ES2913200T3 - Polipéptidos - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido que comprende un dominio variable de la cadena de inmunoglobulina que se une a TNF- alfa, donde el dominio variable de la cadena de inmunoglobulina comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1-CDR3) y cuatro regiones de estructura (FR1-FR4), donde: (a) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 3; (b) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 63 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70; (c) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 64 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70; (d) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 65 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70, (e) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 59, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 66 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 71; (f) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 60, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 67, y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70; (g) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 67 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70; (h) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 68 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 72; (i) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 69 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70; (j) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 62 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70; (k) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 69 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 3; (l) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70; (m) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 61 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70 o (n) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 62 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 3 y donde el polipéptido neutraliza la citotoxicidad del TNF-alfa humano en el ensayo L929 normal con una EC50 de 0,7 nM o menos.

Description

DESCRIPCIÓN
Polipéptidos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden un dominio variable de cadena de inmunoglobulina (ICVd - Immunoglobulin Chain Variable Domain) (o 'dominio variable') que se une al Factor de Necrosis Tumoral alfa ('TNF-alfa', 'TNF-a' o 'TNF' - Tumour Necrosis Factor), así como a construcciones y composiciones farmacéuticas que comprenden estos polipéptidos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El factor de necrosis tumoral alfa es una citocina proinflamatoria homotrimérica involucrada en la inflamación sistémica que existe tanto en forma soluble como unida a la membrana. El TNF-alfa es secretado predominantemente por monocitos y macrófagos, pero también es secretado por líneas de células tumorales, así como por linfocitos T c D4+ y CD8+ de sangre periférica y algunas líneas de células T y B cultivadas. El TNF-alfa se ha implicado en enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, infecciones virales, bacterianas y parasitarias, tumores malignos, y/o enfermedades neurodegenerativas y es una diana para la terapia biológica específica en enfermedades autoinmunes/autoinflamatorias como la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn.
La enfermedad de Crohn, también conocida como síndrome de Crohn y enteritis regional, es un tipo de enfermedad inflamatoria intestinal que causa una amplia variedad de síntomas. Causa principalmente dolor abdominal, diarrea, vómitos. y/o pérdida de peso, pero también puede causar complicaciones fuera del tracto gastrointestinal (GIT -gastrointestinal tract), como anemia, erupciones cutáneas, artritis, inflamación de los ojos, cansancio y falta de concentración (Baumgart y col. 2012 The Lancet 380(9853):1590-605). La enfermedad de Crohn es una enfermedad gastrointestinal actualmente incurable de por vida que es difícil de controlar con las terapias convencionales. La enfermedad de Crohn se analiza con más detalle a continuación en el apartado de "enfermedades autoinmunes".
Un inhibidor de TNF-alfa que tenga suficiente especificidad para TNF-alfa puede ser un fármaco profiláctico o terapéutico efectivo para impedir o tratar enfermedades como la enfermedad de Crohn, donde se ha implicado al TNF-alfa como una citocina clave que impulsa la patología observada.
Terapias basadas en anticuerpos tienen un potencial significativo como tratamientos efectivos para enfermedades autoinmunes porque tienen una alta especificidad para su diana y una baja toxicidad inherente. Se han descrito procedimientos para tratar enfermedades autoinmunes mediante la administración de un anticuerpo que se une al TNF-alfa (Kamm y col. 2011 Inflamm Bowel Dis 17:2366-91).
Tres anticuerpos anti-TNF-alfa, infliximab (nombre comercial Remicade), adalimumab (nombre comercia1Humira) y certolizumab (o 'certolizumab pegol', ambos nombres comerciales Cimzia) se usan clínicamente para el tratamiento de la enfermedad de Crohn; sin embargo, estos anticuerpos generalmente se consideran inadecuados para administración como agentes terapéuticos orales debido a su inherente inestabilidad y susceptibilidad a la degradación proteolítica por parte del sistema digestivo, las proteasas inflamatorias presentes en los sitios de patología en el tracto intestinal y la microflora intestinal. Por lo tanto, estos agentes deben administrarse mediante infusión intravenosa o inyección subcutánea, lo que requiere capacitación especializada para el uso de una jeringa o aguja hipodérmica de manera correcta y segura. Estos agentes también requieren un equipo estéril, una formulación líquida del polipéptido terapéutico, un vial envasado de dicho polipéptido en una forma estéril y estable y un sitio adecuado en el sujeto para la entrada de la aguja. Los sujetos comúnmente experimentan estrés psicológico antes de recibir una inyección y dolor mientras reciben una inyección. El tratamiento a largo plazo con estos anticuerpos sistémicos anti-TNF-alfa conlleva mayores riesgos de infección grave y cáncer. Junto con los altos costos de producción, estos factores actualmente restringen el uso de estos agentes a pacientes con enfermedades más graves.
Varios fármacos antiinflamatorios e inmunosupresores de molécula pequeña también se encuentran actualmente en desarrollo clínico para la enfermedad de Crohn (Danese 2012 Gut 61:918-932 y Shealy y col 2010 mAbs 2:428-439). Aunque estos fármacos se administran por vía oral, muchos se absorberán sistémicamente después de la administración y, por lo tanto, pueden tener acciones inmunosupresoras sistémicas que no están relacionadas con las acciones contra las lesiones del tracto gastrointestinal. Además, como las moléculas pequeñas carecen de la especificidad de los anticuerpos, el riesgo de efectos secundarios significativos fuera de la diana sigue siendo alto.
La enfermedad de Crohn es principalmente una enfermedad del tracto gastrointestinal. La producción de TNF-alfa se localiza en las células presentes dentro de los tejidos de la mucosa y la submucosa y esto impulsa los procedimientos inflamatorios crónicos dentro de la pared intestinal y el reclutamiento de células inflamatorias adicionales que son responsables del desarrollo de la inmunopatología de la enfermedad (van Deventer 1999 Ann Rheum Dis 58 (Suplemento I): I114-I120). La capacidad de administrar un agente terapéutico oral con alta selectividad para TNF-alfa, pero con exposición y actividad limitadas al intestino, puede ofrecer una eficacia similar a la de los anticuerpos anti-TNF-alfa inyectables, combinado con mejoras significativas en la seguridad debido a la reducción de la exposición sistémica. .
WO 2004/041862, WO 2006/122786 y Coppieters y col 2006 Arthritis & Rheumatism 54(6): 1856-1866 describen anticuerpos de un solo dominio dirigidos contra TNF-alfa y aspectos relacionados. La secuencia mencionada en WO 2006/122786 como "TNF1", "PMP1C2" o "SEQ ID NO: 52") se caracteriza más adelante.
Junrong Yan y col. (Journal of Translational Medicine, vol. 12, no.1 pg 343 (2014)) divulga la construcción de una biblioteca de nanocuerpos presentados en fagos sintéticos con regiones CDR3 aleatorias por casetes de trinucleótidos para aplicaciones de diagnóstico. Kamm y col. (Inflammatory Bowel Diseases, vol. 17, no. 11, pgs 2366-2391 (2011)) describe la aplicación práctica de terapia anti-TNF para la enfermedad de Crohn luminal. Rudikoff y col. (Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 79, páginas 1979-1983 (1982)) describe el impacto de una sustitución de aminoácidos en CDR1 de una proteína de unión. Winkler y col. (The Journal of Immunology, vol. 165, n° 8, páginas 4505-4514 (2000)) describe el impacto de sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo anti-p24 (VIH-1). Caldas y col. (Molecular Immunology, vol. 39, no. 15, páginas 941-952 (2003)) describe el impacto de sustituir un residuo de estructura específica en un anticuerpo anti-CD18.
Los polipéptidos de la presente invención pueden, al menos en algunas realizaciones, tener una o más de las siguientes ventajas en comparación con las sustancias anti-TNF-alfa de la técnica anterior:
(i) mayor afinidad por TNF-alfa;
(ii) mayor especificidad por TNF-alfa;
(iii) mayor capacidad de neutralización contra TNF-alfa;
(iv) mayor reactividad cruzada con TNF-alfa de diferentes especies tales como humanos y monos cynomolgus; (v) mayor reactividad cruzada con las formas soluble y de membrana de TNF-alfa;
(vi) inmunogenicidad reducida, por ejemplo cuando se administra a un ratón, mono cynomolgus o ser humano; (vii) mayor estabilidad en presencia de proteasas, por ejemplo (a) en presencia de proteasas que se encuentran en el intestino grueso y/o delgado y/o proteasas inflamatorias de EII (Enfermedad Inflamatoria Intestinal), por ejemplo, tripsina, quimotripsina, MMP3, m MP10, MMP12, otras MMP y catepsina y/o (b) en presencia de proteasas de la microflora intestinal comensal y/o bacterias patógenas, secretadas y/o liberadas activamente por lisis de células microbianas que se encuentran en intestino grueso y/o delgado;
(viii) mayor estabilidad a la degradación de la proteasa durante la producción (por ejemplo, resistencia a las proteasas de levadura)
(ix) mayor idoneidad para la administración por vía oral;
(x) mayor idoneidad para la administración local en el tracto intestinal y la lámina propia después de la administración por vía oral;
(xi) mayor idoneidad para la expresión, en un hospedador heterólogo tal como bacterias tales como Escherichia coli, o una levadura perteneciente a los géneros Aspergillus, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia, tales como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris;
(xii) idoneidad y propiedades mejoradas para el uso en un producto farmacéutico;
(xiii) idoneidad y propiedades mejoradas para su uso en un alimento funcional;
(xiv) penetración tisular mejorada tal como penetración del epitelio de la mucosa colónica inflamada y tejidos submucosos para acceder a la lámina propia submucosa;
(xv) permanecer sustancialmente activo después de (a) congelarse y descongelarse y/o (b) después del almacenamiento a largo plazo en formato liofilizado, líquido/crema a, por ejemplo, 37 o 50 grados C;
(xvi) disminución de la inmunogenicidad en humanos, por ejemplo, debido a una mayor similitud de secuencia con las inmunoglobulinas humanas;
(xvii) mayor idoneidad para formatear en un formato multiespecífico;
(xviii) unión a nuevos epítopos.
Las ventajas (i) a (xviii) anteriores pueden materializarse potencialmente mediante los polipéptidos de la presente invención en un formato monovalente o en un formato multivalente tal como un formato bicabezal (por ejemplo, formatos homobicabeza o heterobicabeza).
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Los presentes inventores han producido polipéptidos sorprendentemente ventajosos que comprenden dominios variables de cadena de inmunoglobulina que se unen a TNF-alfa. Estos polipéptidos en particular se benefician de una potencia sorprendentemente alta. También neutralizan las formas soluble y de membrana del TNF-alfa, son capaces de reaccionar de forma cruzada con el TNF-alfa del mono cynomolgus y permanecen estables con la exposición a la tripsina, la quimotripsina y/o proteasas del intestino delgado y grueso. En una realización, estos polipéptidos se han sometido a una mejora adicional mediante ingeniería. Estos polipéptidos mejorados se benefician de las ventajas anteriores, retienen su actividad neutralizadora de TNF-alfa durante el paso por el tracto intestinal y resisten aún más la degradación y/o inactivación por proteasas del tracto intestinal, por ejemplo, proteasas digestivas, inflamatorias y microbianas de, por ejemplo, múltiples especies de mamíferos (roedores, cerdos, primates no humanos y humanos).
Puede esperarse que estos polipéptidos tengan una utilidad particular en la prevención o tratamiento de enfermedades autoinmunes y/o inflamatorias tales como enfermedad inflamatoria intestinal (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa), o en la prevención o tratamiento de mucositis, particularmente cuando se administran por vía oral.
La presente invención proporciona un polipéptido que comprende un dominio variable de cadena de inmunoglobulina que se une a TNF-alfa, donde el dominio variable de cadena de inmunoglobulina comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1-CDR3) y cuatro regiones de estructura (FR1-FR4), donde:
(a) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID No : 3;
(b) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 63 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(c) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 64 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(d) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 65 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70,
(e) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 59, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 66 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 71;
(f) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 60, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 67, y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(g) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 67 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(h) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 68 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 72;
(i) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 69 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(j) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 62 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(k) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 69 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 3;
(l) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(m) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 61 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID No : 70 o (n) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 62 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 3
y donde el polipéptido neutraliza la citotoxicidad del TNF-alfa humano en el ensayo L929 normal con una EC50 de 0,7 nM o menos.
También se proporciona un polipéptido que consite en SEQ ID NO: 8.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 - % de actividad neutralizadora de TNF-alfa de sobrenadantes periplásmicos y muestras purificadas cuando se exponen y no se exponen a tripsina y quimotripsina
Figura 2A - Neutralización de hs-TNF-alfa por q 65B1, Q65C7, Q62E10 y adalimumab en el ensayo indicador HEK-Nf-kB-SEAP
Figura 2B - Neutralización de hs-TNF-alfa por Q65B1 y Q65D3
Figura 3 - Dominios variables de cadena de inmunoglobulina en digeridos fecales humanos y de intestino delgado de ratón
Figura 4A - Neutralización de hs-TNF-alfa por ID32F, ID34F, Q65B1 e infliximab (primer experimento)
Figura 4B - Neutralización de hs-TNF-alfa por ID32F, ID34F y Q65B1 (segundo experimento)
Figura 4C Neutralización de hs-TNF-alfa por ID37F, ID38F y Remicade (segundo experimento)
Figura 5A - Estabilidad de ID34F e ID25F en proteasas de EII
Figura 5B - Estabilidad de etanercept y adalimumab en proteasas de EII
Figura 5C - Estabilidad de infliximab en proteasas de EII
Figura 6 - Neutralización de h-TNF-alfa por polipéptidos anti-TNF-alfa de la técnica anterior
Figura 7 - Luminal calculado [anti-TNF ICVD] en secciones del tracto gastrointestinal del mono cynomolgus Figura 8 - % total de recuperación de anti-TNF ICVD del tracto gastrointestinal del mono cynomolgus
Figura 9 - Datos de ELISA OD450 de competencia de Humira
Figura 10 - Concentración de anti-TNF ICVd en heces agrupadas de monos cynomolgus
Figura 11 - ICVD anti-TNF calculado recuperado de heces agrupadas de mono cynomolgus
DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS
SEQ ID NO: 1 - Secuencia polipeptídica de ID38F CDR1
SEQ ID NO: 2 - Secuencia polipeptídica de ID38F CDR2
SEQ ID NO: 3 - Secuencia de polipéptido de ID38F CDR3
SEQ ID NO: 4 - Secuencia de polipéptido de ID38F FR1
SEQ ID NO: 5 - Secuencia polipeptídica de ID38F FR2
SEQ ID NO: 6 - Secuencia polipeptídica de ID38F FR3
SEQ ID NO: 7 - Secuencia polipeptídica de ID38F FR4
SEQ ID NO: 8 - Secuencia polipeptídica de ID38F
SEQ ID NO: 9 - Secuencia polipeptídica de TNF-alfa humano soluble (monómero)
SEQ ID NO: 10 - Secuencia polipeptídica de TNF-alfa humano unido a membrana (monómero)
SEQ ID NO: 11 - Secuencia polipeptídica de TNF-alfa de mono cymologus soluble (monómero)
SEQ ID NO: 12 - Secuencia polipeptídica de TNF-alfa de mono cynomolgus unido a membrana (monómero) SEQ ID NO: 13 - Secuencia polipeptídica de TNF-alfa de ratón soluble (monómero)
SEQ ID NO: 14 - Secuencia polipeptídica de TNF-alfa de ratón unido a membrana (monómero)
SEQ ID NO: 15 - Secuencia polipeptídica de Q62E10 CDR1
SEQ ID NO: 16 - Secuencia polipeptídica de Q62E10 CDR2
SEQ ID NO: 17 - Secuencia polipeptídica de Q62E10 CDR3
SEQ ID NO: 18 - Secuencia polipeptídica de Q62E10 FR1
SEQ ID NO: 19 - Secuencia polipeptídica de Q62E10 FR2
SEQ ID NO: 20 - Secuencia polipeptídica de Q62E10 FR3
SEQ ID NO: 21 - Secuencia polipeptídica de Q62E10 FR4
SEQ ID NO: 22 - Secuencia polipeptídica de Q62E10
SEQ ID NO: 23 - Secuencia polipeptídica de Q65F2
SEQ ID NO: 24 - Secuencia polipeptídica de Q65F3
SEQ ID NO: 25 - Secuencia polipeptídica de Q62F2
SEQ ID NO: 26 - Secuencia polipeptídica de Q65G1
SEQ ID NO: 27 - Secuencia polipeptídica de Q65H6
SEQ ID NO: 28 - Secuencia polipeptídica de Q65F1
SEQ ID NO: 29 - Secuencia polipeptídica de Q65D1
SEQ ID NO: 30 - Secuencia polipeptídica de Q65C7
SEQ ID NO: 31 - Secuencia polipeptídica de Q65D3
SEQ ID NO: 32 - Secuencia polipeptídica de Q65B1
SEQ ID NO: 33 - Secuencia polipeptídica de Q65F6
SEQ ID NO: 34 - Secuencia polipeptídica de Q65F11
SEQ ID NO: 35 - Secuencia polipeptídica de Q65E12
SEQ ID NO: 36 - Secuencia polipeptídica de Q65C12
SEQ ID NO: 37 - Secuencia polipeptídica de Q65A6
SEQ ID NO: 38 - Secuencia polipeptídica de Q65A3
SEQ ID NO: 39 - Secuencia polipeptídica de Q62F10
SEQ ID NO: 40 - Secuencia polipeptídica de Q62F11
SEQ ID NO: 41 - Secuencia polipeptídica de ID7F-EV
SEQ ID NO: 42 - Secuencia polipeptídica de ID8F-EV
SEQ ID NO: 43 - Secuencia polipeptídica de ID9F-EV
SEQ ID NO: 44 - Secuencia polipeptídica de ID13F-EV
SEQ ID NO: 45 - Secuencia polipeptídica de ID14F-EV
SEQ ID NO: 46 - Secuencia polipeptídica de ID15F-EV
SEQ ID NO: 47 - Secuencia polipeptídica de ID22F
SEQ ID NO: 48 - Secuencia polipeptídica de ID23F
SEQ ID NO: 49 - Secuencia polipeptídica de ID24F
SEQ ID NO: 50 - Secuencia polipeptídica de ID25F
SEQ ID NO: 51 - Secuencia polipeptídica de ID26F
SEQ ID NO: 52 - Secuencia polipeptídica de ID27F
SEQ ID NO: 53 - Secuencia polipeptídica de ID28F
SEQ ID NO: 54 - Secuencia polipeptídica de ID29F
SEQ ID NO: 55 - Secuencia polipeptídica de Q62E10-DVQLV
SEQ ID NO: 56 - Secuencia polipeptídica de ID34F
SEQ ID NO: 57 - Secuencia polipeptídica de ID37F
SEQ ID NO: 58 - Secuencia polinucleotídica del Cebador 3' con sitio Spe
SEQ ID NO: 59 - Secuencia polipeptídica de Q65F1 CDR1
SEQ ID NO: 60 - Secuencia polipeptídica de Q65D1 CDR1
SEQ ID NO: 61 - Secuencia polipeptídica de ID27F CDR2
SEQ ID NO: 62 - Secuencia polipeptídica de ID28F CDR2
SEQ ID NO: 63 - Secuencia polipeptídica de Q65F2 CDR2
SEQ ID NO: 64 - Secuencia polipeptídica de Q65F3 CDR2
SEQ ID NO: 65 - Secuencia polipeptídica de Q62F2 CDR2
SEQ ID NO: 66 - Secuencia polipeptídica de Q65F1 CDR2
SEQ ID NO: 67 - Secuencia polipeptídica de Q65D1 CDR2
SEQ ID NO: 68 - Secuencia polipeptídica de Q65D3 CDR2
SEQ ID NO: 69 - Secuencia polipeptídica de Q65B1 CDR2
SEQ ID NO: 70 - Secuencia polipeptídica de Q65F2 CDR3
SEQ ID NO: 71 - Secuencia polipeptídica de Q65F1 CDR3
SEQ ID NO: 72 - Secuencia polipeptídica de Q65D3 CDR3
SEQ ID NO: 73 - Secuencia polipeptídica de Q65F6 CDR2
SEQ ID NO: 74 - Secuencia polipeptídica de Q65F11 CDR2
SEQ ID NO: 75 - Secuencia polipeptídica de Q65C12 CDR2
SEQ ID NO: 76 - Secuencia polipeptídica de Q65A6 CDR2
SEQ ID NO: 77 - Secuencia polipeptídica de Q65A3 CDR2
SEQ ID NO: 78 - Secuencia polipeptídica de Q65F6 CDR3
SEQ ID NO: 79 - Secuencia polipeptídica de Q65F11 CDR3
SEQ ID NO: 80 - Secuencia polipeptídica de Q62F10 CDR3
SEQ ID NO: 81 - Secuencia polinucleotídica de M13.rev
SEQ ID NO: 82 - Secuencia polinucleotídica de M13.fw
SEQ ID NO: 83- Secuencia de codificación de polinucleótidos de ID38F, codones optimizados para la expresión de levadura
SEQ ID NO: 84- Secuencia de codificación de polinucleótidos de Q62E10, codones optimizados para la expresión de levadura
SEQ ID NO: 85- Secuencia de codificación de polinucleótidos de ID38F, codones optimizados para la expresión de E. coli
SEQ ID NO: 86- Secuencia de codificación de polinucleótidos de Q62E10, codones optimizados para la expresión de E. coli
SEQ ID NO: 87 - Polinucleótido que consiste en un marco de lectura abierto ID38F para la expresión de E. coli (PeIB líder para etiqueta c-myc-6His 2x codón de terminación)
SEQ ID NO: 88- Polinucleótido que consiste en un marco de lectura abierto ID38F para la expresión de E. coli (PelB líder para etiqueta Flag-6His 2x codón de terminación)
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Polipéptidos que incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que incluyen VH y VHH
Un anticuerpo convencional o inmunoglobulina (Ig) es una proteína que comprende cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L). Cada cadena se divide en una región constante y un dominio variable. Los dominios variables de cadena pesada se abrevian en esta invención como VHC, y los dominios variables de cadena ligera (L) se abrevian en esta invención como VLC. Estos dominios, los dominios relacionados con los mismos y los dominios derivados de los mismos, se denominan en esta invención dominios variables de cadena de inmunoglobulina. Los dominios VHC y VLC se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas "regiones de estructura" ("FR"). Las regiones determinantes de estructura y complementariedad se han definido con precisión (Kabat y col 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE. UU., NIH Número de Publicación 91-3242). En un anticuerpo convencional, cada VHC y VLC se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. El tetrámero de anticuerpo convencional de dos cadenas de inmunoglobulina pesada y dos cadenas de inmunoglobulina ligera se forma con las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera interconectadas por, por ejemplo, enlaces disulfuro, y las cadenas pesadas conectadas de forma similar. La región constante de la cadena pesada incluye tres dominios, CH1, CH2 y CH3. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. El dominio variable de las cadenas pesadas y el dominio variable de las cadenas ligeras son dominios de unión que interactúan con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos habitualmente median la unión del anticuerpo a los tejidos o factores del hospedador, lo que incluye diversas células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. El término anticuerpo incluye inmunoglobulinas de tipo IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de las mismas), donde las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipo kappa o lambda. La estructura general de los anticuerpos de inmunoglobulina gamma (IgG) ensamblados a partir de dos polipéptidos idénticos de cadena pesada (H) y dos idénticos de cadena ligera (L) está bien establecida y altamente conservada en mamíferos (Padlan 1994 Mol Immunol 31:169-217).
Una excepción a la estructura de anticuerpos convencional se encuentra en los sueros de Camelidae. Además de los anticuerpos convencionales, estos sueros poseen anticuerpos IgG especiales. Estos anticuerpos IgG, conocidos como anticuerpos de cadena pesada (HCAb), carecen del polipéptido de cadena L y carecen del primer dominio constante (CH1). En su región del extremo N, la cadena H de la proteína homodimérica contiene un dominio variable de cadena de inmunoglobulina dedicado, denominado VHH, que sirve para asociarse con su antígeno afín (Muyldermans 2013 Annu Rev Biochem 82:775-797, Hamers-Casterman y col 1993 Nature 363(6428):446-448, Muyldermans y col 1994 Protein Eng 7(9):1129-1135).
Un fragmento de unión a antígeno (o "'fragmento de anticuerpo" o "fragmento de inmunoglobulina") como se usa en esta invención se refiere a una porción de un anticuerpo que se une específicamente a TNF-alfa (p. ej., una molécula en la que una o más cadenas de inmunoglobulina no están de longitud completa, pero que se une específicamente a TNF-alfa). Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos por la expresión «fragmento de unión a antígeno» incluyen:
(i) un fragmento Fab (un fragmento monovalente que consiste en los dominios VLC, VHC, CL y CH1);
(ii) Un fragmento F(ab')2 (un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región bisagra);
(iii) un fragmento Fd (que consiste en los dominios VHC y CH1);
(iv) un fragmento Fv (que consiste en los dominios VLC y VHC de un solo brazo de un anticuerpo);
(v) un fragmento scFv (que consiste en dominios VLC y VHC unidos, utilizando procedimientos recombinantes, mediante un enlazador sintético que les permite formar una única cadena proteica en la que las regiones VLC y VHC se emparejan para formar moléculas monovalentes);
(vi) un VH (un dominio variable de cadena de inmunoglobulina que consiste en un dominio VHC (Ward y col Nature 1989341:544-546);
(vii) un VL (un dominio variable de cadena de inmunoglobulina que consiste en un dominio VLC);
(viii) un V-NAR (un dominio variable de cadena de inmunoglobulina que consiste en un dominio VHC de condrictios IgNAR (Roux y col 1998 Proc Natl Acad Sci USA 95:11804-11809 y Griffiths y col 2013 Antibodies 2:66-81)
(ix) un VHH.
El número total de residuos de aminoácidos en un VHH o VH puede estar en la región de 110-130, es adecuadamente de 112-120 y es más adecuado de 115.
Los dominios variables de la cadena de inmunoglobulina de la invención pueden obtenerse, por ejemplo, preparando un ácido nucleico que codifica un dominio variable de la cadena de inmunoglobulina usando técnicas para la síntesis de ácidos nucleicos, seguido de la expresión del ácido nucleico así obtenido. Según una realización específica, un dominio variable de la cadena de inmunoglobulina de la invención no tiene una secuencia de aminoácidos que sea exactamente igual a (es decir, comparte el 100 % de identidad de secuencia con) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de origen natural tal como un dominio VH o VHH de un anticuerpo de origen natural.
La sustitución de al menos un residuo de aminoácido en la región de estructura de un dominio variable de inmunoglobulina no humana con el residuo correspondiente de un dominio variable humano es humanización. La humanización de un dominio variable puede reducir la inmunogenicidad en humanos.
Adecuadamente, el polipéptido de la presente invención consiste en un dominio variable de cadena de inmunoglobulina. Adecuadamente, el polipéptido de la presente invención es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. Adecuadamente, el fragmento de anticuerpo es un VHH, un VH, un VL, un V-NAR, un fragmento Fab, un VL o un fragmento F(ab')2 (tal como un VHH o VH, más adecuadamente un VHH).
Especificidad, afinidad, avidez y reactividad cruzada
La especificidad se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que se puede unir un polipéptido de unión a antígeno en particular. La especificidad de un polipéptido de unión a antígeno es la capacidad del polipéptido de unión a antígeno para reconocer un antígeno particular como una entidad molecular única y distinguirlo de otro.
La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un polipéptido de unión a antígeno (Kd), es una medida de la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión a antígeno en el polipéptido de unión a antígeno: cuanto menor sea el valor de Kd, más fuerte será la fuerza de unión entre un determinante antigénico y el polipéptido de unión al antígeno (alternativamente, la afinidad también se puede expresar como la constante de afinidad (Ka), que es 1/Kd). La afinidad se puede determinar mediante procedimientos conocidos, dependiendo del antígeno específico de interés.
La avidez es la medida de la fuerza de unión entre un polipéptido de unión a antígeno y el antígeno pertinente. La avidez está relacionada tanto con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión al antígeno en el polipéptido de unión a antígeno y el número de sitios de unión pertinentes presentes en el polipéptido de unión a antígeno.
Adecuadamente, los polipéptidos de unión a antígeno de la invención se unirán con una constante de disociación (Kd) de 10'6 a 10-12 M, más adecuadamente 10'7 a 10'12 M, más adecuadamente 10'8 a 10'12 M y más adecuadamente 10' 9 a 10-12 M.
