se alojaron en condiciones libres de patógenos y los experimentos se realizaron de acuerdo con el Comité de Uso y Cuidado de Animales del Instituto de Investigación IIT. Para el estudio de xenoinjerto MDA-MB-231, se inyectaron subcutáneamente células (4 x 106) en un volumen final de 100 pL de medio MEM en el flanco derecho de los ratones. Para el estudio de xenoinjerto PANC-1, se inyectaron subcutáneamente células (5 x 106) en un volumen final de 100 pL de medio RPMI en los flancos derechos de los ratones. Las mediciones de los tumores para ambos modelos se iniciaron tan pronto como los tumores fueron palpables. A partir de entonces, los tumores se midieron dos veces por semana. Los animales se asignaron al azar cuando los tumores alcanzaron un tamaño de rango de 75 a 175 mm3, el control (n=6) y los grupos de tratamiento (n=12) se aleatorizaron utilizando el algoritmo de muestreo aleatorio estratificado. El tratamiento (VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) sdAb) o Vehículo (PBS) se inició el día siguiente a la aleatorización. El tratamiento fue bien tolerado y no se asoció con ninguna muerte relacionada con los fármacos. No se observó ninguna pérdida de peso corporal significativa.
Para el estudio de xenoinjerto MDA-MB-231, el tamaño medio del tumor de la aleatorización (± EE) fue: 103.01 ± 11.89 y 102.61 ± 9.60 para los grupos control y tratamiento, respectivamente. Los pesos corporales medios (± EE) en la asignación al azar fueron: 32.08 ± 0.76 y 30.27 0.75 para el Grupo 1 y el Grupo 2, respectivamente. La tabla 21 muestra los pesos corporales medios (± EE) para todo el estudio.
Tabla 21
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En el día 14 de la dosificación, el tamaño medio del tumor (± EE) para el control fue de 179.11 ± 19.39 frente a 118.86 ± 15.94 para el grupo de tratamiento. Los pesos corporales medios (± EE) a la terminación fueron: 31.98 ± 0.71 y 30.55 ± 0.74 para el Grupo 1 y el Grupo 2, respectivamente. La tabla 22 resume los volúmenes de tumores (± EE) para todo el estudio. El % de inhibición media del crecimiento tumoral en el grupo de tratamiento fue del 33.64%. Los tiempos de duplicación del tumor fueron los siguientes:
Grupo 1: 44.27 días; y Grupo 2: 61.06 días. La figura 5 ilustra la inhibición del crecimiento del sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231. El sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) mostró una inhibición significativa del crecimiento (p= 0.047). Por lo tanto, el sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) tiene actividad quimioterapéutica en el sistema modelo de cáncer de mama humano MDA-MB-231.
Tabla 22
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Para el estudio de xenoinjerto PANC-1, los tamaños medios de la aleatorización (+ EE) del tumor fueron 107.01 ± 4.54 en el control y 110. 58 ± 6.18 en los grupos de tratamiento. Los pesos corporales medios (± EE) en la asignación al azar fueron: 29.0 ± 0.81 y 28.5 ± 0.70 para el Grupo 1 y el Grupo 2, respectivamente. Los pesos corporales medios (± EE) a la terminación fueron: 31.2 ± 0.99 y 30.1 ± 0.75 para el Grupo 1 y el Grupo 2, respectivamente. La Tabla 23 resume los pesos corporales medios (± EE) para todo el estudio. En el día 14 de la dosis, el tamaño medio del tumor (± EE) para el control fue 287.30 ± 33.94 versus 318.74 29.76 para el grupo de tratamiento. La Tabla 24 resume los volúmenes de tumores (± EE) para todo el estudio.
Tabla 23
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Los tiempos de duplicación del tumor fueron los siguientes: Grupo 1: 22.44 días; y Grupo 23.02 días. El sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) no mostró una inhibición significativa del crecimiento en el sistema de modelo de cáncer pancreático humano PANC-1.
Tabla 24
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Ejemplo 10: Estudio de xenoinjerto MDA-MB-231
En este ejemplo, se evaluó adicionalmente la eficacia del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto de mama humana MDA-MB-231. Los horarios de dosificación fueron los siguientes: Grupo 1 (n=4; PBS; IP) dos veces al día durante 14 días [BIDx14]; Grupo 2 (n=4; 1 mg/kg de peso corporal; IP), dos veces al día durante 14 días [BIDx14]; Grupo 3 (n=4; 2 mg/kg de peso corporal; IP) dos veces al día durante 14 días [BIDx14]; y Grupo 4 (n=4; 2 mg/kg de peso corporal; IP) una vez al día durante 14 días [QDx14]. Un período de observación de 7 días siguió a la administración.
