KR20230096981A - 변형된 il-2 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 변형된 IL-2 분자를 개시한다. 여기에서 상기 변형은 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역을 사용해 IL-2 분자 중 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역을 치환하는 단계를 포함하고, 상기 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 9개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 본 출원은 단백질 이종이합체를 더 개시한다. 여기에는 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자, 및 IL15Rα(sushi 도메인) 또는 이의 변이체가 포함된다. 본 출원 중의 변형된 IL-2 분자 및/또는 이를 포함하는 단백질 이종이합체는 IL2Rα와의 친화도를 현저하게 감소시키므로, 임상 치료에서 이의 부작용을 크게 줄여 우수한 약용 전망을 갖고 있다.

Description

변형된 IL-2 분자 및 이의 용도
본 발명은 생물의약 분야에 관한 것으로, 보다 상세하게는 변형된 IL-2 분자 및 이의 용도에 관한 것이다.
공개 정보에 따르면, 2017년 2월 WHO에서 발표한 데이터에 따르면, 전 세계적으로 매년 1,400만 건 이상의 새로운 암 사례가 발생하고 있으며 이 수치는 2030년까지 2,100만 명 이상으로 증가할 것으로 예상된다. 매년 880만 명이 암으로 사망하고 있으며, 전 세계 암 사망자 수는 전체 사망자의 1/6에 달한다. 암의 예방과 치료는 의료계에서 시급히 해결해야 할 전 세계적인 과제이다.
현재 암 치료에 사용되는 종래 방법에는 수술, 화학 요법, 호르몬 요법 및 방사선 요법이 있다(예를 들어, Stockdale, 1998년 <암 환자 관리 원칙>(Principles of Cancer Patient Management), <과학미국인: 의약>(Scientific American: Medicine), 제3권, Rubenstein 및 Federman 편저, 제12장 제IV절 참조). 그러나 환자 건강 상태나 질환 말기 상황으로 인해 외과 수술이 불가능할 수 있고, 수술 후 암세포가 환자 체내에서 완전히 제거되지 않는 경우가 많다. 종양 조직의 방사선에 대한 민감도가 정상 조직보다 높은 경우에만 방사선 요법이 유효하며, 고용량의 방사선량은 종종 심각한 부작용을 일으킨다. 호르몬 요법은 단일 약제로 사용되는 경우가 매우 적다. 이는 효과가 있을 수 있지만 통상적으로 다른 요법으로 대부분의 암세포를 제거한 후 암의 재발을 예방하거나 지연시키는 데 사용된다. 화학 요법의 가장 큰 문제는 환자가 화학 요법 약물에 대한 내성이 빠르게 나타날 수 있다는 것이다.
이 외에도, 면역 조절 인자(예를 들어, 인터류킨)는 동물 모델 및 암 환자에 대해 항종양 효과를 발휘하고 상술한 다양한 종래 요법 중의 결함을 피하기 위해 적용될 수 있다. 그러나 면역 조절 인자의 사용과 관련된 전신 독성 부작용은 그 사용을 크게 제한한다. 따라서 면역 조절 인자의 독성 부작용을 줄일 수 있는 효과적인 치료법의 개발이 필요하다.
상술한 종래 기술의 문제를 고려하여, 일 양상에 있어서, 본 출원은 변형된 IL-2 분자를 제공한다. 여기에서 상기 변형은 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역을 사용해 IL-2 분자 중 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역을 치환하는 단계를 포함하고, 상기 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 9개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 연속적인 아미노산 서열이다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 연속적인 아미노산 서열이 아니다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 1개 이상의 불연속적인 아미노산 부위이다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자 중 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 연속적인 아미노산 서열이다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자 중 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 연속적인 아미노산 서열이 아니다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자 중 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 1개 이상의 불연속적인 아미노산 부위이다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 변형된 IL-2 분자와 IL2Rα의 친화도를 낮출 수 있다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 변형된 IL-2 분자와 IL2Rα의 친화도를 제거할 수 있다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 친화도는 바이오레이어 간섭(biolayer interferometry, BLI) 기술을 통해 측정한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 M(loop M) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 N(loop N) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 나선 B 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 M(loop M) 또는 이의 변이체, 나선 B 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 나선 B 또는 이의 변이체, 루프 N(loop N) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 M(loop M) 또는 이의 변이체, 루프 N(loop N) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 N 말단에서 C 말단까지 순차적으로 루프 M(loop M) 또는 이의 변이체, 나선 B 또는 이의 변이체, 루프 N(loop N) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 m(loop m) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 n(loop n) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 나선 b 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 m(loop m) 또는 이의 변이체, 나선 b 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 나선 b 또는 이의 변이체, 루프 n(loop n) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 m(loop m) 또는 이의 변이체, 루프 n(loop n) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 N 말단에서 C 말단까지 순차적으로 루프 m(loop m) 또는 이의 변이체, 나선 b 또는 이의 변이체, 루프 n(loop n) 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 m(loop m) 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 M(loop M) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 b 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 B 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 n(loop n) 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 N(loop N) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 m(loop m) 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 M(loop M) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 및 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 b 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 B 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 b 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 B 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 및 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 n(loop n) 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 N(loop N) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 m(loop m) 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 M(loop M) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 및 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 n(loop n) 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 N(loop N) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 m(loop m) 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 M(loop M) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 b 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 나선 B 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 및 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 n(loop n) 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 N(loop N) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 상기 변형된 IL-2 분자가 IL15Rα 또는 IL15Rα의 sushi 도메인과 결합할 수 있도록 한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 IL-15 분자 중의 루프 x(loop x) 또는 이의 변이체를 사용하여 IL-2 분자 중의 루프 X(loop X) 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 루프 x는 SEQ ID NO. 10으로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 X는 SEQ ID NO. 3으로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 IL-15 분자 중의 나선 c 또는 이의 변이체를 사용하여 IL-2 분자 중의 나선 C 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 나선 c는 SEQ ID NO. 11로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 C는 SEQ ID NO. 4로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 치환을 포함하지 않는 변형된 IL-2 분자에 비해, 상기 치환은 상기 변형된 IL-2 분자의 안정성을 향상시킬 수 있다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형은 IL-2 분자의 나선 D 영역에서 아미노산 치환을 수행하고, 치환된 아미노산은 상기 나선 b 중의 43번째 페닐알라닌(F)과 방향족 고리 상호 작용을 형성하여 소수성 내부 코어를 안정화할 수 있는 단계를 더 포함하고, 여기에서 아미노산의 위치는 천연 IL-15 분자 아미노산 서열을 기반으로 KABAT 일련번호의 EU 인덱스에 따라 결정되고, 상기 나선 D는 SEQ ID NO. 6으로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 천연 IL-15 분자 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 13으로 표시된다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 아미노산 치환은 W121F를 포함하고, 여기에서 아미노산의 위치는 천연 IL-2 분자 아미노산 서열을 기반으로 KABAT 일련번호의 EU 인덱스에 따라 결정된다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 천연 IL-2 분자 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 7로 표시된다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 변형된 IL-2 분자는 SEQ ID NO. 14로 표시되는 서열을 포함한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 출원은 단백질 이종이합체를 더 제공한다. 여기에는 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자, 및 IL15Rα 또는 이의 변이체가 포함된다. 또는 상기 단백질 이종이합체는 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자, 및 IL15Rα 수용체의 sushi 도메인 또는 이의 변이체가 포함된다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL15Rα는 SEQ ID NO. 16으로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 sushi 도메인은 SEQ ID NO. 15 또는 SEQ ID NO. 20으로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 단백질 이종이합체는 IL2Rα 수용체와 결합되지 않으며, IL-2 분자에 비해 IL2Rβ과의 친화도가 더 높다. 상기 IL-2 분자는 천연 IL-2 분자 및 이의 기능성 변이체를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 천연 IL-2 분자의 기능성 변이체는 상기 변형된 IL-2 분자를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 IL15Rα 변이체 또는 상기 sushi 도메인 변이체는 Fc 단편을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 Fc 단편은 상기 IL15Rα 또는 상기 sushi 도메인의 C 말단에 위치한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 Fc는 인간 IgG1Fc, 인간 IgG4Fc 및 마우스 IgG2aa.1Fc 중 어느 하나를 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 Fc는 SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 24 또는 SEQ ID NO. 25로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 단백질 이종이합체는 SEQ ID NO. 14로 표시되는 서열, 및 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 21 또는 SEQ ID NO. 22로 표시되는 서열을 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자 및 상기 단백질 이종이합체는 상기 변형되지 않은 IL-2 분자에 비해 Treg 세포의 증식 활성을 낮출 수 있다.