Se considera que cualquier valor de Kd inferior a 10‘6 indica unión. La unión específica de un polipéptido de unión a antígeno a un antígeno o determinante antigénico puede determinarse de cualquier manera adecuada conocida, incluyendo, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tales como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competencia tipo sándwich, y las diferentes variantes de los mismos conocidas en la técnica.
Un polipéptido anti-TNF-alfa, un polipéptido que interactúa con TNF-alfa o un polipéptido contra el TNF-alfa son todos polipéptidos que se unen efectivamente al TNF-alfa. El término "se une a TNF-alfa" significa unirse a TNF-alfa trimérico, unirse a un monómero de TNF-alfa y/o unión a una porción de un monómero de TNF-alfa.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención se unirá tanto al TNF-alfa soluble como al de membrana. Adecuadamente, el polipéptido de la invención se unirá al TNF-alfa humano. Más adecuadamente, el polipéptido de la invención se unirá tanto al TNF-alfa humano como al menos al de un primate adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en TNF-alfa de mandril, TNF-alfa de tití, TNF-alfa de cynomolgus y TNF-alfa de rhesus. Más adecuadamente, el polipéptido de la invención se une tanto al TNF-alfa humano como al de cynomolgus.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención neutralizará tanto al TNF-alfa soluble como al de membrana. Adecuadamente, el polipéptido de la invención neutralizará al TNF-alfa humano. Más adecuadamente, el polipéptido de la invención neutralizará tanto al TNF-alfa humano como al menos al de un primate adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en TNF-alfa de mandril, TNF-alfa de tití, TNF-alfa de cynomolgus y TNF-alfa de rhesus. Más adecuadamente, el polipéptido de la invención neutraliza tanto al TNF-alfa humano como al de cynomolgus.
Adecuadamente, TNF-alfa es un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 9, más adecuadamente TNF-alfa es un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 9. Adecuadamente, TNF-alfa es un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 10, más adecuadamente TNF-alfa es un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 10. Adecuadamente, TNF-alfa es un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 11, más adecuadamente TNF-alfa es un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 11. Adecuadamente, TNF-alfa es un polipéptido que comprende SEQ ID NO: 12, más adecuadamente TNF-alfa es un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 12.
Los polipéptidos capaces de reaccionar con TNF-alfa de humanos y TNF-alfa de otra especie ("reacción cruzada"), como con TNF-alfa de mono cynomolgus, son ventajosos porque permiten que los estudios preclínicos se realicen más fácilmente en modelos animales.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención es aislado. Un polipéptido "aislado" es uno que se elimina de su entorno original. Por ejemplo, un polipéptido natural de la invención se aísla si se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural.
Potencia, inhibición y neutralización
La “potencia” es una medida de la actividad del fármaco expresada en términos de la cantidad necesaria para producir un efecto de una intensidad determinada. Un agente muy potente provoca una mayor respuesta a bajas concentraciones en comparación con un agente de menor potencia que provoca una respuesta menor a bajas concentraciones. La potencia es una función de la afinidad y la eficacia. La eficacia se refiere a la capacidad del agente terapéutico para producir una respuesta biológica al unirse a un ligando diana y la magnitud cuantitativa de esta respuesta. El término media concentración efectiva máxima (EC50) se refiere a la concentración de un agente terapéutico que provoca una respuesta a mitad de camino entre la línea de base y la máxima después de un tiempo de exposición especificado. El agente terapéutico puede causar inhibición o estimulación. Se usa comúnmente, y se usa en esta invención, como una medida de potencia.
Un polipéptido neutralizante para el objeto de la invención es un polipéptido que se une a TNF-alfa, inhibiendo la unión de TNF-alfa a uno o ambos de sus receptores afines (por ejemplo, TNFR1, TNFR2) según medido por ELISA. Alternativamente, o además, un polipéptido neutralizante para el objeto de la invención es un polipéptido que defiende una célula de los efectos del TNF-alfa, por ejemplo, inhibiendo el efecto biológico del TNF-alfa. Convencionalmente, los productos de anticuerpos terapéuticos anti-TNF-alfa han utilizado una línea celular murina L929 con un punto final de muerte celular como ensayo de neutralización (Humphreys y Wilson 1999 Cytokine 11(10):773-782). Los procedimientos para este propósito que utilizan la línea celular murina L929 incluyen lo siguiente:
Ensayo L929 de concentración fija: se puede usar un ensayo L929 de concentración fija para una indicación relativamente rápida de la capacidad de una concentración fija de polipéptido, por ejemplo, contenido dentro de extracto periplásmico para neutralizar los efectos de la citotoxicidad del TNF-alfa (como se detalla en la parte 2.2.3 de la sección de Ejemplos).
Ensayo L929 normal - utilizando concentraciones conocidas de polipéptido anti-TNF-alfa, se puede realizar un ensayo L929 normal (como se detalla en las partes 3.2 a 3.2.3 de la sección de Ejemplos) para evaluar la capacidad de un polipéptido anti-TNF-alfa para neutralizar los efectos de la citotoxicidad del TNF-alfa determinando la media concentración efectiva máxima (EC50) del polipéptido anti-TNF-alfa.
Adecuadamente, el polipéptido o construcción de la invención neutraliza la citotoxicidad del TNF-alfa humano en el ensayo L929 normal con una EC50 de 0,6 nM o menos, como 0,5 nM o menos, como 0,4 nM o menos, como 0,3 nM o menos, como como 0,2 nM o menos, como 0,1 nM o menos, como 0,09 nM o menos, como 0,08 nM o menos, como 0,07 nM o menos, como 0,06 nM o menos, como 0,05 nM o menos, como 0,04 nM o menos.
Adecuadamente, el polipéptido o construcción de la invención neutraliza la citotoxicidad del TNF-alfa de cynomolgus en el ensayo L929 normal con una EC50 de 1 nM o menos, como 0,9 nM o menos, como 0,8 nM o menos, como 0,7 nM o menos, como como 0,6 nM o menos, como 0,5 nM o menos, como 0,4 nM o menos, como 0,3 nM o menos, como 0,2 nM o menos, como 0,1 nM o menos, como 0,09 nM o menos, como 0,08 nM o menos, como 0,07 nM o menos, como 0,06 nM o menos, como 0,05 nM o menos, como 0,04 nM o menos, como 0,03 nM o menos, como 0,02 nM o menos, como 0,01 nM o menos.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención inhibe la unión de TNF-alfa humano a TNFR2 en un ensayo ELISA con una EC50 de 30 nM o menos, más adecuadamente 10 nM o menos, más adecuadamente 3 nM o menos, más adecuadamente 1 nM o menos, más adecuadamente 0,6 nM o menos, más adecuadamente 0,5 nM o menos, más adecuadamente 0,4 nM o menos, más adecuadamente 0,3 nM o menos.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención inhibe la unión de TNF-alfa de mono cynomolgus a TNFR2 en un ensayo ELISA con una EC50 de 110 nM o menos, más adecuadamente 30 nM o menos, más adecuadamente 10 nM o menos, más adecuadamente 3 nM o menos, más adecuadamente 1 nM o menos, más adecuadamente 0,6 nM o menos, más adecuadamente 0,5 nM o menos, más adecuadamente 0,4 nM o menos, más adecuadamente 0,3 nM o menos.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención inhibe la unión de TNF-alfa humano a TNFR1 en un ensayo ELISA con una EC50 de 2 nM o menos, más adecuadamente 1 nM o menos, más adecuadamente 0,9 nM o menos, más adecuadamente 0,8 nM o menos, más adecuadamente 0,7 nM o menos, más adecuadamente 0,6 nM o menos, más adecuadamente 0,5 nM o menos, más adecuadamente 0,4 nM o menos, más adecuadamente 0,3 nM o menos.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención inhibe la activación de células indicadoras HEK-293-NF-kappa-B SEAP inducida por TNF-alfa humano soluble con una EC50 de 3 nM o menos, adecuadamente 2 nM o menos, adecuadamente 1 nM o menos, adecuadamente 0,5 nM o menos, adecuadamente 0,4 nM o menos, adecuadamente 0,3 nM o menos, adecuadamente 0,2 nM o menos, adecuadamente 0,1 nM o menos, adecuadamente 0,08 nM o menos.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención inhibe la activación de células indicadoras HEK-293-NF-kappa-B SEAP inducida por TNF-alfa humano de membrana con una CE50 de 300 nM o menos, más adecuadamente 150 nM o menos, más adecuadamente 100 nM o menos, más adecuadamente 80 nM o menos, más adecuadamente 40 nM o menos, más adecuadamente 30 nM o menos, más adecuadamente 25 nM o menos, más adecuadamente 20 nM o menos, más adecuadamente 15 nM o menos.
Secuencias de polipéptidos y polinucleótidos
Con el fin de comparar dos secuencias polipeptídicas estrechamente relacionadas, el "% de identidad de secuencia" entre una primera secuencia polipeptídica y una segunda secuencia polipeptídica se puede calcular usando NCBI BLAST v2.0, usando configuraciones estándar para secuencias polipeptídicas (BLASTP). Con el fin de comparar dos secuencias de polinucleótidos estrechamente relacionadas, el "% de identidad de secuencia" entre una primera secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos se puede calcular usando NCBI BLAST v2.0, usando configuraciones estándar para secuencias de nucleótidos (BLASTN).
Se dice que las secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas son iguales o idénticas a otras secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, si comparten el 100 % de identidad de secuencia en toda su longitud. Los residuos en las secuencias se numeran de izquierda a derecha, es decir, del extremo N- al C- para polipéptidos; del extremo 5' al 3' para polinucleótidos.
Una "diferencia" entre secuencias se refiere a una inserción, deleción o sustitución de un único residuo de aminoácido en una posición de la segunda secuencia, en comparación con la primera secuencia. Dos secuencias polipeptídicas pueden contener una, dos o más de tales diferencias de aminoácidos. Las inserciones, deleciones o sustituciones en una segunda secuencia que, por lo demás, es idéntica (100 % de identidad de secuencia) a una primera secuencia dan como resultado una reducción del % de identidad de secuencia Por ejemplo, si las secuencias idénticas tienen longitud de 9 residuos de aminoácidos, una sustitución en la segunda secuencia da como resultado una identidad de secuencia de 88,9 %. Si las secuencias idénticas tienen longitud de 17 residuos de aminoácidos, dos sustituciones en la segunda secuencia da como resultado una identidad de secuencia de 88,2 %. Si las secuencias idénticas tienen longitud de 7 residuos de aminoácidos, tres sustituciones en la segunda secuencia da como resultado una identidad de secuencia de 57,1 %. Si las secuencias polipeptídicas primera y segunda tienen una longitud de 9 residuos de aminoácidos y comparten 6 residuos idénticos, las secuencias polipeptídicas primera y segunda comparten una identidad superior al 66 % (las secuencias polipeptídicas primera y segunda comparten una identidad del 66,7 %). Si las secuencias polipeptídicas primera y segunda tienen una longitud de 17 residuos de aminoácidos y comparten 16 residuos idénticos, las secuencias polipeptídicas primera y segunda comparten una identidad superior al 94 % (las secuencias polipeptídicas primera y segunda comparten una identidad del 94,1 %). Si las secuencias polipeptídicas primera y segunda tienen una longitud de 7 residuos de aminoácidos y comparten 3 residuos idénticos, las secuencias polipeptídicas primera y segunda comparten una identidad superior al 42 % (las secuencias polipeptídicas primera y segunda comparten una identidad del 42,9 %).
Alternativamente, con el fin de comparar una primera secuencia polipeptídica de referencia con una segunda secuencia polipeptídica de comparación, el número de adiciones, sustituciones y/o deleciones realizadas en la primera secuencia para producir la segunda secuencia puede ser determinado. Una adición es la adición de un residuo de aminoácido en la secuencia del primer polipéptido (incluida la adición en cualquiera de los extremos del primer polipéptido). Una sustitución es la sustitución de un residuo de aminoácido en la secuencia del primer polipéptido con un residuo de aminoácido diferente. Una deleción es la deleción de un residuo de aminoácido de la secuencia del primer polipéptido (incluida la deleción en cualquiera de los extremos del primer polipéptido).
Con el fin de comparar una primera secuencia de polinucleótido de referencia con una segunda secuencia de polinucleótido de comparación, el número de adiciones, sustituciones y/o deleciones realizadas en la primera secuencia para producir la segunda secuencia puede ser determinado. Una adición es la adición de un residuo de nucleótido en la secuencia del primer polinucleótido (incluida la adición en cualquiera de los extremos del primer polinucleótido). Una sustitución es la sustitución de un residuo de nucleótido en la secuencia del primer polinucleótido con un residuo de nucleótido diferente. Una deleción es la deleción de un residuo de nucleótido de la secuencia del primer polinucleótido (incluida la deleción en cualquiera de los extremos del primer polinucleótido).
Una sustitución de aminoácido "conservadora" es una sustitución de aminoácido en la que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de estructura química similar y que se espera que tenga poca influencia en la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Tales sustituciones conservadoras adecuadamente son sustituciones en las que un aminoácido dentro de los siguientes grupos se sustituye por otro residuo de aminoácido de dentro del mismo grupo:
Figure imgf000010_0001
Adecuadamente, un residuo de aminoácido hidrófobo es un aminoácido no polar. Más adecuadamente, un residuo de aminoácido hidrófobo se selecciona de entre V, I, L, M, F, W o C.
Tal como se usa en esta invención, la numeración de las secuencias polipeptídicas y las definiciones de CDR y FR se definen según el sistema Kabat (Kabat y col 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Editción U.S. Department of Health and Human Services, NIH Número de Publicación 91-3242). Un residuo de aminoácido "correspondiente" entre una primera y una segunda secuencia polipeptídica es un residuo de aminoácido en una primera secuencia que comparte la misma posición según el sistema Kabat con un residuo de aminoácido en una segunda secuencia, mientras que el residuo de aminoácido en la segunda secuencia puede diferir en identidad de la primera. Los residuos adecuadamente correspondientes compartirán el mismo número (y letra) si la estructura y las CDR tienen la misma longitud según la definición de Kabat. La alineación se puede lograr manualmente o usando, por ejemplo, un algoritmo informático conocido para la alineación de secuencias como NCBI BLAST v2.0 (BLASTP o BLASTN) usando configuraciones estándar.
Adecuadamente, los polinucleótidos usados en la presente invención son aislados. Un polinucleótido "aislado" es uno que se elimina de su entorno original. Por ejemplo, un polinucleótido natural se aísla si se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Se considera que un polinucleótido está aislado si, por ejemplo, se clona en un vector que no forma parte de su entorno natural o si está comprendido en el ADNc.
En un aspecto de la invención, se proporciona un polinucleótido que codifica el polipéptido o construcción de la invención. Adecuadamente, el polinucleótido comprende o consiste en una secuencia que comparte un 70 % o más, como un 80 % o más, como un 90 % o más, como un 95 % o más, como un 99 % o más, de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 83 a 88. Más adecuadamente, el polinucleótido comprende o consiste en cualquiera de las SEQ ID NO: 83 a 88.
Adecuadamente, la secuencia polipeptídica de la presente invención contiene al menos una alteración con respecto a una secuencia nativa. Adecuadamente, las secuencias polipeptídicas de la presente invención contienen al menos una alteración con respecto a una secuencia nativa. Adecuadamente, la alteración de la secuencia polipeptídica o la secuencia polinucleotídica se realiza para aumentar la estabilidad del polipéptido o polipéptido codificado frente a las proteasas presentes en el tracto intestinal (por ejemplo, tripsina y quimotripsina).
El sistema de numeración de Kabat aplicado a secuencias de dominio variable de cadena de inmunoglobulina seleccionadas
Figure imgf000012_0001
CDR de la Familia 1 particulares del polipéptido de la invención:
Figure imgf000013_0008
Porcentaje de identidad de CDR de ID38F a otros miembros de la Familia 1, TNF1 y Q62F11
Figure imgf000013_0001
CDR
Q65B1 100 94,1 83,3
Q65F2 100 88,2 83,3
Q65F3 100 82,4 83,3
Q62F2 100 88,2 83,3
Q65G1 100 82,4 83,3
Q65H6 100 82,4 83,3
Q65F1 80 82,4 83,3
Q65D1 60 82,4 83,3
Q65D3 100 82,4 66,7
Q65C7
Figure imgf000013_0002
100
Figure imgf000013_0003
82,4
Figure imgf000013_0004
83,3
TNF1 88,2 33,3
Q62F1
Figure imgf000013_0006
52,9
Figure imgf000013_0007
13,3
Figure imgf000013_0005
Adecuadamente, FR1 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que comparte 5 %, 12 %, 18 %, 26 %, 32 %, 38 %, 46 %, 52 %, 58 %, 62 %, 66 %, 68 %, 72 %, 75 %, 78 %, 82 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de identidad de secuencia, con SEQ ID NO: 4.
Alternativamente, FR1 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que tiene no más de 28, más adecuadamente no más de 26, más adecuadamente no más de 24, más adecuadamente no más de 22, más adecuadamente no más de 20, más adecuadamente no más de 18, más adecuadamente no más de 16, más adecuadamente no más de 14, más adecuadamente no más de 13, más adecuadamente no más de 12, más adecuadamente no más de 11, más adecuadamente no más de 10 , más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 adición(es) en comparación con SEQ ID NO: 4. De manera adecuada, FR1 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que tiene no más de 28, más adecuadamente no más de 26, más adecuadamente no más de 24, más adecuadamente no más de 22, mejor no más de 20, mejor no más de 18, mejor no más de 16, mejor no más de 14, mejor no más de 13, mejor no más de 12, mejor no más de 11, más adecuadamente no más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de
7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4 , más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 sustitución(es) en comparación con SEQ ID NO: 4. Adecuadamente, FR1 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en un secuencia que no tenga más de 28, más adecuadamente no más de 26, más adecuadamente no más de 24, más adecuadamente no más de 22, más adecuadamente no más de adecuadamente no más de 18, más adecuadamente no más de 16, más adecuadamente no más de adecuadamente no más de 13, más adecuadamente no más de 12, más adecuadamente no más de 11, mejor no más de 10, mejor no más de 9, mejor no más de 8, mejor no más de 7, mejor no más de 6, mejor no más de 5, mejor no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 deleción(es) en comparación con SEQ ID NO: 4.
Adecuadamente, cualquier residuo de FR1 que difiera de sus residuos correspondientes en SEQ ID NO: 4 son sustituciones conservadoras con respecto a sus residuos correspondientes. Adecuadamente, el residuo de FR1 correspondiente al residuo número 1 de SEQ ID NO: 4 es G, A, V, L, I, F, P, S, T, Y, C, M, K, R, H, W, D , E o N (más adecuadamente D o E, más adecuadamente D). Adecuadamente, el residuo de FR1 correspondiente al residuo número 5 de SEQ ID NO: 4 es G, A, V, L, I, F, P, S, T, Y, C, M, K, R, H, W, D, E o N (adecuadamente V).
Adecuadamente, los residuos de FR1 correspondientes a los residuos números 1 a 5 de SEQ ID NO: 4 son DVQLV.
Adecuadamente, el residuo de FR1 correspondiente a los residuos números 20 y/o 24 de SEQ ID NO: 4 son un aminoácido que es hidrófobo (más adecuadamente L o A, respectivamente). Adecuadamente, el residuo de FR1 correspondiente al residuo número 29 de SEQ ID NO: 4 es F. Adecuadamente, FR1 comprende o más adecuadamente consiste en SEQ ID NO: 4.
Adecuadamente, FR2 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que comparte 10 %, 15 %, 25 %, 30 %, 40 %, 45 %, 55 %, 60 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 % o más de identidad de secuencia, con SEQ ID NO: 5.
Alternativamente, FR2 del polipéptido de la presente invención comprende o consiste más adecuadamente en una secuencia que no tiene más de 13, más adecuadamente no más de 12, más adecuadamente no más de 11, más adecuadamente no más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2 , más adecuadamente no más de 1 adición en comparación con SEQ ID NO: 5. Adecuadamente, FR2 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que tiene no más de 13, más adecuadamente no más de 12, más adecuadamente no más de 11, más adecuadamente no más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2 , más adecuadamente no más de 1 sustitución(es) en comparación con SEQ ID NO: 5. Adecuadamente, FR2 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que tiene no más de 13, más adecuadamente no más de 12, más adecuadamente no más de 11, más adecuadamente no más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 deleción(es) en comparación con SEQ ID NO: 5.
Adecuadamente, cualquier residuo de FR2 que difiera de sus residuos correspondientes en SEQ ID NO: 5 son sustituciones conservativas con respecto a sus residuos correspondientes. Adecuadamente, los residuos de FR2 correspondientes a los residuos números 8 a 11 de SEQ ID NO: 5 son KEXE, donde X es R o L. Alternativamente, los residuos de FR2 correspondientes a los residuos números 9 a 12 de SEQ ID NO: 5 son GLEW. Adecuadamente, FR2 comprende o más adecuadamente consiste en SEQ ID NO: 5.
Adecuadamente, FR3 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que comparte 8 %, 15 %, 20 %, 26 %, 32 %, 40 %, 45 %, 52 %, 58 %, 65 %, 70 %, 76 %, 80 %, 82 %, 85 %,
90 %, 92 %, 95 % o más de identidad de secuencia, con SEQ ID NO: 6.
Alternativamente, FR3 del polipéptido de la presente invención comprende o consiste más adecuadamente en una secuencia que no tiene más de 29, más adecuadamente no más de 27, más adecuadamente no más de 25, más adecuadamente no más de 23, más adecuadamente no más de 21, más adecuadamente no más de 19, más adecuadamente no más de 17, más adecuadamente no más de 15, más adecuadamente no más de 13, más adecuadamente no más de 11, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 7 , más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 adición(es) en comparación con SEQ ID NO: 6. Adecuadamente, FR3 del polipéptido de la presente invención comprende o consiste más adecuadamente en una secuencia que no tiene más de 29, más adecuadamente no más de 27, más adecuadamente no más de 25, más adecuadamente no más de 23, más adecuadamente no más de 21, más adecuadamente no más de 19, más adecuadamente no más de 17, más adecuadamente no más de 15, más adecuadamente no más de 13, más adecuadamente no más de 11, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 7 , más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 sustitución(es) en comparación con SEQ ID NO: 6. Adecuadamente, FR3 del polipéptido de la presente invención comprende o consiste más adecuadamente en una secuencia que no tiene más de 29, más adecuadamente no más de 27, más adecuadamente no más de 25, más adecuadamente no más de 23, más adecuadamente no más de 21, más adecuadamente no más de 19, más adecuadamente no más de 17, más adecuadamente no más de 15, más adecuadamente no más de 13, más adecuadamente no más de 11, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 7 , más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 deleción(es) en comparación con SEQ ID NO: 6.
Adecuadamente, el residuo de FR3 correspondiente al residuo número 26 de SEQ ID NO: 6 es un aminoácido que es hidrófobo (adecuadamente A). Adecuadamente, cualquier residuo de FR3 que difiera de sus residuos correspondientes en SEQ ID NO: 6 son sustituciones conservadoras con respecto a sus residuos correspondientes. Adecuadamente, FR3 comprende o más adecuadamente consiste en SEQ ID NO: 6.
Adecuadamente, FR4 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que comparte 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más de identidad de secuencia, con SEQ ID NO: 7.
Alternativamente, FR4 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que no tiene más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 adición(es) en comparación con SEQ ID NO: 7. Adecuadamente, FR4 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que no tiene más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 sustitución(es) en comparación con SEQ ID NO: 7. Adecuadamente, FR4 del polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que no tiene más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 deleción(es) en comparación con SEQ ID NO: 7.
Adecuadamente, cualquier residuo de FR4 que difiera de sus residuos correspondientes en SEQ ID NO: 7 son sustituciones conservadoras con respecto a sus residuos correspondientes. Adecuadamente, FR4 comprende o más adecuadamente consiste en SEQ ID NO: 7.
Adecuadamente, el polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que comparte 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más de identidad de secuencia, con SEQ ID NO: 8.
Alternativamente, el polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que no tiene más de 20, más adecuadamente no más de 15, más adecuadamente no más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 adición(es) en comparación con SEQ ID NO: 8. Adecuadamente, el polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que no tiene más de 20, más adecuadamente no más de 15, más adecuadamente no más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 sustitución(es) en comparación con SEQ ID NO: 8. Adecuadamente, el polipéptido de la presente invención comprende o más adecuadamente consiste en una secuencia que no tiene más de 20, más adecuadamente no más de 15, más adecuadamente no más de 10, más adecuadamente no más de 9, más adecuadamente no más de 8, más adecuadamente no más de 7, más adecuadamente no más de 6, más adecuadamente no más de 5, más adecuadamente no más de 4, más adecuadamente no más de 3, más adecuadamente no más de 2, más adecuadamente no más de 1 deleción(es) en comparación con SEQ ID NO: 8.
Adecuadamente, el extremo N del polipéptido es D. Adecuadamente, el polipéptido comprende o más adecuadamente consiste en SEQ ID NO: 8.
Enlazadores y multímeros
Una construcción según la invención comprende múltiples polipéptidos y, por lo tanto, puede ser adecuadamente multivalente. Tal construcción puede comprender al menos dos polipéptidos idénticos según la invención. Una construcción que consiste en dos polipéptidos idénticos según la invención es una "homobicabeza". En un aspecto de la invención, se proporciona una construcción que comprende dos o más polipéptidos idénticos de la invención.
Alternativamente, una construcción puede comprender al menos dos polipéptidos que son diferentes, pero ambos siguen siendo polipéptidos según la invención (una "heterobicabeza").
Alternativamente, dicha construcción puede comprender (a) al menos un polipéptido según la invención y (b) al menos un polipéptido tal como un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que no es un polipéptido de la invención (también una "heterobicabeza"). El al menos un polipéptido de (b) puede unirse a TNF-alfa (por ejemplo, a través de un epítopo diferente al de (a)) o, alternativamente, puede unirse a una diana distinta de TNF-alfa. Adecuadamente, el polipéptido diferente (b) se une, por ejemplo, a una interleucina (como IL-1, IL-1 ra, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18 e IL-23), un receptor de interleucina (como IL-6R e IL-7R), un receptor de transcripción (como NF-kB), una citoquina (como TNF-alfa, IFN-gamma, TGF-beta y TSLP), una proteína transmembrana (como gp130 y CD3), una glicoproteína de superficie (como CD4, CD20, CD40 ), una proteína soluble (como CD40L), una integrina (como a4b7 y AlphaEbeta7), una molécula de adhesión (como MAdCAM), una quimiocina (como IP10 y CCL20), un receptor de quimiocina (como CCR2 y CCR9) , una proteína inhibidora (como SMAD7), una quinasa (como JAK3), un receptor acoplado a proteína G (como el receptor de esfingosina-1-P), otros mediadores inflamatorios o ligandos inmunológicamente relevantes implicados en procedimientos patológicos humanos. Así, el polipéptido diferente (b) se une, por ejemplo, a IL-6R, IL-6, IL-12, IL-23, IL-1-beta, IL-17A o CD3; u otros mediadores inflamatorios o ligandos inmunológicamente relevantes implicados en procedimientos patológicos humanos.
Las construcciones pueden ser multivalentes y/o multiespecíficas. Una construcción multivalente (tal como una construcción bivalente) comprende dos o más polipéptidos de unión, por lo que presenta dos o más sitios en los que puede producirse la unión a uno o más antígenos. Un ejemplo de una construcción multivalente podría ser una homobicabeza o una heterobicabeza. Una construcción multiespecífica (como una construcción biespecífica) comprende dos o más polipéptidos de unión diferentes que presentan dos o más sitios en los que (a) puede ocurrir la unión a dos o más antígenos diferentes o (b) puede ocurrir la unión a dos o más epítopos diferentes en el mismo antígeno. Un ejemplo de una construcción multiespecífica podría ser una heterobicabeza. Una construcción multiespecífica es multivalente.
Adecuadamente, los polipéptidos comprendidos dentro de la construcción se seleccionan de entre la lista que consiste en: un VHH, un VH, un VL y un V-NAR. Más adecuadamente, los polipéptidos comprendidos dentro de la construcción son VHH.