Las estirpes celulares de cáncer de mama humano MDA-MB-231 y los ratones hembra sin pelo atímicos-Foxn1nu se describieron anteriormente.
Las células MDA-MB-231 a una densidad de 5 * 106 se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones a un volumen final de 100 |jl en medio MEM. Las mediciones del tumor se iniciaron tan pronto como los tumores fueron palpables. A partir de entonces, los tumores se midieron dos veces por semana. Los animales se asignan al azar cuando los tumores alcanzan un tamaño de rango de 55 a 150 mm3 utilizando el algoritmo de muestreo aleatorio estratificado. El tratamiento (VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) sdAb) o Vehículo (PBS) se inició el día siguiente a la aleatorización.
El tamaño medio del tumor de la aleatorización (± EE) fue: 92.08 ± 13.24, 82.38 ± 5.17, 77.47 ± 7.17 y 104.71 ± 14.64 para los Grupos 1, 2, 3 y 4, respectivamente. Como se muestra en la Tabla 25, los pesos corporales medios (± EE) en la asignación al azar fueron: 23.65 ± 0.72, 23.45 ± 0.66, 23.10 ± 0.20 y 22.45 ± 1.25 para los Grupos 1, 2, 3 y 4, respectivamente.
Como se muestra en la Tabla 26, en el día 14 de la dosis, el tamaño promedio del tumor (± EE) para el grupo de control fue de 221.51 ± 57.32 versus 67.12 ± 10.66, 58.27 ± 22.54 y 131.44 ± 22.86, para el grupo de tratamiento 2, 3, y 4, respectivamente. En el momento de la terminación (día 42), el tamaño medio del tumor (± EE) era: 255.42 ± 65.46, 55.98 ± 6.94, 41.15 ± 13.21 y 145.51 ± 52.32, para los grupos 1, 2, 3 y 4, respectivamente. Los pesos corporales medios (± EE) a la terminación fueron: 24.80 ± 0.49, 23.25 ± 1.20, 24.00 ± 0.32 y 23.2 ± 1.46 para los grupos 1, 2, 3 y 4, respectivamente. El % medio máximo de pérdida de peso neto (día) fue: 0.7 (36), 1.5 (23), 1.8 (36) y 2.2 (29) para los Grupos 1, 2, 3 y 4, respectivamente.
También como se muestra en la Tabla 26, la inhibición media del crecimiento en los grupos de tratamiento fue de 78.3, 75.2 y 55.9, para los Grupos 2, 3 y 4, respectivamente. Los tiempos de duplicación del tumor fueron: Grupo 1: 20.56 días; Grupo 2: 34.54 días; Grupo 3: 30.07 días; y Grupo 4: 27.17 días. Hubo un retraso en el crecimiento de 13.99, 9.52 y 6.61 días para los grupos 2, 3 y 4, respectivamente. Los valores de % de tratamiento/control para los grupos de tratamiento fueron: grupo 2: -33.75 (estasis tumoral); Grupo 3: -54.4 (regresión tumoral); y Grupo 4: 10.28 (inhibición tumoral). La Figura 6 ilustra la inhibición del crecimiento de sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto MDA-MB-231.
La administración de sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) se asoció con una inhibición significativa del crecimiento en el Grupo 2 (p=0.02) [1 mg/kg; BID * 14] y Grupo 3 (p=0.02) [2 mg/kg; BID * 14]. Además, tres de cada cuatro tumores mostraron una regresión significativa. Sobre la base de estos datos, se concluye que el sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) tiene actividad quimioterapéutica en el sistema modelo de cáncer de mama humano MDA-MB-231.
Tabla 25
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Tabla 26
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Ejemplo 11: Eficacia de la sdAb anti-STAT3 bacteriana VHH13 (SEQ ID NO: 3) en tres modelos de cáncer de xenoinjerto humano
En este Ejemplo, se evaluó la eficacia del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en los modelos de xenoinjerto de cáncer de próstata MDA-MB-231 de Mama Humana, PANC-1 y DU145.