다른 일 양상에 있어서, 본 출원은 핵산 분자를 더 제공한다. 이는 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자를 인코딩한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 출원은 핵산 분자 조합을 더 제공한다. 이는 a) 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자, 및 본 출원에 따른 IL15Rα 또는 이의 변이체, 또는 상기 sushi 도메인 또는 이의 변이체를 인코딩한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 출원은 벡터를 더 제공한다. 여기에는 본 출원에 따른 핵산 분자, 또는 본 출원에 따른 핵산 분자 조합이 포함된다.
일부 실시방식에 있어서, 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자를 인코딩하는 핵산 분자와 본 출원에 따른 IL15Rα 또는 이의 변이체, 또는 상기 sushi 도메인 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 동일 벡터에 위치한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 벡터는 제1 벡터 및 제2 벡터를 포함한다. 상기 제1 벡터는 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 제2 벡터는 본 출원에 따른 IL15Rα 또는 이의 변이체, 또는 상기 sushi 도메인 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 출원은 세포를 더 제공한다. 여기에는 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자, 본 출원에 따른 단백질 이종이합체, 본 출원에 따른 핵산 분자, 본 출원에 따른 핵산 분자 조합 또는 본 출원에 따른 벡터를 포함한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 출원은 약학 조성물을 더 제공한다. 여기에는 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자, 본 출원에 따른 단백질 이종이합체, 본 출원에 따른 핵산 분자, 본 출원에 따른 핵산 분자 조합, 본 출원에 따른 벡터 또는 본 출원에 따른 세포를 포함한다.
다른 일 양상에 있어서, 본 출원은 약물 제조에서 본 출원에 따른 변형된 IL-2 분자, 본 출원에 따른 단백질 이종이합체, 본 출원에 따른 핵산 분자, 본 출원에 따른 핵산 분자 조합, 본 출원에 따른 벡터, 본 출원에 따른 세포의 용도를 더 제공한다. 여기에서 상기 약물은 종양을 예방 및/또는 치료하는 데 사용된다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 종양에는 항문암, 담도암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 위암, 결장암, 두경부 편평세포암, 간암, 고형종양, 흑색종, 메르켈세포암, 중피종, 비소세포폐암, 난소암, 신장세포암, 피부 편평세포암, 소세포 폐암, 흉선암, 갑상선암, 결장암 및/또는 흑색종이 포함된다.
임상적으로 저용량의 IL-2 조건에서는 Treg 세포 표면 상에 α 사슬이 있는 고친화도 수용체에 우선적으로 결합하므로 면역억제작용을 일으켜 치료효과를 얻지 못한다. 고용량의 IL-2는 대량의 이펙터 T 세포를 활성화하여 Treg 활성화로 인한 면역 억제를 중화할 수 있으며, 동시에 더 많은 독성 부작용과 세포 사멸(activation induced cell apoptosis)이 나타날 수 있다. 본 출원은 IL-2 중 그 수용체 α 사슬과 결합하는 폴리펩티드 서열을 IL-15 중 그 수용체 α 사슬과 결합하는 폴리펩티드 서열로 치환함으로써, α 수용체와의 결합을 감소 또는 제거한다. 따라서 IL-2가 촉진하는 T 세포 증식 활성 억제 기능을 감소시키는 동시에 내피 세포 α 수용체에 대한 결합도 감소시켜 IL-2 치료로 인한 독성 부작용을 감소 또는 제거할 수 있다. 상기 강점을 기반으로, 본 출원에서 제공하는 변형된 IL-2 분자는 광범위한 임상 응용 전망을 갖는다.
도 1은 본 출원 실시예 1 중 SEC-HPLC에서 IL-2/15 키메라 1과 sushi-Fc 단백질의 이종이합체 정제 생성물을 확인한 결과도이다. 도 1a는 복합체 1, 도 1b는 복합체 2, 도 1c는 복합체 3이다.
도 2는 본 출원 실시예 1 중 SEC-HPLC에서 IL-2/15 키메라 2와 sushi-hIgG4Fc 단백질의 이종이합체 정제 생성물을 확인한 결과도이다.
도 3은 본 출원 실시예 4 중 복합체 1 단백질의 CTLL-2(T 세포) 증식 작용에 대한 결과도이다.
도 4는 본 출원 실시예 6 중 사전 독성 실험 결과이다.
도 5는 본 출원 실시예 7 중 복합체의 대표 암종에서의 항종양 효과도이다.
도 6은 IL-2 및 IL-15의 4-나선 구조도이다. 여기에서 IL-2의 4개 α 나선을 각각 A\B\C\D 나선으로 명명하고, IL-15의 4개 α 나선을 각각 a\b\c\d 나선으로 명명한다.
도 7은 IL-15 및 IL-2와 각 수용체가 형성하는 복합체의 구조 적층 비교도이다. 여기에서 중간 IL-2 또는 IL-15 영역에서 회색은 IL-2, 검정색은 IL-15를 나타낸다.
본 출원에서 용어 "IL-2"는 통상적으로 천연 인터류킨-2 또는 이의 기능성 변이체를 나타낸다. 천연 인터류킨-2는 주로 T 세포(B 세포, NK 세포, 단핵구-대식세포도 생산 가능)에서 생산하는 사이토카인의 일종으로, T 림프구와 NK 세포의 정상적인 기능을 유지하는데 중요한 역할을 하는 구형 당단백질이다. 이는 1976년에 발견되었으며, 당시 T 세포 성장 인자(TCGF)로 불렸다. 인간에서 IL-2는 4번 염색체 상의 유전자에 의해 인코딩된다. IL-2는 133개 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드이며, 분자량이 약 15kD이고, 3개의 시스테인 잔기가 있는데 각각 58번째, 105번째, 125번째에 위치한다. 번역 후 변형은 3번째 위치의 Thr 글리코실화를 포함하고, 58번째와 105번째 위치의 시스테인 잔기는 이황화 결합을 형성하며, 기능에 필수적인 주로 4개의 α-나선 및 일부 연결 서열(loop)로 구성된 고차 구조(Bazan 등, Science 257, 410-413(1992))를 형성한다. 예를 들어, 본 출원에서(도 6에 도시된 바와 같음) IL-2 중 N 말단에서 C 말단까지의 4개 α 나선은 순차적으로 나선 A, 나선 B, 나선 C 및 나선 D로 명명된다. 나선 AB 사이의 연결 서열(loop, 루프)은 루프 M으로 명명되고, 나선 BC 사이의 연결 서열(loop, 루프)은 루프 X로 명명되고, CD 나선 사이의 연결 서열(loop, 루프)은 루프 N으로 명명된다. 예를 들어, 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 나선 C는 SEQ ID NO. 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 나선 D는 SEQ ID NO. 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 루프 X는 SEQ ID NO. 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
IL-2는 IL-2 수용체(IL-2R)를 결합하여 그 작용을 매개하며, 천연 IL-2 수용체(IL-2R)는 3개의 서브 유닛으로 구성되고 이는 각각 α(CD25), β(CD122) 및 γ(CD132) 수용체 서브 유닛이다(도 7에 도시된 바와 같음). 여기에서 α 수용체는 주로 T 억제 세포(Treg) 및 일부 내피 세포(endothelial cells) 표면에서 발현되는 반면, β와 γ 수용체 서브 유닛은 이펙터 T 세포(Teff) 및 NK 세포에서 고도로 발현된다. IL-2는 서로 다른 수용체 서브 유닛의 복합체 형태에 대한 친화도가 다르다. IL-2는 α, β 및 γ 수용체 서브 유닛으로 구성된 복합체에 대한 친화도가 가장 높고, β와 γ 수용체 서브 유닛으로 구성된 복합체에 대한 친화도는 중간 정도(약 100배 더 낮음)이며, IL-2와 두 가지 형태의 수용체 서브 유닛 조합과 결합한 후에는 모두 신호를 전달할 수 있다(Minami 등, Annu Rev Immunol 11, 245-268(1993)).
