JP2015533838A - rTRAIL突然変異体およびそのモノメチルアウリスタチンEコンジュゲート - Google Patents
rTRAIL突然変異体およびそのモノメチルアウリスタチンEコンジュゲート Download PDFInfo
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- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Abstract
Description
(1)rTRAIL突然変異体重合体を脱重合させ、再重合させてrTRAIL突然変異体三量体を生成する。このステップは、特に、rTRAIL突然変異体を、亜鉛イオンを含有する緩衝液中で溶解させ、トリス(β−クロロエチル)ホスフェート(TCEP)をその中に添加し、水浴下で30℃〜40℃において1〜3時間反応させることを含む;
TCEPを添加する目的は、脱重合された不安定重合体を単量体状態で維持するためであり、それというのも、重合体は、rTRAIL突然変異体間のジスルフィド結合により形成することができるためである。その一方、反応系中の亜鉛イオンは、rTRAIL突然変異体単量体の安定三量体の形成をさらに促進し得る。
(2)rTRAIL突然変異体三量体を、リンカーを有するMMAEと混合してカップリング反応を実施する。カップリング後、それぞれの三量体は、1〜3つのMMAE分子と結合し得;カップリング温度は、好ましくは、0〜4℃であり、時間は、30〜60分間である;
(3)反応の完了後、rTRAIL突然変異体−MMAEコンジュゲートを分離および精製により得る。
(1)トータルRNAをヒト組織から抽出し、それを逆転写のためのテンプレートとして用いてcDNAライブラリーを得た;
(2)プライマーP1およびP2を、テンプレートとしての前記cDNAとともにPCR増幅に利用してTRAILコード配列を得た;
(3)プライマーP3およびP4を、テンプレートとしての前記TRAILコード配列とともにPCR部位特異的突然変異増幅に利用して突然変異配列を得た;
(4)前記突然変異配列を、ベクター中に作動可能に連結させて宿主細胞を形質転換した;
(5)融合タンパク質を発現させるように形質転換宿主細胞を誘導して前記rTRAIL突然変異体を得た。
P1:5’−ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG−3’;
P2:5’−TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG−3’;
P3:5’−TATACCATGGGCACCTCTGAGGAAACCATT
TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT−3’;
P4:5’−TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC
GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC−3’。
(1)本発明の前記コンジュゲートは、rTRAIL突然変異体およびMMAEの両方の生物学的機能、例として、腫瘍細胞外部でのアポトーシスの誘導におけるrTRAIL突然変異体の能力、および細胞中でチューブリンを阻害することによるアポトーシスの誘導におけるMMAEの能力の両方を有する。これら2つの協働下で、抗腫瘍有効性は有意に向上される。
(2)rTRAIL突然変異体が腫瘍細胞の表面上のデス受容体と特異的に結合した場合、本発明の前記コンジュゲートは、MMAEを腫瘍細胞に一方向的に輸送し、それが腫瘍細胞内部でさらに放出されてその役割を担い、TRAILに対する低感受性およびさらには耐性を有する腫瘍細胞を殺傷するだけでなく、MMAE単独の投与により引き起こされる毒性副作用も低減させる。
(3)本発明のコンジュゲート中のrTRAIL突然変異体をMMAEとカップリングさせた後、その水溶液は、rTRAIL分子単独の溶解度よりも良好な溶解度を有し、繰り返しの冷凍および解凍後に沈殿しないことを示す。
(1)ヒト前立腺からのトータルmRNAの抽出
ヒト前立腺組織の凍結小片(約100mg)を液体窒素中で粉末に粉砕し、それにTRIZOL試薬(1mL)を添加して繰り返し粉砕し、1.5mlのRNアーゼ不含eppendorf(EP)チューブに移した。チューブを室温において5分間放置し、次いで0.2mLのクロロホルムを添加して15秒間激しく振とうさせ、室温において3分間放置した。4℃において12000gにおいて15分間遠心分離した。上方の水相を別のRNアーゼ不含EPチューブ中に移した。イソプロパノール(0.5mL)を添加し、室温において10分間保持してRNAを沈殿させた。4℃において12000gにおいて10分間遠心分離し、上清を除去した。得られた沈殿物を75%のエタノールにより洗浄した。4℃において12000gにおいて5分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを乾燥させ、次いで50μLのDEPC水により溶解させ、−70℃において貯蔵した。
プライマーとしてオリゴdTを、テンプレートとしてヒト前立腺トータルRNAを用いて、AMV逆転写酵素を添加してリバースPCRを実施してcDNAライブラリーを得、以下のステップを含んだ:
1)RNA予備変性:5μgのヒト前立腺RNA+25μgのオリゴdTを0.1%のDEPCにより10μLにメスアップし、70℃の水浴に5分間供し、室温に冷却してmRNAの二次構造を破壊した。
2)RT:合成系は以下のとおりであった:
逆転写プロセス 42℃ 60分間
逆転写酵素の不活化 70℃ 10分間
