JP4955654B2 - 癌の治療のためのｐ２１タンパク質を含んで成るコンジュゲート - Google Patents

Description

本発明は、Ｐ２１タンパク質並びに当該Ｐ２１タンパク質を含んで成るコンジュゲート及び組成物、に関する。これらの製品は癌の治療特に有用である。

癌は、人類にとって主な死亡原因の一つであり、そして集中的な研究対象となっている。ほぼ全ての悪性腫瘍が、一つの細胞の不死化状態への転換に由来し、この状態では当該細胞が増殖を制御する能力を失っていることが広く知られている。

無秩序の増殖は、細胞周期の制御、真核生物においては、サイクリンとサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によって主に制御される細胞周期の制御、の異常から生じる。サイクリンとＣＤＫのリン酸化状態の制御の複雑なメカニズムは、サイクリン／ＣＤＫ複合体が前記周期の次のフェーズへ細胞を到達させることができるかどうかを制御する。サイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化状態の重要性は、多数の癌が、サイクリン／ＣＤＫのリン酸化及び複合体形成の制御における重要な成分である、Ｐ５３及びＰ２１腫瘍抑制タンパク質の突然変異に関与しているという事実に反映されている。特に、Ｐ２１は、ｃｙｃＤ／ｃｄｋ４複合体の形成を阻止し、そしてＧ１期停止を生じさせる。Ｐ２１タンパク質及びその生物学的機能についての詳細のレビューは、O'Rily MA, Antioxid Redox Signal. 2005 Jan-Feb; 7(1-2): 108-18及びLiu G & Lozano G, Cancer Cell. 2005 Feb: 7(2):113-4に見ることができる。

癌の治療は通常、外科手術、放射線治療及び化学療法（例えば免疫療法）の組み合わせを伴う。近年のがん治療の重大な進展にも関わらず、治療の改良の進歩についての絶え間ない要求が存在している。癌治療は、特に癌細胞のみを標的として破壊するのが理想である。

取り組むべき必要がある更なる問題は、化学療法に起因する薬物耐性である。細胞毒性薬物の継続投与は腫瘍を生じさせることがあり、これは、薬物に対して当初は感受性であるが、次第に薬物耐性となって、その結果、当該薬物はその治療効果を失う。そのため、癌細胞の薬物に対する感受性を向上させる方法が要望されている。

本発明の要約
本発明は、Ｐ２１タンパク質が癌の治療に有用であるという知見に基づいている。特に、Ｐ２１タンパク質が癌治療に使用される少なくとも１つの他の物質と一緒に投与される場合、相乗効果が観察される。

本発明の第一の観点によるコンジュゲートは：
（ａ）Ｐ２１タンパク質、あるいはそのホモログ又は機能的フラグメントを含んで成る第一領域；及び
（ｂ）転位因子を含んで成る第二領域、
を含んで成る。

本発明の第二の観点による組成物は、Ｐ２１タンパク質、あるいはそのホモログ又は機能的フラグメントを含んで成る第一領域及び転移因子を含んで成る第二領域、を含んで成るコンジュゲートを、少なくとも１つの薬物と一緒に含んで成る。

本発明の第三の観点によると、本発明のコンジュゲート又は組成物は、薬剤として、特に癌の治療のために使用されうる。

本発明の第四の観点によると、Ｐ２１タンパク質あるいはそのホモログ又は機能的フラグメントは、薬剤として、特に癌の治療のために使用されうる。

本発明の詳細な説明
本発明は、治療剤としてＰ２１タンパク質を利用する。Ｐ２１タンパク質は、治療剤として、単独で又は他の治療剤と組み合わせて使用されうる。他の治療剤と併用される場合、驚くべき相乗効果が観察される。好ましい態様において、Ｐ２１タンパク質は、当該Ｐ２１タンパク質を標的細胞へと進入させる転位因子と結合している。