본 출원에서 용어 "IL-15"는 통상적으로 천연 인터류킨-15 또는 이의 기능성 변이체를 나타낸다. 인터류킨 15(IL-15)는 일종의 사이토카인으로, 활성화된 단핵구-대식세포, 표피 세포 또는 섬유아세포 등 다양한 세포에서 생성될 수 있다. 천연 인간 인터류킨 15 성숙 펩티드는 114개의 아미노산을 함유하며, 약 12-14kD이고, 4개 α 나선 및 일부 연결 서열(loop)로 구성된다. 또한 4개 시스테인 잔기를 포함한다. 여기에서 Cys35와 Cys85, Cys42와 Cys88이 연결되고, 형성된 2쌍 분자 내 이황화 결합은 IL-15의 공간적 형태와 생물학적 활성을 유지하는 데 중요한 역할을 할 수 있다(Lowe D.C., et al J. Mol. Biol. 406:160-175，2011). 예를 들어, 본 출원에서(도 6에 도시된 바와 같음) IL-15 중 N 말단에서 C 말단까지의 4개 α 나선은 순차적으로 나선 a, 나선 b, 나선 c 및 나선 d로 명명된다. 나선 ab 사이의 연결 서열(loop, 루프)은 루프 m으로 명명되고, 나선 bc 사이의 연결 서열(loop, 루프)은 루프 x로 명명되고, 나선 cd 사이의 연결 서열(loop, 루프)은 루프 n으로 명명된다. 예를 들어, 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 나선 c는 SEQ ID NO. 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 루프 m은 SEQ ID NO. 8으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 루프 x는 SEQ ID NO. 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
IL-15는 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포의 발달 및 증식 촉진 등과 같은 신체의 정상적인 면역 반응에서 역할을 수행할 수 있다. IL-15와 IL-2는 공동의 IL2/15R β 사슬과 γ 사슬 수용체를 보유하고, 상이한 α 사슬 수용체를 가지므로(도 7), IL-2가 Treg 세포와 세포자멸사(AICD)를 활성화하는 반면, 동일 패밀리의 IL-15는 Treg 활성화 및 AICD의 기능을 가지고 있지 않다(Waldmann TA et al, Nature Reviews Immunol 6:595-601, 2006). 또한 상이한 수용체 서브 유닛으로 구성되기 때문에, IL-15는 NK 세포 증식과 기억 T 세포 유지에 보다 현저한 역할을 수행한다. 따라서 본 출원에서 IL-2와 IL-15의 특성을 이용하고 IL-15의 부분 서열을 이용하여 IL-2의 부분 서열을 치환함으로써 IL-2Rα 수용체와의 결합을 차단하면서 IL2/15R β와 γ 수용체와의 결합을 유지한다.
본 출원에 있어서, 용어 "IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역"은 통상적으로 IL-15 분자(천연 IL-15 분자 또는 이의 기능성 변이체 포함) 중 IL-15 분자가 그 수용체 α 서브 유닛과 결합할 수 있도록 하는 서열 전장 또는 그 중 일부분을 의미한다. 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 IL-15 분자 폴리펩티드 서열 중 연속되는 아미노산 서열일 수 있으며, 그 중 불연속적인 아미노산 서열일 수도 있다. 예를 들어 여러 인접하지 않는 아미노산 부위의 결합이 있다.
본 출원에 있어서, 용어 "IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역"은 통상적으로 IL-2 분자(천연 IL-2 분자 또는 이의 기능성 변이체 포함) 중 IL-2 분자가 그 수용체 α 서브 유닛과 결합할 수 있도록 하는 서열 전장 또는 그 중 일부분을 의미한다. 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 IL-2 분자 폴리펩티드 서열 중 연속되는 아미노산 서열일 수 있으며, 그 중 불연속적인 아미노산 서열일 수도 있다. 예를 들어 여러 인접하지 않는 아미노산 부위의 결합이 있다.
본 출원에서 용어 "바이오레이어 간섭(biolayer interferometry, BLI) 기술"은 바이오층 간섭 기술이라고 부르기도 하며, 통상적으로 생체 분자 사이의 동역학 실험 및 정량적 검출 실험에 널리 사용되는 실험 기술을 말한다. 예를 들어, 생체 분자 간의 상호 작용을 실시간으로 감지하는 데 사용할 수 있으므로 단백질, 핵산 및 기타 생체 분자의 동역학 상수를 결정하는 데 널리 사용된다. 예를 들어 결합 속도 상수(Ka), 해리 속도 상수(Kd) 및 친화도 상수(KD)를 포함한 동역학 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 원리는 다음 내용을 포함할 수 있다. 생체분자 A가 바이오 센서 말단(예를 들어 광섬유 물질)에 결합하면 바이오레이어를 형성할 수 있는데, 센서 말단의 분자 A가 검출하고자 하는 분자 B와 결합하면 바이오 센서 말단의 분자량이 변경되어 바이오레이어 두께가 변경될 수 있다. 빛은 센서의 바이오레이어를 통과한 후 투과 및 반사되어 간섭광파를 형성하고, 바이오레이어 두께의 변화는 간섭광파의 상대변위를 유발한다. 생체 분자 결합 전후의 간섭광파를 분광기에서 검출하여 간섭 스펙트럼을 형성하여 간섭 스펙트럼의 실시간 변위(nm)로 표시하고, 마지막으로 분자 결합 전후의 스펙트럼 변화에 따라 검출하고자 하는 분자를 분석한다.
본 출원에서 "천연" 또는 "천연의"라는 용어는 일반적으로 자연계에 존재하는 물질(예를 들어 단백질, 핵산 등 화합물 분자)을 지칭하며, 인위적으로 구조를 변경하지 않고 분리 및 확인되었다. 예를 들어 "천연 IL-15 분자", "천연 IL-2 분자"이다.
본 출원에서 용어 "변이체"는 일반적으로 천연 폴리펩티드 서열 상에서 아미노산 변형(예를 들어 그룹 치환 등) 또는 하나 이상의 아미노산의 삽입, 치환 및/또는 결실(예를 들어 한 구간의 아미노산 서열이 결실된 절단체)을 수행하여 획득한 폴리펩티드 서열을 의미한다. 이는 원래의 천연 폴리펩티드 서열의 기능을 전체적으로 또는 부분적으로 유지할 수 있거나, 원래의 천연 폴리펩티드 서열의 기능을 유지하지 않을 수 있으며, 원래의 천연 폴리펩티드보다 개선된 기능(예를 들어, 상응하는 리간드 또는 수용체와의 친화도 증가)을 가질 수도 있다. 여기에서 원래의 천연 폴리펩티드 서열의 기능을 전체적으로 또는 부분적으로 유지하거나 원래의 천연 폴리펩티드 서열보다 개선된 기능을 갖는 변이체는 "기능성 변이체"라 칭할 수 있다. 예를 들어, 상기 기능성 변이체는 원래 서열보다 우수한 생물학적 활성(또는 기능)을 가질 수 있다. 예를 들어 상기 유지는 반드시 완전한 유지일 필요는 없다. 예를 들어, 상기 기능성 변이체는 원래의 서열 기능을 기본적으로 유지할 수 있다. 예를 들어, 원래 서열의 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 기능을 유지할 수 있다. 예를 들어, 원래 서열의 105%, 110%, 115%, 125%, 140%, 160%, 180%, 200%, 230%, 260%의 기능을 갖는다. 예를 들어, 상기 기능성 변이체의 아미노산 서열은 원래 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 동일성을 가질 수 있다.
본 출원에 있어서, 용어 "C 말단"은 통상적으로 폴리펩티드 사슬의 2개 말단 중 하나를 지칭하며, 이 말단의 아미노산 잔기는 유리된 α 카르복실기(-COOH)를 운반한다.
본 출원에 있어서, 용어 "N 말단"은 통상적으로 폴리펩티드 사슬의 2개 말단 중 하나를 지칭하며, 이 말단의 아미노산 잔기는 유리된 α 아미노기(-NH2)를 운반한다.
본 출원에서 용어 "N 말단에서 C 말단까지 순차적으로 포함"은 통상적으로 포함된 각 서열 단편 또는 요소 위치 순서 관계를 지칭한다. 여기에서 각 서열 단편 또는 요소는 반드시 직접 연결될 것일 필요는 없다.