Los polipéptidos de la invención se pueden enlazar entre sí directamente (es decir, sin el uso de un enlazador) o a través de un enlazador. Adecuadamente, el enlazador es un enlazador lábil a proteasa o no lábil a proteasa. El enlazador es adecuadamente un polipéptido y se seleccionará para permitir la unión de los polipéptidos a sus epítopos. Si se usa con fines terapéuticos, el enlazador es adecuadamente no inmunogénico en el sujeto al que se administran los polipéptidos. Adecuadamente, todos los polipéptidos están conectados mediante enlazadores no lábiles a proteasa. Adecuadamente, el enlazador lábil a proteasa tiene el formato [-(G4S)x-BJB'-(G4S)y-]z donde J es lisina o arginina, B es de 0 a 5 residuos de aminoácidos seleccionados de entre R, H, N, Q, S, T, Y, G, A, V, L, W, P, M, C, F, K o I, B' es de 0 a 5 residuos de aminoácidos seleccionados de entre R, H, N, Q, S, T, Y, G, A, V, L, W, M, C, F, K o I, x es de 1 a 10; y es de 1 a 10 y z es de 1 a 10. Más adecuadamente, J es lisina, B es 0, x es 1, y es 1 y z es 1. De forma adecuada, los enlazadores no lábiles a proteasa tienen el formato (G4S)x. Lo más adecuado es que x sea 6.
Vectores y Hospedadores
Tal como se usa en esta invención, se pretende que el término “vector” haga referencia a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido unida. Un tipo de vector es un «plásmido», que hace referencia a un bucle de ADN de cadena doble circular en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde se pueden ligar segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Determinados vectores pueden replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamíferos) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora después de la introducción en la célula hospedadora y, de esa forma, se replican junto con el genoma hospedador. Además, determinados vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que se encuentran unidos de forma operativa. Se hace referencia a dichos vectores en esta invención como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante se suelen encontrar en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, «plásmido» y «vector» se pueden utilizar de forma intercambiable, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (p. ej., retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que desempeñan funciones equivalentes, y también sistemas de bacteriófagos y fagémidos. La invención también se relaciona con secuencias de nucleótidos que codifican secuencias polipeptídicas o multivalentes. y/o construcciones multiespecíficas. Se pretende que la expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula recombinante" o "célula hospedadora"), tal como se usa en esta invención, haga referencia a una célula en la cual se ha introducido un ácido nucleico recombinante como por ejemplo un vector recombinante. Se entenderá que dichos términos no pretenden hacer referencia solamente a la célula en cuestión particular sino a la progenie de dicha célula.
Estabilidad
Adecuadamente, el polipéptido o construcción de la presente invención retiene sustancialmente la capacidad de neutralización y/o potencia cuando se administra por vía oral y después de la exposición al tracto intestinal (por ejemplo, después de la exposición a las proteasas del intestino delgado y/o grueso y/o proteasas inflamatorias de la EII). Dichas proteasas incluyen enteropeptidasa, tripsina, quimotripsina y proteasas inflamatorias de la enfermedad del intestino irritable (tales como MMP3, MMP12 y catepsina). Proteasas de, o producidas en, el intestino delgado y/o grueso incluyen proteasas provenientes de la microflora comensal intestinal y/o bacterias patógenas, por ejemplo donde las proteasas son proteasas unidas a la membrana celular, proteasas excretadas y proteasas liberadas en la lisis celular.
Más adecuadamente, las proteasas son tripsina y quimotripsina.
Adecuadamente, el tracto intestinal es el tracto intestinal de un perro, cerdo, ser humano, mono cynomolgus o ratón.
El intestino delgado consiste adecuadamente en el duodeno, el yeyuno y el íleon. El intestino grueso consiste adecuadamente en el ciego, el colon, el recto y el canal anal. Adecuadamente, el polipéptido o construcción de la invención es sustancialmente resistente a una o más proteasas. El tracto intestinal, a diferencia del tracto gastrointestinal, consiste solo en el intestino delgado y el intestino grueso.
El polipéptido o construcción de la presente invención retiene sustancialmente la capacidad de neutralización cuando adecuadamente 10 %, más adecuadamente 20 %, más adecuadamente 30 %, más adecuadamente 40 %, más adecuadamente 50 %, más adecuadamente 60 %, más adecuadamente 70 %, más adecuadamente 80 %, más adecuadamente 90 %, más adecuadamente 95 %, más adecuadamente, el 100 % de la capacidad de neutralización original del polipéptido o la construcción de la invención se retiene después de la exposición a las proteasas presentes en el intestino delgado y/o grueso y/o proteasas inflamatorias de la EII.
Adecuadamente, el polipéptido o construcción de la invención retiene sustancialmente la capacidad de neutralización después de la exposición a las proteasas presentes en en el intestino delgado y/o grueso y/o proteasas inflamatorias de la EII para, por ejemplo, hasta al menos 2, más adecuadamente hasta al menos 3, más adecuadamente hasta al menos 4, más adecuadamente hasta al menos 5, más adecuadamente hasta al menos 5,5, más adecuadamente hasta al menos 16, más adecuadamente hasta al menos 21 o más adecuadamente hasta al menos 22 horas a 37 grados C.
Adecuadamente 10 % o más, más adecuadamente 20 % o más, más adecuadamente 30 % o más, más adecuadamente 40 % o más, más adecuadamente 50 % o más, más adecuadamente 60 % o más, más adecuadamente 70 % o más de la capacidad de neutralización del polipéptido o construcción de la invención se retiene después de 16 horas de exposición a condiciones del tracto intestinal, más adecuadamente el intestino delgado o grueso, más adecuadamente extracto fecal humano.
Adecuadamente 10 % o más, más adecuadamente 20 % o más, más adecuadamente 30 % o más, más adecuadamente 40 % o más, más adecuadamente 50 % o más, más adecuadamente 60 % o más, más adecuadamente 70 % o más de la capacidad de neutralización del polipéptido o construcción de la invención se retiene adecuadamente después de 4, 6 o 16 horas de exposición a sobrenadante del intestino delgado de ratones.
Adecuadamente 10 % o más, más adecuadamente 15 % o más, más adecuadamente 20 % o más, más adecuadamente 25 % o más, más adecuadamente 30 % o más, más adecuadamente 35 % o más, más adecuadamente 40 % o más de la capacidad de neutralización del polipéptido o construcción de la invención se retiene después de 16 horas de exposición a sobrenadante del intestino delgado de ratones.
Adecuadamente 50
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o más, más adecuadamente 60 %
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más, más adecuadamente 65 % o más, más adecuadamente 70 % o más, más adecuadamente 75 % o más, más adecuadamente 80 % o más, más adecuadamente 85 % o más de la capacidad de neutralización del polipéptido o construcción de la invención se retiene después de 16 horas de exposición a sobrenadante del intestino delgado de ratones.
Adecuadamente 10 % o más, más adecuadamente 20 % o más, más adecuadamente 30 % o más, más adecuadamente 40 % o más, más adecuadamente 50 % o más, más adecuadamente 60 % o más, más adecuadamente 70 % o más de la dosis administrada de polipéptidos o construcciones de la invención retienen la capacidad de neutralización contra TNF-alfa y permanecen en las heces de ratón, de mono cynomolgus y/o humanas (heces adecuadamente excretadas o retiradas del tracto intestinal) después de 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 horas de exposición a las condiciones del tracto intestinal.
Un polipéptido de la invención o construcción de la presente invención permanece sustancialmente intacto cuando adecuadamente 10 %, más adecuadamente 20 %, más adecuadamente 30 %, más adecuadamente 40 %, más adecuadamente 50 %, más adecuadamente 60 %, más adecuadamente 70 %, más adecuadamente 80 %, más adecuadamente 90 %, más adecuadamente 95 %, más adecuadamente 99 %, más adecuadamente, el 100 % de la cantidad administrada de polipéptido de la invención o construcción permanece intacto después de la exposición a las proteasas presentes en intestino delgado y/o grueso y/o proteasas inflamatorias de la EII.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención o la construcción de la presente invención permanece sustancialmente intacto después de la exposición al estómago, duodeno, yeyuno o íleon de un mono cynomolgus durante 5 horas. Adecuadamente, el polipéptido de la invención o la construcción de la presente invención permanece sustancialmente intacto después de la exposición al ciego o colon de un mono cynomolgus durante 16 horas.
Adecuadamente, un polipéptido o construcción de la presente invención retiene sustancialmente la capacidad de neutralización cuando adecuadamente 10 %, más adecuadamente 20 %, más adecuadamente 30 %, más adecuadamente 40 %, más adecuadamente 50 %, más adecuadamente 60 %, más adecuadamente 70 %, más adecuadamente 80 %, más adecuadamente 90 %, más adecuadamente 95 %, más adecuadamente el 100 % de la capacidad de neutralización original del polipéptido o construcción se retiene después de la congelación y descongelación.
Uso terapéutico y administración
Una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido, composición farmacéutica o construcción de la invención es una cantidad que es efectiva, tras la administración de dosis única o múltiple a un sujeto, para neutralizar el TNF-alfa en un grado significativo en un sujeto. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del polipéptido de la invención, la composición farmacéutica o la construcción se ven superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. El polipéptido o construcción de la invención puede incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. El polipéptido o construcción de la invención puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.
Una composición farmacéutica de la invención se puede formular adecuadamente para administración por vía oral, intramuscular, subcutánea o intravenosa. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden presentar de diversas formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquida, semisólida y sólida, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. Se prefieren las formas de dosificación sólidas. El polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción de la invención pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares.
La composición farmacéutica comprende un polipéptido o construcción de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. Vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida útil o la eficacia del polipéptido o construcción de la invención. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, desintegrantes, sabores, colores, lubricantes, sorbentes, conservantes, edulcorantes, excipientes liofilizados (incluidos los lioprotectores) o auxiliares de compresión.
Más adecuadamente, el polipéptido de la invención, la composición farmacéutica o la construcción de la invención se administra por vía oral. Un problema clave con la administración por vía oral es asegurar que suficiente polipéptido, composición farmacéutica o construcción llegue al área del tracto intestinal donde se requiere. Factores que impiden que un polipéptido, una composición farmacéutica o una construcción de la invención lleguen al área del tracto intestinal donde se requiere incluyen la presencia de proteasas en las secreciones digestivas que pueden degradar un polipéptido, una composición farmacéutica o una construcción de la invención. Adecuadamente, el polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción de la invención son sustancialmente estables en presencia de una o más de tales proteasas en virtud de las propiedades inherentes del propio polipéptido o construcción. Adecuadamente, el polipéptido o construcción de la invención se liofiliza antes de incorporarse a una composición farmacéutica.
Un polipéptido de la invención también se puede proporcionar con un recubrimiento entérico. Un recubrimiento entérico es una barrera de polímero que se aplica a la medicación oral y que ayuda a proteger el polipéptido del bajo pH del estómago. Materiales utilizados para los recubrimientos entéricos incluyen ácidos grasos, ceras, goma laca, plásticos y fibras vegetales. Componentes de recubrimiento entérico adecuados incluyen copolímeros de acrilato de metilo y ácido metacrílico, succinato de acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, succinato de acetato de hidroxipropilmetilcelulosa (succinato de acetato de hipromelosa), ftalato de polivinilacetato (PVAP), copolímeros de metacrilato de metilo y ácido metacrílico, alginato de sodio y ácido esteárico. Recubrimientos entéricos adecuados incluyen polímeros de liberación dependientes del pH. Estos son polímeros que son insolubles al pH altamente ácido que se encuentra en el estómago, pero que se disuelven rápidamente a un pH menos ácido. Así, adecuadamente, el recubrimiento entérico no se disolverá en los jugos ácidos del estómago (pH ~3), pero lo hará en el entorno de pH más alto presente en el intestino delgado (pH superior a 6) o en el colon (pH superior a 7,0). El polímero de liberación dependiente del pH se selecciona de modo que el polipéptido o la construcción de la invención se libere aproximadamente en el momento en que la dosis llega al intestino delgado.
Un polipéptido, construcción o composición farmacéutica de la invención puede formularse en preparaciones para inyección disolviéndolos, suspendiéndolos o emulsionándolos en un solvente acuoso o no acuoso, como aceites vegetales u otros similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y, si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizantes y conservantes. Vehículos, excipientes y/o estabilizantes aceptables no son tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico, glutatión, cisteína, metionina y ácido cítrico; conservantes (tales como etanol, alcohol bencílico, fenol, m-cresol, p-clor-m-cresol, metil o propil parabenos, cloruro de benzalconio o combinaciones de los mismos); aminoácidos tales como arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, prolina y combinaciones de los mismos; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como gelatina o albúmina sérica; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como trehalosa, sacarosa, lactosa, glucosa, manosa, maltosa, galactosa, fructosa, sorbosa, rafinosa, glucosamina, N-metilglucosamina, galactosamina y ácido neuramínico; y/o tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, éteres POE, poloxámeros, Triton-X o polietilenglicol.
Una composición farmacéutica de la invención se puede administrar tópicamente en la piel (por ejemplo, para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune como psoriasis o eccema). Dicha composición farmacéutica puede estar adecuadamente en forma de crema, ungüento, loción, gel, espuma, parche transdérmico, polvo, pasta o tintura y puede incluir adecuadamente análogos de vitamina D3 (p. ej., calcipotriol y maxacalcitol), esteroides (p. ej., propionato de fluticasona, valerato de betametasona y propionato de clobetasol), retinoides (por ejemplo, tazaroteno), alquitrán de hulla y ditranol. Medicamentos tópicos a menudo se usan en combinación entre sí (por ejemplo, una vitamina D3 y un esteroide) o con otros agentes como el ácido salicílico. Si la composición farmacéutica de la invención se va a administrar por vía tópica para el tratamiento de psoriasis o eccema, se puede incluir adecuadamente en la composición una sustancia adicional que se considere efectiva en el tratamiento de la psoriasis o el eccema, como esteroides, especialmente esteroides de Clase 4 o Clase 5 tales como hidrocortisona (p. ej. crema de hidrocortisona al 1 %); ciclosporina o agente macrólido similar o retinoides.
Para todos los modos de administración, el polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción de la invención pueden formularse en un tampón, para estabilizar el pH de la composición, a una concentración entre 5 y 50, o más adecuadamente entre 15 y 40 o más adecuadamente 25-30 g/litro. Ejemplos de componentes tampón adecuados incluyen sales fisiológicas como el citrato de sodio y/o ácido cítrico. Tampones adecuados contienen 100-200, más adecuadamente 125-175 mM de sales fisiológicas tales como cloruro sódico. Adecuadamente, el tampón se selecciona para que tenga un pKa cercano al pH de la composición o al pH fisiológico del paciente.
Concentraciones ejemplares de polipéptido o construcción en una composición farmacéutica pueden oscilar entre aproximadamente 1 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL o entre aproximadamente 50 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL, o entre aproximadamente 150 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL. .
Una formulación acuosa del polipéptido, construcción o composición farmacéutica de la invención se puede preparar en una solución de pH tamponado, por ejemplo, a un pH que oscila entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 7,0, o entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0, o alternativamente aproximadamente 5,5. Ejemplos de tampones adecuados incluyen tampones de fosfato, histidina, citrato, succinato, acetato y otros tampones de ácidos orgánicos. La concentración de tampón puede ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, dependiendo, por ejemplo, del tampón y la tonicidad deseada de la formulación.
La tonicidad de la composición farmacéutica se puede alterar al incluir un modificador de la tonicidad. Dichos modificadores de la tonicidad pueden ser especies químicas cargadas o no cargadas. Modificadores de tonicidad no cargados típicos incluyen azúcares o alcoholes de azúcar u otros polioles, preferiblemente trehalosa, sacarosa, manitol, glicerol, 1,2-propanodiol, rafinosa, sorbitol o lactitol (especialmente trehalosa, manitol, glicerol o 1,2-propanodiol). Modificadores de tonicidad cargados típicos incluyen sales tales como una combinación de iones de sodio, potasio o calcio, con iones de cloruro, sulfato, carbonato, sulfito, nitrato, lactato, succinato, acetato o maleato (especialmente cloruro de sodio o sulfato de sodio); o aminoácidos tales como arginina o histidina. Adecuadamente, la formulación acuosa es isotónica, aunque pueden ser adecuadas soluciones hipertónicas o hipotónicas. El término "isotónica" denota una solución que tiene la misma tonicidad que alguna otra solución con la que se compara, tal como solución salina fisiológica o suero. Agentes de tonicidad pueden usarse en una cantidad de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 350 mM, por ejemplo, en una cantidad de 1 mM a 500 nM. Adecuadamente, se incluye en la composición al menos un agente isotónico.
También se puede añadir un tensioactivo a la composición farmacéutica para reducir la agregación del polipéptido o construcción formulado y/o minimizar la formación de partículas en la formulación y/o reducir la adsorción. Los tensioactivos ejemplares incluyen ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán (Tween), éteres de alquilpolioxietileno (Brij), éteres de alquilfenilpolioxietileno (Triton-X), copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (Poloxamer, Pluronic) y dodecilsulfato de sodio (SDS). Ejemplos de ésteres de polioxietilensorbitán y ácidos grasos adecuados son el polisorbato 20 y el polisorbato 80. Concentraciones ejemplares de tensioactivo pueden oscilar entre aproximadamente 0,001 % y aproximadamente 10 %. p/v.
También se puede añadir un lioprotector para proteger el polipéptido o la construcción de la invención frente a condiciones desestabilizadoras durante el proceso de liofilización. Por ejemplo, lioprotectores conocidos incluyen azúcares (incluyendo glucosa, sacarosa, manosa y trehalosa); polioles (incluyendo manitol, sorbitol y glicerol); y aminoácidos (incluyendo alanina, glicina y ácido glutámico). Lioprotectores pueden incluirse en una cantidad de aproximadamente 10 mM a 500 mM.
Los intervalos de dosificación para la administración del polipéptido de la invención, composición farmacéutica o construcción de la invención son aquellos para producir el efecto terapéutico deseado. El intervalo de dosificación requerido depende de la naturaleza precisa del polipéptido de la invención, composición o construcción farmacéutica, la vía de administración, la naturaleza de la formulación, la edad del paciente, la naturaleza, extensión o gravedad de la afección del paciente, contraindicaciones, si las hay, y el juicio del médico tratante. Variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajustar utilizando rutinas empíricas estándar para optimización.
Las dosis diarias adecuadas de polipéptido de la invención, composición farmacéutica o construcción de la invención están en el intervalo de 50 ng-50 mg por kg, como 50 ug-40 mg por kg, como 5-30 mg por kg de peso corporal. La dosis unitaria puede variar desde menos de 100 mg, pero típicamente estará en la región de 250-2000 mg por dosis, que puede administrarse diariamente o con más frecuencia, por ejemplo, 2, 3 o 4 veces al día o con menos frecuencia, por ejemplo, cada dos días o una vez por semana, una vez por quincena o una vez por mes.
Con la palabra "tratamiento" se pretende abarcar tanto la profilaxis como el tratamiento terapéutico. El tratamiento de enfermedades también abarca el tratamiento de las exacerbaciones de las mismas y también abarca el tratamiento de pacientes en remisión de los síntomas de la enfermedad para prevenir la recaída de los síntomas de la enfermedad.
Terapia de combinación
Una composición farmacéutica de la invención también puede comprender uno o más agentes activos (p. ej., agentes activos adecuados para tratar las enfermedades mencionadas en esta invención).
Para el tratamiento de la EII (como la enfermedad de Crohn o la colitis ulcerosa), las posibles combinaciones incluyen combinaciones con, por ejemplo, uno o más agentes activos seleccionados de entre la lista que comprende: ácido 5-aminosalicílico, o un profármaco del mismo (como sulfasalazina , olsalazina o bisalazida); corticosteroides (p. ej., prednisolona, metilprednisolona o budesonida); inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus, metotrexato, azatioprina o 6-mercaptopurina); anticuerpos anti-TNF-alfa (p. ej., infliximab, adalimumab, certolizumab pegol o golimumab); anticuerpos anti-IL12/IL23 (p. ej., ustekinumab); anticuerpos anti-IL6R o inhibidores de IL12/IL23 de molécula pequeña (p. ej., apilimod); anticuerpos anti-alfa-4-beta-7 (p. ej., vedolizumab); bloqueadores de MAdCAM-1 (p. ej., PF-00547659); anticuerpos contra la molécula de adhesión celular alfa-4-integrina (p. ej., natalizumab); anticuerpos contra el subconjunto alfa del receptor de IL2 (p. ej., daclizumab o basiliximab); inhibidores de JAK3 (p. ej., tofacitinib o R348); inhibidores de Syk y profármacos de los mismos (p. ej., fostamatinib y R-406); inhibidores de la fosfodiesterasa-4 (p. ej., tetomilast); Hm p L-004; probióticos; Dersalazina; semapimod/CPSI-2364; e inhibidores de proteína quinasa C (por ejemplo, AEB-071). Los agentes combinados más adecuados son infliximab, adalimumab, certolizumab pegol o golimumab.
Por lo tanto, otro aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica de la invención en combinación con uno o más agentes activos adicionales, por ejemplo, uno o más agentes activos descritos anteriormente.
Un aspecto de la invención proporciona un producto combinado que comprende:
(A) un polipéptido, composición farmacéutica o construcción de la presente invención; y
(B) uno o más de otros agentes activos,
donde cada uno de los componentes (A) y (B) se formula en mezcla con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En este aspecto de la invención, el producto combinado puede ser una formulación única (combinada) o un kit de piezas. Así, este aspecto de la
invención abarca una formulación de combinación que incluye un polipéptido, composición farmacéutica o construcción de la presente invención y otro agente terapéutico, mezclado con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención también abarca un kit de piezas que comprende componentes:
(i) un polipéptido, composición farmacéutica o construcción de la presente invención mezclado con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable; y
(ii) una formulación que incluye uno o más agentes activos, mezclados con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, cuyos componentes (i) y (ii) se proporcionan cada uno en una forma que es adecuada para la administración junto con el otro.
El componente (i) del kit de piezas es, por lo tanto, el componente (A) anterior mezclado con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. De forma similar, el componente (ii) es el componente (B) anterior mezclado con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. El uno o más de los otros agentes activos (es decir, el componente (B) anterior) puede ser, por ejemplo, cualquiera de los agentes mencionados anteriormente en relación con el tratamiento de enfermedades autoinmunes como la EII (por ejemplo, la enfermedad de Crohn y/o colitis ulcerosa). Si el componente (B) es más de un agente activo adicional, estos agentes activos adicionales pueden formularse entre sí o formularse con el componente (A) o pueden formularse por separado. En una realización, el componente (B) es otro agente terapéutico. En una realización, el componente (B) son otros dos agentes terapéuticos. El producto de combinación (ya sea una preparación combinada o un kit de piezas) de este aspecto de la invención puede usarse en el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune (por ejemplo, las enfermedades autoinmunes mencionadas en esta invención).
Adecuadamente, el polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción de la invención es para uso como medicamento y, más adecuadamente, para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o enfermedad inflamatoria.
Enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias
Las enfermedades autoinmunes se desarrollan cuando el sistema inmunitario responde negativamente a los tejidos normales del cuerpo. Los trastornos autoinmunes pueden resultar en daño a los tejidos del cuerpo, crecimiento anormal de órganos y/o cambios en la función de los órganos. El trastorno puede afectar solo a un tipo de órgano o tejido o puede afectar a múltiples órganos y tejidos. Los órganos y tejidos comúnmente afectados por trastornos autoinmunes incluyen componentes sanguíneos como glóbulos rojos, vasos sanguíneos, tejidos conectivos, glándulas endocrinas como la tiroides o el páncreas, músculos, articulaciones y piel. Una enfermedad inflamatoria es una enfermedad caracterizada por inflamación. Muchas enfermedades inflamatorias son enfermedades autoinmunes y viceversa.
Enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias del GIT (Tracto Gastro Intestinal)
Las enfermedades inflamatorias crónicas del intestino (EII), la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa, que afectan tanto a niños como a adultos, son ejemplos de enfermedades autoinmunes e inflamatorias del GIT (Hendrickson y col 2002 Clin Microbiol Rev 15(1):79-94). La colitis ulcerosa se define como una afección en la que la respuesta inflamatoria y los cambios morfológicos permanecen confinados al colon. El recto está afectado en el 95 % de los pacientes. La inflamación se limita en gran medida a la mucosa y consiste en un compromiso continuo de gravedad variable con ulceración, edema y hemorragia a lo largo del colon (Hendrickson y col 2002 Clin. Microbiol Rev 15(1):79-94). La colitis ulcerosa generalmente se manifiesta por la presencia de sangre y mucosidad mezclada con las heces, junto con calambres abdominales inferiores que son más severos durante el paso de las deposiciones. Clínicamente, la presencia de diarrea con sangre y moco diferencia la colitis ulcerosa del síndrome del intestino irritable, en el que no hay sangre. A diferencia de la colitis ulcerosa, la presentación de la enfermedad de Crohn suele ser sutil, lo que lleva a un diagnóstico tardío. Factores como la ubicación, la extensión y la gravedad de la afectación determinan la extensión de los síntomas gastrointestinales. Los pacientes que tienen afectación ileocolónica suelen tener dolor abdominal posprandial, con hipersensibilidad en el cuadrante inferior derecho y una masa inflamatoria ocasional. Los síntomas asociados con la enfermedad de Crohn gastroduodenal incluyen saciedad temprana, náuseas, emesis, dolor epigástrico o disfagia. La enfermedad perianal es común, junto con marcas anales, fisuras anales profundas y fístulas (Hendrickson y col 2002 Clin Microbiol Rev 15(1):79-94).
En estas enfermedades, el TNF-alfa se produce en la lámina propia subyacente al epitelio gastrointestinal. Este epitelio se rompe en la EII y facilita el transporte del dominio variable de la cadena de inmunoglobulina a la lámina propia - el sitio de producción de TNF-alfa y acción biológica en estas enfermedades (ver Ejemplo 8). Otras enfermedades del GIT incluyen, por ejemplo, la enfermedad inflamatoria mucositis (adecuadamente mucositis inducida por fármacos y radiación) donde las lesiones inflamatorias están presentes en la mucosa que interrumpen las uniones estrechas epiteliales que también permiten que el dominio variable de la cadena de inmunoglobulina acceda al sitio de producción de TNF-alfa. En la mucositis, las lesiones pueden ocurrir desde la boca hasta el ano y, para las lesiones de la boca y el esófago, se puede usar un enjuague bucal o una crema que contenga el dominio variable. Para lesiones anales y rectales, los supositorios, cremas o espumas que contienen el dominio variable serían adecuados para aplicación tópica. Los dominios variables de la cadena de inmunoglobulina se eliminarán de la lámina propia u otros sitios inflamatorios mediante absorción en el torrente sanguíneo en sitios de inflamación o mediante limpieza linfática y posterior entrada en el torrente sanguíneo. Por lo tanto, los dominios llegarán al hígado a través del torrente sanguíneo y se eliminarán mediante filtración glomerular en el riñón. Por lo tanto, existe una buena razón de que los dominios funcionarán terapéuticamente en enfermedades tales como hepatitis autoinmune, diabetes tipo II y nefritis glomerular.
Adecuadamente, el polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción de la invención se usan en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o enfermedad inflamatoria del tracto GI (gastrointestinal) donde el TNF-alfa contribuye a la patología de tal enfermedad.
Adecuadamente, el polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción de la invención se utilizan en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o enfermedad inflamatoria del tracto gastrointestinal seleccionada de entre la lista que consiste en enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad del intestino irritable, diabetes tipo II, glomerulonefritis, hepatitis autoinmune, síndrome de Sjogren, enfermedad celíaca y mucositis inducida por fármacos o radiación (más adecuadamente enfermedad de Crohn).
La administración por vía oral del dominio variable de la cadena de inmunoglobulina idealmente tratará enfermedades inflamatorias en las que el TNF-alfa contribuye a al menos una proporción de la patología y el dominio variable de la cadena de inmunoglobulina puede acceder al tejido donde el TNF-alfa es biológicamente activo.
Enfermedades autoinmunes y/o enfermedades inflamatorias de la piel
La psoriasis es una enfermedad dermatológica autoinmune debilitante. La psoriasis en placas, la forma más común de la enfermedad, se caracteriza por una piel roja cubierta con escamas plateadas. Histológicamente, el cuadro es de diferenciación desordenada e hiperproliferación de queratinocitos dentro de la placa psoriásica con infiltrados de células inflamatorias (Ortonne, 1999 Brit J Dermatol 140 (suppl. 54):1-7). Las lesiones cutáneas psoriásicas son placas inflamatorias, rojas, bien delimitadas, de diversas formas, con una característica descamación plateada brillante. El término psoriasis incluye la psoriasis y los síntomas de la psoriasis, incluidos el eritema, el engrosamiento/elevación de la piel y descamación.
