CN111499762B

CN111499762B - 一种包含PDGFRβ特异性亲和体和TNFα的融合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN111499762B
Application number: CN202010070719.8A
Authority: CN
Inventors: 卢晓风; 陶泽; 杨浩; 程惊秋
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111499762A

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白，它包括如下部分：(1)PDGFRβ特异性亲和体的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少80％同源性序列的结构域；(2)肿瘤坏死因子α的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少80％同源性序列的结构域。本发明的融合蛋白具有较高的安全性和抗肿瘤作用，还可以提高肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，显著提高阿霉素的抗肿瘤活性。本发明在抗肿瘤药物制备中具有很高的应用价值。

Description

一种包含PDGFRβ特异性亲和体和TNFα的融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术药物领域，具体涉及一种包含PDGFRβ特异性亲和体和TNFα的融合蛋白的制备和应用。

背景技术

肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α，TNFα)是一种促炎性细胞因子，在机体抗肿瘤中起重要作用。重组表达的TNFα具有显著的抗肿瘤效果。但是，因受体广泛表达于正常细胞，TNFα直接应用将引起严重的系统毒性，只能下肢局部灌注用于治疗黑色素瘤或肉瘤，或肝脏局部灌注治疗无法手术切除的肝癌等(Ronca等，Immunobiology，2009，214：800-810)。靶向运输是减少TNFα系统毒性的有效途径。已有研究集中利用特异性识别肿瘤细胞或肿瘤血管细胞的抗体或肿瘤导向肽靶向递送TNFα(Corti等，BioDrugs，2013，27：591-603)。但是，将抗体或抗体片段与TNFα连接组建的融合蛋白分子量较大，难于表达。

NGR(CNGRCG)是一种肿瘤导向肽(tumor-homing peptide)，能特异结合肿瘤血管内皮细胞高表达的CD13。NGR与TNFα共价连接形成的融合蛋白NGR-TNFα能结合于肿瘤血管内皮细胞而富集于肿瘤部位，发挥抗肿瘤效果。研究发现，高剂量的NGR-TNFα可直接损伤血管内皮细胞，导致血管渗漏，引起出血性坏死而显示抗肿瘤作用；但是，NGR-TNFα结合CD13的能力较弱，且CD13也在正常组织中表达，将NGR-TNFα用于抗肿瘤药物制备，具有较大的安全性问题。

目前缺少一种安全性高的靶向递送TNFα的导向分子，或者一种安全性高的靶向性的TNFα相关融合蛋白。

亲和体(affibody)是一种衍生于葡萄球菌A蛋白Z结构域的人工蛋白质分子，为单链结构，由58个氨基酸组成，相对分子质量约为6.5kDa，形成3个α螺旋结构，其中第1及第2螺旋中的13个特定位点的氨基酸对其结构无明显影响，分别是Q9(谷氨酰胺)、Q10(谷氨酰胺)、N11(天冬酰胺)、F13(苯丙氨酸)、Y14(酪氨酸)、L17(亮氨酸)、H18(组氨酸)、E24(谷氨酸)、E25(谷氨酸)、R27(精氨酸)、N28(天冬酰胺)、Q32(谷氨酰胺)、K35(赖氨酸)，用简并密码子NNK(K＝G或者T，包含32种密码子，囊括了20种氨基酸)替换这13个氨基酸的密码子，形成很多转化体，理论上包含3213个基因序列和2013个氨基酸序列，这些转化体也就组成了affibody文库，用该文库对靶标进行筛选，可获得能与靶标特异结合的亲和体(KronqvistN等，Protein Eng Des Sel，2011，24(4)：385-396)，简称特异性亲和体。

肿瘤标志物蛋白的特异性亲和体，已经开始被用于肿瘤成像研究中(杨恒丽.第四军医大学，2015.)和抗肿瘤药物研究(Zielinski R，Clinical Cancer Research，2011，17(15)：5071-5081)中。但目前尚未见将亲和体用于靶向递送TNFα的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种融合蛋白，它包括如下部分：