본 출원에서 용어 "약학 조성물"은 통상적으로 환자, 예를 들어 사람 환자에 적합하도록 투여하는 조성물에 관한 것을 지칭한다. 예를 들어 본 출원에 따른 약학 조성물은 본 출원에 따른 핵산 분자, 본 출원에 따른 벡터 및/또는 본 출원에 따른 세포, 및 어느 약학적으로 허용 가능한 보조제를 포함할 수 있다. 또한 상기 약학 조성물은 하나 이상의(약학적으로 유효한) 담체, 안정화제, 부형제, 희석제, 가용화제, 계면 활성제, 유화제 및/또는 방부제의 적합한 제제를 더 포함할 수 있다. 조성물의 허용 가능한 성분은 사용하는 용량과 농도 하에서 수용자에게 독성이 없다. 본 발명의 약학 조성물은 액체, 냉동 및 동결건조 조성물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 출원에서 용어 "벡터"는 통상적으로 특정 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 내부에 삽입하고 단백질이 발현될 수 있도록 하는 일종의 핵산 운반 도구이다. 벡터는 유전 물질 요소가 숙주 세포 내에서 발현되도록 숙주 세포를 형질전환, 형질도입 또는 형질감염시킴으로써 발현될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체, λ파지 또는 M13 파지와 같은 박테리오파지 및 바이러스 벡터를 포함한다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하여 발현을 제어하는 다양한 요소를 포함할 수 있다. 또한 벡터는 복제 기점을 포함할 수도 있다. 벡터는 바이러스 입자, 리포솜 또는 단백질 코트와 같이 세포로의 진입을 돕는 성분을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "예방"은 통상적으로 본원에 기재된 질병 및 병증의 발생을 예방하기 위해 건강한 환자에게 조합물을 예방적으로 투여하는 것을 지칭한다. 또한, 용어 "예방"은 치료할 알레르기 질환의 전 단계에 있는 환자에게 이 조합물을 예방적으로 투여하는 것을 의미한다. 용어 "예방"은 사건의 가능성을 100% 제거할 필요는 없다. 보다 정확하게는, 상기 약학 조성물 또는 방법의 존재 하에 사건이 발생할 가능성이 감소됨을 의미한다.
본 출원에서 용어 "치료"는 통상적으로 환자에게 치료제를 적용 또는 투여하거나, 환자로부터 분리된 조직 또는 세포주에 치료제를 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다. 해당 환자는 질병이 있고, 질병 증상 또는 질병 경향이 있으며, 이의 목적은 해당 질병, 질병 증상 또는 질병 경향을 치료, 치유, 경감, 완화, 변경, 구조, 개선, 향상하거나 영향을 미치는 것이다. 질병 상태 개선, 병변 제거 또는 예후 개선이 포함될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "종양" 및 "암"은 통상적으로 정상적인 성장 및/또는 발육 동안 증식 조절의 적어도 부분적 손실을 나타내는 세포를 지칭한다. 예를 들어, 일반적인 종양 또는 암세포는 통상적으로 접촉 억제를 상실하고 침습적이거나 전이 능력이 있을 수 있다.
본 출원의 특정 실시방식에 있어서, 생물정보학 및 단백질 공학 기술을 사용하여 IL-2 분자 중 주로 IL-2Rα와의 결합을 담당하는 아미노산을 IL-15의 상응하는 서열로 치환한다. 즉, IL-2 분자 중 나선 A와 나선 B 사이의 루프 M(SEQ ID NO. 1), 나선 B(SEQ ID NO. 2) 및 나선 C와 나선 D 사이의 루프 N(SEQ ID NO. 5)을 IL-15의 상응하는 서열(즉, 루프 m(SEQ ID NO. 8), 나선 b(SEQ ID NO. 9), 루프 n(SEQ ID NO. 12))으로 치환하여 IL-2와 IL2Rα의 결합을 차단한다. IL-2/15 키메라(변형된 IL-2 분자) 구조의 안정성을 더욱 향상시키기 위해, IL-2의 나선 B와 나선 C 사이의 루프 X(SEQ ID NO. 3), 나선 C(SEQ ID NO. 4)를 마찬가지로 IL-15의 루프 x(SEQ ID NO. 10), 나선 c(SEQ ID NO. 11)로 치환한다. 또한 나선 D 중의 115번째 트립토판(W)을 페닐알라닌(F)으로 돌연변이시킨다. 이는 도입된 IL-15 나선 b 중의 55번째 페닐알라닌(F)와 방향족 고리 상호 작용을 형성하는 동시에 소수성 내부 코어를 안정화시키고, 계속해서 4-나선 다발 구조를 안정화시키며, 최종적으로 새로 형성된 단백질 분자 IL-2/15 키메라가 IL2Rα 수용체와 결합하지 않고 β 사슬 및 γ 사슬 수용체에 대한 결합을 유지시키는 것이다.
임상적으로 저용량의 IL-2 조건에서는 Treg 세포 표면 상에 α 사슬이 있는 고친화도 수용체에 우선적으로 결합하므로 면역억제작용을 일으켜 치료효과를 얻지 못한다. 고용량의 IL-2는 대량의 이펙터 T 세포를 활성화하여 Treg 활성화로 인한 면역 억제를 중화할 수 있으며, 동시에 더 많은 독성 부작용과 세포 사멸(activation induced cell apoptosis)이 나타날 수 있다. 따라서 본 출원에서 채택된 기술적 해결책은 α 수용체에 대한 결합을 약화시키거나 제거함으로써, IL-2가 T 세포 증식을 촉진시키는 활성을 억제하는 기능을 감소시키는 동시에 내피 세포 α 수용체에 대한 결합도 감소시킬 수 있다. 따라서 IL-2 치료로 인한 독성 부작용을 줄이거나 제거하지만 IL-15는 Treg 활성화 및 AICD의 기능을 갖지 않는다(Waldmann TA et al, Nature Reviews Immunol 6:595-601, 2006). 또한 상이한 수용체 서브 유닛으로 구성되기 때문에, IL-15는 NK 세포 증식과 기억 T 세포 유지에 더 명백한 영향을 미친다. 따라서 본 발명은 IL-2 및 IL-15의 특성을 이용하여 IL2/15R β와 γ 수용체에 대한 결합은 유지하면서 IL2Rα 수용체에 대한 결합을 차단한다.
일부 실시방식에 있어서, IL-2에 도입된 IL-15 단백질 서열은 IL15Rα와 결합할 수 있으므로 IL15Rα 수용체(sushi 도메인)를 IL-2/15 키메라와 공동 발현하여 이종이합체 복합체를 형성할 수 있으며, IL-2/15 키메라를 안정화시키는 동시에 IL2/15Rβ 수용체와의 친화도를 향상시켜 더욱 우수한 생물학적 효능을 구현할 수 있다. 또한 sushi 도메인(예를 들어 SEQ ID NO. 15 또는 SEQ ID NO. 20)의 C 말단에 Fc를 융합 발현할 수 있으며, 이는 인간 IgG1 Fc, 인간 IgG4 Fc 또는 마우스 IgG2aa.1 Fc일 수 있고, 장기적인 효과를 달성할 수 있다.
본 발명은 실시예를 참조하여 하기에 추가로 설명될 것이며, 이들 실시예는 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 보호 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다.
하기 실시예에서 구체적인 조건이 언급되지 않은 실험 방법은 통상적으로 일반적인 조건을 따른다. 예를 들어 Sambrook 등 분자 클론: 실험실 매뉴얼(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기술된 조건, 또는 제조업체의 지침에 따른 조건이 있다. 사용된 시약은 달리 명시되지 않는 한 시판되거나 공개적으로 획득 가능한 시약이다.
실시예 1 포유동물 세포로부터 IL-2/15 키메라의 제조
1.1 발현 플라스미드의 합성과 구축
쑤저우 GENEWIZ에 위탁하여 각각 IL-2/15 키메라 1(SEQ ID NO. 14), sushi-hIgG1Fc(SEQ ID NO. 19), sushi-hIgG4Fc(SEQ ID NO. 21), sushi- mIgG2aa.1Fc(SEQ ID NO. 22) 4개 단백질의 표적 유전자 단편을 합성하여 pZD 벡터의 EcoRI와 HindIII 부위 사이에 클로닝함으로써 4개의 발현 플라스미드를 수득한다. 일련번호는 각각 PM619, PM432, PM657, PM599이다. 플라스미드 PM619를 기반으로 <분자 클로닝>에 설명된 방법에 따라 점 돌연변이를 수행하고, 115번째 위치(천연 IL-2 분자 아미노산 서열의 121번째 위치에 해당) 페닐알라닌(F)을 트립토판(W)으로 돌연변이시켜, IL-2/15 키메라 2(SEQ ID NO. 23)의 플라스미드를 수득하였으며, 플라스미드 일련번호는 PM824이다. 그 후 합성 또는 구축된 플라스미드를 각각 DH10B로 형질전환하여 서열을 분석하고 보존하였다.
1.2 플라스미드 추출 및 HEK293 세포 준비
1.2.1 플라스미드 추출
<Qiagen Mini-prep Kit> 및 <Qiagen Endofree Maxi-prep Kit>에 언급된 조작 방법에 따라 상기 2가지 IL-2/15 키메라와 3가지 sushi-Fc의 플라스미드를 제조하였다.
1.2.2 HEK293 세포 준비
신선하게 계대된 밀도가 1-1.2 x 106/ml인 HEK293 세포(National Research Council, Canada)를 일과성 발현에 사용한다.