Los ratones Athymic Nude-Foxn1nu, las células de cáncer de mama MDA-MB-231, el cáncer pancreático PANC-1 y las estirpes celulares de cáncer de próstata DU145 se describieron anteriormente. El peso corporal de los ratones varió de 17 a 19 g (34 hembras) y de 21 a 23 g (16 machos) en el día 1 del estudio.
Las células en pasajes tempranos (4 a 10) se usaron para la implantación en los ratones y se recogieron durante el crecimiento de la fase logarítmica. MDA-MB-231 (5 * 106), DU145 (5 * 106) y PANC-1 (1.5 * 106) se inyectaron subcutáneamente en el flanco derecho de los ratones en un volumen final de 100 |jl de medio. Las mediciones del tumor se iniciaron tan pronto como los tumores fueron palpables. A partir de entonces, los tumores se midieron dos veces por semana.
Los animales se aleatorizaron utilizando el algoritmo de muestreo aleatorio estratificado cuando los tumores alcanzan un tamaño de rango de: 74-120 mm3 (MDA-MB-231), 89-146 mm3 (DU145), o 60-160 mm3 (PANC-1). El tratamiento (que contiene el sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) y denominado aquí SBT-100) o Vehículo (PBS) se inició el día siguiente a la aleatorización, denominado día 1.
El sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) se suministró como una solución preformulada a una concentración de 0.651 mg/ml y se almacenó a -20°C hasta que esté listo para su uso. La solución de reserva se diluyó en PBS estéril a pH 7.6 para proporcionar 5 mg/kg en un volumen de dosificación de 10 ml/kg. La solución de trabajo se preparó cada 7 días, se dividió en alícuotas en siete viales y se almacenó a 4°C. En cada día de tratamiento, solo el vial necesario se llevó a temperatura ambiente. Todo el material sdAb sobrante se conservó a 4°C según se necesite para la siguiente dosis. El día 8, se descartó cualquier material sdAb restante y se preparó un lote nuevo.
Se administraron dos grupos (control y SBT-100) de ratones por modelo de tumor de acuerdo con el protocolo que se muestra en la Tabla 27. Los horarios de dosificación fueron los siguientes: Grupo 1 (n=4; PBS) dos veces al día durante 14 días [ BIDx14]; Grupo 2 (n=4; SBT-100, 5 mg/kg de peso corporal), dos veces al día durante 14 días [BIDx14]. Tanto el vehículo (PBS pH 7.6) como el SBT100 se administraron por vía intraperitoneal (i.p.) dos veces al día, con seis horas de diferencia durante catorce días. La dosificación se realizó de acuerdo con los pesos individuales de los animales. Un período de recuperación de 7 días siguió a la administración.
Tabla 27
Diseño experimental del estudio de xenoinjerto
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Study Log Study Director Animal Study Management Software (San Francisco, California) se usó para aleatorizar animales, recopilar datos (por ejemplo, dosis, pesos corporales, mediciones de tumores, observaciones clínicas), y realizar análisis de datos.
En el modelo de xenoinjerto de tumor MDA-MB-231, los animales se asignaron al azar el día 23 después de la inoculación con un tamaño de tumor medio (± EE) de: 77.98 ± 21.58 y 84.71 ± 5.56 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. Los pesos corporales medios (± EE) en la asignación al azar fueron: 20.04 ± 0.62 y 23.7 ± 1.84 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. La Tabla 28 resume los pesos corporales medios (± EE) para todo el estudio. En el último día de la dosis (día 14), el tamaño medio del tumor (± EE) para el grupo de control fue 168.28 ± 51.57 versus 83.81 ± 22.65 para los ratones tratados con SBT-100. La Tabla 29 resume los volúmenes de tumores (± EE) para todo el estudio. En el momento de la terminación (día 28), el tamaño medio del tumor (± EE) era: 270.49 ± 112.35 y 91.72 ± 33.17, para los Grupos 1 y 2, respectivamente. Los pesos corporales medios (± EE) a la terminación fueron: 25.36 ± 1.07 y 24.25 ± 1.68 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. Al final del estudio, la inhibición media del crecimiento tumoral en el grupo tratado con SBT-100 fue del 85.8% (p=0.006). La figura 7 ilustra el volumen medio del tumor. Los tiempos de duplicación del tumor fueron 25.78 días versus 111.6 días para el Grupo 1 y el Grupo 2, respectivamente. El % de tratamiento/control para el Grupo 2 fue 13.35 (inhibición del tumor).