(1)PDGFRβ(血小板源性生长因子受体β)特异性亲和体的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少80％同源性序列的结构域；

(2)肿瘤坏死因子α的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少80％同源性序列的结构域。

如前述的融合蛋白，它包括如下部分：

(1)PDGFRβ特异性亲和体的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少90％同源性序列的结构域；

(2)肿瘤坏死因子α的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少90％同源性序列的结构域。

如前述的融合蛋白，部分(1)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

如前述的融合蛋白，部分(2)所述的功能性片段是肿瘤坏死因子α的胞外段。

如前述的融合蛋白，部分(2)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.7所示。

如前述的融合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了一种核酸分子，它包括如下部分：

(1)PDGFRβ特异性亲和体的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少80％同源性序列的结构域的DNA或RNA编码序列；

(2)肿瘤坏死因子α的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少80％同源性序列的结构域的DNA或RNA编码序列。

如前述的核酸分子，它包括如下部分：

(1)PDGFRβ特异性亲和体的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少90％同源性序列的结构域的DNA或RNA编码序列；

(2)肿瘤坏死因子α的功能性片段结构域或与该功能性片段具有至少90％同源性序列的结构域的DNA或RNA编码序列。

如前述的核酸分子，部分(1)的编码序列如SEQ ID NO.2所示。

如前述的核酸分子，部分(2)所述的功能性片段是肿瘤坏死因子α的胞外段。

如前述的核酸分子，部分(2)的编码序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示。

如前述的核酸分子，的序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示。

本发明还提供了包含前述核酸分子的序列的重组载体。

所述重组载体是重组质粒或基因工程载体；优选地，所述的重组质粒为重组pQE30质粒。

本发明还提供了含有如前所述重组载体的细胞。

进一步地，所述细胞是大肠杆菌细胞。

本发明还提供了前述融合蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

如前述的用途，所述治疗肿瘤的药物包括治疗黑色素瘤、肉瘤的药物。

本发明还提供了一种抗肿瘤药物，它是以前述融合蛋白为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明还提供了一种抗肿瘤联合用药物，它含有相同或不同规格的用于同时或者分别给药的前述抗肿瘤药物和阿霉素。

本发明具有如下有益效果：

1)本发明的融合蛋白分子量较小，容易纯化。SDS-PAGE电泳能得到单一条带，凝胶过滤层析可得到单峰。

2)本发明的融合蛋白可有效地通过周细胞表面的PDGFRβ与周细胞有效结合，该效果在实施例3中得到了流式细胞术的验证。

3)本发明的融合蛋白的系统毒性低于TNFα以及现有技术中的NGR-TNFα，表明安全性较高。

4)本发明的融合蛋白抗肿瘤效果显著，10μg/只的注射剂量即可在小鼠皮下黑色素瘤模型中显著抑制肿瘤的生长，其效果优于NGR-TNFα。

5)本发明的融合蛋白还可与DOX(阿霉素)联用，发挥协同增效作用，实现有效的肿瘤治疗。在肉瘤或黑色素瘤小鼠模型中，1μg/只的前述融合蛋白单独使用，几乎没有抗肿瘤作用；但1μg/只的前述融合蛋白和3mg/kg Dox联用能显著增强DOX的抗肿瘤效果。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为变异体Z-TNFα的分子设计；