テンプレートとして前記cDNAを、上流および下流プライマーとしてP1およびP2を用いて、TRAILのコード配列をTaq DNAポリメラーゼの触媒作用下で合成し、増幅させた。配列分析により、得られたDNA配列がGenBankに登録されているTRAILコード配列(NM_003842.4)と同一であることを確認し、すなわち、TRAILコード配列を得た。プライマーの配列は、以下のとおりであった:
P2:5’−TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG−3’。
(1)rTRAIL N109Cの突然変異体配列の取得
テンプレートとしてTRAILコード配列を、上流および下流プライマーとしてP3およびP4を用いて、rTRAIL N109C突然変異体のコード配列をTaq DNAポリメラーゼの触媒作用下で合成し、増幅させた。配列分析により、得られたDNA配列が配列番号2に示されるものであることを確認し、それは予測と一致した。プライマーの配列は、以下のとおりであった:
TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAATGTATTTCT−3’;
P4:5’−TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC
GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC−3’。
テンプレートとしてTRAILコード配列を、上流および下流プライマーとしてP5およびP6を用いて、rTRAIL N109C突然変異体のコード配列をTaq DNAポリメラーゼの触媒作用下で合成し、増幅させた。配列分析により、得られたDNA配列が配列番号4に示されるものであることを確認し、それは予測と一致した。プライマーの配列は、以下のとおりであった:
TCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCT−3’;
P6:5’−TTCTCGAGTTAGCCAACTAAAAAGGCCCC
GAAAAAACTGGCTTCATGGTCCATGTCCATGTC−3’。
rTRAIL N109C突然変異体配列およびpET28a(+)をそれぞれNcoI/XhoIにより二重消化し、次いで3:1のモル比においてT4リガーゼ(Takara)によりライゲートした。ライゲーション産物を大腸菌(E.coli)DH5aコンピテント細胞中に形質転換し、陽性クローンを選択し、培養した。プラスミドの抽出後、NcoI/XhoI二重消化を使用してそれらのライゲーションを確認し、配列決定を使用してさらなる確認を行い、rTRAIL突然変異体発現ベクター:pET28a(+)−rTRAIL N109Cを得ることをもたらした。
発現ベクターpET28a(+)−rTRAIL N109Cを、大腸菌(E.coli)発現宿主BL21(DE3)(Novagenから購入)中に形質転換し、単一クローンをカナマイシンプレートからピックし、37℃、160rpmにおいて一晩培養した。細菌液PCR法を使用してrTRAIL突然変異体発現ベクターが発現宿主中に形質転換されたか否かを決定した。テンプレートとして細菌液を、プライマーとしてP3およびP4を用いて、PCRを実施した。確認された陽性単一クローンを関心対象の遺伝子操作細菌として同定し、細菌液を10〜15%のグリセロールの添加後に−80℃において保持した。
構築された遺伝子操作細菌を、LB培養培地(200mL、15μg/mLのカナマイシンを含有)中で接種し、細菌液OD600が約0.8に達するまで160rpmの回転速度のシェーカー中で37℃において培養した。IPTG(最終濃度:1mM)を添加してBL21(DE3)の融合タンパク質の発現を誘導し、誘導時間は12時間であった。BL21細菌を7200gにおいて10分間遠心分離することにより得た。
緩衝液A:50mMのNaH2PO4、300mMのNaCl、pH7.4
緩衝液B:20mMのNaH2PO4、pH6.0
緩衝液C:20mMのNaH2PO4、1MのNaCl、pH6.0
0.5mgのrTRAIL N109C突然変異体を0.8mLのPBS(pH6.0、10μMのZnCl2を含有)中で溶解させ、その中に6μLのTCEPを添加し、水浴を37℃において2時間維持した。撹拌しながら、50μLの30%アセトニトリル/水により溶解させた10倍過剰量のvcMMAEを添加して4℃において40分間反応させ、反応を過剰量のシステインの添加により終了させた(前記vcMMAEは、Jiangyin Concortis Biotechnology Co.,Ltdにより合成し、10倍過剰量は、反応系においてvcMMAEのモル量がN109Cのモル量の10倍以上であることを意味した)。10kDaのMWCOを有する限外濾過チューブ(Millipore)を使用して反応系中の小分子を除去した。得られたコンジュゲートを0.22μm(細孔サイズ)水膜に通して濾過して細菌を除去し、後の使用のために−20℃において貯蔵した。
4つのタイプの細胞を選択してrTRAIL突然変異体およびMMAEコンジュゲートのインビトロ抗腫瘍活性を計測した:TRAIL感受性タイプ(NCI−H460)、TRAIL無感受性タイプ(Hela)、TRAIL耐性タイプ(MCF−7)および正常細胞(HEK293)。これら4つのタイプの細胞の全ては、TRAILデス受容体をそれらの表面上で有した。
(1)NCI−H460細胞を個々の細胞に消化し、次いで1×104個の細胞/mLに希釈し、細胞を96ウェルプレート(それぞれのウェルにつき100μL)上でスプレッドし、細胞を通常条件下で24時間培養すること。