Los agentes biológicos de uso en el tratamiento de la psoriasis incluyen terapias anti-TNF-alfa (como anticuerpos monoclonales contra el TNF, por ejemplo, adalimumab e infliximab, o proteínas de fusión del receptor del TNF-alfa como etanercept), anticuerpos humanizados contra CD11a (efalizumab) o agentes que se unen a CD2 como alefacept (bloqueando así la interacción CD2 LFA3). Cabe señalar que no todos los agentes biológicos enumerados en esta invención han sido aprobados para su uso en el tratamiento de la psoriasis.
El polipéptido de la invención se puede incorporar en una crema/ungüento u otro vehículo tópico para administración a lesiones cutáneas inflamatorias en las que el TNF-alfa contribuye a la patología de tales lesiones.
Adecuadamente, el polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción de la invención se utilizan en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o enfermedad inflamatoria de la piel seleccionada de entre la lista que consiste en pénfigo, psoriasis, eccema y esclerodermia.
Adecuadamente, el polipéptido, la composición farmacéutica o la construcción se utilizan en el tratamiento de otras enfermedades autoinmunes/inflamatorias en las que el TNF-alfa es responsable de una proporción de la patología observada.
Procedimientos de Preparación
Los polipéptidos de la invención pueden obtenerse y manipularse usando las técnicas descritas, por ejemplo, en Green y Sambrook 2012 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4a Edición Cold Spring Harbour Laboratory Press.
Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante la tecnología de hibridomas, mediante la fusión de una célula B productora de anticuerpos específicos con una célula de mieloma (cáncer de células B) que se selecciona por su capacidad para crecer en cultivo de tejidos y por la ausencia de síntesis de cadena de anticuerpos (Kohler y Milstein 1975 Nature 256:495-497 y Nelson y col 2000 Molecular Pathology 53(3):111-117).
Un anticuerpo monoclonal dirigido contra un antígeno determinado puede obtenerse, por ejemplo, mediante: a) inmortalizar linfocitos obtenidos de sangre periférica de un animal previamente inmunizado con un antígeno determinado, con una célula inmortal y preferiblemente con células de mieloma, para formar un hibridoma, b) cultivar las células inmortalizadas (hibridoma) formadas y recuperar las células que producen los anticuerpos que tienen la especificidad deseada.
Alternativamente, no se requiere el uso de una célula de hibridoma. En consecuencia, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
a) clonar en vectores, especialmente en fagos y más particularmente en bacteriófagos filamentosos, secuencias de ADN o ADNc obtenidas de linfocitos, especialmente linfocitos de sangre periférica de un animal (adecuadamente inmunizado previamente con determinados antígenos),
b) transformar células procarióticas con los vectores anteriores en condiciones que permitan la producción de los anticuerpos,
c) seleccionar los anticuerpos sometiéndolos a selección por afinidad al antígeno,
d) recuperar los anticuerpos que tienen la especificidad deseada.
Se conocen procedimientos para inmunizar camélidos, clonando el repertorio VHH de células B circulantes en sangre (Chomezynnski y Sacchi 1987 Anal Biochem 162:156-159), y el aislamiento de VHH específicos de antígenos de bibliotecas inmunes (Arbabi-Ghahroudi y col 1997 FEBS Lett 414:521-526) y no inmunes (Tanha y col 2002 J Immunol Methods 263:97-109) que utilizan fagos, levaduras o ribosomas (WO92/01047, Nguyen y col 2001 Adv Immunol 79:261-296 y Harmsen y col 2007 Appl Microbiol Biotechnol 77(1): 13-22).
Fragmentos de anticuerpos que se unen a antígenos, como los fragmentos scFv y Fv, se pueden aislar y expresar en E. coli (Miethe y col 2013 J Biotech 163(2):105-111, Skerra y col 1988 Science 240(4855): 1038-1041 y Ward y col Nature 1989341:544-546).
Se pueden realizar mutaciones en el ADN o el ADNc que codifica polipéptidos que no conocen la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que proporcionan codones preferidos para la traducción en un hospedador particular. Se conocen los codones preferidos para la traducción de un ácido nucleico en, por ejemplo, E. coli y S. cerevisiae.
La mutación de polipéptidos se puede lograr, por ejemplo, mediante sustituciones, adiciones o deleciones de un ácido nucleico que codifica el polipéptido. Las sustituciones, adiciones o deleciones de un ácido nucleico que codifica el polipéptido se pueden introducir mediante muchos procedimientos, incluidos, por ejemplo, PCR propensa a errores, mezcla aleatoria, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, PCR de ensamblaje, mutagénesis por PCR, mutagénesis in vivo, mutagénesis en casete, mutagénesis de conjunto recursivo, mutagénesis de conjunto exponencial, mutagénesis específica de sitio (Ling y col 1997 Anal Biochem 254(2):157-178), reensamblaje de genes, mutagénesis por saturación del sitio del gen (GSSM), reensamblaje de ligación sintética (SLR) o una combinación de estos procedimientos. Las modificaciones, adiciones o deleciones de un ácido nucleico también pueden introducirse mediante un procedimiento que comprende recombinación, recombinación de secuencia recursiva, mutagénesis de ADN modificado con fosfotioato, mutagénesis de plantilla que contiene uracilo, mutagénesis dúplex con huecos, mutagénesis de reparación de desajustes puntuales, mutagénesis de cepas hospedadoras deficiente de reparación, mutagénesis química, mutagénesis radiogénica, mutagénesis por deleción, mutagénesis por restricción-selección, mutagénesis por restricción-purificación, mutagénesis de conjunto, creación de multímeros de ácidos nucleicos quiméricos, o una combinación de los mismos.
En particular, se puede utilizar la síntesis de genes artificiales (Nambiar y col 1984 Science 223:1299-1301, Sakamar y Khorana 1988 Nucl. Acids Res 14:6361-6372, Wells y col 1985 Gene 34:315-323 y Grundstrom y col 1985 Nucl. Acids Res 13:3305-3316). Un gen que codifica un polipéptido de la invención se puede producir sintéticamente, por ejemplo, mediante síntesis de ADN en fase sólida. Pueden sintetizarse genes completos de nuevo, sin necesidad de ADN de plantilla precursor. Para obtener el oligonucleótido deseado, los componentes básicos se acoplan secuencialmente a la cadena de oligonucleótidos en crecimiento en el orden requerido por la secuencia del producto. Una vez que se completa el ensamblaje de la cadena, el producto se libera de la fase sólida a la solución, se desprotege y se recolecta. Los productos se pueden aislar mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para obtener los oligonucleótidos deseados de alta pureza (Verma y Eckstein 1998 Annu Rev Biochem 67:99-134)
La expresión de dominios variables de la cadena de inmunoglobulina, como VH y VHH, se puede lograr utilizando un vector de expresión adecuado, como una célula procariota, como una bacteria, por ejemplo, E. coli (por ejemplo, según los protocolos descritos en WO94/04678, detallado más adelante). La expresión de dominios variables de cadena de inmunoglobulina tales como VH y VHH también se puede lograr usando células eucariotas, por ejemplo, células de insecto, células CHO, células Vero o adecuadamente células de levadura tales como levaduras pertenecientes a los géneros Aspergillus, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia. Se utiliza adecuadamente S. cerevisiae (por ejemplo, según los protocolos descritos en WO94/025591, detallado más adelante).
Específicamente, los VHH se pueden preparar según los procedimientos descritos en WO94/04678 usando células de E. coli mediante un procedimiento que comprende los etapas de:
a) clonar en un vector Bluescript (Agilent Technologies) una secuencia de ADN o ADNc que codifica para el VHH (por ejemplo, obtenida de linfocitos de camélidos o producida sintéticamente) incluyendo opcionalmente una etiqueta His, b) recuperar el fragmento clonado después de la amplificación usando un cebador 5' específico para el VHH que contiene un sitio Xhol y un cebador 3' que contiene el sitio Spel que tiene la secuencia TC TTA ACT AGT GAG g Ag ACG GTG ACC TG (SEQ ID NO: 58) ,
c) clonar el fragmento recuperado en fase en el vector Immuno PBS (Huse y col 1989 Science 246 (4935):1275-1281) después de la digestión del vector con las enzimas de restricción Xhol y Spel,
d) transformar células hospedadoras, especialmente E. coli por transfección con el vector PBS Inmuno recombinante de la etapa c,
e) recuperar el producto de expresión de la secuencia codificante de VHH, por ejemplo mediante purificación por afinidad tal como mediante cromatografía en una columna usando Proteína A, intercambio catiónico o una resina de afinidad por níquel si el VHH incluye una etiqueta His.
Alternativamente, los dominios variables de la cadena de inmunoglobulina como VH y VHH se pueden obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
a) obtener una secuencia de ADN o ADNc que codifique un VHH, que tenga un sitio de unión a antígeno específico determinado,
b) amplificar el ADN o ADNc obtenido, utilizando un cebador 5' que contiene un codón de iniciación y un sitio HindIII, y un cebador 3' que contiene un codón de terminación que tiene un sitio XhoI,
c) recombinar el ADN o ADNc amplificado en los sitios HindIII (posición 2650) y XhoI (posición 4067) de un plásmido pMM984 (Merchlinsky y col 1983 J. Virol. 47:227-232),
d) transfectar células permisivas, especialmente células NB-E (Faisst y col 1995 J Virol 69:4538-4543) con el plásmido recombinante,
e) recuperar los productos obtenidos.
Además, los dominios variables de la cadena de inmunoglobulina como VHH o VH se pueden producir utilizando E. coli o S. cerevisiae según los procedimientos descritos en Frenken y col 2000 J Biotech 78:11-21 y WO99/23221 de la siguiente manera:
Después de tomar una muestra de sangre de una llama inmunizada y enriquecer la población de linfocitos a través de Ficoll (un polisacárido hidrófilo neutro, altamente ramificado, de gran masa, que se disuelve fácilmente en soluciones acuosas - Pharmacia), centrifugación en gradiente discontinuo, aislando ARN total por extracción con tiocianato de guanidio ácido (Chomezynnski y Sacchi 1987 Anal Biochem 162:156-159), y la síntesis de ADNc de la primera cadena (p. ej., utilizando un kit de ADNc como RPN 1266 (Amersham)), los fragmentos de ADN que codifican los fragmentos VHH y VH y parte de la región bisagra corta o larga se amplifican mediante PCR utilizando los cebadores específicos detallados en las páginas 22 y 23 de WO99/23221. Tras la digestión de los fragmentos de PCR con PstI y HindIII o BstEII, los fragmentos de ADN con una longitud entre aproximadamente 300 y 450 pb se purifican mediante electroforesis en gel de agarosa y se ligan en el vector fagémido pUR4536 de E. coli o en el vector de expresión pUR4548 episomal de S. cerevisiae, respectivamente. pUR4536 se deriva de pHEN (Hoogenboom y col 1991 Nucl Acid Res 19:4133-4137) y contiene el gen laclq y sitios de restricción únicos para permitir la clonación de los genes VHH y VH de llama. pUR4548 se deriva de pSY1 (Harmsen y col 1993 Gene 125:115-123). A partir de este plásmido, el sitio BstEII en el gen leu2 se elimina mediante PCR y los sitios de clonación entre la secuencia señal SUC2 y el terminador se reemplazan para facilitar la clonación de fragmentos de genes VH/VHH. Los VH/VHHs tener la etiqueta c-myc en el extremo C para detección. Colonias individuales de E. coli JM109 se transfieren a placas de microtitulación de 96 pocillos que contienen 150 ml de medio 2TY suplementado con glucosa al 1 % y 100 mg L'1 de ampicilina. Después del crecimiento durante la noche (37 grados C), las placas se duplican en medio 2TY que contiene 100 mg L-1 de ampicilina e IPTG 0,1 mM. Después de otra incubación durante la noche y, opcionalmente, congelación y descongelación, las células se centrifugan y sedimentan y el sobrenadante se puede usar en un ELISA. Colonias individuales de S. cerevisiae se transfieren a tubos de ensayo que contienen medio mínimo selectivo (que comprende 0,7 % de base nitrogenada de levadura, 2 % glucosa, suplementada con los aminoácidos esenciales y bases) y se cultivan durante 48 ha 30 grados C. Posteriormente, los cultivos se diluyen diez veces en medio YPGal (que comprende 1 % de extracto de levadura, 2 % de bacto peptona y 5 % de galactosa). Después de 24 y 48 h de crecimiento, las células se sedimentan y el sobrenadante del cultivo se puede analizar en un ELISA. La absorbancia a 600 nm (OD600) es medida opcionalmente.
Además, los dominios variables de la cadena de inmunoglobulina como VH/VHHs se puede producir usando S. cerevisiae usando el siguiente procedimiento:
Aislar una secuencia de ADN de origen natural que codifica el VH/VHH u obtener una secuencia de ADN producida sintéticamente que codifica el VH/VHH, incluyendo una secuencia señal 5'-UTR, codones de parada y flanqueada con sitios Sacl y HindIII (tal secuencia sintética se puede producir como se describe anteriormente o, por ejemplo, se puede pedir a un proveedor comercial como Geneart (Life Technologies)).
Usar los sitios de restricción para la transferencia del gen VH/VHH al vector de integración multicopia (MCI) pUR8569 o pUR8542, como sigue. Cortar la secuencia de ADN que codifica el VHH contenido opcionalmente dentro de un vector lanzadera, casete u otra construcción de gen sintético y el vector MCI con Sacl y HindIII utilizando: 25 ul de ADN de VHH (plásmido Geneart o vector MCI), 1 ul de Sacl, 1 ul de HindIII, 3 ul de un tampón adecuado para la doble digestión, como el tampón NEB 1 (New England Biolabs) durante la noche a 37 grados C. Correr 25 ul de ADN digerido que codifica el VHH y 25 ul del vector MCI digerido en un gel de agarosa al 1,5 % con tampón 1xTAE y a continuación realizar la extracción en gel, por ejemplo, utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen)). Configurar una ligadura del vector MCI digerido y el a Dn digerido que codifica el VH/VHH de la siguiente manera: 100 ng de vector, 30 ng del gen VHH, 1,5 ul de tampón de ligasa 10x, 1 ul de ligasa de ADN T4 y ddH2O. A continuación realizar la ligadura durante la noche a 16 grados C.
A continuación, transformar las células de E. coli. Para células azules XL-1 químicamente competentes, descongelar 200 ul de células azules XL-1 competentes al calor y agregar 5 ul de mezcla de ligadura en hielo durante aproximadamente 30 minutos, seguido de un choque térmico durante 90 segundos a 42 grados C. A continuación agregar 800 ul de medio de Luria-Bertani bajo en sal complementado con 2 % de glucosa y recuperar las células durante 2 horas a 37 grados C. Colocar células en placas de agar de Luria-Bertani y ampicilina (100 ug/ml) y mantenerlas durante la noche a 37 grados C. Para células de E. coli TG1 electrocompetentes, usar una cubeta de electroporación. En la cubeta de electroporación: descongelar 50 ul de células TG1 electrocompetentes y 1 ul de mezcla de ligadura en hielo durante unos 15 minutos. Colocar la cubeta en el soporte y pulsar. Añadir 500 ul de medio 2TY y recuperar las células durante 30 minutos a 37 grados C. Sembrar 100 ul de células en placas de agar de Luria-Bertani, que contiene ampicilina (100 ug/ml) y 2 % de glucosa Mantener las placas a 37 grados C durante la noche.
Después de la clonación del gen VH/VHH en E. coli como se detalló anteriormente, S. cerevisiae se puede transformar con el vector MCI linealizado. Antes de llevar a cabo la transformación, se realizan algunas etapas: (i) el ADN debe cambiarse de circular a lineal mediante digestión o, de lo contrario, el ADN no puede integrarse en el genoma de la levadura y (ii) el ADN digerido debe limpiarse de impurezas mediante precipitación con etanol. Además, durante el procedimiento de transformación, las células de levadura se vuelven semipermeables para que el ADN pueda atravesar la membrana.
Preparación para la transformación de levadura: realizar una digestión Hpal del midi-prep preparado a partir de la colonia de E. coli seleccionada que expresa la VH/VHH gen de la siguiente manera. Preparar una solución de 100 ul que contenga 20 ng de midi-prep, 5 ul de Hpal, 10 ul de un tampón adecuado como el tampón NEB4 (BioLabs) y ddH2O.
Cortar el ADN con el Hpal a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, realizar una precipitación con etanol (y dejar a un lado una muestra de 5 ul de la digestión con Hpal). Añadir 300 ul de etanol al 100 % a 95 ul de midiprep digerido con Hpal, agitar en vórtex y centrifugar a máxima velocidad durante 5 minutos. Decantar cuidadosamente cuando haya un sedimento presente, agregar 100 ul de etanol al 70 %, a continuación girar nuevamente durante 5 minutos a toda velocidad. Decantar la muestra nuevamente y mantenerla a 50-60 grados C hasta que el sedimento esté seco. Volver a suspender el sedimento en 50 ul de ddH2O. Correr 5 ul en un gel junto a los 5 ul de muestra digerida con Hpal.
Transformación de levadura: preparar placas de YNBglu. Usar 10 g de agar 425 ml de agua (esterilizada), 25 ml de YNB filtrado 20x (3,35 g de YNB (base nitrogenada de levadura) en 25 ml de H2O esterilizada) y 50 ml de glucosa al 20 % estéril y verter en placas de Petri. Elegir una colonia de levadura de la placa maestra y cultarla en 3 ml de YPD (extracto de levadura peptona dextrosa) durante la noche a 30 grados C. Al día siguiente, preparar unos 600 ml de YPD y usarlos para llenar 3 matraces con 275 ml, 225 ml y 100 ml de YPD. Añadir 27,5 ul de cultivo de YPD de levadura al primer matraz y mezclar suavemente. Tomar 75 ml del primer matraz y ponerlos en el segundo matraz, mezclar suavemente. Tomar 100 ml del segundo matraz y ponerlos en el tercero, mezclar suavemente. Crecer hasta alcanzar una OD660 entre 1 y 2. Dividir el matraz hasta alcanzar esta OD en 4 tubos Falcon, ± 45ml en cada uno. Girar durante 2 minutos a 4200 rpm. Desechar el sobrenadante. Disolver los sedimentos en dos tubos Falcon con 45 ml de H2O (reduciendo el número de tubos de 4 a 2). Girar durante 2 minutos a 4200 rpm. Disolver los sedimentos en 45 ml de H2O (de 2 tubos a 1). Girar durante 2 minutos a 4200 rpm. Disolver suavemente los sedimentos en 5 ml de acetato de litio (LiAc) (100 mM) y girar durante unos segundos. Desechar con cuidado un poco de LiAc, pero conservar más de la mitad del LiAc en el tubo. Girar en vórtice las células, hervir el ADN vehículo durante 5 minutos y enfriar rápidamente en agua helada. Añadir a un tubo de 15 ml que contenga: 240 ul de PEG, 50 ul de células, 36 ul de LiAc (1 M), 25 ul de ADN vehículo, 45 ul de VH/VHH precipitado con etanol. Mezclar suavemente después de cada etapa (tratar la muestra en blanco de la misma manera, solo que sin VH/VHH precipitado con etanol). Incubar durante 30 minutos a 30 grados C, invertir suavemente el tubo de 3 a 4 veces, a continuación aplicar calor durante 20 a 25 minutos a 42 grados C. Girar hasta 6000 rpm durante un breve período de tiempo. Retirar suavemente el sobrenadante y agregar 250 ul ddH2O y mezclar. Esparcir todo en una placa YNBglu hasta que las placas estén secas y crezcan durante 4-5 días a 30 grados C. Finalmente, preparar las placas YNBglu dividiéndolas en 6 partes iguales, numerar las partes del 1 al 6, inocular la colonia más grande y esparcir el número 1. Repetir para otras colonias de grandes a pequeñas de 1 a 6. Cultivar a 30 grados C durante 3-4 días hasta que se produzcan colonias. Los clones de VH/VHH se cultivan utilizando glucosa como fuente de carbono, y la inducción de la expresión de VH/VHH se realiza activando el promotor de galactosa-7 mediante la adición de galactosa al 0,5 %. Realizar un cultivo a pequeña escala de 3 ml para probar las colonias y elegir cuál muestra la mejor expresión de VH o VHH. Esta colonia se utiliza a continuación en la purificación.
Purificación: el VH/VHH se purifica mediante cromatografía de intercambio catiónico con una resina aniónica fuerte (como Capto S). El día 1, inocular la colonia de levadura seleccionada que exprese el VH/VHH en 5 ml de medio YPD (medio y P 2 % de glucosa) y hacer crecer las células en tubos estériles sellados de 25 ml a 30 grados C durante la noche (agitando a 180 rpm). En el día 2, diluir los 5 ml de cultivo durante la noche en 50 ml de medio YP recién preparado 2 % de glucosa galactosa al 0,5 %, hacer crecer las células en matraces con deflectores aireados de 250 ml a 30 grados C durante dos noches (agitando a 180 rpm). En el día 4, hacer girar las células en una centrífuga a 4200 rpm durante 20 min. Etapa de purificación de intercambio catiónico utilizando una resina aniónica fuerte: ajustar el pH del sobrenadante que contiene el ligando a 3,5. Lavar 0,75 ml resina (+/-0.5mL suspensión) por 50 ml de sobrenadante con 50 ml de ddH2O seguido de tres lavados con tampón de unión. Agregar la resina lavada al sobrenadante e incubar la suspensión a 4 grados C en un agitador durante 1,5 horas. Sedimentar el VH/VHH unido por resina por centrifugación a 500 g durante 2 minutos y lavar con tampón de lavado. Decantar el sobrenadante y volver a suspender la resina con 10 ml de tampón de unión. Colocar un filtro en una columna PD-10, verter la resina en la columna y dejar que la resina se asiente por un tiempo, a continuación agregar un filtro sobre la resina. Esperar hasta que se haya agotado todo el tampón de unión. Eluir el VH/VHH con tampón de elución 6 * 0,5 ml. Recoger las fracciones de elución en tubos de Eppendorf. Medir la concentración de proteína de las 6 fracciones eluidas con un Nanodrop. Reunir las fracciones que contienen el VHH y transferir la solución a una membrana de diálisis de corte de 3500 Da. Dializar la solución de proteína purificada contra 3 L de PBS durante la noche a 4 grados C. El día 5, dializar la solución de proteína purificada contra 2 L de PBS fresco durante 2 horas adicionales a 4 grados C. Finalmente, calcular la concentración final por BCA.
Aunque discutido en el contexto del VH/VHH, las técnicas descritas anteriormente también podrían usarse para scFv, Fab, Fv y otros fragmentos de anticuerpos si es necesario.
Múltiples fragmentos de unión a antígeno (adecuadamente VH/VHHs) puede fusionarse mediante reticulación química al hacer reaccionar residuos de aminoácidos con un agente derivatizante orgánico como el descrito por Blattler y col Biochemistry 24:1517-1524. Alternativamente, los fragmentos de unión a antígeno pueden fusionarse genéticamente a nivel de a Dn , es decir, se forma una construcción polinucleotídica que codifica la construcción polipeptídica completa que comprende uno o más fragmentos de unión a antígeno. Una forma de unir múltiples fragmentos de unión a antígeno a través de la ruta genética es enlazando las secuencias codificantes del fragmento de unión a antígeno directamente o mediante un enlazador peptídico. Por ejemplo, el extremo carboxi del primer fragmento de unión a antígeno puede estar unido al extremo amino del siguiente fragmento de unión a antígeno. Este modo de enlace se puede ampliar para enlazar fragmentos de unión a antígeno para la construcción de construcciones tri-, tetra-, etc. funcionales. Un procedimiento para producir construcciones polipeptídicas VHH multivalentes (tales como bivalentes) se describe en WO 96/34103.
Adecuadamente, el polipéptido de la invención (en particular, un VHH de la invención) se puede producir en un hongo tal como una levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) que comprende el crecimiento del hongo en un medio que comprende una fuente de carbono donde 50-100 % en peso de dicha fuente de carbono es etanol, según los procedimientos descritos en WO02/48382. La producción a gran escala de fragmentos VHH en S. cerevisiae se describe en Thomassen y col 2002 Enzyme and Micro Tech 30:273-278.
En esta invención se describe un procedimiento para la preparación del polipéptido o construcción de la invención que comprende las siguientes etapas:
i) clonar en un vector, como un plásmido, el polinucleótido de la invención,
ii) transformar una célula, tal como una célula bacteriana o una célula de levadura capaz de producir el polipéptido o construcción de la invención, con dicho vector en condiciones que permitan la producción del polipéptido o construcción,
iii) recuperar el polipéptido o construcción, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad.
La presente invención se describirá adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Inmunización de llamas, exhibición de fagos, selección y propagación de dominios variables de cadena de inmunoglobulina
1.1 Protocolo de inmunización 1
Inicialmente, dos llamas (llama 33 y llama 35) recibieron cada una 3 inyecciones (en los días 0, 14 y 28) de TNF-alfa recombinante humano soluble (100 ug inyectados por vía intramuscular, después de mezclar 1:1 con adyuvante Stimune) seguido de 2 inyecciones (en los días 56 y 70) con células THP-1 que habían sido preactivadas mediante incubación con lipopolisacárido bacteriano para aumentar la expresión de TNF-alfa en la membrana (107 células THP-1 inyectadas por vía subcutánea en 1 ml de PBS ). Se administró una inmunización de refuerzo final con TNF-alfa soluble y células THP-1 activadas el día 84 y se extrajo sangre 9 días después para el aislamiento de linfocitos de sangre periférica y la extracción de ARN para la construcción de bibliotecas.
1.2 Protocolo de inmunización 2
Después de descansar durante un período de cuatro meses, las llamas fueron reinmunizadas con dos inyecciones con una semana de diferencia de células CHO Flp-In que habían sido diseñadas para expresar una forma transmembrana no escindible de TNF-alfa humano. Se extrajo sangre dos semanas después para el aislamiento de linfocitos de sangre periférica y se extrajo el ARN para la construcción de bibliotecas. Se evaluaron respuestas inmunitarias séricas a inmunizaciones para cada una de las llamas en varios puntos de tiempo midiendo la unión de los anticuerpos de cadena pesada solamente al TNF-alfa humano inmovilizado utilizando un formato de placa ELISA y detección con suero de dominio anti-variable policlonal de conejo e IgG anti-conejo de burro acoplados a peroxidasa de rábano picante (HRP). Las curvas de titulación obtenidas mostraron que cada una de las llamas había respondido a la primera ronda de inmunizaciones dando altos títulos de anticuerpos de cadena pesada IgG que se unen a TNF-alfa. También se observaron títulos elevados de anticuerpos séricos después de la segunda ronda de inmunizaciones, aunque estos fueron algo más bajos para ambos animales.
1.3 Construcción de biblioteca de fagos
Las células sanguíneas recolectadas de cada llama al final de cada fase de inmunización se usaron para generar cuatro bibliotecas de exhibición de fagos separadas. (#33, #35, #33NEW y #35NEW). El ARN total se extrajo de los linfocitos de sangre periférica que se aislaron de cada una de las llamas inmunizadas (llamas 33 y 35). A continuación, se usó el ARN para generar ADNc usando transcriptasa inversa y cebadores u oligonucleótidos octámeros aleatorios. A continuación se realizó la PCR para amplificar específicamente la región del dominio variable de los anticuerpos solo de cadena pesada, utilizando cebadores adecuados. Los fragmentos de ADNc que codifican el repertorio de dominio variable se clonaron en un vector fagémido y la biblioteca se introdujo en E. coli. Los fagos se rescataron de las bacterias que contenían las bibliotecas inoculando respectivamente 40 y 51 ul de la solución madre de glicerol en 50 ml de medio que contenía glucosa y ampicilina. Cuando los cultivos estaban en fase logarítmica, se añadió fago auxiliar para infectar los cultivos y producir fagos. Al día siguiente, los fagos producidos se precipitaron del sobrenadante del cultivo utilizando una solución de PEG/NaCl. El número de fagos se determinó por titulación de la solución e infectando E. coli TG1 en fase logarítmica con las diferentes diluciones de fagos. Se usó la dilución más alta que aún daba lugar a la formación de colonias para calcular los títulos de los fagos. Para la selección en sTNF-alfa, una placa estéril de 96 pocillos (como Maxisorp) se cubrió durante la noche a 4 grados C con 1000, 250 o 63 ng/pocillo o PBS solamente. Al día siguiente se taponaron los pocillos de la placa con 4 % Marvel en PBS, a continuación los fagos precipitados, que fueron preincubados con 2 % de marvel/PBS, se agregaron a los pocillos. Después de un lavado extenso con PBS-Tween y PBS, los fagos unidos se eluyeron utilizando un choque de pH alcalino (trietilamina 0,1 M) durante 15 minutos y se neutralizaron con Tris-HCl 1 M pH 7,5 (elución total) o con elución competitiva, utilizando un exceso de 10 veces del receptor de TNF, durante dos horas. El número de fagos eluidos se determinó por titulación de las eluciones de los diferentes pocillos seguido de infección de E. coli TG1 en fase logarítmica. Aproximadamente la mitad de los fagos eluidos se rescataron infectando TG1 en fase logarítmica y seleccionando en medio que contenía ampicilina y glucosa.