图2为Z-TNFα蛋白的SDS-PAGE电泳；

图3为Z-TNFα蛋白的凝胶过滤层析；

图4为Z-TNFα与周细胞的结合结果；A：周细胞表达PDGFRβ；B：Z-TNFα对周细胞的结合及其被抗PDGFRβ抗体(a-PDGFRβ)的封闭；

图5为Z-TNFα与TNFα的系统毒性比较；

图6为Z-TNFα单独使用的抗肿瘤效果；

图7为Z-TNFα与NGR-TNFα的有效性对比图；

图8为Z-TNFα与NGR-TNFα的安全性对比图；

图9为Z-TNFα增强DOX的抗肿瘤效果(S180肉瘤)；

图10为Z-TNFα增强DOX的抗肿瘤效果(B16F1黑色素瘤)；

图11为Z_PDGFRβ和TNFα混合未增强DOX的抗肿瘤效果(B16F1黑色素瘤)。

具体实施方式

下表(表1)中包含实施例中的氨基酸和核酸序列。

表1本发明涉及的融合蛋白氨基酸和核苷酸序列

实施例1包含PDGFRβ特异性亲和体Z_PDGFRβ和TNFα的融合蛋白Z-TNFα的分子设计及克隆构建

1、Z-TNFα的分子设计

亲和体Z_PDGFRβ由58个氨基酸组成(表1)。TNFα为鼠源TNFα胞外段(77-233的氨基酸组成的片段)(见表1)。优先设计将Z_PDGFRβ连接在TNFα的N末端，构建融合蛋白Z-TNFα。

2、Z-TNFα表达载体的构建

根据Z_PDGFRβ的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，设计其初始编码基因(SEQ ID NO：2)，再经核酸分析软件优化。TNFα基因编码序列参考gene bank(NM_013693.3)提供的序列(SEQID NO：3，SEQ ID NO：4)。根据分子设计，用软件组建Z-TNFα编码基因(SEQ ID NO：5，SEQ IDNO：6)，然后委托基因合成公司人工合成。基因两端添加BamHI和SalI酶切位点，酶切后克隆入pQE 30表达载体，获得Z-TNFα表达载体pQE30-Z-TNFα。用同样的方法制备TNFα表达载体pQE30-TNFα。

实施例2 Z-TNFα的表达及分离纯化

将pQE30-Z-TNFα质粒转入大肠杆菌M15菌株，挑取单克隆菌种接入双抗性(氨苄西林100μg/ml，卡那霉素30μg/ml)LB液体培养基中，37℃振荡培养，当菌液浓度A₆₀₀至0.8左右时，加入0.05mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，26℃振荡诱导培养14-16小时。离心(7000g，10min)收集菌体，用Lysis buffer(50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0；300mM氯化钠；20mM咪唑；10mM β-巯基乙醇)重悬，加入苯甲基磺酰氟(Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)至终浓度为1mM，冰浴条件下超声破菌(功率300W，工作10s，间隔30s，共40min)。破菌完成后，离心(4℃，25000g，10min)，重复4次，收集破菌上清。获得的上清与Ni-NTA树脂凝胶(购自Qiagen)按照适量体积比混合，4℃振荡结合2h。将结合后的凝胶填料灌入层析柱，待蛋白样品过柱完成后，用Wash buffer(50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0；300mM氯化钠；40mM咪唑；10mM β-巯基乙醇)洗涤凝胶柱30倍柱体积以上。然后用Elution buffer(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.6；300mM氯化钠；300mM咪唑；10mM β-巯基乙醇)洗脱收集蛋白样品。用同样的方法制备TNFα。纯化后的蛋白经SDS-PAGE电泳显示为单一条带(图2)，凝胶过滤层析显示为单峰(图3)，表明我们获得了Z-TNFα蛋白。纯化后的蛋白用磷酸盐缓冲液PBS(10mM磷酸氢二钠，137mM氯化钠，2.68mM氯化钾，2mM磷酸二氢钾，pH 7.4)透析过夜后备用。

实施例3 Z-TNFα与周细胞的结合

首先通过PDGFRβ特异性抗体与周细胞孵育后，利用流式细胞术检测周细胞表面的PDGFRβ受体表达情况。结果如图4A所示，周细胞表面高表达PDGFRβ。为了进一步分析Z-TNFα是否能够与周细胞结合，我们利用FAM染料标记Z-TNFα和TNFα，然后将其与周细胞共同孵育1h，再用流式细胞术分析。图4B结果显示，Z-TNFα能够与周细胞结合。而且，这种结合能够被预先与细胞孵育的PDGFRβ特异性抗体(a-PDGFRβ)减弱，说明Z-TNFα是通过细胞表面的PDGFRβ与细胞结合。但是，TNFα基本不与周细胞结合，这些说明融合Z_PDGFRβ赋予了TNFα对PDGFRβ高表达周细胞的结合能力。