1.3 HEK293 일과성 발현
1.3.1 시약 제조
A) G418 용액: GeneticinTM 250mg을 칭량하고 초순수 4.5ml를 넣어 용해시키며 초순수로 5ml까지 용량을 만들고 0.22μm 여과막으로 여과하여 -20℃에서 보관한다.
B) PEI 용액: 50mg의 PEI를 칭량하고 45ml의 초순수를 첨가하며, 1M NaOH로 pH를 7.0으로 조정하고, 초순수로 50ml까지 용량을 만들어 0.22μm 여과막으로 여과하고, -20℃에서 보관한다.
C) 배지: 1L FreeStyleTM 293 발현 배지에 10ml, 10%의 PluronicdTM F-68 및 500 μl G418을 첨가한다.
D) 플라스미드는 2ml 내독소가 없는 원심분리 튜브에서 미리 준비한다.
E) 형질감염에 필요한 부피에 따라 1-1.2 x 106cells/ml으로 신선하게 계대된 세포 현탁액을 준비한다.
1.3.2 형질감염 시약-플라스미드 복합물 제조
A액: 플라스미드 1μg/ml + Opti-MEMTM 33.3μl/ml
B액: PEI 2μg/ml + Opti-MEMTM 33.3μl/ml
1mL의 B액을 1mL의 A액에 붓고 잘 섞어 10분 동안 배양한 다음 세포 현탁액을 첨가한다.
IL-2/15 키메라 1과 3가지 sushi-Fc를 각각 1:1의 질량비(총량 1μg/mL)로 혼합하여 형질감염시켰다. IL-2/15 키메라 2와 sushi-hIgG4Fc를 1:1의 질량비(총량 1μg/mL)로 혼합한 후 형질감염시켰다.
1.3.3 환액
115rpm, 36.8℃, 5% CO2에서 4시간 동안 배양한 후, 800g에서 5분 동안 원심분리하고 PluronicdTM F-68 및 G418을 첨가하지 않은 FreeStyleTM 293 발현 배지로 변경한다.
1.3.4 발현 배양 및 수확
115rpm, 36.8℃, 5% CO2에서 5일 동안 배양한 후, 세포를 8500rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 세포 상청액을 수집하여 정제하였다.
1.4 정제 제조
IL-2/15 키메라 1은 각각 sushi-hlgG1Fc, sushi-hIgG4Fc 및 sushi-mlgg2aa.1Fc와 공동 발현하였으며, 발현 과정에서 이종이합체 복합체를 형성할 수 있었다. 이를 각각 복합체 1, 복합체 2, 복합체 3으로 명명하였으며, 3가지 복합체는 모두 Fc 태그를 가지고 있다. Mabselectsure(Protein A, GE Healthcare)를 이용하여 친화성 정제를 수행하며, 정제 방법은 정제 충전재 설명서에 따른다. 그 후 겔여과 크로마토그래피(Superdex200 pg, GE Healthcare)로 추가 정제하여 순도가 비교적 높은 단백질을 수득하고 응집체를 제거한다. 고성능 액체 크로마토그래피 분자체 컬럼(SEC-HPLC)을 이용하여 순도 분석을 수행하였으며, 그 결과는 도 1(a~c)에 도시된 바와 같다. 정제 후 단백질 SEC 주요 피크는 단일 피크이며, 이는 IL-2/15 키메라 1과 3가지 sushi-Fc가 각각 모두 복합체를 형성하였고 순도가 비교적 우수함을 설명한다. 고분자 및 단편의 총량은 5% 미만이며 액체 질량 분석에서 알 수 있듯이, 정제된 단백질에는 2가지 성분이 함유되며, 이는 각각 sushi-Fc 및 IL-2/15이다. 이는 단백질 발현 및 정제가 성공적임을 의미한다. IL-2/15 키메라 2도 sushi-hIgG4Fc와 공동 발현되어 복합체를 형성하고 정제되었다(도 2에 도시된 바와 같음).
실시예 2 대장균으로부터 IL-2/15 키메라 제조
2.1 발현 플라스미드의 합성과 구축
쑤저우 GENEWIZ에 위탁하여 IL-2/15 키메라 1 유전자 단편(SEQ ID NO. 26)을 합성하고 pET41a 벡터의 NdeI와 XhoI 부위 사이에 클로닝하여 일련번호가 1187인 발현용 플라스미드를 수득하였다.
2.2 대장균에서 IL-2/15 키메라의 발현 및 정제
<분자 클로닝>에 언급된 조작 방법에 따라 플라스미드를 추출하고 발현 균주 BL21(DE3)을 형질전환시켰다. 단백질 원핵생물 발현의 일반적인 방법에 따라 IL-2/15 키메라 1의 발현을 수행하였다. 그 후, 고전적인 변성 및 재생 기술과 크로마토그래피 기술(예를 들어, Yunier Rodr
Figure pct00001
guez-
Figure pct00002
lvarez et al, Preparative Biochemistry and Biotechnology, 47:9, 889-900)에 의한 정제를 통해 더 순수한 키메라 단백질을 수득하였다.
실시예 3 IL-2/15 키메라와 IL2Rα 및 IL2/15Rβ의 결합력 측정
BLI(biolayer interferometry)를 채택하여 표적 단백질과 수용체 사이의 친화력을 측정하며, 방법은 (Estep,P 등, High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning.MAbs, 2013.5(2): p.270-8)를 참조하여 수행할 수 있다. 실험에 사용된 수용체 단백질 IL-15Rα-his, IL2Rα-his 및 IL2/15Rβ-Fc/Fc는 모두 당사에서 생산한 것으로 IL2Rα 무결합 IL-2 유도체와 IL2Rα 무결합 IL-2 복합체는 모두 특허문헌 CN111018961A에 설명된 대로 제조하였다. IL-15(N72D)/sushi-hIgG1Fc 복합체는 문헌(K.-p. Han et al. / Cytokine 56 (2011) 804-810)에 따라 제조를 완료하였다. 완충액 배합은 10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.1% BSA 및 0.05% tween20이다. 수용체 단백질은 모두 미리 각각 상응하는 센서 상에 고정한 후, 구축 방법(Estep, P 외，High throughput solution Based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5(2): p.270-8 참조)에 따라 기준선(baseline), 로딩(loading), 기준선(baseline), 연합(Association) 및 해리(Dissociation)의 단계를 수행한다. 데이터 획득 및 분석 작업은 각각 Fortebio Octet RED96 소프트웨어 Data acquisition 11.0와 Data analysis 11.0을 채택한다. 결과는 표 1과 같다(수치가 작을수록 친화도가 강함). IL-2에 비해, IL-2/15 키메라 1, IL-2/15 키메라 1-sushi-Fc(복합체 1, 복합체 2 또는 복합체 3)는 IL2Rα 수용체와 결합하지 않았다. IL-15에 비해, IL-2/15 키메라 1은 IL-15Rα 수용체와의 친화도가 10배 미만으로 감소한 반면 복합체 1, 복합체 2 또는 복합체 3은 IL-15Rα와 결합하지 않았다. IL2/15Rβ와의 친화도 비교의 경우, IL-2/15 키메라 1은 IL-15보다 현저하게 약하고, IL-2보다 약간 약한 반면, 복합체 1, 복합체 2 또는 복합체 3의 친화도는 IL-2 또는 IL-15보다 더 강하였으나 IL-15(N72D)/sushi-hlgG1Fc 복합체보다 약하였다.
Figure pct00003
실시예 4 T 세포의 증식 촉진 실험
CTLL-2(T 세포)의 증식 실험은 세포 수준에서 인터류킨 자극 면역 세포의 활성을 측정하기 위해 일반적으로 사용되는 실험이다. 본 실시예에서는 CTLL-2 세포의 증식 실험을 통해 실시예 1에서 제조한 IL-2/15 키메라 1의 생물학적 활성을 검출하였다. FBS와 Rat-T-Stim이 포함된 배양액에 CTLL-2 세포(ATCC에서 구매, 제품 번호 No. ATCC® TIB-214™)를 재현탁하고, 21000개/웰로 정량된 CTLL-2 세포를 96웰 배양 플레이트에 접종하는 동시에, 양성 대조군(IL-2)과 측정할 복합체 1 단백질을 각각 배로 희석하여 웰 플레이트에 첨가한다. 시작 작업 농도는 0.0078125nM이었고 각 희석 농도에 대해 모두 3개의 이중 웰을 설정한다. 배양액 대조군 웰(100 μl 세포 + 100 μl 배양액)를 별도로 설정한다. 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양한 다음 CellTiter96® AQueous One Solution Reagent(Promega에서 구입, 제품 번호 Cat# G3581) 20μl를 각 웰에 추가하고 37℃, 5% CO2에서 2 내지 4시간 동안 배양한다. 마이크로플레이트 리더로 490nm 파장에서 흡광도 값(A)을 측정하고 EC50 값을 계산한다. 결과는 표 2 및 도 3에 도시된 바와 같다. 복합체 1 단백질은 CTLL-2(T 세포)의 증식을 촉진하는 현저한 활성을 가지며, 활성은 양성 대조군 IL-2보다 높다.