1.4 Selecciones de bibliotecas para fagos con actividad de unión a TNF-alfa humana y de mono cynomolgous
Los dominios variables con actividad antagonista de TNF-alfa se aislaron de las cuatro bibliotecas de presentación de fagos mediante la unión del fago al TNF-alfa humano seguido de la elución de los dominios variables específicos de TNF-alfa con un exceso de proteína de fusión TNFR2-Fc soluble (etanercept), o por elución por lotes. A continuación, se realizó una segunda ronda de selección mediante la unión del fago específico de TNF-alfa humano eluido a TNF-alfa de mono cynomolgus de modo que se pudiera obtener un grupo de dominios variables con actividad de unión a TNF-alfa entre especies.
1.4.1 Primera ronda de selecciones de bibliotecas de fagos que presentan dominios variables con actividad de unión al TNF-alfa humano
Las bibliotecas de fagos se derivaron de llama 33 y llama 35 con respecto a cada etapa de inmunización (inmunización de primera etapa: Biblioteca #33 y Biblioteca #35; inmunización de segunda etapa: Biblioteca #33NEW y Biblioteca #35NEW). Se realizó una primera ronda de selección para aislar el fago que presentaba dominios variables con actividad de unión a TNF-alfa mediante inmunoadsorción en TNF-alfa humano.
TNF-alfa humano recombinante soluble (1000, 250 o 63ng/pocillo) se revistió directamente sobre pocillos de una placa de micropocillos de polipropileno hidrofilizado (HPM) (por ejemplo, Nunc maxisorp) y se permitió que los fagos se adhirieran. Después de un lavado extenso, los fagos unidos se recolectaron utilizando (i) elución no selectiva por choque de pH alcalino o (ii) mediante el desplazamiento selectivo de los fagos unidos a TNF-alfa mediante la adición de TNFR2-Fc (etanercept 100, 25 y 6,3 ug/ml, 2 h).
Biblioteca #33 y Biblioteca #35 - El número de fagos eluidos de los pocillos de control (sin control de TNF-alfa y PBS) fue bajo y para ambas bibliotecas hubo enriquecimientos relacionados con la concentración de fagos eluidos de los pocillos que habían sido recubiertos previamente con TNF-alfa, utilizando cualquiera de los procedimientos de elución. En general, los enriquecimientos de fagos que se unen a TNF logrados en las selecciones de la primera ronda fueron aproximadamente 100 veces mayores para ambas Bibliotecas #33 y #35.
Biblioteca #33NEW y Biblioteca #35NEW - Se encontró que el número de clones recuperados de las primeras rondas de selección de las bibliotecas preparadas a partir de las llamas reinmunizadas era bajo. Esto puede haber reflejado una menor respuesta inmune de las llamas a las células mTNF-alfa-CHO (menor número de clones reactivos a TNF-alfa en total) o que la respuesta condujo a la generación de clones reactivos a mTNF-alfa pero que solo un un número limitado de estos reaccionaron de forma cruzada con la forma soluble de TNF-alfa. Los fagos eluidos en la primera ronda de selecciones con TNFR2-Fc (etanercept) de los pocilios recubiertos con 1000 ng/ml el TNF-alfa humano se expandió produciendo suspensiones con títulos de aproximadamente 2 * 1012 fagos /ml.
1.4.2 Selecciones de segunda ronda para fagos que muestran dominios variables de cadena de inmunoglobulina con actividad de unión al TNF-alfa humano y de mono cynomolgus
Biblioteca #33 y Biblioteca #35 - Las selecciones de la segunda ronda se realizaron mediante la unión de los fagos seleccionados a TNF-alfa humano o de mono cynomolgus soluble (500, 125 o 31 ng/pocillo o PBS) que se había adsorbido previamente en la superficie del pocillo de una placa de HPM. Los fagos unidos a TNF-alfa humano se eluyeron con TNFR2-Fc soluble (50, 12,5 y 3,1 ug/ml respectivamente) mientras que aquellos unidos a TNF-alfa de mono cynomolgus se eluyeron utilizando un choque de pH alcalino. Las recuperaciones de las selecciones en el TNF-alfa de mono cynomolgus fueron más bajas que las del TNF-alfa humano, posiblemente debido a frecuencias más bajas en ambas bibliotecas de fagos que expresan dominios variables que tienen reactividad cruzada con el TNF-alfa humano y de mono cynomolgus. Biblioteca # 33NEW y Biblioteca # 35NEW - Las selecciones de la segunda ronda se realizaron mediante la unión de los fagos seleccionados a TNF-alfa de mono cynomolgus soluble (1000, 250 o 63ng/pocillo o PBS) que se había adsorbido previamente en la superficie del pocillo de una placa de HPM. Los fagos unidos se eluyeron utilizando un choque de pH alcalino.
Ejemplo 2: Evaluación primaria de sobrenadantes periplásmicos de clones de dominio variable de cadena de inmunoglobulina seleccionados al azar
2.1 Propagación y generación de extractos periplásmicos para evaluación primaria
El fago presente en los eluatos de las selecciones de la primera ronda en TNF-alfa humano y las selecciones de la segunda ronda en TNF-alfa de mono cynomolgus se usaron para infectar células TG1 de E. coli. Las colonias se eligieron al azar (186 clones de Bibliotecas #33 y #35 en placas maestras M60-M63; 96 clones de Bibliotecas #33NEW y Biblioteca #35NEW en la placa maestra M65) y se propagaron para generar sobrenadantes periplásmicos mediante centrifugación secuencial, resuspensión en 1xPBS, fractura por congelación-descongelación y centrifugación de los cultivos propagados (M60-63 y M65 también se conocen como 'MP60-63' y 'MP65', respectivamente; los sobrenadantes periplásmicos también se denominan fracciones periplásmicas (PF) o extractos).
Los extractos periplásmicos se seleccionaron para evaluar su capacidad para (i) inhibir la unión de TNF-alfa humano soluble a TNFR2-Fc en una placa ELISA y (ii) neutralizar la citotoxicidad inducida por TNF-alfa en el ensayo de concentración fija L929 . En el ensayo L929, el efecto citotóxico de TNF-alfa (0,5ng/ml) se considera que está mediado a través de TNFR1, por lo que se espera que los dominios variables con actividades inhibidoras en los ensayos de unión a TNF-alfa-TNFR2 y L929 supriman las respuestas de TNF-alfa mediadas a través de cualquiera de los receptores.
2.2.1 Evaluación de la actividad de unión y neutralización de TNF-alfa (placas maestras M60-M63)
Se realizaron ensayos de citotoxicidad y ELISA de L929 en las 186 fracciones periplásmicas obtenidas de clones seleccionados de entre la Biblioteca #33 y Biblioteca #35. Los clones se dispusieron en 4 placas maestras M60, M61, M62 y M63 y se produjeron fracciones periplásmicas a partir de estas placas maestras. M60-61 contenía clones seleccionados al azar de la biblioteca #33 y #35. M62-63 contenía clones seleccionados de entre las mismas bibliotecas después de que se realizaran 2 etapas posteriores de selección de la siguiente manera: (i) 10 ug/mL hsTNF-alfa y etanercept para la elución; (ii) hsTNF-alfa (5 ug/mL y 0,3 ug/mL) o cynomolgus sTNF-alfa (5 ug/mL y 0,3 ug/mL) seguido de elución selectiva con etanercept o elución completa con trietilamina. Todas las 186 PF se analizaron mediante un ensayo de citotoxicidad L929 independiente de la concentración utilizando resazurina.
2.2.2 Detección de sobrenadantes periplásmicos por ELISA (placas maestras M60-63)
La concentración de TNF-alfa utilizada para la detección fue 1,25ng/ml. Los sobrenadantes periplásmicos se analizaron en dilución 1/20 (M60 y M61) o dilución 1/10 (M62 y M63) en 1 % de BSA. Los sobrenadantes de TNF-alfa y periplásmico se prepararon al doble de la concentración del ensayo y a continuación se mezclaron 1:1. Se realizaron determinaciones por triplicado para cada sobrenadante. Además, se utilizó adalimumab a 10 nM como control de anticuerpos neutralizantes positivos. En cada placa ELISA, una dosis-respuesta de TNF-alfa limitada (0-5 ng/ml) también se incorporó. Las placas ELISA para los análisis de los sobrenadantes periplásmicos se cubrieron durante la noche con etanercept 0,7 ug/ml, 50 ul/pocillo. Después de lavar y bloquear, se añadieron las mezclas de sobrenadante de TNF-alfa y se incubaron durante 2 h. Los ELISA se desarrollaron utilizando el anticuerpo anti-TNF-alfa humano de conejo policlonal biotinilado, por ejemplo, BAF210 (R & Sistemas D) a 0,2 ug/ml seguido de mAvidina - HRP y a continuación TMB.
Ninguno de los clones en M60 o M61 tuvo una actividad neutralizadora de TNF-alfa significativa (todos los clones demostraron alrededor o menos del 10 % de neutralización de TNF-alfa). Por el contrario, adalimumab proporcionó una inhibición casi completa en el ELISA en todas las placas donde se incluyó. Muchos de los clones en M62 (derivados de la biblioteca 33) mostraron una buena neutralización de TNF-alfa (11 clones lograron una neutralización del 90 % o más y 45 clones lograron una neutralización del 50 % o más). También se encontraron algunos buenos clones neutralizantes en M63 (derivados de la biblioteca 35), pero los números fueron mucho más bajos que en M62, aunque los procedimientos de selección fueron idénticos (2 clones lograron una neutralización del 90 % o más y 7 clones lograron una neutralización del 50 % o mayor neutralización).
2.2.3 Detección de sobrenadantes periplásmicos (PS) mediante ensayo de citotoxicidad L929 de concentración fija (placas maestras M60-M63)
Materiales
-Células L929 (10000 células/pocillo)
-concentración fija de TNF-alfa humano para el ensayo: 500 pg/ml
-Concentración de actinomicina D: 0,75 ug/mL
-PS de placas maestras M60-M63 diluido en el ensayo 1:10
-VHH anti-TNF-alfa puro como control positivo: concentración final 250 nM
-curva dosis-respuesta corta de TNF-alfa humano: 500, 125, 31,25, 7,8 pg/ml
-tiempos de incubación: 24h
-reactivo de viabilidad celular de resazurina
Procedimiento
10000 células/pocillo en 100 ul se sembraron el día 0 en microplacas de 96 pocillos en medio completo DMEM y se incubaron durante la noche a 37 grados C, 5 % de CO2. El día 1 se prepararon placas de dilución (con volúmenes suficientes para triplicar para cada punto) y además cada placa contenía como controles:
1. DMEM completo 0,01 % Tritón X-100
2. DMEM completo 0,75 ug/mL Actinomicina D
3. Curva dosis-respuesta de TNF-alfa 0,75 ug/mL Actinomicina D
Se eliminó el medio de cada pocillo de la microplaca y se incubaron las células con 100 ul de DMEM completo que contenía hTNF-alfa a 500 pg/mL+ 0,75 ug/mL Actinomicina D PS (1:10) o con 100 ul de los diferentes controles. Después de 24 h de incubación a 37 grados C se añadieron 5 % de CO2, 10 ul de resazurina a cada pocillo y las células se incubaron durante 2 h a 37 grados C. 5 % de CO2.50 ul de SDS al 3 % se añadieron posteriormente a cada pocillo. A continuación, las placas se leyeron en un lector de placas fluorescentes a Excitación (Ex) 544 nm. / Emisión (Em) 590 nm.
Resultados
Ninguno de los sobrenadantes periplásmicos de M60-61 mostró un efecto protector sobre las células L929 frente al TNF-alfa humano. El control positivo mostró protección frente al efecto del TNF-alfa, mientras que el VHH irrelevante no. Múltiples sobrenadantes periplásmicos de los clones seleccionados de M62-63 mostraron un efecto protector sobre las células L929 frente al TNF-alfa (107 clones lograron una supervivencia superior o igual al 50 %). El control positivo mostró neutralización de TNF-alfa (mayor o igual a 100 %), mientras que el VHH irrelevante mostró menos del 10 % de neutralización de TNF-alfa.
2.3 Evaluación de la actividad de unión y neutralización de TNF-alfa (placa maestra M65)
Los ensayos de citotoxicidad ELISA y L929 se realizaron en M65 de la misma manera que los descritos anteriormente con respecto a M60-M63, a menos que se indique lo contrario.
2.3.1 Detección de sobrenadantes periplásmicos por ELISA (placa maestra M65)
Los sobrenadantes periplásmicos M65 de clones de dominio variable específicos de TNF-alfa (96 en total) se analizaron para determinar la inhibición de la unión de TNFR-2 - TNF-alfa mediante ELISA inmediatamente después de la descongelación y después de 18 horas de incubación a 37 grados C.
Las placas ELISA se recubrieron con 2 ug/ml, 50 ul/pocillo etanercept a 4 grados C durante la noche, lavadas y a continuación bloqueadas en preparación para la incubación con las mezclas de dominio variable de TNF-alfa. Se usó adalimumab a 10 nM como control positivo. Los sobrenadantes periplásmicos de dominio variable anti-TNF-alfa se diluyeron inicialmente 1:10 en 1 % de BSA, a continuación mezclado 1:1 con 2,5 ng/ml TNF-alfa y añadido a las placas ELISA. El procesamiento posterior de ELISA siguió el protocolo descrito anteriormente con respecto a M60-63.
Veintiocho de los sobrenadantes dieron una inhibición superior al 80% de la unión de TNF-alfa, de los cuales 18 retuvieron la mayor parte o la totalidad de la actividad inhibidora después de la incubación a 37 grados C.
2.3.2 Detección de sobrenadantes periplásmicos mediante ensayo de citotoxicidad L929 (placa maestra M65) El ensayo de citotoxicidad L929 se realizó con un total de 96 sobrenadantes periplásmicos (PS) obtenidos de clones seleccionados de entre 2 bibliotecas de presentación de fagos (M65 - de #33NEW y #35NEW). Los clones se recogieron después de realizar (i) una primera ronda de selecciones en hsTNF-alfa (10 ug/mL) etanercept y TEA para la elución y de (ii) una segunda ronda de selecciones en cynomolgus sTNF-alfa (10 ug/mL) seguido de elución completa con trietilamina. Todos los 96 PS se analizaron mediante el ensayo de citotoxicidad L929 utilizando resazurina.
Materiales
-Células L929 (10000 células/pocillo)
-concentración fija de TNF-alfa humano para el ensayo: 500 pg/ml concentración final
-Dilución de PS en el ensayo: 1:10
-VHH anti-TNF-alfa puro como control positivo: Concentración final 250 nM
-Sobrenadantes M65
-Curva dosis-respuesta corta de TNF-alfa: 500, 125, 7,8 pg/ml
-tiempo de incubación: 22 h
-Reactivo de viabilidad celular de resazurina
Procedimiento
10000 células/pocillo en 100 ul se sembraron el día 0 en microplacas Costar de 96 pocillos en medio completo DMEM y se incubaron durante la noche a 37 grados C y 5 % de CO2. El día 1 se prepararon placas de dilución (con volúmenes suficientes para triplicar para cada punto) y además cada placa contenía como controles:
1. DMEM completo 0,01 % Tritón X-100
2. DMEM completo 0,75 ug/mL Actinomicina D
3. Curva dosis-respuesta de TNF-alfa 0,75 ug/mL Actinomicina D
Se eliminó el medio de cada pocillo de la microplaca y se incubaron las células con 100 ul de DMEM completo que contenía hTNF-alfa a 500 pg/mL+ 0,75 ug/mL Actinomicina D PS (1:10) o con 100 ul de los diferentes controles. Después de 22h de incubación a 37 grados C se añadieron 10 ul de resazurina a cada pocillo y las células se incubaron durante 2 h a 37 grados C. 5 % de CO2. 50 ul de SDS al 3 % se añadieron posteriormente a cada pocillo. Las placas se leyeron a continuación usando el lector de placas de fluorescencia Ex544 nm/Em590 nm.
Múltiples sobrenadantes periplásmicos de los clones seleccionados de M65 mostraron un efecto protector sobre las células L929 contra h-TNF-alfa. En 9 clones, el tratamiento con las fracciones periplásmicas mostró una supervivencia superior al 120 % de las células L929. Un total de 53 clones de 96 mostraron una actividad neutralizante de TNF-alfa superior al 50 % en el ensayo L929 y entre ellos, 32 mostraron una neutralización casi completa.
2.3.3 Resistencia a la inactivación por tripsina y quimotripsina
Se analizó la resistencia de los sobrenadantes (y muestras purificadas) de los clones de dominio variable a la inactivación por tripsina y quimotripsina en función de la retención de su actividad de unión a TNF en el ELISA TNF-TNFR2.
Procedimiento
La tripsina y la quimotripsina se disolvieron por separado (en la mitad del volumen final) en Tris-HCl 1 mM pH 8,0, CaCl220 mM y a continuación se mezclaron para obtener una concentración final de 3 mg/mL cada uno (3 veces la concentración del ensayo). Se incubaron 20 uL de cada extracto periplásmico con 10 uL de PBS (no digerido) o con 10 uL de 3 mg/mL tripsina mezcla de quimotripsina (digerida) durante 75 min a 37 grados C. 30 uL de solución de parada de proteasa 2x helada (2 % BSA, 1xPBS, NaETDA 5 mM, AEBSF 4 mM, Aprotinina 0,6 pM, Bestatina 260 pM, EDTA 2 mM, E-6428 pM, Leupeptina 2 pM, PBSF 1 mM) a cada muestra y, posteriormente, 140 uL de 1xPBS, 1 % de BSA se agregaron a cada muestra para llegar a una dilución final 1:10 de los extractos periplásmicos. Un intervalo de concentraciones que incluye una concentración máxima de 3uM en 1% de BSA se preparó para cada muestra purificada. Se incubaron 10 uL de muestra purificada con 10 uL de mezcla de tripsina y quimotripsina (o PBS para muestra no digerida) y 10 uL de tampón de tripsina/quimotripsina. Las muestras periplásmicas y purificadas se almacenaron durante la noche a -80 grados C y se analizaron al día siguiente en el ensayo ELISA TNFR-2 - TNF-alfa. Las placas ELISA se recubrieron con etanercept a 0,7 ug/ml, 50 ul/pocillo durante la noche, se lavaron y a continuación se bloquearon en preparación para incubación con las muestras de dominio variable de TNF-alfa. Se mezclaron muestras de dominio variable de TNF-alfa 1:1 con 5 ng/ml h-TNF-alfa (para obtener una concentración de ensayo de TNF-alfa de 2,5ng/mL y muestras diluidas 1:20) y se agregaron 50 uL de cada muestra a las placas ELISA. Después de la incubación a 4 °C, las placas de ELISA se lavaron y se incubaron con 0,2ug/mL de anticuerpo anti-h-TNF-alfa de conejo policlonal biotinilado durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se lavaron las placas ELISA, se incubaron con 1:1000 conjugado de avidina-HRP modificado (mAvidin-HRP) (mAvidin, por ejemplo, ExtrAvidin® (Sigma) es una forma modificada de avidina de clara de huevo que retiene la alta afinidad y especificidad de la avidina por la biotina, pero no muestra la unión no específica en pH fisiológico que se ha informado para la avidina) durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron nuevamente y se agregaron 100 uL de sustrato TMB ELISA a cada muestra. Después de 30 min, la reacción se detuvo con 50 uL de H2SO40,5 M y se leyó la absorbancia de las placas ELISA a 450 nm.
Resultados 11 dominios variables (Q65B1-Q65F6) procedían de sobrenadantes periplásmicos y 4 dominios variables (Q62F2-Q62F11) procedían de muestras purificadas. Se encontró que 10 dominios variables en el sobrenadante periplásmico y 2 dominios variables purificados tenían una resistencia buena o excelente a la tripsina y la quimotripsina. Posteriormente se descubrió que 10 de estos dominios variables pertenecían a la misma familia (Familia 1, consultar la parte 2.4 a continuación) y 2 de estos dominios variables más tarde se descubrió que pertenecían a la misma familia (Familia 2, consultaqr la parte 2.4 a continuación). Q62F11, que no pertenece ni a la Familia 1 ni a la Familia 2, no fue resistente a la proteasa. Se cree que el resultado con Q62F10 se debe a un error experimental (Figura 1).
2.4 Resumen de la evaluación primaria
M62 y M63: De los 186 clones seleccionados originalmente, 52 de los sobrenadantes periplásmicos mostraron una neutralización mayor o igual al 50 % de TNF-alfa soluble humano en el ensayo de citotoxicidad celular L929, así como una inhibición de TNF mayor o igual al 50 % de inhibición de la actividad de unión de TNF-alfa-TNFR2 en el ensayo ELISA. Un análisis de secuencia realizado en 25 de los clones de dominio variable con mayor actividad neutralizante mostró que estos podían agruparse en familias. Clones representativos fueron seleccionados de entre los diferentes grupos familiares. Las secuencias de ADN de dominio variable se volvieron a clonar para una expresión de alto nivel en E. coli y los dominios variables purificados se generaron para estudios de evaluación más detallados.
M65: De los 96 clones seleccionados originalmente, 53 de los sobrenadantes periplásmicos mostraron una actividad neutralizante superior al 50 % contra el TNF-alfa soluble humano en el ensayo de citotoxicidad celular L929, así como una inhibición superior o igual al 50 % de actividad de unión de TNF-alfa-TNFR2 en el ensayo ELISA, mostrando 32 una neutralización casi completa en ambos ensayos. Para identificar los clones más estables, se analizó la inhibición de la unión de TNFR-2-TNF-alfa mediante ELISA en los sobrenadantes periplásmicos (96 en total) inmediatamente después de la descongelación y después de 18 horas de incubación a 37 grados C. Dieciocho de los sobrenadantes retuvieron la mayor parte o toda la actividad inhibidora de unión de TNFR-2-TNF-alfa. Los sobrenadantes periplásmicos más activos (28/96) a continuación se seleccionaron para ensayar la inhibición de la citotoxicidad de células L929 inducida por TNF de mono cynomolgus. Un análisis de secuencia realizado en 36 de los clones de dominio variable con mayores actividades neutralizantes de TNF-alfa y resistencia a proteasas mostró que estos podían agruparse con los dominios variables derivados de M62 y M63 en familias. Clones derivados de M65 representativos fueron seleccionados de entre los diferentes grupos familiares. Las secuencias de ADN de dominio variable se volvieron a clonar para expresión en E. coli y los dominios variables purificados se generaron para estudios de evaluación más detallados.
Ejemplo 3: Evaluación de dominios variables recombinantes de E. coli purificados
3.1 Producción de clones de dominio variable seleccionados en E. coli
Las secuencias de ADN de los dominios variables seleccionados de entre M62, M63 y M65 se volvieron a clonar para la producción en E. coli y a continuación los dominios variables expresados se purificaron como sigue.
Los dominios variables seleccionados se subclonaron del vector fagémido en el plásmido de expresión pMEK222 (pMEK222 es una versión del fagémido pUR8100 con el gen3 eliminado, y donde el dominio variable clonado es seguido por etiquetas c-myc y 6His, dos codones de parada y la secuencia terminadora M13 (ver WO2013/064701)). Los genes del dominio variable se digirieron con Sfil y Eco91I y se ligaron en pMEK222 cortado con las mismas enzimas de restricción. BL21 DE3 de cepa deE. coli se transformó mediante ligaciones y se sembró en placas de agar-LB suplementadas con ampicilina y 2 % de glucosa. Los transformantes se rastrearon usando PCR de colonias. Las amplificaciones utilizando los cebadores M13.rev (SEQ ID NO: 81) y M13.fw (SEQ ID NO: 82) condujeron a la generación de plásmidos que contenían insertos de 700 pb y de ~350 pb (plásmidos vacíos) observados por PCR.
Los dominios variables se produjeron a partir de pMEK222 mediante la inoculación de un cultivo fresco cultivado durante la noche a dilución 1/100 en 800 ml 2X YT, glucosa al 0,1% y 100 ug/ml de ampicilina y se cultivaron durante 2 horas a 37 grados C. Posteriormente, se añadió isopropil beta-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM y el cultivo se hizo crecer durante 5 horas adicionales a 37 grados C. Las bacterias se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en 30 ml de PBS. Las bacterias se congelaron mediante incubación a -20 grados C durante la noche. Las bacterias se descongelaron a temperatura ambiente y se fraccionaron por centrifugación. A la fracción soluble, que contiene el dominio variable, Co2+ se añadieron perlas de agarosa, por ejemplo, resina Talon (Thermo Scientific) para unir el dominio variable marcado con His. Después de lavar las perlas, los dominios variables unidos se eluyeron con PBS suplementado con imidazol 150 mM. Finalmente, las fracciones que contenían los dominios variables se dializaron frente a PBS para eliminar el imidazol.
Las actividades neutralizantes de TNF-alfa de los dominios variables purificados se evaluaron en varios sistemas de ensayo in vitro para evaluar la eficacia frente a las formas soluble y de membrana del TNF-alfa humano y el TNF-alfa soluble de mono cynomolgus.
3.2 Inhibición de la citotoxicidad inducida por TNF-alfa de células L929
El ensayo de dominios variables con actividad neutralizante de TNF-alfa se llevó a cabo usando una línea celular murina L929 y una lectura biológica basada en la inducción de citotoxicidad por TNF-alfa humano soluble (o mono cynomolgus). Células L929 (10000 células/pocillo) se cultivaron durante 24 h en presencia de TNF-alfa soluble (500 pg/ml) y actinomicina (0,75 ug/mL) junto con diluciones de los dominios variables purificados. Al final del experimento se determinó la citotoxicidad utilizando resazurina. La inhibición de la citotoxicidad inducida por TNF humano soluble de células L929 de ratón se probó para determinar la actividad neutralizante de TNF-alfa de cada uno de los dominios variables de las series Q62, Q63 y Q65 recombinantes de E. coli contra TNF humano y de mono cynomolgus.
3.2.1 Dominios variables de cadena de inmunoglobulina purificada seleccionados de entre M62 y M63
Materiales
-Células L929 (10000 células/pocillo)
-Placas estériles de polipropileno de 96 pocillos
-CFoncentración fija de h-TNF-alpha para el ensayo: 500 pg/ml
-Concentración de Actinomicina D: 0,75 ug/mL
-Dominios variables purificados (desde MP 62-63) incluidos Q62F2, Q62F11, Q62E10, Q62F10
-intervalo de diluciones de los dominios variables purificados: 300 nM - 5 pM (diluciones 1:3)
-Curva dosis-respuesta de TNF-alfa humano: 3 ng/mL - 0,5 pg/mL
-Curva dosis-respuesta de TNF-alfa de mono cynomolgus: 10ng/mL - 0,2 pg/mL
-Curva dosis-respuesta de adalimumab: 10 nM - 0,5 pM
-Tiempos de incubación: 22 h
-Reactivo de viabilidad celular de resazurina
Procedimiento
10000 células/pocillo en 100 ul se sembraron el día 0 en microplacas de 96 pocillos en medio completo DMEM y se guardaron durante la noche a 37 grados C y 5 % de CO2. El día 1 se prepararon placas de dilución (con volúmenes suficientes para triplicados para cada punto) y además las placas contenidas como controles:
1. DMEM completo 0,75 ug/mL Actinomicina D
2. DMEM completo 0,75 ug/mL Actinomicina D 0,5 ng/mL h-TNF-alfa
3. DMEM completo Tritón al 0,01 % (solo en la placa que contiene respuesta a dosis de Cyno-TNF-alfa)
4. DMEM completo (solo en la placa que contiene respuestas de dosis de Cyno-TNF-alfa, h-TNF-alfa y adalimumab)
Se eliminó el medio de cada pocillo de las microplacas y se incubaron las células con 100 ul de cada dilución de dominio variable o con 100 ul de los diferentes controles. Después de 22 h de incubación a 37 grados C y 5 % de CO2, se añadieron 10 ul de resazurina a cada pocillo y las células se incubaron durante 2 h a 37 grados C. 50 ul de SDS al 3 % se añadieron posteriormente a cada pocillo. Las placas se leyeron a continuación usando el lector de placas de fluorescencia Ex544 nm/Em590 nm.