实施例4融合Z_PDGFRβ降低了TNFα的系统毒性

为了评估融合Z_PDGFRβ后TNFα的系统毒性是否有变化，我们对雌性C57BL/6小鼠(16-18g，每组10只)隔天通过尾静脉注射不同剂量Z-TNFα或TNFα，每天记录小鼠体重变化和存活率。结果如图5所示，当TNFα剂量为20μg/只时，第一次注射后，小鼠存活率只有10％，第三次注射后小鼠全部死亡。当TNFα剂量降低到10μg/只时，第一次注射后小鼠存活率为70％，第三次注射后小鼠存活率仅为40％。而以20μg/只剂量Z-TNFα注射三次后，小鼠存活率为100％。即便当Z-TNFα剂量加大到40μg/只时，三次给药后仍有80％的小鼠存活。这些结果说明融合Z_PDGFRβ显著降低了TNFα的系统毒性，提高了TNFα的安全性。

实施例5 Z-TNFα单独使用能直接发挥抗肿瘤作用

将5×10⁴个小鼠黑色素瘤B16F1细胞接种到C57小鼠皮下，构建荷瘤模型。接种后第5天，将小鼠随机分组，分别通过尾静脉给予高剂量(10μg/只)或低剂量(1μg/只)Z-TNFα，对照组给予相同体积的PBS。隔天给药，共5次。每天测量肿瘤大小，观察结束时，取瘤体称重。如图6所示，高剂量Z-TNFα能够显著抑制肿瘤生长。治疗结束时，PBS对照组、低剂量Z-TNFα组和高剂量Z-TNFα组的瘤体平均重量分别为0.447±0.051g，0.37±0.053g和0.071±0.027g。这一结果表明高剂量Z-TNFα(10μg/只)在体内具有直接抗肿瘤作用。

实施例6 Z-TNFα与NGR-TNFα的有效性、安全性比较

与Z_PDGFRβ相似，NGR也具有肿瘤靶向性。已有研究将NGR肽与TNF α融合构建了融合蛋白NGR-TNFα(氨基酸和DNA序列分别如SEQ ID NO：11和12所示).为了进行比较，本实施例(比较了Z-TNFα和NGR-TNFα在有效性和安全性方面的差异

1.安全性实验

将小鼠分组，每只分别注射Z-TNFα 20μg、Z-TNFα 40μg或NGR-TNFα 20μg，观察融合蛋白对小鼠存活率的影响。

结果如图7所示，Z-TNFα 20μg组在注射后16天存活率保持在100％，Z-TNFα 40μg组在注射后第4天有少量死亡，NGR-TNFα 20μg组在注射后4天半数死亡。

安全性实验表明，本发明的Z-TNFα的安全性比NGR-TNFα安全性更高。

2.有效性实验

将小鼠黑色素瘤B16F1细胞(2×10⁴个)接种小鼠皮下，建立荷瘤模型。成瘤后将小鼠分组，分别给予Z-TNFα(10μg/只)或NGR-TNFα(10μg/只)，与等体积PBS对照相比，比较其抗肿瘤效果的差异。结果如图8所示，经Z-TNFα和NGR-TNFα治疗后，肿瘤生长速度均变慢，说明两种蛋白均有一定抗肿瘤效果。但是，Z-TNFα治疗后的肿瘤生长速度比NGR-TNFα治疗后的肿瘤生长速度慢，说明Z-TNFα比NGR-TNFα的抗肿瘤作用强。