Figure pct00004
실시예 5 Mo7e 세포의 증식 촉진 실험
Mo7e 세포주(IL-2/15R β와 γ 수용체 발현)를 37℃, 5% CO2 조건 하에서 완전 배지(RPMI1640+10%FBS+GM-CSF(10ng/mL))에서 배양한다. 대수 성장기의 세포를 수집한다. 세포를 PBS로 2회 세척하여 사이토카인을 제거한 다음, 사이토카인이 없는 배지에 세포를 재현탁시킨다. 세포 밀도는 사이토카인이 없는 배지로 조정한 다음 총 5000개 세포에 대해 웰당 90μL로 96웰 세포 배양 플레이트에 접종한다. 96웰 플레이트의 세포를 사용할 때까지 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양한다. 10배 약물 용액을 제조하여, 마지막 작업 농도를 0.020116μM, 9개 농도, 3.16배 희석이 되도록 한다. 그 후 연속 희석된 샘플 10 μL을 96웰 셀 플레이트의 해당 실험 웰에 옮기고 각 약물 농도에 대해 3개의 이중 웰을 설치한다. 약물을 이미 첨가한 96웰 플레이트를 37℃, 5% CO2 조건 하에서 72시간 동안 계속 배양한 후 CTG(Celltiter Glo assay kit, Promega)로 분석한다. 동일한 부피의 CTG 용액을 각 웰에 첨가한다. 냉광 신호를 안정화시키기 위해 세포 플레이트를 실온에서 20분 동안 방치한다. 냉광 값을 판독하고 데이터를 수집한다. GraphPad Prism 7.0 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고, 비선형 S곡선 회귀를 사용하여 데이터를 맞춰 용량-반응 곡선을 획득하고, 이를 기반으로 EC50 값을 계산한다.
세포 생존율(%) = (Lum 시험 약물-Lum 배지 대조군)/(Lum 용매 대조군-Lum 배지 대조군)×100%.
본 실험에서 hIgG1과 hIgG4는 대조군으로 사용되었으며 모두 세포 증식을 촉진할 수 없다. 결과에서 알 수 있듯이, 단독 IL-2/15 키메라 1의 활성은 IL-15와 IL-2 사이에 있으며, IL-15의 활성보다 약 10배 낮다. 그러나 IL-2/15 키메라 1과 sushi의 복합체 활성은 IL-15(N72D)/sushi-hIgG1 Fc 복합체보다 약하다. 앞서 임상에서 IL-2/15R βγ 수용체 작용제의 너무 높은 활성으로 인한 약물 독성으로 인해 IL-2/15 키메라 1과 sushi의 복합체의 안전성이 더욱 우수할 수 있다.
Figure pct00005
실시예 6 사이노몰구스 원숭이의 사전 독성 시험
실험은 2개 군으로 나눈다. 각각 복합체 2군과 IL-15(N72D)/sushi-hIgG1Fc 복합체군이다. 각 군은 무작위로 수컷 1마리와 암컷 1마리로 나누며 1mg/kg 용량을 주 1회, 총 2회 정맥주사한다. 매일 동물의 임상 양상을 관찰하였으며, 체중을 측정하고 약물 내성 여부를 분석하였다.
실험에 따르면, 복합체 2군 암컷은 D2-D4일에 소량의 황색 묽은 변을 보였으나, 수컷 및 암컷 모두의 체중은 14일 동안 비교적 안정적이었으므로(도 4에 도시된 바와 같음), 1mg/kg의 용량이 허용되는 것으로 나타났다. IL-15(N72D)/sushi-hlgG1Fc 복합체군의 수컷 및 암컷 동물은 D3-D4일에 무기력, 자발적 활동 감소, 황색의 소량/중간량 묽은 변, 안와 함몰이 나타났고 D4에 사망하였다. 따라서 1mg/kg의 용량이 허용되지 않는 것으로 나타났다.
실시예 7: 마우스 피부 흑색종 B16F10 피하 이식된 C57BL/6 마우스 종양 모델에서 IL-2/15 키메라 복합체의 약력학적 평가
B16F10 세포 현탁액 5.0×106cells/mL를 균일하게 피펫팅하고, 얼음 위에 둔다. 마우스의 오른쪽 뒷다리 체모를 제거하고 아이오도포르(iodophor) 면봉으로 소독하고, 0.1mL의 세포 현탁액을 마우스의 오른쪽 뒷다리에 1mL 주사기로 5 x 105cells/point로 피하 접종하였다. 종양 세포를 접종한 날 동물을 체중에 따라 무작위로 3개의 군으로 나누었고 각 군에 5마리의 동물을 넣었다. 그룹화한 날을 실험 Day0으로 간주하고 그룹화 후 두 번째 날(Day1)에 투여를 시작한다. 투여 및 그룹화 정보는 아래 표 4와 같다.
Figure pct00006
종양 접종 후, 동물의 종양 성장 상황, 활동 능력, 식이, 체중, 눈, 모발 및 기타 비정상적인 행동을 일상적으로 확인하고 그에 따라 인도적 종말점을 제공한다. 그룹화 투여 후, 동물 종양 부피를 주 2회 측정하였다. 종양의 부피는 양방향 측정법으로 측정하였으며, 먼저 아들자 캘리퍼스로 종양의 장경과 단경을 측정한 후 T = 0.5 × a × b2의 공식을 이용하여 종양의 부피를 계산하였다. a 및 b는 각각 종양의 장경 및 단경을 나타낸다.
상대적 종양 억제율은 TGI(%): TGI=1-T/C(%)이다. T/C %는 상대적 종양 증식률, 즉 특정 시점에 치료군과 대조군의 상대적 종양 부피 또는 종양 중량의 백분율 값이다. T 및 C는 각각 특정 시점에서 치료군 및 대조군의 상대 종양 부피(RTV)이다. 계산 공식은 다음과 같다. T/C % = TRTV / CRTV × 100% (TRTV: 치료군의 평균 RTV; CRTV: 용매 대조군 평균 RTV; RTV=Vt-V0, V0은 그룹화 시 해당 동물의 종양 체적, Vt는 치료 후 해당 동물의 종양 체적).
결과는 도 5에 도시된 바와 같다. 본 실험에서는 마우스 흑색종 B16F10 세포를 피하 접종한 C57BL/6 암컷 마우스 모델에서 시험약 단독 투여 효능을 검증하였다. 여기에서 G1 대조군 동물은 Day13까지, 동물 평균 종양 체적이 2942±545.3mm3였다. G2 복합체 2 2mg/kg BIW를 Day13까지 투여하며 해당 군은 TGI%=95%로 대조군과 매우 유의한 차이를 보였다(p<0.01). G3 복합체 3 2mg/kg BIW를 Day13까지 투여하며 해당 군은 TGI%=92%이고, 대조군과 매우 유의한 차이를 보였다(p<0.01). 데이터에 따르면, 마우스 흑색종 종양 세포 B16F10을 접종한 C57BL/6 마우스 모델의 약 13일 실험에서, 복합체 2 또는 복합체 3의 시험 약물이 강한 약효를 나타냈으며 대조군에 비해 통계학적 차이를 나타냈다(p<0.01). 그러나 복합체 2와 복합체 3는 차이가 없었으며, 모두 현저한 종양 억제 효과를 나타냈다.