3.2.2 Dominios variables de cadena de inmunoglobulina purificada seleccionados de entre M65
Materiales
-Células L929 (10000 células/pocillo)
-Placas estériles de polipropileno de 96 pocillos
-DMEM
-Concentración de TNF-alfa humano: 500 pg/ml
-Concentración de TNF-alfa de mono cynomolgus: 500 pg/ml
-Concentración de Actinomicina D: 0,75 ug/mL
-Dominios variables purificados de M65, incluidos Q65D1, Q65D3, Q65B1, Q65C7, Q65A3, Q65E12, Q65F6 -Intervalo de diluciones de los dominios variables purificados: 300nM - 5pM (diluciones 1:3)
-Curvas dosis-respuesta de TNF-alfa humano y TNF-alfa de Cynomolgus: 10ng/mL - 0,5pg/mL
-Curva dosis-respuesta de adalimumab : 10nM - 0.5pM
-Tiempos de incubación: 22h
-Reactivo de viabilidad celular de resazurina
Procedimiento
10000 células/pocillo en 100ul se sembraron el día 0 en microplacas de 96 pocilios en medio completo DMEM y se guardaron durante la noche a 37 grados C y 5 % de CO2. El día 1 se establecieron diluciones seriadas 1:3 (en DMEM Act.D TNF) para cada dominio variable purificado (con volúmenes suficientes para triplicados para cada punto) a partir de una concentración máxima de 300 nM. Para adalimumab, la concentración máxima utilizada fue 10 nM.
Se agregaron los siguientes controles a las placas:
1. DMEM completo 0,75 ug/mL Actinomicina D
2. DMEM completo 0,75 ug/mL Actinomicina D 0,5 ng/mL de h-TNF-alfa o cino-TNF-alfa
3. DMEM completo Tritón al 0,01 % (solo en la placa que contiene respuestas a dosis de TNF-alfa)
4. DMEM completo (solo en las placas que contienen las respuestas a dosis de TNF-alfa)
Se eliminó el medio de cada pocillo de las microplacas y se incubaron las células con 100 ul de cada dilución de dominio variable o con 100 ul de los diferentes controles. Después de 22 h de incubación a 37 grados C y 5 % de CO2, se añadieron 10 ul de resazurina a cada pocillo y las células se incubaron durante 2 h a 37 grados C. 50 ul de SDS al 3 % se añadieron posteriormente a cada pocillo. Las placas se leyeron a continuación usando el lector de placas de fluorescencia Ex544 nm/Em590 nm.
3.2.3 Resultados de ensayos de citotoxicidad L929
Tabla 1a
Figure imgf000033_0001
Tabla 1b
Figure imgf000033_0002
Se puede observar que los dominios variables que pertenecen a la Familia 1 generalmente mostraron una inhibición extremadamente efectiva de la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa tanto en humanos como en cynomolgus y los dominios variables que pertenecen a la Familia 2 también mostraron en general una inhibición muy efectiva de la citotoxicidad inducida del TNF-alfa tanto en humanos como en cynomolgus. Varios dominios variables mostraron un rendimiento similar al de adalimumab.
3.3 Inhibición de la actividad de unión de TNF-TNFR2 (dominios variables de cadena de inmunoglobulina purificada seleccionados de entre M65)
Placas Maxisorb se recubrieron con etanercept (50 ul / pocillo de 0,7 ug/ml). Los dominios variables se diluyeron y se mezclaron con TNF-alfa humano o de mono cynomolgus (1,25 ng/ml) para permitir la unión antes de añadir a las placas ELISA. Se detectó TNF-alfa unido a etanercept con anticuerpo anti-TNF-alfa policlonal de conejo biotinilado (0,2ug/ml) y mAvidina-HRP seguido de TMB y se determinó el nivel de competencia por el dominio variable para la unión de TNF-alfa a etanercept. Los dominios variables particulares fueron capaces de unirse al TNF-alfa humano y de mono cynomolgus, lo que condujo a la inhibición de las interacciones TNF-alfa-TNFR2.
3.3.1 Resultados de los ensayos de actividad de unión de TNF-TNFR2
Tabla 2 a
Figure imgf000034_0001
Tabla 2 b
Figure imgf000034_0002
Se puede observar que los dominios variables que pertenecen a la Familia 1 generalmente mostraron una inhibición extremadamente efectiva de la unión por TNF-alfa-TNFR2 tanto humano como de cynomolgus y los dominios variables que pertenecen a la Familia 2 también mostraron en general una inhibición muy efectiva de la unión por TNF-alfa-TNFR2 tanto humano como de cynomolgus. Varios dominios variables mostraron un rendimiento similar o mejor que el de adalimumab.
3.4 Inhibición de la activación inducida por TNF-alfa soluble de células indicadoras NF-kB/SEAP HEK-293
Las potencias de los dominios variables seleccionados se midieron inicialmente en función de la inhibición de la citotoxicidad del TNF-alfa soluble hacia las células murinas L929. Para confirmar que estos dominios variables también eran efectivos y potentes en un ensayo con células humanas, se realizaron experimentos con células indicadoras HEK-293-NF-kB-SEAP. Las células NF-kB/SEAP HEK-293 se transfectan de manera estable con el gen indicador SEAP (fosfatasa alcalina secretada) bajo el control transcripcional de un elemento de respuesta NF-kB. Se confirmó la inducción del gen indicador por TNF-alfa humano soluble y se demostró la capacidad de inhibir esta respuesta mediante anticuerpos neutralizantes del TNF-alfa. En estas células, la activación del gen indicador SEAP depende de la vía NF-kB, que es activada por el TNF-alfa soluble a través de los receptores TNFR1 de la membrana celular. En el primer experimento se probaron Q65B1 (Familia 1), Q65C7 (Familia 1), Q62E10 (Familia 2) y adalimumab. En el segundo experimento se comparó Q65D3 con Q65B1.
3.4.1 Inhibición por Q65B1, Q65C7, Q62E10 y adalimumab
Materiales
-Células HEK-293 NF-kB/SEAP (Imgenex): 3,5*104 células/pocillo, 2*104 células/pocillo (ii), 104 células/pocillo (ii) - Placas estériles de 96 pocillos
-DMEM (Sigma, D6429) complementado con 10 % de FBS, Pen/Strep, y 500ug/mL de antibiótico geneticina (G418, Invitrogen, 10131027)
-Concentración de TNF-alfa humano (Invitrogen, PHC3015): 2ng/ml
-Dominios variables de cadena de inmunoglobulina purificada Q65B1, Q65C7, Q65D3, Q65E5, Q65E6 y Q62E10 -intervalo de diluciones de dominios variables de cadena de inmunoglobulina y adalimumab: 500nM - 2pM; 150 nM-1 pM; (diluciones de 3,5 veces)
-Curvas dosis-respuesta del TNF-alfa humano: 10ng/mL - 0,01ng/mL
-Controles en las placas:
-medio celular (CM)
-TNF-alfa soluble humano ("hs-TNF-alfa") a 2ng/ml
-Triton X-100 al 0,01 % (para respuesta a dosis de TNF)
-Tiempos de incubación: 22,5h
-Medio QuantiBlue (InvivoGen): 200ul
-Volumen de sobrenadante probado: (i) 10uL, (ii) 10uL y 20uL
-Lectura de punto de tiempo: 2h 45min
-Lector de placas BioRad (620nm)
Procedimientos
3,5*104 células/pocillo de células NF-kB/SEAP HEK-293 se colocaron en placas en 100 ul el día 0 en microplacas de fondo plano estériles de 96 pocillos y se almacenaron durante la noche a 37 grados C y 5 % de CO2. En el día 1, se prepararon diluciones en serie (3,5 veces) para cada dominio variable de la cadena de inmunoglobulina purificada (con volúmenes suficientes para triplicados) en 100 ul de medio HEK que contenía 2ng/mL hs-TNF-alfa. El medio se eliminó de las placas de ensayo y se sustituyó con 100 ul de cada dilución de muestra. Después de 22,5h a 37 grados C y 5 % de CO2, se mezclaron 10 ul o 20 ul de cada sobrenadante con 200 ul de medio Quanti Blue precalentado (InvivoGen) en una placa NUNC de fondo plano de 96 pocillos. Después de 2 horas y 45 minutos de incubación a 37 grados C en la oscuridad con agitación, se midió la producción de SEAP con el lector de placas BioRad a 620 nm.
Los resultados mostraron que Q65B1 (Familia 1), Q65C7 (Familia 1) y Q62E10 (Familia 2) lograron una inhibición máxima de la activación celular inducida por el TNF-alfa humano soluble. Los resultados mostraron que estos dominios variables de la cadena de inmunoglobulina inhiben de forma potente y efectiva las respuestas al TNF-alfa soluble mediado por los TNFR expresados en células humanas (Figura 2A).
3.4.2 Inhibición por Q65D3 y Q65B1 (ambos Familia 1)
Los materiales y procedimientos fueron los descritos anteriormente en el punto 3.4.1, excepto por un número diferente de células/pocillo (3,5*104, 2*104, y 1x104) y volúmenes de sobrenadante celular tras la estimulación con TNF (10 ul y 20 ul).
Resultados
Tanto Q65B1 como Q65D3 pueden neutralizar por completo la actividad del TNF-alfa soluble humano en células indicadoras HEK-293 NF-kB/SEAP, con valores EC50 de alrededor de 0,2 nM para Q65B1 y 0,6 nM para Q65D3 (Figura 2B).
3.5 Inhibición de la activación celular inducida por TNF-alfa de membrana
Tanto el TNF-alfa soluble como el unido a membrana pueden inducir la activación de las células que expresan los receptores del TNF-alfa y se considera que ambas formas contribuyen a la inflamación y la patología en la enfermedad de Crohn. Es probable que los dominios variables capaces de unirse y neutralizar la actividad del TNF-alfa tanto soluble como unida a la membrana sean los más efectivos.
Se desarrolló un ensayo indicador de contacto celular para garantizar que los dominios variables pudieran identificarse con la capacidad de inhibir la activación celular inducida por TNF-alfa de membrana. Se creó una línea de células CHO que expresa constitutivamente una forma transmembrana no escindible de TNF-alfa humano (mTNF-alfa-CHO). En co-cultura con las células NF-kB/SEAP HEK-293, las células mTNF-alfa-CHO indujeron la activación del gen indicador. Por lo tanto, se pudo determinar la capacidad de los diferentes dominios variables para inhibir la activación celular inducida por mTNF-alfa.
3.5.1 Resultados de los ensayos de activación celular inducida por TNF-alfa de membrana
Tabla 3(a)
Figure imgf000036_0001
Tabla 3 b
Figure imgf000036_0002
Puede verse que los dominios variables pertenecientes a la Familia 1 generalmente mostraron una inhibición efectiva de mTNF-alfa y los dominios variables pertenecientes a la Familia 2 también mostraron generalmente una inhibición de mTNF-alfa.
Ejemplo 4: Reactividad cruzada con adalimumab
Adalimumab 1|jg/ml se revistió sobre placas de HPM y a continuación se incubó con TNF-alfa humano en ausencia o presencia de los diferentes dominios variables. Después de lavar para eliminar los complejos libres de TNF-alfadominio variable, el TNF-alfa restante unido al mAb inmovilizado se detectó mediante incubación con anticuerpo policlonal de conejo biotinilado anti hTNF-alfa; a continuación, se añadió mAvidina-HRP seguido de TMB para el desarrollo del color por nELISA.
Resultados
Q62E10 (Familia 2), Q62F2 (Familia 1), Q62F10 (Familia 2), Q65A3 (Familia 2), Q65B1 (Familia 1), Q65C7 (Familia 1) , Q65D1 (Familia 1), Q65D3 (Familia 1), Q65E12 ( Familia 2), Q65F6 (Familia 2) y Q62F11 (ni Familia 1 ni Familia 2) , mostraron una inhibición completa de la unión de TNF-alfa a adalimumab.
Ejemplo 5: Estabilidad de dominios variables de cadena de inmunoglobulina anti-TNF-alfa recombinante de E. coli purificada en sobrenadante de intestino delgado de ratón
Los dominios variables purificados se analizaron en presencia de un extracto sobrenadante preparado a partir del contenido combinado del intestino delgado de varios ratones. Después de la incubación de los dominios variables en presencia del extracto intestinal durante diferentes períodos de tiempo, se analizaron las actividades de unión a TNF-alfa de las muestras de dominios variables "digeridas" utilizando el ELISA h-TNF-alfa-TNFR2.
Sobrenadantes de intestino delgado de ratón
Se extirparon intestinos delgados de ratón, se eliminaron los contenidos sólidos y se lavaron los intestinos con 1 ml de solución salina al 0,9%. Las partes sólidas y líquidas se combinaron en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, se agitaron con vórtex hasta la homogeneidad y se centrifugaron a 16k xrcf durante 10 minutos a 4 grados C. Los sobrenadantes se retiraron y almacenaron a -80 grados C antes de su uso.
Placas y antígenos
Los dominios variables anti-TNF-alfa se analizaron en placas de HPM recubiertas con 1 ug/mL etanercept (50 uL/pocillo) toda la noche a 4 grados. Las placas se bloquearon con 1 % de BSA durante un mínimo de 1 hora antes de su uso en el ensayo.
Solución de parada de proteasa
Tabletas de cóctel de inhibidor de proteasa se disolvieron en 5 ml de tampón de parada de proteasa (BSA al 2 %, PBS 1x, NaEDTA 5 mM) para preparar una solución madre de inhibidor de proteasa 20x. Se produjo una solución de parada de proteasa 2x (como se describe en la sección 2.3.3) diluyendo la solución inhibidora de proteasa 20x 1 en 10 con una dilución 1 en 100 de PMSF en tampón de parada de proteasa
Procedimientos
Digeridos:
Se prepararon soluciones madre de dominio variable en BSA al 0,4 % a 250 ug/mL. A 55,2 ul de sobrenadante SI en hielo, se añadieron 4,8 ul de dominio variable y se mezclaron mediante agitación vorticial. Inmediatamente se extrajeron 25 ul y se mezclaron con 25 ul de solución de parada de proteasa enfriada con hielo (control no digerido) y se congelaron a -80 grados C. Se movió una segunda alícuota de 25 ul a un solo pocillo en una placa PCR de pared delgada de policarbonato, y se incubó durante 1 a 24 horas a 37 grados C (dominio variable digerido). Después de la incubación, las muestras de dominio variable digeridas se colocaron en hielo y se añadieron a cada tubo 25 uL de solución de parada de proteasa enfriada con hielo. Las muestras se congelaron a -80 grados C antes del ensayo.
ELISA
Los dominios variables se diluyeron en 1 % de BSA Solución de inhibidor de proteasa 1x, hecha diluyendo solución madre de inhibidor de proteasa 20x en 1 % de BSA y mezclado 1:1 con 5 ng/mL de h-TNF-alfa. La mezcla de TNF-alfa se transfirió a las placas HPM ELISA bloqueadas recubiertas con 1 ug/mL de etanercept. Las placas se incubaron durante 2 h, se lavaron 4x con PBS 0,5 % PEG20 (PBST), se secaron y a continuación se incubaron con anticuerpo TNF-alfa anti-humano policlonal de conejo biotinilado (50 uL /pocillo, 0.27 ug/mL) durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente. Después de 1 h, las placas se lavaron 4 veces con PBST, se secaron con golpecitos y a continuación se incubaron con mAvidin-HRP (50 uL/pocillo, 1/1000 dilución) con agitación a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, las placas se lavaron con PBST 4x, se secaron con golpecitos y se revelaron usando 100 uL de TMB. Las curvas estándar de los dominios variables (en PBS) se corrieron junto con muestras digeridas/no digeridas La concentración máxima de los dominios variables utilizados en la curva estándar y las muestras de prueba fue de 300 ng/mL y 200 ng/mL respectivamente.
Análisis de los Datos
El nivel de inhibición logrado por el dominio variable se calculó restando la señal en los dominios variables de control digeridos y no digeridos de un control solo de TNF (señal máxima). Esto dio la reducción de señal para cada dominio variable, que es proporcional a la cantidad de dominio variable en la muestra. La supervivencia en % se calculó dividiendo la reducción de la señal del dominio variable digerido por la reducción de la señal del dominio variable no digerido para una única dilución.
Resultados
62F2 y 65B1 (ambos de la Familia 1) mostraron una supervivencia superior al 80 %, 62E10 mostró una supervivencia superior al 70 % (Familia 2), 65D1 y 65C7 (Familia 1) mostraron una supervivencia de alrededor del 50 %.
A continuación se realizó un estudio del curso del tiempo para medir el rendimiento a 1h, 3h y 7h. Los resultados coincidieron ampliamente con el trabajo anterior sobre sobrenadante del intestino delgado.
Ejemplo 6: Optimización de dominios variables de cadena de inmunoglobulina anti-TNF-alfa seleccionados
Los dominios variables investigados hasta el momento no se han mutado y los dominios variables purificados tienen todos etiquetas de extremo C incluidas (c-myc-6His o Flag-6His). Los mutantes se diseñaron para explorar si la modificación de los aminoácidos del extremo N, o la ausencia de etiquetas del extremo C, cuando se combinan con mutaciones en Q65B1, conducirían a una mayor estabilidad.
6.1 Construcciones y mutaciones
(i) Se diseñó un conjunto de mutantes de monómero Q65B1 (ID7F-EV, ID8F-EV ID9F-EV, ID13F-EV, ID14F-EV e ID15F-EV; todos con etiquetas His) para investigar los efectos de mutaciones particulares en la resistencia a proteasa.
(ii) Se diseñó un conjunto de construcciones de dos cabezas (ID22F - ID29F) que incluían variantes de monómero Q65B1 mutado y eliminación de etiquetas His.
(iii) Se diseñó un conjunto de mutantes de monómero Q65B1 que incluían la mutación del comienzo de la secuencia a DVQLV y la eliminación de etiquetas His para investigar las posibilidades de optimización futura de la expresión de levadura (mutantes de DVQLV ID37F e ID38F en comparación con los equivalentes de EVQLV ID32F (ID32F es ID8F-EV sin His-tag) e ID34F, respectivamente).
En las tablas a continuación se muestran más detalles de estas construcciones y mutaciones. Las mutaciones se muestran subrayadas y en negrita en relación con la secuencia del monómero original Q65B1.
Detalles de construcciones y mutaciones
Figure imgf000039_0001
Ċ
Figure imgf000040_0001
6.2.1 Efectos sobre la potencia y resistencia a las proteasas intestinales
(i) ID7F-EV, ID8F-EV ID9F-EV, ID13F-EV, ID14F-EV e ID15F-EV
Sobrenadante del intestino delgado de ratón sin tratamiento: el contenido del intestino delgado de siete ratones machos C57BL/6 se eliminaron con solución salina al 0,9 %, se combinaron, se homogeneizaron y se centrifugaron. El sobrenadante resultante se eliminó, se dividió en alícuotas y se congeló.
Agrupación de sobrenadante fecal humano: las muestras fecales se convirtieron en suspensiones con la adición de 1x PBS. A continuación, las suspensiones se agruparon, centrifugaron y los sobrenadantes se separaron, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 grados C. Este procedimiento elimina la matriz fecal, incluido cualquier material celular.
Los dominios variables anti-TNF-alfa se analizaron en placas de HPM recubiertas con 1 ug/mL de etanercept (50 uL/pocillo) toda la noche. Las placas se bloquearon con 1 % de BSA durante un mínimo de 1 hora antes de su uso en el ensayo. Se produjo una solución de parada de proteasa 2x como se describe en el Ejemplo 5.
Digeridos:
Soluciones madre de dominio variable a 250 ug/mL se prepararon en 0,34 % (3400 ug/mL) de BSA. A 55,2 ul de sobrenadante fecal o de intestino delgado en hielo, se añadieron 4,8 ul de dominio variable y se mezcló mediante agitación vorticial. Inmediatamente se extrajeron 25 uL y se mezclaron con 25 uL de solución de parada de proteasa enfriada con hielo (control sin digerir) y se congelaron a -80 grados C. Se colocaron alícuotas de 25 ul en pocillos de una placa de PCR de pared delgada de policarbonato y se incubaron durante 17 h o 7 h respectivamente a 37 grados C. Después de la incubación, las muestras de dominio variable digeridas se colocaron en hielo y se añadieron 25 ul de solución de parada de proteasa enfriada con hielo a cada tubo. Las muestras se congelaron a -80 grados C antes del ensayo.
ELISA
Los dominios variables se diluyeron en 1 % de BSA 1x solución de inhibición de proteasa como se describe en el Ejemplo 5, mezclada 1:1 con 5 ng/mL de h-TNF-alfa, y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de TNF-alfa de dominio variable se cargó a continuación en placas ELISA bloqueadas recubiertas con 1 ug/mL de etanercept y se incubó durante 2 horas con agitación a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 4 veces con PBST, se secaron con golpecitos y se incubaron con el anticuerpo policlonal anti humano-TNF-alfa de conejo biotinilado (50 uL /pocillo, 0,3 ug/mL) durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente. Después de 1 h, las placas se lavaron y, como antes, se incubaron con mAvidin-HRP (50 uL/pocillo, 1/1000 dilución) con agitación a temperatura ambiente durante 30 min. A continuación, las placas se lavaron y secaron como antes y se revelaron usando 100 uL de TMB. Las curvas estándar de los dominios variables (en PBS) se corrieron junto con muestras digeridas/no digeridas La concentración máxima de los dominios variables utilizados en la curva estándar y las muestras de prueba fue de 100 ng/mL.
Análisis de los Datos
Después de la digestión, las concentraciones de dominio variable se midieron utilizando el ELISA de interferencia TNFR2. En este ensayo, los dominios variables se mezclan con TNF-alfa. A continuación se mide el nivel restante de TNF-alfa. La concentración del dominio variable se deduce de la cantidad de TNF-alfa inhibida de unirse al receptor TNFR2 que se une a la placa ELISA. Los valores brutos de OD450 se ajustaron con lecturas en blanco tomadas de pocillos que contenían 1 % de BSA solamente. Las curvas estándar se trazaron usando Graphpad Prism usando regresión no lineal para ajustar curvas de cuatro parámetros. Las concentraciones de dominio variable en las muestras de prueba se calcularon en Graphpad Prism usando la curva estándar. La supervivencia en % se calculó dividiendo la concentración de dominio variable promedio en los pocillos de punto de tiempo 0 por la concentración de dominio variable promedio para un solo punto de tiempo. Se calculó el error estándar de la relación de dos medias.
Resultados
La evaluación de los monómeros del dominio variable Q65B1 mostró que, sorprendentemente, la inclusión de estas mutaciones no afectó mucho a la potencia de neutralización de TNF-alfa (ELISA de TNF-alfa-TNFR2) de los dominios variables modificados.
ID8F-EV e ID13F-EV mostraron una resistencia mejorada a la inactivación por proteasas presentes en extractos de sobrenadante fecal humano e intestinal de ratón (Figura 3).
(ii) Construcciones ID22F - ID29F
Materiales
-Células HEK-293 NF-kB/SEAP: 104 células/pocillo en 50ul
-Placa de 96 pocillos
-DMEM complementado con 10 % de FBS, Pen/Strep, y 500ug/mL Antibiótico geneticina (G418) -Concentración de TNF-alfa humano: 2 ng/ml
-Dominios variables homo bi-cabeza purificados: ID22F - ID29F
-Diluciones de dominio variable: 20 nM - 2,1 pM; diluciones de 2,5 veces
-Tiempo de incubación: 23h
-Medio sustrato colorimétrico SEAP: 200uL; volumen de sobrenadante analizado: 20 ul; lectura de punto de tiempo: 2h
-Lector de placas (620nm)
Procedimientos
104 células/pocillo de NF-kB/SEAP Las células HEK-293 se sembraron en 50 uL en microplacas de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 grados C y 5 % de CO2. Al día siguiente, se prepararon diluciones en serie (2,5 veces) para cada dominio variable purificado al doble de la concentración del ensayo (con volúmenes suficientes para triplicados) en 50 uL de medio HEK que contenía 4 ng/mL hs-TNF-alfa. Los dominios variables y el TNF-alfa se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente y
se agitaron antes de agregar 50 uL de cada dilución a las placas de ensayo. Después de 23 h a 37 °C y 5 % de CO2, se mezclaron 20 ul de cada sobrenadante con 200 ul de medio SEAP precalentado en placas de fondo plano de 96 pocillos. Después de 2 horas de incubación a 37 grados C en la oscuridad con agitación, se midió la producción de SEAP con el lector de placas a una absorbancia de 620 nm.
Resultados
Los derivados homo-bicabeza Q65B1 (incluidos aquellos con cambios K59H, K65H, K78S, K101H) fueron igualmente potentes y efectivos con valores EC50 entre 0,02 nM y 0,03 nM en el ensayo indicador HEK293-NF-kB-SEAP inducido por TNF soluble . La potencia de homo bicabeza Q65B1 aumentó aproximadamente 10 veces en relación con el monómero.
(iii) ID32F, ID34F, ID37F, ID38F
Para evitar la posibilidad de generar un producto con un glutamato del extremo N ciclado si se expresa en levadura, se investigaron los efectos de cambiar el aminoácido del extremo N del dominio variable basado en Q65B1 de un ácido glutámico a un residuo de ácido aspártico (que no es susceptible a la ciclación). Se generaron mutantes de Q65B1 para producir el Q65B1 correspondiente con el residuo D del extremo N y variantes que combinaban cada uno de estos con las mutaciones favorables de resistencia a la proteasa.
Capacidad de neutralización de sTNF-alfa de ID-32F, ID-34F, ID-37F e ID-38F usando ensayo indicador de células NF-kB/SEAP HEK-293
Para confirmar que ID-38F e ID-34F neutralizan el TNF-alfa humano soluble, estos dominios variables se probaron en el ensayo indicador celular NF-kB/SEAP HEK-293 en comparación con el anticuerpo comercial anti-TNF-alfa infliximab (Remicade). Los resultados se obtuvieron de dos experimentos separados realizados en días diferentes.
Materiales
-Células HEK-293 NF-kB/SEAP (Imgenex): 104 células/pocillo en 50uL
-placas esterilizadas de 96 pocillos
-DMEM (Sigma, D6429) complementado con 10 % de FBS, Pen/Strep, y 500ug/mL de antibiótico geneticina (G418, Invitrogen, 10131027)
-Concentración de TNF-alfa humano (Invitrogen, PHC3015): 2 ng/ml
-5 dominios variables purificados: ID-32F, ID-34F, ID-37F, ID-38F y Q65B1
-dilución de infliximab: 10 nM - 1 pM (1° exp.); 2nM - 1pM (2° exp)
-Diluciones de dominio variable: 10 nM - 1 pM (1° exp.); 5 nM - 1 pm. (2° exp.)
-Tiempo de incubación: 22h
-Medio QuantiBlue (InvivoGen): 200 ul; volumen de sobrenadante analizado: 20 ul; lectura de punto de tiempo: 2h -Lector de placas BioRad (620nm)
Procedimientos
104 células/pocillo de células NF-kB/SEAP HEK-293 se colocaron en placas en 50 ul en microplacas de fondo plano estériles de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 grados C y 5 % de CO2. Al día siguiente, se prepararon diluciones en serie de dominios variables e infliximab (2,5 veces) al doble de la concentración del ensayo en medio HEK que contenía 4ng/mL hs-TNF-alfa (para Exp 1). En el segundo experimento, se prepararon diluciones en serie (1,9 veces para el dominio variable y 2,2 veces para adalimumab) a 4x la concentración del ensayo en 120 ul de medio HEK. A continuación se diluyeron 100uL de cada dilución 1:1 con 100uL de medio HEK que contiene 8ng/mL hsTNF-alfa (4x) para tener dominios variables y TNF-alfa al doble de las concentraciones del ensayo. Los dominios variables y el TNF se incubaron durante 1 hora con agitación a temperatura ambiente antes de agregar 50 ul de cada dilución a las placas de ensayo. Después de 22h de incubación a 37 grados C y 5 % de CO2, se mezclaron 20 uL de cada sobrenadante con 200 uL de medio Quanti Blue precalentado en placas NUNC de fondo plano de 96 pocillos. Después de 2 horas de incubación a 37 grados C en la oscuridad con agitación, se midió la producción de SEAP con el lector de placas BioRad a 620 nm.