实施例7 Z-TNFα联用能提高DOX的抗肿瘤效果

将小鼠肉瘤S180(2x10⁶个)细胞或小鼠黑色素瘤B16F1细胞接种到相应的小鼠皮下，建立荷瘤模型。成瘤后将小鼠分组，分别单独给予Z-TNFα(1μg/只)和DOX组(3mg/kg)或将两者联合使用。与PBS对照相比，比较不同药物组合抗肿瘤效果的差异。

在S180肉瘤荷瘤鼠模型中，接种后第4天开始，通过尾静脉隔天给药，共8次。结果如图9所示，治疗结束时，PBS对照组、Z-TNFα组、DOX组和Z-TNFα+DOX联合组的瘤体平均重量分别为0.858±0.106g，0.788±0.098g，0.435±0.074g和0.209±0.035g，说明与Z-TNFα联用，显著增强了DOX的抗肿瘤效果。

在B16F1黑色素瘤荷瘤鼠模型中，接种后第8天开始给药，隔天给药共5次。结果如图10所示，治疗结束时，PBS对照组、Z-TNFα组、DOX组和Z-TNFα+DOX组的瘤体平均重量分别为0.416±0.071g，0.339±0.051g，0.161±0.033g和0.066±0.015g，也说明与Z-TNFα联用显著增强了DOX的抗肿瘤效果。但是，治疗小鼠B16F1黑色素瘤荷瘤鼠模型发现，治疗结束时，PBS对照组、Z_PDGFRβ与TNFα混合物组(Z_PDGFRβ+TNFα)、DOX组和Z_PDGFRβ与TNFα混合物和DOX联合组(Z_PDGFRβ+TNFα+DOX)的瘤体平均重量分别为0.802±0.101g，0.618±0.094g，0.2±0.013g和0.188±0.009g(图11)，说明与Z_PDGFRβ和TNFα混合物联用，并不能显著增强DOX的抗肿瘤效果。

上述结果说明只有将Z_PDGFRβ与TNFα融合，而不是简单将两者混合，才对DOX有增效作用。

实施例8 Z-TNFα01的分子设计

亲和体Z_PDGFRβ由58个氨基酸组成(SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2)。TNFα01为人源TNFα胞外段(77-233的氨基酸组成的片段)(SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8)。优先设计将Z_PDGFRβ连接在TNFα01的N末端，构建融合蛋白Z-TNFα01(SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10)。

Z-TNFα01是在Z-TNFα的基础上，将鼠源TNFα胞外段替换成人源TNFα，可以合理推知Z-TNFα01同样具有Z-TNFα抗肿瘤活性、与DOX的协同增效抗肿瘤活性以及安全性；并且可能更适用于人类肿瘤治疗。

综上，本发明的融合蛋白Z-TNFα或Z-TNFα01既可单独用于抗肿瘤，又能与阿霉素发挥协同增效作用，达到更高的抗肿瘤效果；而且，本发明的融合蛋白还比已报道的同类融合蛋白NGR-TNFα具有更强的抗肿瘤活性和更高的安全性。本发明的融合蛋白具有十分优良的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种包含PDGFRβ特异性亲和体和TNFα的融合蛋白及其用途

<130> GYKH1094-2020P018885CCZ20JS007

<150> 2019101064183

<151> 2019-01-31

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 58

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Ala Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ala Ala Glu Ile