SEQUENCE LISTING 序列表 >110> 北京志道生物科技有限公司 >120> ?修?的IL-2分子及其用途 >130> CN010-21005PICN >160> 26 >170> PatentIn version 3.5 >210> 1 >211> 24 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-2?M?基酸序列 >400> 1 Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe 1 5 10 15 Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 20 >210> 2 >211> 20 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-2螺旋B?基酸序列 >400> 2 Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu 1 5 10 15 Val Leu Asn Leu 20 >210> 3 >211> 9 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-2?X?基酸序列 >400> 3 Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg 1 5 >210> 4 >211> 16 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-2螺旋C?基酸序列 >400> 4 Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys 1 5 10 15 >210> 5 >211> 16 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-2?N?基酸序列 >400> 5 Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr 1 5 10 15 >210> 6 >211> 20 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-2螺旋D?基酸序列 >400> 6 Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile 1 5 10 15 Ser Thr Leu Thr 20 >210> 7 >211> 133 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-2?基酸序列 >400> 7 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 >210> 8 >211> 19 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-15?m?基酸序列 >400> 8 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 1 5 10 15 Pro Ser Cys >210> 9 >211> 18 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-15螺旋b?基酸序列 >400> 9 Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser 1 5 10 15 Leu Glu >210> 10 >211> 5 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-15?x?基酸序列 >400> 10 Ser Gly Asp Ala Ser 1 5 >210> 11 >211> 16 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-15螺旋c?基酸序列 >400> 11 Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu 1 5 10 15 >210> 12 >211> 21 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-15?n?基酸序列 >400> 12 Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu 1 5 10 15 Leu Glu Glu Lys Asn 20 >210> 13 >211> 114 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL-15?基酸序列 >400> 13 Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile 1 5 10 15 Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His 20 25 30 Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln 35 40 45 Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu 50 55 60 Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Ala Asn Val 65 70 75 80 Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile 85 90 95 Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn 100 105 110 Thr Ser >210> 14 >211> 127 >212> PRT >213> Artificial Sequence（人工序列） >220> >223> IL-2/IL-15嵌合?1?基酸序列 >400> 14 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Gln Ser Met His 20 25 30 Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys 35 40 45 Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu 50 55 60 Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile 65 70 75 80 Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly 85 90 95 Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Val Glu Phe Leu 100 105 110 Asn Arg Phe Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 115 120 125 >210> 15 >211> 65 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL15Rα sushi??域?基酸序列1 >400> 15 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg 65 >210> 16 >211> 175 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL15Rα?基酸序列 >400> 16 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser Thr Val 65 70 75 80 Thr Thr Ala Gly Val Thr Pro Gln Pro Glu Ser Leu Ser Pro Ser Gly 85 90 95 Lys Glu Pro Ala Ala Ser Ser Pro Ser Ser Asn Asn Thr Ala Ala Thr 100 105 110 Thr Ala Ala Ile Val Pro Gly Ser Gln Leu Met Pro Ser Lys Ser Pro 115 120 125 Ser Thr Gly Thr Thr Glu Ile Ser Ser His Glu Ser Ser His Gly Thr 130 135 140 Pro Ser Gln Thr Thr Ala Lys Asn Trp Glu Leu Thr Ala Ser Ala Ser 145 150 155 160 His Gln Pro Pro Gly Val Tyr Pro Gln Gly His Ser Asp Thr Thr 165 170 175 >210> 17 >211> 219 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL2Rα?基酸序列 >400> 17 Glu Leu Cys Asp Asp Asp Pro Pro Glu Ile Pro His Ala Thr Phe Lys 1 5 10 15 Ala Met Ala Tyr Lys Glu Gly Thr Met Leu Asn Cys Glu Cys Lys Arg 20 25 30 Gly Phe Arg Arg Ile Lys Ser Gly Ser Leu Tyr Met Leu Cys Thr Gly 35 40 45 Asn Ser Ser His Ser Ser Trp Asp Asn Gln Cys Gln Cys Thr Ser Ser 50 55 60 Ala Thr Arg Asn Thr Thr Lys Gln Val Thr Pro Gln Pro Glu Glu Gln 65 70 75 80 Lys Glu Arg Lys Thr Thr Glu Met Gln Ser Pro Met Gln Pro Val Asp 85 90 95 Gln Ala Ser Leu Pro Gly His Cys Arg Glu Pro Pro Pro Trp Glu Asn 100 105 110 Glu Ala Thr Glu Arg Ile Tyr His Phe Val Val Gly Gln Met Val Tyr 115 120 125 Tyr Gln Cys Val Gln Gly Tyr Arg Ala Leu His Arg Gly Pro Ala Glu 130 135 140 Ser Val Cys Lys Met Thr His Gly Lys Thr Arg Trp Thr Gln Pro Gln 145 150 155 160 Leu Ile Cys Thr Gly Glu Met Glu Thr Ser Gln Phe Pro Gly Glu Glu 165 170 175 Lys Pro Gln Ala Ser Pro Glu Gly Arg Pro Glu Ser Glu Thr Ser Cys 180 185 190 Leu Val Thr Thr Thr Asp Phe Gln Ile Gln Thr Glu Met Ala Ala Thr 195 200 205 Met Glu Thr Ser Ile Phe Thr Thr Glu Tyr Gln 210 215 >210> 18 >211> 232 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> hIgG1Fc?基酸序列 >400> 18 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 >210> 19 >211> 297 >212> PRT >213> Artificial Sequence（人工序列） >220> >223> sushi-hIgG1Fc?基酸序列 >400> 19 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 65 70 75 80 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 85 90 95 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 100 105 110 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 115 120 125 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 130 135 140 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 145 150 155 160 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 165 170 175 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 180 185 190 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 195 200 205 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 210 215 220 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 225 230 235 240 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 245 250 255 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 260 265 270 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 275 280 285 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 290 295 >210> 20 >211> 78 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> IL15Rα sushi??域?基酸序列2 >400> 20 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Arg Pro Ala Pro Pro Ser 65 70 75 >210> 21 >211> 293 >212> PRT >213> Artificial Sequence（人工序列） >220> >223> sushi-hIgG4Fc?基酸序列 >400> 21 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 65 70 75 80 Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 85 90 95 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 100 105 110 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 115 120 125 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 130 135 140 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 145 150 155 160 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 165 170 175 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 180 185 190 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 195 200 205 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 210 215 220 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 225 230 235 240 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 245 250 255 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 260 265 270 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 275 280 285 Ser Leu Ser Leu Gly 290 >210> 22 >211> 298 >212> PRT >213> Artificial Sequence（人工序列） >220> >223> sushi-mIgG2aa.1Fc?基酸序列 >400> 22 Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val 1 5 10 15 Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly 20 25 30 Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn 35 40 45 Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile 50 55 60 Arg Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys 65 70 75 80 Pro Ala Pro Asn Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 85 90 95 Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys 100 105 110 Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp 115 120 125 Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg 130 135 140 Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln 145 150 155 160 His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn 165 170 175 Lys Gln Leu Pro Ser Ser Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly 180 185 190 Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu 195 200 205 Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met 210 215 220 Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu 225 230 235 240 Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe 245 250 255 Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn 260 265 270 Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr 275 280 285 Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 290 295 >210> 23 >211> 127 >212> PRT >213> Artificial Sequence（人工序列） >220> >223> IL-2/15嵌合?2?基酸序列 >400> 23 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Gln Ser Met His 20 25 30 Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys 35 40 45 Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu 50 55 60 Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile 65 70 75 80 Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly 85 90 95 Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Val Glu Phe Leu 100 105 110 Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr 115 120 125 >210> 24 >211> 228 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> hIgG4Fc?基酸序列 >400> 24 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly 225 >210> 25 >211> 233 >212> PRT >213> Homo sapiens（人?） >220> >223> mIgG2aa.1Fc?基酸序列 >400> 25 Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro 1 5 10 15 Ala Pro Asn Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe 50 55 60 Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu 65 70 75 80 Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His 85 90 95 Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys 100 105 110 Gln Leu Pro Ser Ser Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser 115 120 125 Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met 130 135 140 Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro 145 150 155 160 Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn 165 170 175 Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser 195 200 205 Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Thr 210 215 220 Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 225 230 >210> 26 >211> 381 >212> DNA >213> Artificial Sequence（人工序列） >220> >223> 合成IL-2/15嵌合?1基因序列 >400> 26 gcgccgacga gcagtagcac caaaaaaacg cagctgcagc tggaacatct gttactggat 60 ctgcagatga ttctgaacgg cattcagagc atgcatattg atgcgaccct gtataccgaa 120 agcgatgtgc atccgagctg caaagtgacc gcgatgaaat gctttctgct ggaactgcaa 180 gtgattagcc tggaaagcgg cgatgcgagc attcatgata ccgtggaaaa cctgattatt 240 ctggcgaaca acagcctgag cagcaacggc aacgtgaccg aaagcggctg caaagaatgc 300 gaagaactgg aagaaaaaaa cattgtggaa tttctgaacc gctttattac ctttgcgcag 360 agcattatta gcaccctgac c 381