(2)N109C、N109C−vcMMAEおよびS96C−vcMMAEをそれぞれ培養培地により希釈し、それらを細胞プレート中に、試験群として提供するために32、63、125、250、500、1000ng/mLの最終濃度で添加する一方、標準TRAIL(114〜281)を陽性対照群として使用し、緩衝液(試験試料を溶解させるために使用し、同一の様式で培養培地により希釈)を陰性対照群として使用し、培養培地(いかなる溶液も添加せず)をブランク対照群として使用すること。全ての対照群および試験群をトリプリケート(3連)で試験した。
(3)対照群および試験群中の試料を細胞プレート中に添加し、37℃において96時間培養し、対照群および試験群の標的細胞に対する殺傷能を観察すること。
(4)培養完了後に10μLのCCK−8発色溶液をそれぞれのウェル中に添加し、発色のために試料をインキュベーター中で1時間インキュベートし、それらを取り出して450nmおよび630nmの二重波長において計測すること。
(5)結果の計算:陰性群中の等価希釈物のOD値よりも高いOD値を有する試験群中の試料を陽性とみなした(t検定、P<0.01)。計算結果を図6に示した。
N109C−vcMMAEを一例として取り出し、コンジュゲートを蛍光標識法によりマウス中リアルタイムで追跡してコンジュゲートの腫瘍標的化能を観察した。
体重20gの無胸腺マウスを選択し、107個のNCI−H460細胞を前肢の片方の腋窩中で皮下注射した。3日後、腫瘍形成を明確に観察することができた。
近赤外線活性化色素としてのCy5を蛍光標識として使用して蛍光の動物皮膚への通過を促進し、リアルタイム生体観察の目的を達成した。Cy5標識の具体的な方法に関しては、製造業者(Lumiprobe)により提供される説明書を参照されたい。
約50μgのCy5標識コンジュゲートを含有する200μLの試料を担腫瘍マウス中に尾静脈を介して注射した一方、等量の生理食塩水をブランク対照群中に注射した。
以下のステップを含むレーザー共焦点技術により腫瘍細胞中でのrTRAIL突然変異体−vcMMAEコンジュゲートの挙動を観察するためにNCI−H460細胞を一例として取り出した:
a)カバースリップを1MのHClおよび70%のエタノールと浸漬し、超音波処理に30分間供し、再蒸留水により5〜6回洗浄し、後の使用のために滅菌した;
b)ウェル滅菌カバースリップを24ウェルプレート中で置き、細胞を104個の細胞/ウェルにおいてプレーティングし、37℃において一晩培養した;
c)投与:N109C−vcMMAEおよび96C−vcMMAEをそれぞれ1μg/mLの最終濃度に希釈し、細胞をステップd)に従って異なる時点(1、4、8および12時間)において処理した一方、薬物不含培養培地をブランク対照群に使用した;
d)カバースリップを冷PBSにより3回洗浄し、次いで4%のパラホルムアルデヒドにより室温において10分間固定した;
e)PBSを使用してカバースリップをさらに3回洗浄した;
f)0.1%のTriton X−100を添加して室温において10分間浸透化させた;
g)PBSにより3回洗浄した後に2%のBSAを添加して30分間ブロッキングした;
h)一次抗体インキュベーション:ウサギ抗ヒトrTRAILポリクローナル抗体を1%のBSA/PBSにより1μg/mLに希釈し、室温において45分間インキュベートした;
i)二次抗体インキュベーション:FITC標識ヤギ抗ウサギ二次抗体を1%のBSA/PBSにより500倍希釈し、室温において45分間インキュベートした;
j)DAPIによる細胞核の染色:PBS洗浄(3回)後、PBSにより1000倍希釈されたDAPIをそれぞれのカバースリップ上で滴加し(細胞をちょうどカバーすることが適切であった)、カバースリップを25℃において約2分間インキュベートした;
k)封入:PBS洗浄後、1滴の退色防止蛍光染色用封入剤をカバースリップ上で添加し、次いでカバースリップをガラススライド上で逆さに置き、次いでカバースリップ縁部をマニキュア液によりシールした;
l)共焦点検出:検出結果を図8に示した。
<120> RTRAIL MUTANT AND MONOMETHYL AURISTATIN E CONJUGATE THEREOF
<130> SS40040
<150> CN 201210416648.8
<151> 2012-10-25
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 187
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Cys Ile
1 5 10 15
Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile
20 25 30
Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys
35 40 45
Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg
50 55 60
Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu
65 70 75 80
Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe
85 90 95
Arg Phe Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met
100 105 110
Val Gln Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu
115 120 125
Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly
130 135 140
Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp
145 150 155 160
Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His
165 170 175
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly
180 185
<210> 2
<211> 561
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
acctctgagg aaaccatttc tacagttcaa gaaaagcaac aatgtatttc tcccctagtg 60
agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg aagaagcaac 120
acattgtctt ctccaaactc caagaatgaa aaggctctgg gccgcaaaat aaactcctgg 180
gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa tggtgaactg 240
gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag 300
gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca 360
agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat 420
gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac 480
agaatttttg tttctgtaac aaatgagcac ttgatagaca tggaccatga agccagtttt 540
ttcggggcct ttttagttgg c 561
<210> 3
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
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gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag 300
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tc 62
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<400> 9
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tct 63
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ttctcgagtt agccaactaa aaaggccccg aaaaaactgg cttcatggtc catgtccatg 60
tc 62
Claims (10)
- アミノ酸配列が、配列番号1により表わされることを特徴とする、rTRAIL突然変異体。
- 塩基配列が、配列番号2により表わされることを特徴とする、請求項1に記載のrTRAIL突然変異体をコードする遺伝子。
- 請求項2に記載の遺伝子を含有する発現単位、組換えベクターまたは発現系。
- モノメチルアウリスタチンE(MMAE)をrTRAIL突然変異体三量体とリンカーを介してコンジュゲートすることにより形成され、前記rTRAIL突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号1により表わされることを特徴とする、rTRAIL突然変異体−MMAEコンジュゲート。
- 前記リンカーが、マレイミド修飾バリン−シトルリンジペプチドである、請求項4に記載のrTRAIL突然変異体−MMAEコンジュゲート。
- 抗腫瘍薬の調製における、請求項4または5に記載のrTRAIL突然変異体−MMAEコンジュゲートの使用。
- rTRAIL突然変異体−MMAEコンジュゲートを調製する方法であって、
(1)rTRAIL突然変異体重合体を脱重合させ、再重合させてrTRAIL突然変異体三量体を生成し;
(2)前記rTRAIL突然変異体三量体を、リンカーを有するMMAEと混合してカップリング反応を実施し;
(3)反応の完了後、rTRAIL突然変異体−MMAEコンジュゲートを分離および精製により得ること
を含み、
前記rTRAIL突然変異体のアミノ酸配列が、配列番号1により表わされ;
前記リンカーが、マレイミド修飾バリン−シトルリンジペプチドである方法。 - 前記rTRAIL突然変異体を、亜鉛イオンを含有する緩衝液中で溶解させ、トリス(β−クロロエチル)ホスフェートをその中に添加し、水浴下で30℃〜40℃において1〜3時間反応させること
含む方法により前記rTRAIL突然変異体三量体を調製する、請求項7に記載の方法。 - 前記カップリング反応を、4℃以下の温度において30〜60分間実施する、請求項7に記載の方法。
- 前記分離および精製が、反応溶液から10kDa未満の分子量を有する物質を限外濾過により除去し、沈殿物を遠心分離により除去して上清を得、前記上清を濾過により滅菌して前記rTRAIL突然変異体−MMAEコンジュゲートを得ることを含む、請求項7に記載の方法。
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