Tabla 28
Pesos corporales medios para ratones en MDA-MB-231
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Tabla 29
Volúmenes tumorales para MDA-MB-231
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En el modelo de xenoinjerto de tumor DU145, los animales se asignaron al azar el día 17 después de la inoculación con un tamaño de tumor medio (± EE) de: 111.87 ± 20.53 y 111.23 ± 25.16 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. Los pesos corporales medios (± EE) en la asignación al azar fueron: 29.10 ± 1.94 y 30.68 ± 1.56 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. La tabla 30 resume los pesos corporales medios (± EE) para todo el estudio. En el último día de la dosis (día 14), el tamaño medio del tumor (± EE) para el grupo de control fue 621.81 ± 276.25 versus 364.14 ± 51.64 para los ratones tratados con SBT-100. La Tabla 31 resume los volúmenes de tumores (± EE) para todo el estudio. En el momento de la terminación (día 28), el tamaño medio del tumor (± EE) fue de 819.42 ± 351.88 y 601.83 ± 131.51, para los Grupos 1 y 2, respectivamente. Los pesos corporales medios (± EE) a la terminación fueron: 29.20 ± 2.33 y 29.60 ± 1.04 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. Al final del estudio, la inhibición media del crecimiento tumoral en el grupo tratado con SBT-100 fue del 26.6% (p=0.29). La figura 8 ilustra el volumen medio del tumor. Los tiempos de duplicación del tumor fueron 14.57 días versus 18.19 días para el Grupo 1 y el Grupo 2, respectivamente. El % de tratamiento/control para el Grupo 2 fue de 74.8.
Tabla 30
Pesos corporales medios para los ratones en DU145
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Tabla 31
Volúmenes tumorales para fase DU145
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En el modelo de xenoinjerto de tumor PANC-1, los animales se asignaron al azar el día 22 después de la inoculación con un tamaño de tumor medio (± EE) de: 78.74 ± 40.21 y 93.84 ± 36.31 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. Los pesos corporales medios (±EE) en la asignación al azar fueron: 22.50 ± 1.47 y 24.23 ± 1.63 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. La Tabla 32 resume los pesos corporales medios (± EE) para todo el estudio. En el último día de la dosis (día 14), el tamaño medio del tumor (± EE) para el grupo de control fue de 204.95 ± 178.90 versus 159.03 ± 28.01 para los ratones tratados con SBT-100. La Tabla 33 resume los volúmenes de tumores (± EE) para todo el estudio. En el momento de la terminación (día 28), el tamaño medio del tumor (± EE) fue de 284.77 ± 288.88 y 203.02 ± 30.34, para los grupos 1 y 2, respectivamente. Los pesos corporales medios (± EE) a la terminación fueron: 27.38 ± 1.07 y 26.23 ± 1.19 para los Grupos 1 y 2, respectivamente. Al final del estudio, la inhibición media del crecimiento tumoral en el grupo tratado con SBT-100 fue del 41.78% (p=0.35). La figura 9 ilustra el volumen medio del tumor. Los tiempos de duplicación del tumor fueron 18.51 días versus 35.70 días para el Grupo 1 y el Grupo 2, respectivamente. El % de tratamiento/control para el Grupo 2 fue de 52.79.
Tabla 32
Pesos corporales medios para ratones en la PANC-1
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Tabla 33
Volúmenes tumorales para PANC-1
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Ejemplo 12: Eficacia sdAb de anti-STAT3 VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto de tumor de mama humano ER+/PR+ (MCF-7)
Este ejemplo demuestra la eficacia del sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) en el modelo de xenoinjerto de tumor de mama humano MCF-7 en ratones sin pelo.
Los ratones sin pelo atímicos hembra (Crl:NU(Ncr)-Foxn1nu, Charles River) tenían doce semanas de edad con un rango de peso corporal (BW) de 23.0 a 30.1 g en el día 1 del estudio. Los animales fueron alimentados y alojados como se describió anteriormente.
Se obtuvieron células de carcinoma de mama humano MCF-7 y se cultivaron como se describió anteriormente, y se usaron para la xenografía de ratón. Tres días antes de la implantación de la célula tumoral, se implantaron por vía subcutánea gránulos de estrógeno (0.36 mg de estradiol, liberación durante 60 días, Innovative Research of America, Sarasota, Florida) entre las escápulas de cada animal de prueba utilizando un trocar esterilizado.