Resultados
Los resultados del experimento 1 se muestran en la Figura 4A y los resultados del experimento 2 se muestran en las Figuras 4B y 4C. Todos los dominios variables muestran neutralización completa de sTNF-alfa y potencias similares con valores EC50 entre 0,3 nM y 0,5 nM. Está claro que la adición de mutaciones en estos dominios variables no afecta la potencia de estos dominios variables para neutralizar sTNF-alfa. Infliximab no proporciona una neutralización completa de sTNF-alfa en ninguno de los experimentos que muestran curvas de respuesta a la dosis casi estancadas con ~80 % de neutralización máxima a aproximadamente 2 nM.
Actividad neutralizadora de mTNF-alfa de ID-34F, ID-38F, Q65B1, ID-8FEV, adalimumab e infliximab usando ensayo indicador celular NF-kB/SEAP HEK-293
Para confirmar que ID-38F e ID-34F neutralizan el TNF-alfa unido a membrana, estos dominios variables se probaron en el ensayo indicador celular NF-kB/SEAP HEK-293 en comparación con 2 progenitores (Q65B1 e ID8F-EV). Se probaron 2 anticuerpos comerciales anti-TNF-alfa (adalimumab e infliximab) en el mismo ensayo como referencia.
Materiales:
-Concentración de células NF-kB/SEAP HEK-293 (Imgenex): 3,5 * 104 células/pocillo
-TNF-alpha_DEL estable que expresa la línea celular Flp-ln CHO (Invitrogen & GeneArt, Life Technogies): 25x103 células/pocillo
-2 dominios variables mutantes anti-TNF-alfa purificados: ID-34F e ID-38F
-2 dominios variables anti-TNF-alfa purificados: Q65B1 e ID8F-EV
-2 anticuerpos: adalimumab e infliximab
-Diluciones de dominio variable /Ab: 300 nM - 0,11 nM (diluciones de 2,2 veces)
-Tiempo de incubación: 24h
-Medio QuantiBlue (InvivoGen): 200uL; volumen de sobrenadante probado: 10uL; lectura de punto de tiempo: 2h -Lector de placas BioRad (620nm)
Procedimientos:
3,5*104 células/pocillo de células NF-kB/SEAP HEK-293 en 50 ul se colocaron en placas el día 0 en microplacas de fondo plano de 96 pocillos y se almacenaron durante la noche a 37 grados C y 5 % de CO2. En el día 1, se prepararon diluciones en serie para cada dominio variable purificado (con volúmenes suficientes para triplicados) a tres veces las concentraciones del ensayo en 50 ul de medio HEK. Se agregaron 50 uL de cada dilución de dominio variable (3x) a las placas de ensayo y a continuación se almacenaron las placas a 37 grados C y 5 % de CO2 por 1h. 50uL de células m-TNF-alfa CHO (25000células/50uL) preparados en medio HEK se añadieron a las placas de ensayo HEK para obtener las concentraciones finales del ensayo de dominio variable (1x). Las células se incubaron durante 24 h a 37 °C y 5 % de CO2 El día 2, se mezclaron 10 ul de cada sobrenadante con 200 ul de medio Quanti Blue precalentado (InvivoGen). Después de 2 horas de incubación a 37 grados C en la oscuridad con agitación, se midió la producción de SEAP con el lector de placas BioRad a 620 nm. Las curvas de respuesta a la dosis resultantes se analizaron mediante el software GraphPad Prism.
Resultados
Tabla 4
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ID-34F e ID-38F muestran potencias similares en la neutralización del TNF-alfa unido a membrana, lo que indica que cambiar el aminoácido del extremo N del dominio variable de E a D no afecta la potencia del dominio variable. ID-34F e ID-38F parecen ser ligeramente más potentes que los monómeros parentales Q65B1 e ID-8FEV contra mTNF. ID-34F e ID-38F son solo marginalmente menos potentes que los anticuerpos comerciales adalimumab e infliximab para neutralizar el mTNF-alfa.
Comparación de ELISA TNFR1 de ID38F
Como también se cree que TNFR1 desempeña un papel en la patología del TNF-alfa, se realizó un ELISA para probar las capacidades de ID38f y adalimumab para impedir la unión de TNF a TNFR1.
Procedimiento
Una placa de microtitulación estéril de 96 pocillos se revistió con 50 ul de 0,5 ug/ml hTNFR1 (R&D Systems) por pozo durante la noche a 4 grados C. La placa se lavó en PBST utilizando un lavador de placas y se bloqueó durante 1 hora en 200 ul 1 % de BSA por pozo. Se incubó una serie de diluciones triples a partir de 30 nM para cada anticuerpo con 2,5 ng/ml TNF-alfa durante 1 hora, 50 ul/pocillo del cual se añadió a continuación a la placa lavada y se incubó durante 5 horas. La placa se lavó y se incubó con 50 ul/pocillo de una dilución 1/1000 de alfa-hTNF de conejo biotinilado (Peprotech P31AB7) en 1 % de BSA y se incubó durante la noche a 4 grados C. La placa se lavó y se incubó con 50 ul/pocillo de una dilución 1/1000 de mAvidina HRP en 1 % de BSA durante 1 hora antes de un lavado e incubación final con 100 ul/pocillo de sustrato TMB. La reacción se detuvo después de 20 minutos con 50 ul/pocillo de H2SO40,5 M y se leyó la absorbancia a 450 nm. Los valores de EC50 se calcularon a partir de datos ELISA en GraphPad Prism. Resultados
Tabla 5
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ID38F es capaz de neutralizar la unión de TNF-alfa a TNFR1 en un EC50 subnanomolar. La mayor potencia de adalimumab en este ensayo puede reflejar el hecho de que esta molécula es divalente mientras que ID38F es monovalente.
TNFR2 ELISA y ensayos de estabilidad
La evaluación de las actividades de unión a TNF-alfa de los monómeros del dominio variable en el ELISA TNFR2 mostró que cambiar el aminoácido del extremo N del dominio variable de E a D no tuvo un efecto significativo. Las estabilidades de los monómeros de dominio variable se probaron como anteriormente midiendo su resistencia a la inactivación por proteasas presentes en sobrenadantes fecales humanos y de intestino delgado de ratón. Cambiar el aminoácido del extremo N del dominio variable de E a D tuvo solo un efecto muy leve sobre la estabilidad de la proteasa.
6.2.2 Resumen
Estos resultados han demostrado que un monómero relacionado con Q65B1, con la secuencia del extremo N DVQLV y los cambios de aminoácidos K59H y K101H ("ID38F"), en particular, tiene una potente actividad neutralizadora de TNF-alfa, excelente resistencia a la inactivación por parte del intestino delgado y proteasas fecales y el potencial para la producción de un producto que no sea susceptible a la piroglutamación si se expresara en levadura.
Ejemplo 7: Estabilidad frente a proteasas inflamatorias intestinales y de EII
7.1 Evidencia de estabilidad a las proteasas presentes en tejido inflamado por EII
Actividades de proteasa que pueden conducir a una degradación rápida de los anticuerpos terapéuticos están reguladas al alza en la enfermedad de Crohn (MMP3, MMP12, catepsina) (Biancheri y col ECCO, Dublin 2011 Abstract P007)). Por lo tanto, era importante investigar las estabilidades de los dominios variables anti-TNF-alfa en presencia de proteasas inflamatorias purificadas y en lisados de tejido mucoso de EII más complejos.
MMP-3 humana recombinante y MMP-12 humana recombinante se obtuvieron de proveedores comerciales, por ejemplo, R&D Systems (513-MP-010 y 917-MP-010 respectivamente). Se realizaron activaciones enzimáticas e incubaciones de 22 horas en tampón de ensayo TCNB: Tris 50 mM, CaCh10 mM, NaCl 150 mM, 0,05 % (p/v) polioxietileno (23) lauril éter, por ejemplo Brij-35, pH 7,5. Las MMP se activaron mediante preincubación, antes de su uso en el ensayo principal. Para activar rhMMP-3, la enzima se diluyó a 20 ug/mL en TCNB que contiene 5 ug/mL quimotripsina y se incubó a 37 grados C durante 30 minutos. Después de la activación, la actividad de la quimotripsina se inhibió mediante la adición de PMSF hasta una concentración final de 2 mM. PMSF no debería afectar negativamente a la actividad de rhMMP-3. La rhMMP-12 se activó diluyéndola a 50 pg/mL en TCNB e incubando a 37 grados C durante 30 horas. No se usaron más aditivos o inhibidores para activar rhMMP-12.
Materiales
Monómero ID34F, bicabeza ID25F, etanercept, adalimumab e infliximab.
Procedimientos
Los compuestos de prueba, preparados en tampón TCNB, se mezclaron con rhMMP-3 y rhMMP-12 activados en hielo. Los compuestos de prueba estaban presentes al comienzo del ensayo a una concentración de 30 ug/mL. rhMMP-3 estaba presente a una concentración de ensayo inicial de 12 ug/mL. rh-MMP-12 estuvo presente a una concentración de ensayo inicial de 30 ug/mL. Cada compuesto se probó en presencia de ambas enzimas y un control de tampón TCNB solo para verificar la degradación independiente de la enzima durante el transcurso del ensayo. Las enzimas también se incubaron con TCNB solo para proporcionar controles "sin compuesto". El volumen final de todas las reacciones en t = 0 horas = 30 ul. En t = 0 horas, se extrajeron 10 uL del volumen inicial del ensayo y se agregaron a 10 uL de solución de inhibidor de proteasa 2x en tampón de parada de proteasa (1 * PBS 2 % de b Sa , EDTA 5 mM, como se describe en el Ejemplo 5) en hielo para detener la reacción. T= 0 - Las muestras se congelaron a -80 grados C. Los volúmenes de reacción restantes de 20 uL se sellaron en una placa de ensayo de PCR y se incubaron a 37 grados C durante 22 horas.
Después de 22 horas de incubación, se encontró que la mayoría de las reacciones estaban en ~ 20 ul. Se añadieron 20 uL de solución de inhibidor de proteasa 2x en tampón de parada de proteasa (1 * PBS 2 % de BSA, EDTA 5 mM) para detener la reacción. T= 22 h - Las muestras se congelaron a -80 grados C. Las muestras de ensayo se analizaron mediante transferencia Western. Las muestras se diluyeron al equivalente de 6,6 ng/uL de compuesto de prueba en colorante de carga y se cargaron 15 uL (100 ng de cada prueba compuesto/pista, suponiendo que no haya cambios en la concentración del compuesto de prueba durante el transcurso del experimento) en un gel de Bis-Tris al 10 %. También se cargó el volumen equivalente de los controles 'sin compuesto de ensayo'. Se añadió una escalera de proteína MW quimioluminiscente, por ejemplo, Super Signal (Pierce) como estándar a 5 uL /pista. Las muestras se sometieron a electroforesis en tampón s DS-MES y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa utilizando un programa de transferencia de 7 minutos en una máquina de transferencia semiseca, por ejemplo, iBlot. Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 grados C en solución de bloqueo (1 % de BSA, 2 % de leche en polvo desnatada, 0,05 % de PEG20, 1xPBS pH 7,4). Los dominios variables se detectaron usando 1) Primario: anti-Q65B1 (-Flag-6His) (suero de sangrado terminal) policlonal de conejo a 1/1000 en solución de bloqueo y 2) Secundario: anticuerpo IgG anti-conejo porcino policlonal HRP-conjugado a 1/1000 más 1 % de suero de cabra normal) en solución de bloqueo. Etanercept, Adalimumab e Infliximab se detectaron utilizando anti-IgG humana conjugada con peroxidasa específica para cadenas Gamma (Dako, P0214) a 1/1000 en solución de bloqueo (no se utilizó anticuerpo secundario). Las transferencias se lavaron durante 6x5 minutos en 25 ml de PBST (1xPBS, PEG20 al 0,1 %) entre cada etapa de incubación para eliminar el anticuerpo unido de forma no específica. Se usó Pierce Super-Signal ECL (34087) para desarrollar las transferencias, que se visualizaron usando un ImageQuant (LAS4000), variando el tiempo de exposición, cuando fue necesario.
Resultados
ID34F (variante Q65B1 K59H y K101H) e ID25F (una homobicabeza de ID34F) parecen completamente resistentes tanto a rh-MMP3 como a rh-MMP12 in vitro después de 22 horas de incubación (Figura 5A). En comparación, cada uno de los agentes biológicos clínicos Etanercept, Adalimumab e Infliximab se someten a una escisión parcial o total de la molécula de longitud completa para generar fragmentos de PM más bajos (Figuras 5B y 5C). Los análisis muestran bandas correspondientes al monómero (15kDa) y bicabeza (30kDa) que no se modifican tras el tratamiento.
7.2 Evidencia de estabilidad en fluidos intestinales y extractos fecales de cerdo y mono
ID32F, ID34F, ID8F-EV y Q65B1 se incubaron en presencia de sobrenadantes de (a) duodeno porcino durante 5 horas y media, (b) intestino delgado de ratón durante 5 horas y media y (c) heces humanas durante 21 horas. Los dominios variables probados mostraron una buena estabilidad en estos extractos de diferentes regiones Gl. La supervivencia aproximada correspondiente en % para cada dominio variable fue la siguiente:
Tabla 6
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7.3 Estabilidad de ID8F-EV en extractos preparados a partir de contenidos luminales de diferentes regiones del tracto gastrointestinal de mono
ID8F-EV se incubó durante 5 horas en sobrenadantes de estómago, duodeno, yeyuno e íleon, y durante 16 horas en sobrenadantes de ciego y colon. Después de la incubación, el % de supervivencia de ID8F-EV fue entre aproximadamente 60 % y 90 %.
Ejemplo 8: Administración local de dominios variables de la cadena de inmunoglobulina al tracto intestinal y acceso a la lámina propia después de la administración por vía oral
Es poco probable que los dominios variables de la invención se unan al TNF-alfa murino; sin embargo, la demostración de la administración local al tracto intestinal y la penetración de la lámina propia a continuación de la administración por vía oral en un modelo de ratón con EII proporciona evidencia de que la neutralización del TNF-alfa puede lograrse en los sitios de inflamación intestinal.
8.1 Penetración epitelial del colon de 65B1 después de incubación ex vivo en lúmenes de segmentos de colon tomados de ratones normales y con colitis DSS (colitis inducida por Dextrano Sulfato de Sodio)
Procedimientos
Se indujo colitis DSS en dos ratones utilizando un protocolo estándar. Se administró dextrano sulfato al 2 % (MP biomedical) en agua potable durante 7 días, después de lo cual los ratones se mantuvieron durante 3 días más para permitir el desarrollo máximo de la enfermedad. A continuación, se sacrificaron los ratones, junto con 2 ratones normales, y se extirparon los dos colones. El contenido luminal del colon se lavó suavemente con PBS, a continuación los segmentos se ligaron con hilo y se procesaron como se muestra a continuación. Se cargaron segmentos de colon con 3ug/ml 65B1 en RPMI que contiene 2 % de FCS y HEPES 15 mM, a continuación se ligaron los extremos de los segmentos abiertos y los segmentos se incubaron balanceándolos suavemente en RPMI 2 % de FCS HEPES 15 mM en un matraz de cultivo a temperatura ambiente durante 1,75 h. A continuación, se cortaron los segmentos de colon, se lavaron brevemente y se fijaron en paraformaldehído o se incluyeron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) y se congelaron instantáneamente. Se recogieron secciones de tejido del tejido del colon proximal. Se cortaron secciones de 6 um y se fijaron en acetona helada durante 90 segundos. Las secciones se secaron al aire y se almacenaron a -20 grados C hasta que se analizaron. Se usaron dos secciones en serie para cada ratón para teñir cada conjunto de anticuerpos.
Inmunohistoquímica
Los portaobjetos se descongelaron y las secciones se bloquearon con 3 % de BSA libre de ácidos grasos en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. La incubación del anticuerpo primario (ya sea dominio anti-variable policlonal de conejo o un anticuerpo policlonal de control de conejo) se llevó a cabo durante la noche (~18 horas) a 4 grados C en una cámara humidificada. Se tiñó un conjunto de tres portaobjetos para cada bloque de tejido de colon de la siguiente manera (un portaobjetos por tratamiento):
-Vehículo (3 % de FAF-BSA en PBS como se describe anteriormente)
-10 ug/ml de anticuerpo de control policlonal de conejo purificado por afinidad
-10 ug/ml anticuerpo policlonal de conejo purificado por afinidad de dominio anti-variable (AB1219).
Después de la incubación, cada sección se lavó tres veces durante tres minutos con PBS helado. Todas las secciones se tiñeron con un anticuerpo IgG Alexa Fluor 594 anti-conejo de cabra a 20 ug/ml (Molecular Probes A11037) y 1 ug/ml Hoescht 33342 (para identificar núcleos celulares) en vehículo durante seis horas en la oscuridad a temperatura ambiente. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, las secciones se lavaron como se describió anteriormente, seguido de un lavado final con agua Milli Q. Las secciones se secaron al aire en la oscuridad, se montaron con un medio fijador (antifadent) (Citifluor, AF1) y se cubrieron con un cubreobjetos de vidrio. Los portaobjetos se mantuvieron en la oscuridad a 4 grados C hasta su visualización. Los portaobjetos se vieron al día siguiente con un microscopio Olympus AX70 y las imágenes se capturaron secuencialmente para cada fluorocromo (Alexa Fluor 488 y UV) con Image Pro-Plus (v7.0, Media Cybernetics). Los niveles de exposición se establecieron utilizando secciones de ratones de control o DSS tratados con el anticuerpo policlonal de conejo de control y se capturaron al menos dos campos de visión aleatorios de cada portaobjetos de cada animal.
Resultados
A diferencia de las imágenes de colon normal de ratón, la fluorescencia asociada con 65B1 aumenta considerablemente en las secciones de colon de ratones con colitis DSS. La sección de hematoxilina y eosina (H&E) reveló una inflamación extensa, que presumiblemente comprometía gravemente la función de barrera epitelial, lo que permitía el fácil acceso de 65B1 a la lámina propia subyacente. Mientras que hubo poca o ninguna penetración transepitelial de 65B1 en segmentos de colon de ratones normales, se produjo una penetración extensa en los segmentos de colon de ratones con colitis DSS. Los hallazgos sugieren que las alteraciones inducidas por la enfermedad en la función de la barrera epitelial han permitido el acceso de los dominios variables al tejido submucoso.
8.2 Examen de la penetración de 65B1 en la mucosa del colon de ratones normales y con colitis DSS después de alimentación forzada oral
Materiales y procedimientos
-Q65B1 (3,35mg/ml = 222,3uM)
-Solución de bicarbonato de sodio 1M
-Leche en polvo (Marvel),
-Anticuerpo de dominio anti-variable de conejo, pAB 1219
-pAb de conejo de control
-Alexa anti-conejo de cabra 594nm (Molecular Probes, A11037)
Se indujo colitis DSS en 3 ratones C57BL/6 administrando dextrano sulfato al 2 % (MP biomedical) en agua potable durante 7 días, después de lo cual los ratones se mantuvieron durante 3 días más para permitir el desarrollo máximo de la enfermedad. El día de la dosificación, todos los ratones con colitis DSS y 3 ratones normales recibieron 100 ul de NaHCO3, 0,1 M, 450mg/ml de leche en polvo, a continuación, -10 minutos más tarde, a dos ratones normales y dos ratones con colitis DSS con la enfermedad más grave (a juzgar por las mediciones del peso corporal) se les administraron 150 ul de NaHCO3 0,1 M que contenía 65B1, concentración final de 33,6 uM (equivalente a 76 ug) y 450mg/ml leche en polvo, mientras que los otros dos ratones (uno normal y otro con colitis DSS) recibieron solo vehículo. Los ratones se sacrificaron a las 3,25 - 3,5 h después de la dosificación de 65B1 y se extirparon los tractos gastrointestinales. Se aislaron los dos colones, se exprimió suavemente el contenido luminal y a continuación se lavaron brevemente en medio RPMI que contenía 2 % de suero de ternera fetal, después de lo cual se congelaron instantáneamente como se describe en el protocolo adjunto.
Resultados
Los colones de ratones que no recibieron 65B1 proporcionaron material para establecer la fluorescencia de fondo contra la cual se podía juzgar la fluorescencia específica de 65B1. La fluorescencia asociada a VHH era roja mientras que los núcleos celulares, marcados con Hoechst 33342, eran azules. El ratón 1, que recibió solo vehículo, mostró fluorescencia de fondo en el colon, mientras que los ratones 2 y 3 recibieron dosis de 65B1. Hay poca o ninguna diferencia en la fluorescencia roja entre los dos colones de los tres ratones, lo que demuestra que la penetración de 65B1 en el colon normal del ratón es insignificante, como se esperaba. La sección teñida con H&E mostró una estructura de colon típica sin inflamación evidente. En contraste con los ratones normales, había áreas de inflamación extensa y en algunos lugares se había producido un daño epitelial significativo. Hubo un claro aumento en la fluorescencia asociada con 65B1 en los ratones con colitis DSS que recibieron el dominio variable en comparación con los ratones con colitis DSS que recibieron solo el vehículo, lo que indica una penetración transepitelial en la lámina propia.
Este resultado demuestra que un dominio variable administrado por vía oral puede acceder a la submucosa del colon de ratones con colitis inducida. El acceso a este compartimento en pacientes con EII es un requisito previo necesario para la eficacia terapéutica.
Ejemplo 9: Efectos de ID38F e infliximab sobre la fosforilación de proteínas de señalización presentes en cultivos ex vivo de tejido de biopsia de EII
Debido a que las terapias anti-TNF-alfa basadas en anticuerpos generalmente carecen de reactividad cruzada con, por ejemplo, TNF-alfa murino, no ha sido posible evaluar la eficacia de los dominios variables de la cadena de inmunoglobulina de la presente invención en un modelo preclínico de EII basado en ratones. . Sin embargo, se ha demostrado que la administración intestinal local de lactobacilos secretores de dominios de anticuerpos anti-TNF-alfa murino es suficiente para suprimir la inflamación del colon en un modelo de ratón con EII (Vandenbroucke y col 2010 Mucosal Immunology 3(1):49-56). Los resultados de estos estudios proporcionan validación preclínica para el concepto de una estrategia basada en anticuerpos de dominio TNF anti-humano administrados por vía oral para la prevención o el tratamiento de la EII.
El infliximab es efectivo para el tratamiento de la EII. Se cree que el infliximab actúa principalmente al neutralizar la actividad biológica del t Nf , lo que conduce a la inhibición de los efectos proinflamatorios posteriores de la citoquina. La activación de los diferentes tipos celulares presentes en el tejido enfermo por parte del TNF y los mediadores inflamatorios secundarios implica múltiples vías de señalización de receptores que dan como resultado la fosforilación de receptores, proteínas quinasas y factores de transcripción. Los experimentos han demostrado que (i) los patrones de fosforilación de proteínas están alterados en la EII frente al tejido intestinal normal y que (ii) los patrones de fosforilación son sensibles a los inhibidores de mecanismos proinflamatorios específicos.
Se investigó (i) si la actividad neutralizadora de TNF de ID38F puede demostrarse en cultivos ex vivo de tejido con EII en función de los cambios en los patrones de fosforilación de proteínas tisulares y (ii) para comparar los efectos de ID38F con el infliximab anti-TNF mAb clínicamente efectivo.
Cultivo de órganos
Se colocaron biopsias colónicas perendoscópicas o muestras de mucosa ileal quirúrgica de pacientes con EII activa (una biopsia por pocillo) en placas de 24 pocillos (VWR International, Lutterworth, Reino Unido) en 300 ul de medio HL-1 sin suero (Cambrex BioScience, Wokingham, Reino Unido) complementado con 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina, y cultivadas a 37 grados C, 5 % de CO2 con los siguientes estímulos:
-IgG1 10ug/ml
-Infliximab 10ug/ml
-ID38F 4ug/ml
-Dominio variable de cadena de inmunoglobulina no anti-TNF-alfa de control) 4ug/ml
Después de 48 horas de cultivo, las biopsias y los sobrenadantes se congelaron rápidamente y se almacenaron a -70 grados C.
Procedimiento de análisis de fosfo-matriz
Para el análisis del contenido de fosfoproteínas, muestras de tejido con EII se descongelaron, se lisaron en tampón RIPA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) complementado con cóctel inhibidor de fosfatasa 2 (Sigma-Aldrich) y cóctel inhibidor de proteasa (Sigma-Aldrich), ambos al 1 %. Las concentraciones de proteína de los lisados se determinaron mediante el ensayo Bio-Rad Protein (Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Reino Unido) y las muestras se diluyeron a 1,0 mg/ml en tampón diluyente de matriz. El análisis de los perfiles de fosfoproteína se realizó con los kits de matriz de anticuerpos de señalización PathScan RTK (tecnología de señalización celular con lectura quimioluminiscente #7982). La matriz multiplexada es una matriz de anticuerpos basada en portaobjetos basada en el principio de inmunoensayo tipo sándwich. El kit de matriz permite la detección simultánea de 28 tirosina quinasas receptoras y 11 nodos de señalización importantes, cuando se fosforilan en tirosina u otros residuos (consultar la Tabla 7A). Anticuerpos de captura específicos de diana, la proteína biotinilada (control positivo) y la IgG no específica (control negativo) se colocaron por duplicado en portaobjetos de vidrio recubiertos con nitrocelulosa. El análisis de los lisados de tejidos se realizó según las instrucciones del fabricante utilizando los reactivos proporcionados. Brevemente, cada lisado diluido se incubó en el portaobjetos seguido de un cóctel de anticuerpos de detección biotinilados. A continuación, se utilizaron HRP conjugado con estreptavidina y el reactivo LumiGLO® para visualizar el anticuerpo de detección unido mediante quimioluminiscencia. Se capturó una imagen del portaobjetos en película sensible quimioluminiscente estándar. Se obtuvo una imagen de la película escaneando en un escáner a color HP LaserJet Pro 100 y se cuantificaron las intensidades puntuales usando el software ImageJ.
T l 7A
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Análisis de datos
Se midió una señal de "fondo" para cada transferencia y se restó de las señales de fosfoproteína no corregidas. Se observó que se obtuvieron valores negativos para algunos valores de fosfoproteína "sustraídos del fondo". Esto probablemente se debió al procedimiento utilizado para leer las matrices, que implicaba la exposición a una película de rayos X y el escaneo de la imagen negativa en lugar de la medición directa de la salida de luz. En los casos en los que la señal medida para una fosfoproteína en un lisado tratado con ID38F (o infliximab) dio un valor negativo después de la corrección de fondo, pero el valor corregido para el control correspondiente del dominio variable de la cadena de inmunoglobulina no anti-TNF-alfa (o IgG) fue positivo, el nivel de inhibición se calificó como > 50 %.
La evaluación visual de los datos de la matriz mostró que tanto ID38F como infliximab produjeron efectos inhibitorios sobre algunas de las fosfoproteínas en algunos de los tejidos. Para buscar los efectos de los tratamientos anti-TNF en cada una de las diferentes fosfoproteínas, las señales tomadas de las matrices de ID38F e infliximab se compararon directamente con las del dominio variable de control correspondiente y las matrices de IgG y las relaciones de señal (ID38F/control dominio variable y infliximab/IgG) calculadas. Para evaluar si había un patrón consistente de inhibición por parte de los anticuerpos anti-TNF en los tejidos de los diferentes pacientes, se destacaron aquellas fosfoproteínas que fueron inhibidas en > 50 % en los tejidos de al menos 3 de los 4 pacientes con EC (ver Tabla 7B).
Tabla 7B
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Según estos criterios, el análisis de los datos de matriz sin procesar muestra que el tratamiento con ID38F inhibió 12/39 fosfoproteínas mientras que infliximab inhibió 14/39 fosfoproteínas de las cuales 8 se compartieron con ID38F. Todas las funciones de estas proteínas son relevantes para las vías de señalización y los procedimientos inmunológicos que probablemente sean importantes en la inflamación y/o patología de la EII. Cuando se compararon los resultados de los análisis utilizando los datos "no corregidos" y de "control normalizados", el conjunto de 12 fosfoproteínas inhibidas por ID38F fue el mismo en ambos casos; para infliximab, se identificaron 12 fosfoproteínas como comunes a ambos análisis.
Para analizar más a fondo los datos de la matriz, los valores de "control normalizados" tomados de las matrices de ID38F e infliximab se compararon directamente con los valores de "control normalizados" del dominio variable de control correspondiente y las matrices de IgG y las proporciones calculadas como anteriormente. Se observó nuevamente un patrón constante de inhibición por parte de los anticuerpos anti-TNF basado en aquellas fosfoproteínas que fueron inhibidas en > 50 % en tejidos de al menos 3 de los 4 pacientes con EII (consultar la Tabla 7C).