1 5 10 15

Asp Ala Leu Pro Asn Leu Asn Arg Arg Gln Trp Asn Ala Phe Ile Lys

20 25 30

Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys

50 55

<210> 2

<211> 174

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

gctgaaaaca aatttaacaa agaactgatt gaagccgctg ccgaaattga tgctctgccg 60

aacctgaacc gtcgccagtg gaatgctttt attaaatctc tggtggatga cccgagccag 120

tctgctaacc tgctggctga agcgaaaaaa ctgaatgatg cccaagcacc gaaa 174

<210> 3

<211> 156

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val

85 90 95

Lys Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro

100 105 110

Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly

115 120 125

Asp Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala

130 135 140

Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu

145 150 155

<210> 4

<211> 468

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

ctcagatcat cttctcaaaa ttcgagtgac aagcctgtag cccacgtcgt agcaaaccac 60

caagtggagg agcagctgga gtggctgagc cagcgcgcca acgccctcct ggccaacggc 120

atggatctca aagacaacca actagtggtg ccagccgatg ggttgtacct tgtctactcc 180

caggttctct tcaagggaca aggctgcccc gactacgtgc tcctcaccca caccgtcagc 240

cgatttgcta tctcatacca ggagaaagtc aacctcctct ctgccgtcaa gagcccctgc 300

cccaaggaca cccctgaggg ggctgagctc aaaccctggt atgagcccat atacctggga 360

ggagtcttcc agctggagaa gggggaccaa ctcagcgctg aggtcaatct gcccaagtac 420

ttagactttg cggagtccgg gcaggtctac tttggagtca ttgctctg 468

<210> 5

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Ala Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ala Ala Glu Ile

1 5 10 15

Asp Ala Leu Pro Asn Leu Asn Arg Arg Gln Trp Asn Ala Phe Ile Lys

20 25 30

Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Leu Arg Ser Ser Ser Gln

50 55 60

Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn His Gln Val

65 70 75 80

Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala

85 90 95

Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ala Asp Gly

100 105 110

Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro

115 120 125

Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe Ala Ile Ser Tyr

130 135 140

Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys Ser Pro Cys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr

165 170 175

Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln Leu Ser Ala Glu

180 185 190

Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr

195 200 205

Phe Gly Val Ile Ala Leu

210

<210> 6

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gctgaaaaca aatttaacaa agaactgatt gaagccgctg ccgaaattga tgctctgccg 60

aacctgaacc gtcgccagtg gaatgctttt attaaatctc tggtggatga cccgagccag 120

tctgctaacc tgctggctga agcgaaaaaa ctgaatgatg cccaagcacc gaaactcaga 180

tcatcttctc aaaattcgag tgacaagcct gtagcccacg tcgtagcaaa ccaccaagtg 240

gaggagcagc tggagtggct gagccagcgc gccaacgccc tcctggccaa cggcatggat 300

ctcaaagaca accaactagt ggtgccagcc gatgggttgt accttgtcta ctcccaggtt 360

ctcttcaagg gacaaggctg ccccgactac gtgctcctca cccacaccgt cagccgattt 420

gctatctcat accaggagaa agtcaacctc ctctctgccg tcaagagccc ctgccccaag 480

gacacccctg agggggctga gctcaaaccc tggtatgagc ccatatacct gggaggagtc 540

ttccagctgg agaaggggga ccaactcagc gctgaggtca atctgcccaa gtacttagac 600

tttgcggagt ccgggcaggt ctactttgga gtcattgctc tg 642

<210> 7

<211> 157

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 7

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

115 120 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

130 135 140

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

145 150 155

<210> 8

<211> 471

<212> DNA

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 8

gtcagatcat cttctcgaac cccgagtgac aagcctgtag cccatgttgt agcaaaccct 60

caagctgagg ggcagctcca gtggctgaac cgccgggcca atgccctcct ggccaatggc 120

gtggagctga gagataacca gctggtggtg ccatcagagg gcctgtacct catctactcc 180

caggtcctct tcaagggcca aggctgcccc tccacccatg tgctcctcac ccacaccatc 240

agccgcatcg ccgtctccta ccagaccaag gtcaacctcc tctctgccat caagagcccc 300

tgccagaggg agaccccaga gggggctgag gccaagccct ggtatgagcc catctatctg 360

ggaggggtct tccagctgga gaagggtgac cgactcagcg ctgagatcaa tcggcccgac 420

tatctcgact ttgccgagtc tgggcaggtc tactttggga tcattgccct g 471

<210> 9

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Ala Glu Asn Lys Phe Asn Lys Glu Leu Ile Glu Ala Ala Ala Glu Ile