Las células tumorales usadas para la implantación se recogieron durante el crecimiento de la fase logarítmica y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 1 x 108 células/ml. El día de la implantación, cada ratón de prueba recibió 1x107 células MCF-7 (0.1 ml de suspensión celular) implantadas por vía subcutánea en el flanco derecho y se monitorizó el crecimiento del tumor a medida que el tamaño promedio se acercaba al rango objetivo de 100-150 mm3. Veintiún días después, designado como Día 1 del estudio, los animales se clasificaron en dos grupos, cada uno de los cuales consistía en cuatro ratones con volúmenes de tumores individuales que iban de 108 a 144 mm3 y los volúmenes tumorales medios del grupo de 117 a 123 mm3.
El sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) se proporcionó como una solución preformulada lista para dosificar a una concentración de 0.41867 mg/ml en alícuotas de 1 ml y se almacenaron a -20°C hasta que se necesitó. La solución de 0.41867 mg/ml proporcionó una dosis de 1 mg/kg en un volumen de dosificación de 23.88 ml/kg. En cada día de tratamiento, solo los viales necesarios de VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) sdAb se descongelaron a temperatura ambiente. Todas las suspensiones de dosificación sobrantes se retuvieron a 4°C según sea necesario para la siguiente dosis.
Se dosificaron dos grupos de ratones atímicos sin pelo de acuerdo con el protocolo que se muestra en la Tabla 34. Todas las dosis de sdAb de vehículo (control) y VHH13 bacteriana anti-STAT3 (SEQ Id NO: 3) se administraron por vía intraperitoneal (i.p.) tres veces al día. seis horas de diferencia durante catorce días, con dos dosis administradas el día 1 y una dosis administrada en la mañana del día 15 (tid x 14, primer día 2 dosis). El volumen de dosificación para el sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) bacteriano del vehículo fue de 0.478 ml por 20 gramos de peso corporal (23.88 ml/kg) y se ajustó al peso corporal de cada animal individual. El grupo 1 recibió el vehículo y sirvió como el grupo de referencia para el injerto y la progresión del tumor, así como el control. Al grupo 2 se le administró sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) a 1 mg/kg.
Tabla 34
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____ ____
Los tumores se midieron dos veces por semana, y cada animal se sacrificó cuando su neoplasia alcanzó el volumen final predeterminado (1000 mm3) o al final del estudio, el día 39, lo que ocurriera primero. Cuando un tumor alcanzó el volumen final, se documentó que el animal había sido sometido a eutanasia para la progresión del tumor (TP), con la fecha de la eutanasia. El tiempo hasta el punto final (TTE) para cada ratón se calculó mediante la siguiente ecuación:
TTE = Log-m (volumen final) - b
m
donde TTE se expresa en días, el volumen del punto final se expresa en mm3, b es la intersección y m es la pendiente de la línea obtenida por regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento de tumor transformado logarítmicamente. El conjunto de datos consta de la primera observación que excedió el volumen final utilizado en el análisis y las tres observaciones consecutivas que inmediatamente precedieron al logro de este volumen final. El TTE calculado generalmente es menor que la fecha de TP, el día en que el animal fue sacrificado por el tamaño del tumor. A los animales que no alcanzaron el volumen final se les asignó un valor TTFigual al último día del estudio (D39). Cualquier animal clasificado como muerto por causas relacionadas con el tratamiento (TR) se le asignaría un valor de TTE igual al día de la muerte. Cualquier animal clasificado como muerto por causas no relacionadas con el tratamiento (NTR) debía ser excluido de los cálculos de TTE.
La eficacia del tratamiento se determinó a partir del retraso en el crecimiento del tumor (TGD), que se define como el aumento de la TTE media, en días, para un grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control:
TGD = T - C
El porcentaje de aumento en la mediana TTE, en relación con el grupo de control, es
donde:
%TGD = T - C x 100
C
T = TTE mediana para un grupo de tratamiento, y
C = TTE mediana para el grupo de control designado.
La eficacia del tratamiento en cada grupo puede estar indicada por el volumen mediano del tumor, MTV(n), que se definió como el volumen mediano del tumor en el último día del estudio (D39) en el número de animales restantes (n) cuyos Los tumores no habían alcanzado el volumen final.