Claims (57)

  1. 변형된 IL-2 분자에 있어서,
    상기 변형은 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역을 사용해 IL-2 분자 중 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역을 치환하는 단계를 포함하고, 상기 IL-15 분자 중 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 9개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 변형된 IL-2 분자와 IL2Rα의 친화도를 감소시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 변형된 IL-2 분자와 IL2Rα의 친화도를 제거할 수 있는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 M 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 N 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 나선 B 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 M 또는 이의 변이체, 나선 B 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 나선 B 또는 이의 변이체, 루프 N 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 M 또는 이의 변이체, 루프 N 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역은 N 말단에서 C 말단까지 순차적으로 루프 M 또는 이의 변이체, 나선 B 또는 이의 변이체, 루프 N 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 m 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 n 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 나선 b 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 m 또는 이의 변이체, 나선 b 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 나선 b 또는 이의 변이체, 루프 n 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 루프 m 또는 이의 변이체, 루프 n 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역은 N 말단에서 C 말단까지 순차적으로 루프 m 또는 이의 변이체, 나선 b 또는 이의 변이체, 루프 n 또는 이의 변이체를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 m 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 M 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 b 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 B 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 n 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 N 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 m 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 M 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 및 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 b 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 B 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  22. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 b 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 B 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 및 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 n 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 N 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 나선 b는 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 B는 SEQ ID NO. 2로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 9로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  23. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 m 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 M 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 및 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 n 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 N 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 루프 m은 SEQ ID NO. 8로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 M은 SEQ ID NO. 1로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 n은 SEQ ID NO. 12로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 N은 SEQ ID NO. 5로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  24. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 m 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 M 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 b 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 나선 B 또는 이의 변이체를 치환하는 단계, 및 상기 IL-15 분자와 IL15Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 n 또는 이의 변이체를 사용하여 상기 IL-2 분자와 IL2Rα 결합을 매개하는 영역 내의 루프 N 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 상기 변형된 IL-2 분자가 IL15Rα 또는 IL15Rα의 sushi 도메인과 결합할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  26. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 IL-15 분자 중의 루프 x 또는 이의 변이체를 사용하여 IL-2 분자 중의 루프 X 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 루프 x는 SEQ ID NO. 10으로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 루프 X는 SEQ ID NO. 3으로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  27. 제1항에 있어서,
    상기 변형은 IL-15 분자 중의 나선 c 또는 이의 변이체를 사용하여 IL-2 분자 중의 나선 C 또는 이의 변이체를 치환하는 단계를 포함하고, 상기 나선 c는 SEQ ID NO. 11로 표시되는 서열을 포함하고, 상기 나선 C는 SEQ ID NO. 4로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서,
    상기 치환을 포함하지 않는 IL-2 분자에 비해, 상기 치환은 상기 변형된 IL-2 분자의 안정성을 향상시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 변형은 IL-2 분자의 나선 D 영역에서 아미노산 치환을 수행하고, 치환된 아미노산은 상기 나선 b 중의 43번째 페닐알라닌과 방향족 고리 상호 작용을 형성하여 소수성 내부 코어를 안정화할 수 있는 단계를 더 포함하고, 여기에서 아미노산의 위치는 천연 IL-15 분자 아미노산 서열을 기반으로 KABAT 일련번호의 EU 인덱스에 따라 결정되고, 상기 나선 D는 SEQ ID NO. 6으로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 천연 IL-15 분자 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 13으로 표시되는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 아미노산 치환은 W121F를 포함하고, 여기에서 아미노산의 위치는 천연 IL-2 분자 아미노산 서열을 기반으로 KABAT 일련번호의 EU 인덱스에 따라 결정되는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 천연 IL-2 분자 아미노산 서열은 SEQ ID NO. 7로 표시되는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  33. 제32항에 있어서,
    SEQ ID NO. 14로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 변형된 IL-2 분자.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자, 및 IL15Rα 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 IL15Rα는 SEQ ID NO. 16으로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  36. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자, 및 IL15Rα 수용체의 sushi 도메인 또는 이의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  37. 제35항에 있어서,
    상기 sushi 도메인은 SEQ ID NO. 15 또는 SEQ ID NO. 20으로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  38. 제34항 또는 제35항에 있어서,
    상기 단백질 이종이합체는 IL2Rα 수용체와 결합되지 않고, IL-2 분자에 비해 IL2Rβ와 친화도가 더욱 높고, 상기 IL-2 분자는 천연 IL-2 분자 및 이의 기능성 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  39. 제34항에 있어서,
    상기 IL15Rα 변이체는 Fc 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 Fc 단편은 상기 IL15Rα의 C 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서,
    상기 Fc는 인간 IgG1Fc, 인간 IgG4Fc 및 마우스 IgG2aa.1Fc 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  42. 제40항에 있어서,
    상기 Fc는 SEQ ID NO. 18로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  43. 제36항 또는 제37항에 있어서,
    상기 단백질 이종이합체는 IL2Rα 수용체와 결합되지 않고, IL-2 분자에 비해 IL2Rβ와 친화도가 더욱 높고, 상기 IL-2 분자는 천연 IL-2 분자 및 이의 기능성 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  44. 제36항에 있어서,
    상기 sushi 도메인 변이체는 Fc 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 Fc 단편은 상기 sushi 도메인의 C 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서,
    상기 Fc는 인간 IgG1Fc, 인간 IgG4Fc 및 마우스 IgG2aa.1Fc 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  47. 제45항에 있어서,
    상기 Fc는 SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 24 또는 SEQ ID NO. 25로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  48. 제45항에 있어서,
    SEQ ID NO. 14로 표시되는 서열, 및 SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 21 또는 SEQ ID NO. 22로 표시되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 이종이합체.
  49. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  50. a) 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자, 및 b) 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 IL15Rα 또는 이의 변이체, 또는 상기 sushi 도메인 또는 이의 변이체를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자 조합.
  51. 제49항에 따른 핵산 분자 또는 제48항에 따른 핵산 분자 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  52. 제51항에 있어서,
    제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자를 인코딩하는 핵산 분자와 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 IL15Rα 또는 이의 변이체, 또는 상기 sushi 도메인 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자는 동일 담체에 위치하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  53. 제52항에 있어서,
    제1 벡터 및 제2 벡터를 포함하고, 상기 제1 벡터는 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하고, 상기 제2 벡터는 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 IL15Rα 또는 이의 변이체, 또는 상기 sushi 도메인 또는 이의 변이체를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  54. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자, 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 단백질 이종이합체, 제49항에 따른 핵산 분자, 제50항에 따른 핵산 분자 조합 또는 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  55. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자, 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 단백질 이종이합체, 제49항에 따른 핵산 분자, 제50항에 따른 핵산 분자 조합, 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 제53항에 따른 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  56. 약물 제조에서 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 변형된 IL-2 분자, 제34항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 단백질 이종이합체, 제49항에 따른 핵산 분자, 제49항에 따른 핵산 분자 조합, 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 제54항에 따른 세포의 용도에 있어서, 상기 약물은 종양 예방 및/또는 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 종양에는 항문암, 담도암, 방광암, 유방암, 자궁경부암, 위암, 결장암, 두경부 편평세포암, 간암, 고형종양, 흑색종, 메르켈세포암, 중피종, 비소세포폐암, 난소암, 신장세포암, 피부 편평세포암, 소세포 폐암, 흉선암, 갑상선암, 결장암 및/또는 흑색종이 포함되는 것을 특징으로 하는 용도.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5744369B2 (ja) * 2004-02-27 2015-07-08 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ＩＬ１５−Ｒα用ＩＬ−１５結合部位およびアゴニスト／アンタゴニスト活性を有する特異的ＩＬ−１５突然変異体
US20070160578A1 (en) * 2005-12-14 2007-07-12 The Gov. Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dep. Of Health And Human Services Expansion of natural killer and CD8 T-cells with IL-15R/ligand activator complexes
SI2673294T1 (sl) * 2011-02-10 2016-08-31 Roche Glycart Ag Mutirani polipeptidi interlevkina-2
WO2012107416A2 (en) * 2011-02-10 2012-08-16 Roche Glycart Ag Improved immunotherapy
CN110437339B (zh) * 2018-05-04 2021-08-13 免疫靶向有限公司 一种以白介素15为活性成分的融合蛋白型药物前体
CN112739713A (zh) * 2018-06-25 2021-04-30 华盛顿大学 有力的且选择性的白介素模拟物的从头设计
EP3854805A4 (en) * 2018-09-21 2022-08-24 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. NOVEL INTERLEUKIN 2 AND ITS USE
CN113383013B (zh) * 2018-12-21 2022-11-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人白细胞介素2变体或其衍生物
CN111647068A (zh) * 2019-03-04 2020-09-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种人白细胞介素2变体或其衍生物
CN114437198A (zh) 2019-12-17 2022-05-06 北京志道生物科技有限公司 白介素-2衍生物
CA3175717A1 (en) * 2020-03-19 2021-09-23 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Interleukin-2 mutant and use thereof

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