本発明以前、Ｐ２１が癌治療において広範に使用することが出来るとは考えられていなかった。多くの癌が、Ｐ５３遺伝子の突然変異から生じているため、Ｐ５３遺伝子は癌の治療薬をデザインする場合に、明白で且つ最も好ましい標的である。Ｐ２１タンパク質は、アポトーシスのカスケードを更に下流に位置させる機能を有し、治療剤としては考えられていなかった。本発明は、Ｐ５３をバイパスして、活性Ｐ２１を癌の治療のために直接的に送達させる。

Ｐ２１と化学療法剤の投与は、抗癌治療における驚くべき向上をもたらす。

本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」は、当業者が理解するように、ペプチド結合を経由して連結した多数のアミノ酸残基を含んで成るポリマー分子を指す。ペプチド及びポリペプチドは、用語「タンパク質」に包含される。

ヒトＰ２１タンパク質は、本明細書では配列番号１として定義する。

アノテートされたヒトＰ２１配列は、第一アクセッション番号Ｐ３８９３６（エントリーネーム ＣＤＮ１Ａ ＨＵＭＡＮ）を有するＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースにおいて見られる。当該ヒト配列（配列番号１）が好ましいが、あらゆる種に由来するＰ２１を本発明に従い使用することができ、例えばマウス(Mus musculus)タンパク質（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ第一アクセッション番号Ｐ３９６８９）又はネコ(Felis silvestris catus)タンパク質（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ第一アクセッション番号Ｏ１９００２）である。Ｐ２１タンパク質をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内である。

ヒトＰ２１タンパク質（配列番号１）の機能的変異体（すなわち、ホモログ）及びフラグメントも本発明に含まれる。例えば、配列番号１に対して高レベルの配列類似性（例えば６０％超、好ましくは７０％超、更に好ましくは８０％超、そして最も好ましくは９０％超、例えば９５％超）を有するタンパク質が本発明の範囲内である。用語「類似性」は当業界で知られている。当該用語は、アミノ酸配列間の比較を意味し、そして相当の位置の同一アミノ酸だけでなく、相当の位置にある機能的に類似のアミノ酸を考慮する。従って、ポリペプチド配列間の類似性は、配列類似性に加え、機能的類似性を指す。

アミノ酸配列間の類似性のレベルは、既知の方法を用いて算出することができる。公に利用可能となっているコンピューターベースの類似性決定方法には、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡプログラム、ＢＬＡＳＴＸプログラム、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩから入手可能なＧａｐプログラムが含まれる。本明細書で言及する類似性のレベルは、例えばＧａｐプログラムを用いて、ギャップペナルティー１２、そしてギャップ長ペナルティー４で決定することもできる。

Ｐ２１の変異体及びフラグメントは、常用のタンパク質技術に基づき、当業者にとって自明の、標準的なＤＮＡ技術、例えば部位指定突然変異誘発を用いて製造することができる。Ｐ２１タンパク質のフラグメント又はホモログは、天然のＰ２１タンパク質の機能を保持すべきであり、すなわち、「機能的」フラグメント又はホモログであるべきである。保持されなければならない機能は、腫瘍抑制タンパク質として作用し、そしてｃｙｃ／ＣＤＫ４複合体の形成を阻止し、それにより真核生物細胞のＧ１期停止を生じさせる能力である。細胞分裂及び生存性についての試験は当業界で周知であり、例えばCellTiter（登録商標）及びCyto Tox 96（登録商標）アッセイはPromega Corp., Wisconsin USAから入手可能である。

好ましい態様において、Ｐ２１タンパク質は転位因子と関連しており、コンジュゲートを形成する。本明細書で使用する場合、用語「コンジュゲート」は、転移因子及びＰ２１タンパク質から形成されるキメラ分子を指す。そのため、当該コンジュゲートは、天然の形態では一緒には見られない分子のハイブリッドである。好ましくは、コンジュゲートの形成は、Ｐ２１タンパク質又は転位因子が意図するように機能する能力を軽減させることも、他の方法でかかる能力に有害に作用することもない。