1 5 10 15

Asp Ala Leu Pro Asn Leu Asn Arg Arg Gln Trp Asn Ala Phe Ile Lys

20 25 30

Ser Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala

35 40 45

Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Arg Ser Ser Ser Arg

50 55 60

Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala

65 70 75 80

Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala

85 90 95

Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly

100 105 110

Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro

115 120 125

Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser

130 135 140

Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln

145 150 155 160

Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile

165 170 175

Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala

180 185 190

Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val

195 200 205

Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

210 215

<210> 10

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

gctgaaaaca aatttaacaa agaactgatt gaagccgctg ccgaaattga tgctctgccg 60

aacctgaacc gtcgccagtg gaatgctttt attaaatctc tggtggatga cccgagccag 120

tctgctaacc tgctggctga agcgaaaaaa ctgaatgatg cccaagcacc gaaagtcaga 180

tcatcttctc gaaccccgag tgacaagcct gtagcccatg ttgtagcaaa ccctcaagct 240

gaggggcagc tccagtggct gaaccgccgg gccaatgccc tcctggccaa tggcgtggag 300

ctgagagata accagctggt ggtgccatca gagggcctgt acctcatcta ctcccaggtc 360

ctcttcaagg gccaaggctg cccctccacc catgtgctcc tcacccacac catcagccgc 420

atcgccgtct cctaccagac caaggtcaac ctcctctctg ccatcaagag cccctgccag 480

agggagaccc cagagggggc tgaggccaag ccctggtatg agcccatcta tctgggaggg 540

gtcttccagc tggagaaggg tgaccgactc agcgctgaga tcaatcggcc cgactatctc 600

gactttgccg agtctgggca ggtctacttt gggatcattg ccctg 645

<210> 11

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Cys Asn Gly Arg Cys Gly Leu Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp

1 5 10 15

Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu

20 25 30

Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp

35 40 45

Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val

50 55 60

Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu

65 70 75 80

Leu Thr His Thr Val Ser Arg Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val

85 90 95

Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu

100 105 110

Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val

115 120 125

Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro

130 135 140

Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile

145 150 155 160

Ala Leu

<210> 12

<211> 486

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

tgcaacggcc gttgcggcct cagatcatct tctcaaaatt cgagtgacaa gcctgtagcc 60

cacgtcgtag caaaccacca agtggaggag cagctggagt ggctgagcca gcgcgccaac 120

gccctcctgg ccaacggcat ggatctcaaa gacaaccaac tagtggtgcc agccgatggg 180

ttgtaccttg tctactccca ggttctcttc aagggacaag gctgccccga ctacgtgctc 240

ctcacccaca ccgtcagccg atttgctatc tcataccagg agaaagtcaa cctcctctct 300

gccgtcaaga gcccctgccc caaggacacc cctgaggggg ctgagctcaa accctggtat 360

gagcccatat acctgggagg agtcttccag ctggagaagg gggaccaact cagcgctgag 420

gtcaatctgc ccaagtactt agactttgcg gagtccgggc aggtctactt tggagtcatt 480

gctctg 486

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.9所示。

2.一种核酸分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.10所示。

3.包含权利要求2所述核酸分子的序列的重组载体。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是基因工程载体。

5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是重组质粒。

6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述的重组质粒为重组pQE30质粒。

7.包含权利要求3-5任一项所述重组载体的细胞。

8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于：所述细胞是大肠杆菌细胞。

9.权利要求1所述融合蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述治疗肿瘤的药物为治疗肉瘤的药物。

10.权利要求1所述融合蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的用途，所述治疗肿瘤的药物为治疗黑色素瘤的药物。

11.一种抗肿瘤药物，其特征在于：所述药物是以权利要求1所述融合蛋白为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

12.一种抗肿瘤联合用药物，其特征在于：其是含有相同或不同规格的用于同时或者分别给药的权利要求11所述的药物和阿霉素。