La eficacia del tratamiento también se puede determinar a partir de la incidencia y la magnitud de las respuestas de regresión observadas durante el estudio. El tratamiento puede causar regresión parcial (PR) o regresión completa (CR) del tumor en un animal. En una respuesta de PR, el volumen del tumor fue del 50% o menos de su volumen D1 durante tres mediciones consecutivas durante el curso del estudio, y fue igual o superior a 13.5 mm3 para una o más de estas tres mediciones. En una respuesta de CR, el volumen del tumor fue inferior a 13.5 mm3 durante tres mediciones consecutivas durante el curso del estudio. Cualquier animal con una respuesta de CR al final del estudio se clasificó adicionalmente como un sobreviviente libre de tumores (TFS).
Los animales se pesaron diariamente durante los primeros cinco días, luego dos veces a la semana durante el resto del estudio. Los ratones se observaron con frecuencia en busca de salud y signos evidentes de cualquier efecto secundario adverso relacionado con el tratamiento de la TR, y se registraron observaciones clínicas notables. La pérdida de peso corporal individual fue monitoreada por protocolo, y cualquier animal con una pérdida de peso superior al 30% para una medición, o superior al 25% para tres mediciones, debía ser sacrificado por motivos de salud como una muerte TR. Si se recupera el peso corporal medio del grupo, la dosis puede reanudarse en ese grupo, pero con una dosis más baja o un horario de dosificación menos frecuente. La toxicidad aceptable se definió como una pérdida de peso medio en el grupo de menos del 20% durante el estudio y no más de una muerte por TR entre los diez animales tratados, o el 10%. Cualquier régimen de dosificación que resulte en una mayor toxicidad se considera por encima de la dosis máxima tolerada (MTD). Una muerte debía clasificarse como TR si era atribuible a los efectos secundarios del tratamiento, como lo demuestran los signos clínicos y/o la necropsia, o también puede clasificarse como TR si se debe a causas desconocidas durante el período de dosificación o dentro de los 14 días de la última dosis. Una muerte se clasificó como NTR si había evidencia de que la muerte estaba relacionada con el modelo de tumor, en lugar de estar relacionada con el tratamiento. Las muertes por NTR se clasifican además como NTRa (debido a un accidente o error humano), NTRm (debido a la diseminación del tumor confirmada por necropsia por invasión o metástasis) y NTRu (debido a causas desconocidas).
Se empleó Prism 6.07 (GraphPad) para Windows para análisis gráficos. Las estadísticas no fueron empleadas debido al pequeño tamaño de la muestra.
Se construyó una gráfica de dispersión para mostrar los valores de TTE para ratones individuales, por grupo; esta gráfica muestra las muertes por NTR, que se excluyeron de todas las demás cifras. Animales individuales, grupo mediano y volumen tumoral medio se representaron como funciones del tiempo. Cuando un animal abandonó el estudio debido al tamaño del tumor o la muerte por TR, su volumen de tumor registrado final se incluyó con los datos utilizados para calcular la mediana del volumen en los puntos de tiempo posteriores. Se construyó una parcela de Kaplan-Meier para mostrar el porcentaje de animales en cada grupo que permanece en estudio versus tiempo. Las curvas de crecimiento tumoral se truncaron después de que ocurrieran dos muertes por TR en el mismo grupo. Los cambios de BW medios en el grupo durante el transcurso del estudio se representaron como porcentaje de cambio, ± EEM, desde el día 1. El crecimiento del tumor y las curvas de cambio de peso se truncaron después de que más de la mitad de los ratones evaluables en un grupo salieron del estudio. La figura 10 ilustra el volumen tumoral medio en el estudio.
La Tabla 35 proporciona las pérdidas medias de BW, las muertes TR y NTR para los ratones. Los signos clínicos se registraron cuando se observaron, como se muestra en las Tablas 36-38. No se produjeron muertes por TR durante el estudio. Las pérdidas de peso corporal fueron variables, severas para un animal en cada grupo, y resultaron de los efectos del estrógeno. Las observaciones clínicas que incluyeron pérdida de peso, trompas uterinas agrandados y cristales de vejiga estuvieron presentes en ambos grupos y también fueron atribuibles a los efectos del estrógeno. La toxicidad por estrógenos dio como resultado dos muertes no relacionadas con el tratamiento en cada grupo. El tratamiento evaluado en el estudio fue tolerado de forma aceptable.