Tabla 7C
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Tratamiento ID38F inhibió 12/39 fosfoproteínas mientras que infliximab inhibió 14/39 fosfoproteínas de las cuales 8 se compartieron con ID38F. Cuando se compararon los resultados de los análisis utilizando los datos "no corregidos" y de "control normalizados", el conjunto de 12 fosfoproteínas inhibidas por ID38F fue el mismo en ambos casos; para infliximab, se identificaron 12 fosfoproteínas como comunes a ambos análisis.
Conclusión
En cultivos de tejido de EII inflamados tomados de pacientes humanos con enfermedad activa, el tratamiento ex vivo con ID38F o con el anticuerpo monoclonal clínicamente efectivo infliximab puede inhibir la fosforilación de un conjunto de proteínas que incluyen receptores tirosina quinasas y dianas involucradas en la señalización celular. La evidencia de que el tratamiento con anticuerpos estructuralmente diferentes inhibió la fosforilación de un conjunto casi idéntico de 8 proteínas en 3 de los 4 tejidos sugiere fuertemente que los efectos de ambos anticuerpos se deben a la neutralización de procedimientos endógenos impulsados por TNF. Se observó inhibición del conjunto de fosfoproteínas por ID38F o infliximab en biopsias de tejido tomadas de al menos 3 de los 4 pacientes con EII. La falta de inhibición de fosfoproteínas particulares en uno de los tejidos con EII puede haber reflejado diferencias en la enfermedad entre pacientes. y/o diferencias en la celularidad de las biopsias tomadas de diferentes sitios de inflamación.
Este estudio proporciona evidencia de que el patrón de fosfoproteínas tisulares inhibidas por ID38F es casi idéntico al logrado con una concentración clínicamente relevante de infliximab.
Ejemplo 10: Comparación de potencia neutralizante de ID38F (un polipéptido según la presente invención) y polipéptidos anti-TNF-alfa de la técnica anterior
La potencia neutralizante de ID38F se comparó en un mismo ensayo con la de los siguientes polipéptidos anti-TNF-alfa de la técnica anterior:
TNF1 (un VHH descrito en WO2006122786, en la misma SEQ ID NO: 52)
TNF3 (un VHH descrito en WO2006122786, en la misma SEQ ID NO: 60)
TNF30 (un VHH descrito en WO2006122786, en la misma SEQ ID NO: 96)
VHH#3E (un VHH descrito en WO2004041862, en la misma SEQ ID NO: 4)
Adalimumab (anticuerpo monoclonal humano disponible comercialmente)
Materiales
Células L929 (104 células/pocillo)
Placas de 96 pocillos (Costar)
DMEM (Invitrogen) complementado con Pen/Strep L-glutamina 2 mM
Concentración de TNF-alfa humano (Invitrogen): 500pg/ml
Concentración de Actinomicina D (Sigma): 0,75 ug/mL
ID38F purificado de S. cerevisiae
ID38F Flag-His etiquetado purificado de E. coli
Adalimumab
TNF1, TNF3, TNF30, VHH#4E purificado de E. coli con etiquetas Flag-His
Intervalo de diluciones: 5pM - 30nM (diluciones 1:3)
Tiempos de incubación: 23h
Reactivo de viabilidad celular Alamar Blue (Invitrogen, DAL1100): 10uL/pocillo
3 % de SDS
Lector de microplacas (Fluostar Optima) (OD590nm)
Procedimiento
104 células L929/pocillo en 100 ul se sembraron el día 0 en microplacas de 96 pocillos (Costar) en medio completo DMEM y se almacenaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO2. El día 1 diluciones seriadas 1:3 (en DMEM Act.D) para cada purificado VHH/Ab se establecieron al doble de las concentraciones de ensayo (con volúmenes suficientes para triplicados) a partir de una concentración máxima de 60 nM. A continuación se diluyeron 165uL de cada dilución 1:1 con 165uL de hTNF-alfa 2* (1ng/mL) preparado en DMEM Act.D. Se diluyeron 0,9 mL de TNF 2x con 0,9 mL de CM Act. D para tener el único control de t Nf en el ensayo. Se retiró el medio de cada pocillo de las microplacas de ensayo y se incubaron las células con 100 ul de cada TNF dilución de VHH, CM act. D o solo control TNF. Después de 23 h de incubación a 37 °C y 5 % de CO2, se añadieron 10 ul de Alamar Blue a cada pocillo, las células se incubaron durante 2h a 37 °C y 5 % de CO2, y posteriormente se añadió 50ul de SDS al 3 % a cada pocillo. A continuación se leyeron las placas a 590 nm.
Resultados
Las curvas de neutralización resultantes (producidas con GraphPad Prism, utilizando una curva de regresión no lineal de 4 parámetros) se muestran en la Figura 6. Los valores de EC50 se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8
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Se puede ver en la Figura 6 y la Tabla 8 que VHH#3E fue el polipéptido anti-TNF-alfa menos potente para neutralizar la citotoxicidad inducida por el TNF-alfa soluble humano en células L929. ID38F (producido tanto por E. coli como por S. cerevisiae) tenía una EC50 aproximadamente 4 veces - 1 log más baja que la de los VHH anti -TNF- alfa de la técnica anterior.
Ejemplo 11: Formulación de un ICVD anti-TNF-alfa de la invención en una composición farmacéutica Se produjo una composición farmacéutica sólida que comprende uno de los ICVD anti-TNF-alfa de la invención descritos en esta invención en forma de minicomprimidos mediante granulación en seco y compresión. Este ICVD anti-TNF-alfa es un polipéptido de 12,6 kDa y 115 aminoácidos con un pl de 6,8 y una solubilidad acuosa superior a 30mg/mL. El ICVD se une con alta afinidad y tiene una potente actividad neutralizante contra el TNF-alfa humano y de mono Cynomolgus.
Los minicomprimidos se presentaron en diferentes presentaciones, donde cada presentación contenía una cantidad diferente de minicomprimidos en diferentes tamaños de cápsulas. La presentación principal utilizada en los ejemplos que se detallan a continuación fue una cápsula de HPMC de tamaño 00 que contenía 15 minitcomprimidos recubiertos entéricamente (un total de 185 mg de polipéptido de unión farmacéuticamente activo). Los núcleos de los minicomprimidos tenían un diámetro de 3 mm (excluyendo el espesor del recubrimiento). Los componentes contenidos en cada minicomprimido y, por lo tanto, en los 15 minicomprimidos contenidos en la cápsula se enumeran en la Tabla 9 a continuación.
Tabla 9
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El polipéptido total en la composición tiene una pureza de aproximadamente 70-90 %, de modo que 225 mg de polipéptido contienen 185 mg de polipéptido de unión farmacéuticamente activo.
Los minicomprimidos fueron producidos por la siguiente metodología.
El polipéptido liofilizado se mezcló con manitol y una porción del estearato de magnesio y se secó para aumentar su densidad. A continuación, este material se pasó a través de un tamiz, se mezcló con los otros excipientes de los minicomprimidos (celulosa microcristalina, croscarmelosa sódica y el estearato de magnesio restante) y se comprimió para producir los minicomprimidos. A continuación, los minicomprimidos se recubrieron con un 5 % de solución de hidroxipropilmetilcelulosa en etanol:agua 80:20, se secaron y el solvente fue eliminado para crear una sub-capa y una superficie más suave. A continuación, los minicomprimidos se recubrieron con el polímero Eudragit® L100, junto con citrato de trietilo, talco y laurilsulfato de sodio, como una solución orgánica en alcohol isopropílico y agua, y se secaron para crear una capa entérica sensible al pH. Los minicomprimidos resultantes de aproximadamente 3 mm de diámetro se envasaron a continuación en cápsulas a las dosis indicadas anteriormente. El recubrimiento entérico sensible al pH tenía un espesor de 100-170 um. El ICVD anti-TNF-alfa de la invención utilizado en esta formulación también se denomina a continuación “polipéptido de unión farmacéuticamente activo”, “ ICVD” y “polipéptido”.
Ejemplo 12: Administración a monos Cynomolgus: concentración de polipéptido en diferentes compartimentos del tracto intestinal y en las heces
12.1 Concentración de polipéptidos en diferentes compartimentos del tracto intestinal
Se realizó un estudio para evaluar el perfil de liberación de una composición similar a la del Ejemplo 11 a través de regiones del tracto intestinal cuando se administró por vía oral a monos Cynomolgus hembra. El perfil de liberación se evaluó mediante el análisis de la concentración de polipéptidos en los diferentes compartimentos del tracto intestinal.
Se administró por vía oral una sola cápsula que contenía 11 minicomprimidos a cada uno de los tres monos Cynomolgus (los monos se denominan M234, M236 y M238). La composición del minicomprimido variaba de la del Ejemplo 11 en que cada minicomprimido contenía 1 mg adicional de azul de metileno (colorante) y una dosis de 141 mg de ICVD. 8 de los minicomprimidos también contenían 0,7 mg de isoprenalina. El colorante azul de metileno se utilizó para el análisis visual de la distribución de minicomprimidos disueltos a través del tracto gastrointestinal (GI) (no discutido en esta invención) y la isoprenalina fue utilizada en un estudio de control de la frecuencia cardíaca (no discutido en esta invención).
Cuatro horas después de la administración por vía oral, los animales fueron sacrificados. Se extrajeron cuidadosamente los tractos gastrointestinales, se ligaron los diferentes compartimentos GI y a continuación se cortaron y se recogieron los contenidos luminales y los lavados. Se anotó el número de minicomprimidos sin disolver y parcialmente disueltos y se extrajeron estos minicomprimidos. A continuación, las muestras se homogeneizaron y congelaron hasta su análisis. Después de la centrifugación inicial de las suspensiones durante 5 min a 5000 rpm a 10 °C, se extrajo 1 ml de sobrenadante de cada muestra y se centrifugó a 13300 rpm en una microcentrífuga a la misma temperatura durante 5 min. A continuación, los sobrenadantes se centrifugaron de nuevo en las mismas condiciones, pero durante 20 min, después de lo cual se analizaron mediante un ELISA de competición estándar de Humira. Todas las diluciones de muestras y Humira y el estándar ICVD se prepararon en PBS que contenía 1 % de BSA, NaCl 0,6 M, 1 % de suero AB humano, Tween 20 al 0,05 % y 2x inhibidores de la proteasa. Las concentraciones de ICVD se interpolaron a partir de una curva estándar usando una ecuación de ajuste de curva no lineal de 4 parámetros en GraphPad Prism. Las concentraciones de ICVD en muestras del tracto GI sin diluir se obtuvieron tomando la media de los mejores datos interpolados multiplicados por el factor de dilución del sobrenadante.
No se encontraron minicomprimidos intactos en el estómago, duodeno, yeyuno o íleon de M236 o M238. En M234, se encontraron 4 minicomprimidos intactos en el estómago, 1 en el duodeno y 1 en el yeyuno. No se encontraron minicomprimidos parcialmente disueltos en ninguna región del tracto GI de ningún mono.
La preparación de los sobrenadantes de la suspensión requería agregar grandes volúmenes de tampón, lo que inevitablemente diluía el ICVD. En la Figura 7, se presentan las concentraciones luminales esperadas de ICVD. Estas se calcularon, asumiendo que el contenido del tracto GI luminal tiene una gravedad específica de 1, multiplicando las concentraciones de ICVD del sobrenadante por la dilución en veces al agregar el tampón. Como se muestra, concentraciones muy altas de ICVD (0.1 - > 1 mM) es probable que se produzcan en el lumen de algunos compartimentos del tracto gastrointestinal de mono.
ICVD solo se detectó en el contenido del estómago de un mono Cynomolgus (M234). También se encontró ICVD en altas concentraciones en el contenido del íleon, ciego y colon superior de todos los monos. Además, M234 y M238 se detectaron en altas concentraciones en el contenido del yeyuno (ver Figura 7).
Finalmente, el % del ICVD recuperado se calculó asumiendo que la dosis real a las 4 horas se administró solo con minicomprimidos que se habían disuelto. Como se muestra en la Figura 8, se representó entre el 51,5 y el 74,9 % de la dosis de ICVD.
Este estudio ha demostrado que un ICVD anti-TNF-alfa de la invención puede administrarse en altas concentraciones al tracto GI inferior de los monos Cynomolgus. El hallazgo de que algunos minicomprimidos permanecieron intactos 4 horas después de la dosificación sugiere que la dosis se administrará durante un período de tiempo, lo que ofrece la posibilidad de una exposición prolongada. Si estos hallazgos se reflejan en el tratamiento de pacientes con EII cuando se usa un polipéptido de unión anti-TNF-alfa, entonces es razonable esperar que las concentraciones de polipéptido anti-TNF-alfa expuestas al tracto gastrointestinal inferior sean más que adecuadas para una neutralización efectiva de TNF-alfa.
12.2 Concentración de polipéptidos en heces
Se administró por vía oral una sola cápsula que contenía 11 minicomprimidos a cada uno de los tres monos Cynomolgus. La composición del minicomprimido variaba de la del Ejemplo 11 en que cada minicomprimido contenía 1 mg adicional de azul de metileno (colorante) y 8 de los minicomprimidos también contenían 0,7 mg de isoprenalina. El colorante azul de metileno se utilizó para el análisis visual de la disolución de los minicomprimidos en las heces y la isoprenalina se utilizó en un estudio de control de la frecuencia cardíaca (no discutido en esta invención).
Las heces agrupadas de los monos se recogieron a las 8, 12, 20, 24 y 36 h (no se recogieron muestras a las 16 h). No se encontraron minicomprimidos en ninguna de las muestras fecales. Estos se mezclaron con tampón de extracción (BSA al 0,1 %, NaCl 0,6 M, Tween 20 al 0,05 %, inhibidores de proteasa 1x, EDTA 5 mM en PBS), a 1 g de heces/ 4 ml de tampón, a continuación homogeneizado y las suspensiones congeladas a -80°C para almacenamiento antes del análisis. El examen visual reveló una coloración azul de las suspensiones de 12h, 20h, 24h y 36h. Experimentos in vitro previos (no mostrados) han demostrado que la concentración creciente de azul de metileno tras la disolución de los minicomprimidos está estrechamente relacionada con la concentración de ICVD.
Las suspensiones se descongelaron y centrifugaron durante 5 min a 4000 rpm (3200 g) para eliminar la mayor parte de las partículas. Aproximadamente 1 ml de cada sobrenadante se transfirió a tubos Eppendorf y se centrifugó en una microcentrífuga a 13,5 K, 10 °C durante 5 min, después de lo cual los sobrenadantes se colocaron en tubos nuevos y se centrifugaron durante 20 min a 10 °C. A continuación, los sobrenadantes se utilizaron inmediatamente para la medición de ICVD utilizando un ELISA de competición de Humira.
Las lecturas de ELISA OD450 para los diferentes sobrenadantes fecales se muestran en la Figura 9. Los datos muestran claramente que ICVD está presente en las muestras de sobrenadante de heces en todos los puntos de tiempo, con la posible excepción del sobrenadante de 36 h (aunque puede haber una ligera actividad visible en la dilución más baja).
La interpolación de estos datos con las curvas estándar para ICVD usando GraphPad Prism y la multiplicación por el factor de dilución del tampón agregado dieron las concentraciones de ICVD en cada muestra fecal, utilizando las suposiciones de que 1 g de heces equivale a 1 ml de volumen de líquido y que el polipéptido es uniformemente distribuido en las heces. Los resultados se muestran en la Figura 10.
Uso de volúmenes de suspensión (calculados sobre la base de 1 g de heces = 1 ml, volumen de tampón para la extracción) se determinaron las cantidades en |jg de ICVD en cada muestra (Figura 11)).
En resumen, se logró una concentración sustancial sostenida de polipéptido de unión farmacéuticamente activo a través del tracto intestinal del mono cynomolgus durante más de 8 horas.
Ejemplo 13: Administración a seres humanos: concentración de polipéptido en la unión ileal-cecal y en heces
13.1 Concentración de polipéptidos en la unión ileal-cecal
El objetivo de este estudio fue demostrar que el ICVD anti-TNF-alfa de la invención incorporado en la composición del Ejemplo 11 se administra en altas concentraciones a la unión ileocecal en el hombre, un sitio importante para la enfermedad de Crohn y el sitio proximal de las lesiones de la enfermedad de Crohn en el intestino de muchos pacientes.
Cuatro voluntarios humanos, equipados con bolsas de ileostomía terminal, recibieron cada uno una dosis oral única de 1665 mg de ICVD, formulada en minipestaña dentro de cápsulas de tamaño 00 (9 cápsulas en total). En estos individuos por lo demás sanos, todo el contenido del íleon terminal drena en la bolsa externa desmontable. En cada punto de tiempo horario posterior a la dosificación, se retiró la bolsa ajustada que contenía el efluente ileal total, se congeló y se colocó una bolsa nueva. Se recogieron muestras de ileostomía de esta manera cada hora durante un período de 12 horas después de la dosificación. Después de este tiempo, se recogieron muestras de ileostomía cada cuatro horas hasta 24 horas después de la dosificación. También se tomó como control una muestra previa a la dosificación (día -1). Todos los minicomprimidos parcialmente disueltos que se observaron en las bolsas se retiraron antes del análisis, de modo que solo se analizó el ICVD completamente soluble. El ICVD se extrajo del líquido ileal y las concentraciones de ICVD activo se determinaron mediante ELISA funcional, suponiendo que 1 g de líquido ileal equivale a 1 ml de volumen líquido.
Los datos revelaron altas concentraciones de ICVD activo presente en las bolsas de ileostomía, en el intervalo de 200 nM hasta 1 mM. Además, se observaron altas concentraciones durante varias horas de cambios de bolsa para cada sujeto (ver Tabla 10).
Tabla 10
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No se detectó ICVD en ninguna de las muestras previas a la dosis (Día -1) de ningún sujeto.
En resumen, se logró una concentración alta y sostenida de polipéptido de unión farmacéuticamente activo en la unión ileal-cecal en estos voluntarios humanos.
13.2 Concentración de polipéptidos en heces
Se administró por vía oral a sujetos varones sanos de 18 a 45 años una dosis única de 62, 555, 1665 o 4995 mg de ICVD, usando la composición detallada en el Ejemplo 11. Cada dosis única por sujeto se administró entre 8:30 para 12:00 el día 1. Se recogieron muestras fecales antes de la dosis (ya sea el día -1 o antes de la dosis del día 1) y en todos los momentos disponibles después de la dosis hasta la mañana del día 4 (el final del estudio). El ICVD se extrajo de las heces y las concentraciones de ICVD activo se determinaron mediante ELISA funcional, suponiendo que 1 g de heces equivale a 1 ml de volumen líquido y que el polipéptido se distribuye uniformemente en las heces.
Se obtuvieron altas concentraciones en el intervalo de 180 nM a 724 pM en las heces de los sujetos (ver Tabla 11). Tabla 11
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Los agentes anti-TNF que se usan clínicamente para tratar la enfermedad de Crohn, como adalimumab (Humira) e infliximab (Remicade), se administran mediante infusión intravenosa o inyección subcutánea. Ungar y col. (2016) Clin Gastroenterol Hepatol. 14(4):550-557 afirman que los niveles séricos mínimos de 56-83 nM (8-12 pg/mL) para adalimumab y 42-70 nM (6-10 pg/mL) para infliximab son necesarios para lograr la cicatrización de la mucosa en 80 %-90 % de pacientes con EII, y que esto podría considerarse como una "ventana terapéutica". Estos niveles mínimos en suero también se indican en la Figura 7 con respecto a las concentraciones luminales calculadas de ICVD anti-TNF-alfa en secciones del tracto gastrointestinal del mono cynomolgus establecidas anteriormente en el punto 12.1.
Las concentraciones de ICVD anti-TNF-alfa administradas en la unión ileocecal (sección 13.1 anterior) y recuperadas en las heces de voluntarios humanos durante el trabajo clínico en esta sección fueron significativamente más altas que estos niveles y, por lo tanto, se prevé que sean eficaces como tratamiento para la enfermedad de Crohn. Esto supone que las concentraciones luminales intestinales de ICVD anti-TNF-alfa son comparables a las concentraciones séricas de agentes anti-TNF comercializados con respecto al acceso/penetración a la mucosa y submucosa intestinal. Sin embargo, se ha demostrado en trabajos experimentales adicionales (no mostrados) que este ICVD anti-TNF-alfa de la invención, dosificado por vía oral en ratones con colitis DSS, es capaz de penetrar en la lámina propia donde reside durante varias horas, a pesar de una falta de participación en la diana (TNF) en ratones.
Junto con los datos presentados en el punto 13.1 anterior, estos resultados demuestran la administración exitosa de niveles terapéuticos de ICVD desde la unión ileocecal hasta el ano.
Ejemplo 14: Administración a seres humanos: estudio de inmunogenicidad
Los fármacos proteicos, incluidos los anticuerpos terapéuticos, pueden provocar una respuesta de anticuerpos en los pacientes. Los anticuerpos (de múltiples clases de Ig) producidos en pacientes que reconocen epítopos de fármacos proteicos se denominan anticuerpos antifármaco (ADA). La presencia de ADA puede resultar en la pérdida de eficacia/potencia de fármacos o efectos adversos en el paciente (van Schie y col., Ann Rheum Dis 201574:311-314).
Se llevó a cabo un estudio para evaluar si la dosificación oral sostenida en el hombre de la composición del Ejemplo 11 provoca una respuesta de ADA. Sujetos masculinos sanos de 18 a 45 años de edad recibieron dosis por vía oral, tres veces al día, durante 14 días con cápsulas que contenían 1665 mg (un total de 4995 mg por día) de ICVD o placebo, formulados en minicomprimidos según el Ejemplo 11. Se tomaron muestras de suero de los sujetos antes de la dosificación, los días 7 y 14 después de la dosificación y finalmente a los 28 días (14 días después de la interrupción del tratamiento). Estas muestras se analizaron mediante ELISA Sandwich para detectar la presencia de anticuerpos anti-fármaco (ADA) de ICVD. Este análisis reveló sueros positivos para ADA, aunque con títulos bajos, de 4 voluntarios, dos de los cuales recibieron placebo. En todos estos individuos, los ADA estaban presentes en algún nivel antes de la dosificación de ICVD (ADA preexistentes).
El análisis de la potencia de ICVD en un ELISA TNF-TNFR2 reveló que la presencia de todas las muestras de sueros humanos positivos para ADA a 5 % no afectó la actividad de ICVD contra TNF-alfa. Por lo tanto, no se encontró evidencia de ADA neutralizantes de ICVD en los sueros de ningún voluntario en ningún momento (consulte la Tabla 12).
Tabla 12
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Diversos
A lo largo de esta memoria descriptiva y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo exija de otro modo, la palabra 'comprende', y variaciones tales como 'comprenden' y 'que comprende', se entenderá que implican la inclusión de un número entero declarado, etapa, grupo de enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero, etapa, grupo de números enteros o etapas.
La solicitud de la que forman parte esta descripción y reivindicaciones puede utilizarse como base para la prioridad con respecto a cualquier solicitud posterior. Las reivindicaciones de dicha solicitud posterior pueden estar dirigidas a cualquier característica o combinación de características descritas en esta invención. Pueden tomar la forma de reivindicaciones de producto, composición, procedimiento o uso y pueden incluir, a modo de ejemplo y sin limitación, las siguientes reivindicaciones.
Ċ
SECUENCIAS
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido que comprende un dominio variable de la cadena de inmunoglobulina que se une a TNF-alfa, donde el dominio variable de la cadena de inmunoglobulina comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1-CDR3) y cuatro regiones de estructura (FR1-FR4), donde:
(a) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID No : 3;
(b) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 63 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(c) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 64 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(d) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 65 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70,
(e) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 59, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 66 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 71;
(f) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 60, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 67, y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(g) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 67 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(h) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 68 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 72;
(i) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 69 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(j) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 62 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(k) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 69 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 3;
(l) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70;
(m) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 61 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 70 o
(n) la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 62 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 3
y donde el polipéptido neutraliza la citotoxicidad del TNF-alfa humano en el ensayo L929 normal con una EC50 de 0,7 nM o menos.
2. El polipéptido según la reivindicación 1, donde la secuencia de CDR1 comprende SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 comprende SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDR3 comprende SEQ ID NO: 3.
3. El polipéptido según la reivindicación 2, donde la secuencia de CDR1 consiste en SEQ ID NO: 1, la secuencia de CDR2 consiste en SEQ ID NO: 2 y la secuencia de CDR3 consiste en SEQ ID NO: 3.
4. Un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 8.
5. El polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el polipéptido es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo seleccionado de entre la lista que consiste en: un VHH, un VH, un VL, un V-NAR, un fragmento Fab y un fragmento F(ab')2.
6. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que neutraliza la citotoxicidad del TNF-alfa humano en el ensayo L929 normal con una EC50 de 0,6 nM o menos, como 0,5 nM o menos, como 0,4 nM o menos, como 0,3 nM o menos, como 0,2 nM o menos, como 0,1 nM o menos, como 0,09 nM o menos, como 0,08 nM o menos, como 0,07 nM o menos, como 0,06 nM o menos, como 0,05 nM o menos, tal como 0,04 nM o menos.
7. El polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es sustancialmente resistente a una o más proteasas, como una o más proteasas presentes en el intestino delgado o grueso.
8. El polipéptido según la reivindicación 7, donde una o más proteasas se seleccionan de entre el grupo que consiste en enteropeptidasa, tripsina, quimotripsina y proteasas inflamatorias de la enfermedad inflamatoria intestinal, tales como m Mp 3, MMP12 o catepsina.
9. Una construcción que comprende al menos un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y al menos un polipéptido diferente, donde el polipéptido diferente se une a una diana distinta de TNF-alfa, como una interleucina (como IL-1, IL- 1Ra, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, IL-18 e IL-23), un receptor de interleucina (como IL-6R e IL-7R), un factor de transcripción (como NF-kB), una citocina (como IFN-gamma TGF-beta y TSLP), una proteína transmembrana (como gp130 y CD3), una glicoproteína de superficie (como CD4, CD20, c D40), una proteína soluble (como CD40L), una integrina (como a4b7 y AlphaEbeta7), una molécula de adhesión (como MAdCAM ), una quimiocina (como IP10 y CCL20), un receptor de quimiocina (como CCR2 y CCR9), una proteína inhibidora (como SMAD7), una cinasa (como JAK3), un receptor acoplado a proteína G (como receptor de esfingosina-1-P), otros mediadores inflamatorios o ligandos inmunológicamente relevantes involucrados en procedimientos patológicos humanos.
10. La construcción según la reivindicación 9, donde al menos un polipéptido diferente se une a IL-23.
11. La construcción según la reivindicación 9, donde al menos un polipéptido diferente se une a IL-7R.
12. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido o construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 y uno o más diluyentes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
13. La composición farmacéutica según la reivindicación 12 donde la composición se presenta en forma entéricamente recubierta.
14. La composición farmacéutica según la reivindicación 12 o 13 que comprende al menos un agente activo adicional seleccionado de entre la lista que consiste en: ácido 5-aminosalicílico, o un profármaco del mismo (como sulfasalazina, olsalazina o bisalazida); corticosteroides (p. ej., prednisolona, metilprednisolona o budesonida); inmunosupresores (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimus, metotrexato, azatioprina o 6-mercaptopurina); anticuerpos anti-TNF-alfa (p. ej., infliximab, adalimumab, certolizumab pegol o golimumab); anticuerpos anti-IL12/IL23 (p. ej., ustekinumab); anticuerpos anti-IL6R o inhibidores de IL12/IL23 de molécula pequeña (p. ej., apilimod); anticuerpos anti-alfa-4-beta-7 (p. ej., vedolizumab); bloqueadores de MAdCAM-1 (p. ej., p F-00547659); anticuerpos contra la molécula de adhesión celular alfa-4-integrina (p. ej., natalizumab); anticuerpos contra la subunidad alfa del receptor de IL2 (p. ej., daclizumab o basiliximab); inhibidores de JAK3 (p. ej., tofacitinib o R348); inhibidores de Syk y profármacos de los mismos (p. ej., fostamatinib y R-406); inhibidores de la fosfodiesterasa-4 (p. ej., tetomilast); h Mp L-004; probióticos; dersalazina; semapimod/CPSI-2364; e inhibidores de la proteína quinasa C (por ejemplo, AEB-071).
15. El polipéptido, construcción o composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o enfermedad inflamatoria.
16. El polipéptido, construcción o composición farmacéutica para uso según la reivindicación 15 en el tratamiento de una enfermedad autoinmune y/o enfermedad inflamatoria por administración por vía oral.
17. Un polinucleótido que codifica el polipéptido o construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.
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