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Debido a que dos de los cuatro ratones en el grupo de control y también en el grupo de tratamiento murieron por toxicidad por estrógenos, no se pudo determinar una conclusión estadística. Con los datos disponibles, la mediana del crecimiento del tumor y el volumen medio del tumor se redujeron en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control. Esta diferencia estuvo presente durante los 14 días de tratamiento, pero también hasta el día 25 del estudio. El grupo de control tardó 25 días en alcanzar un volumen tumoral de 1000 mm3, mientras que el grupo de tratamiento tardó 36 días en alcanzar un volumen tumoral de 1000 mm3. Esto sugiere que el sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) desacelera el crecimiento del tumor MCF-7 in vivo. A lo largo del estudio, tanto el grupo control como el grupo de tratamiento mantuvieron ponderaciones similares. Esto sugiere que el VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) sdAb no causó toxicidad con respecto a la pérdida de peso
Ejemplo 13: Tratamiento del cáncer de mama HER2+ (BT474) humano con sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) en ratones con xenoinjerto
En este ejemplo, la eficacia de la sdAb VHH13 bacteriana anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) se determinó en el xenoinjerto de tumor de mama humano BT474 en ratones CB.17 SCID.
Se trataron dos grupos de ratones CB.17 SCID de 8-12 semanas de edad que contenían xenografías de fragmentos de tumor BT474 de 1 mm3 en su flanco según el protocolo que se muestra en la Tabla 39 cuando los tumores alcanzaron un tamaño promedio de 100-150 mm3. Todas las dosis de vehículo (control de PBS) y VHH13 bacteriana anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3) sdAb (que se muestra en la Tabla 39 como SB-01) se administraron por vía intraperitoneal (i.p.) tres veces al día, con seis horas de diferencia durante catorce días, con dos dosis entregadas en el día 1 (tid * 14, primer día 2 dosis). El volumen de dosificación para el sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID n O: 3) bacteriano del vehículo fue de 0.478 ml por 20 gramos de peso corporal (23.88 ml/kg) y se ajustó al peso corporal de cada animal individual. El grupo 1 recibió el vehículo y sirvió como el grupo de referencia para el injerto y la progresión del tumor, así como el control. Al grupo 2 se le administró sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) a 1 mg/kg.
Tabla 39
Protocolo de estudio
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____ ____
Durante los primeros 14 días del estudio, el grupo de tratamiento recibió anti-STAT3 B VHH13 y el grupo de control solo recibió el vehículo. Como se muestra en la Tabla 40, durante este tiempo, el grupo de tratamiento mantuvo y ganó peso a lo largo del estudio, mientras que el grupo de control tuvo pesos más bajos durante todo el estudio. Esto sugiere que el grupo de tratamiento no experimentó toxicidad por el sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) con respecto a la pérdida de peso. Ambos grupos significaron que el volumen del tumor y el volumen mediano del tumor fueron similares, y exactamente iguales en el día 15 del estudio. En el día 59 del estudio, ambos grupos alcanzaron un volumen tumoral de 700 mm3 cúbicos. Esto sugiere que el sdAb VHH13 (SEQ ID NO: 3) bacteriano anti-STAT3 no redujo el crecimiento de tumores BT474 in vivo en comparación con el grupo de control. La figura 11 ilustra el volumen tumoral medio del grupo.
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Ejemplo 14: Producción de anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra sdAb VHH13 bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3)
En este ejemplo, se generaron anticuerpos monoclonales de ratón hacia el sdAb de la invención. Los animales utilizados fueron ratones hembra BALB/c, de 8 a 10 semanas. Se utilizó un adyuvante soluble en agua (CBL). E1HAT y el HT utilizados fueron de Sigma-Aldrich.
Se usó sdAb anti-STAT3 bacteriano VHH13 (SEQ ID NO: 3) para inmunizar tres ratones y formar estirpes celulares de hibridoma. Los ratones se inmunizaron tres veces, cada uno con adyuvante soluble en agua. En un ratón, el título de suero alcanzó 1/51200. El ratón se sacrificó y se formaron estirpes celulares de hibridoma fusionando células de bazo con la estirpe celular de mieloma Sp2/0.
Las células fusionadas se sembraron en placas de 96 pozos por dilución limitada. Las células fusionadas se cultivaron en presencia de HAT y se analizaron 651 clones individuales. De los 651 clones individuales, se identificaron 27 clones positivos que se unían específicamente al antígeno sdAb bacteriano anti-STAT3 (SEQ ID NO: 3).
Ejemplo 15: Citotoxicidad de los anticuerpos de un solo dominio KRAS (G12D) en células de cáncer pancreático humano PANC-1
Este ejemplo demuestra los efectos antiproliferativos del sdAb anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO: 2) usando la estirpe de células de cáncer de páncreas humano PANC-1. Para los experimentos, las células PANC-1 se cultivaron hasta que alcanzaron una confluencia del 90%. En ese momento, los estudios de proliferación se llevaron a cabo utilizando el ensayo MTT como se describió anteriormente.
Las propiedades antiproliferativas de sdAB anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO: 2) en células PANC-1 tres días después del tratamiento se muestran en la Tabla 41. Células PANC-1 tratadas con el anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO: 2) el sdAb mostró una inhibición de crecimiento promedio de 19.9 y 37.7 a 50.0 y 100 pg/ml, respectivamente.
Tabla 41
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De este modo, el sdAb anti-KRAS (G12D) (SEQ ID NO: 2) mostró una inhibición del crecimiento dependiente de la dosis en las células de cáncer pancreático humano PANC-1.
Ejemplo 16: Inhibición del crecimiento in vitro por sdAb de TNF-alfa
Este Ejemplo demuestra el desarrollo del método para determinar la concentración de TNF-alfa y la evaluación de la inhibición de la función de TNF-alfa. La concentración de TNF-alfa requerida para mostrar una modulación medible de la actividad en la estirpe celular de linfoblastos de pulmón humano U937 se evaluó mediante la cuantificación del ATP presente, que señala la presencia de células metabólicamente activas utilizando el ensayo de Viabilidad Celular Luminosa de Promega Cell Titer-GJo®.
Las células U937 se sembraron en una placa de microcultivo de poliestireno transparente de 96 pozos (placa de fondo plano de 96 pozos Corning® Costar®, Cat. # 3997) en un volumen total de 90 pL/pozo. Después de 24 horas de incubación en una incubadora humidificada a 37°C con 5% de CO2 y 95% de aire, se agregaron a cada pozo 5 pL de 20X, TNF-alfa diluido en serie en el medio de crecimiento por duplicado (10 pt dosis respuesta, mayor concentración 20 ng/mL). Además, se añadieron a cada pozo 5 pL de estaurosporina diluida 20X en medio de crecimiento por duplicado (concentración 1 nM).
Después de 24 horas de cultivo en presencia de agentes de prueba, la concentración de compuesto requerida para mostrar la modulación medible de la actividad de TNF-alfa en la estirpe celular U937 según se evaluó por la cuantificación del ATP presente. El porcentaje de crecimiento celular se calculó en relación con los pozos de control sin tratar. Todas las pruebas se realizaron por duplicado en cada nivel de concentración.
El valor de EC50 para los agentes de prueba se estimó utilizando Prism 6.05 ajustando los datos a la curva mediante la siguiente ecuación de cuatro parámetros logísticos:
Superior — Inferior
Y = n + Inferior
1 +

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido aislado, comprendiendo el polipéptido aislado un anticuerpo de dominio único anti-KRAS (sdAb) que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2.
2. Un polipéptido aislado de la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un anticuerpo de dominio único anti-KRAS (sdAb), en el que el sdAb anti-KRAS comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2.
3. El sdAb como se reivindica en la reivindicación 2, para uso como medicamento.
4. El sdAb para el uso como se reivindica en la reivindicación 3, en el que el sujeto es un mamífero; preferiblemente un humano.
5. El sdAb para el uso como se reivindica en la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que el sdAb se administra en combinación con uno o más compuestos, preferiblemente en el que el uno o más compuestos es un inhibidor de la transcripción.
6. El sdAb para el uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el medicamento es para administración intravenosa, administración intramuscular, administración oral, administración rectal, administración enteral, administración parenteral, administración intraocular, administración subcutánea, administración transdérmica, administración como gotas para los ojos, administración en forma de aerosol nasal, administración por inhalación o nebulización, administración tópica, y administración como fármaco implantable.
7. Un método para medir los niveles de un sdAb como se reivindica en la reivindicación 2 en una muestra de un sujeto, comprendiendo el método los pasos de:
a) generar un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra uno o más dominios de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos como se expone en la SEQ ID NO: 2;
b) realizar un inmunoensayo cuantitativo en una muestra del sujeto, en el que el inmunoensayo cuantitativo puede comprender opcionalmente un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), marcado específico de analitos y ensayo de recaptura (SALRA), cromatografía líquida, espectrometría de masas, clasificación de células activadas por fluorescencia, o una combinación de los mismos, con el anticuerpo monoclonal de ratón y la muestra para determinar la cantidad de sdAb en un sujeto; y
c) cuantificar la cantidad de sdAb en el sujeto.
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