本明細書で使用する場合、用語「転位」は、細胞膜の向こう側へタンパク質を送達することを指す。当業者にとって、転移因子は、Ｐ２１タンパク質を標的細胞に送達するのに必要とされる。本明細書で使用する場合、用語「転位因子」は、細胞膜、すなわち外側の細胞膜の向こう側に転位させる能力を有するあらゆる部分を指す。Ｐ２１タンパク質がコンジュゲート内に転移因子を伴う場合、Ｐ２１も細胞膜の向こう側に転位される。

転位因子は、好ましくはタンパク質である。細胞膜を転位する能力を有する多数のタンパク質が当業界で知られており、これにはヒストンタンパク質、ヘルペス単純ウイルスＶＰ２２タンパク質及びＨＩＶ ｔａｔドメインが含まれる。ＨＩＶのＩ型に由来するｔａｔタンパク質は、２つのエクソンにコードされる８６アミノ酸を含んで成る。最初の７２アミノ酸は、エクソン１にコードされており、そして完全な転写活性化活性を示す。この領域の塩基性アミノ酸残基クラスターが細胞膜の向こう側に転位できることが知られている。このクラスターは、アミノ酸残基３７〜７２内に含まれており、本発明の範囲内である。更に具体的には、アミノ酸４９〜５８は、Vives et al, J. Biol. Chem: 272 (1997): 25: pp16010-16017に開示されているように、好ましい転位因子である。当該文献は引用により本明細書に組み入れられる。ＨＩＶ ＴＡＴのアミノ酸４９〜５８は、配列番号２として以下列記する。
配列番号２：RKKRRQRRR

しかしながら、細胞膜を転位する能力を保持する、ＨＩＶ−１型ｔａｔタンパク質のあらゆるフラグメント又はホモログが本発明の範囲内である。

転位する能力を有する特定のアミノ酸モチーフはＷＯ０３／００２５９８に記載されており、これは引用により本明細書に組み入れられる。本発明によると、ショウジョウバエ(Drosophila)のアンテナペディアタンパク質のホメオドメインが転位因子として使用するのが好ましい。アンテナペディアホメオドメインの機能的変異体及びホモログも、それらが転位する能力を維持する限り使用可能である。アンテナペディアホメオドメイン転位因子の余すところのない解説はＷＯ−Ａ−９９／１１８０９に示されており、これらの内容は引用により本明細書に組み入れられる。Ａｎｔｐ遺伝子のホメオドメインを配列番号３中に示す。
配列番号３：RKRGRQTYTR YQTLELEKEF HFNRYLTRRR RIEIAHALCL TERQIKIWFQ NRRMKWKKEN

誤解を避けるために、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質のアミノ酸配列は、ホメオドメインとして知られている約６０のアミノ酸を含んでおり、これは転位因子として機能する能力を有する。完全長のタンパク質、ホメオドメインあるいは転位する能力を維持している当該タンパク質の任意のホモログ又はフラグメントは、本発明において転移因子として使用されうる。ホモログは、好ましくは、高レベル（例えば６０％超、好ましくは７０％超、更に好ましくは８０％超、そして最も好ましくは９０％超、例えば９５％以上）の配列類似性をショウジョウバエのアンテナペディアホメオドメインに対して有している領域を含んで成る。

ショウジョウバエのホメオドメイン及びアンテナペディアの完全長タンパク質が好ましいが、当業者は機能的ホモログが任意の生物から派生しうることを認識するであろう。アンテナペディアのホモログは、多細胞生物の多くで見られており、そしてよく保存されている。例えば、ヒトとショウジョウバエのホメオドメインは、１つの保存的アミノ酸置換だけが異なる。人工的に、例えば部位指定突然変異誘発を用いて作られたホモログも本発明の範囲内である。天然又は人工の配列が膜を転位する能力は、当業界で周知のルーチンな方法によって試験することができる。

膜を転位する能力を保持するホメオドメインの変異体は当業界で報告されており、これらは本発明の範囲内である。例えば、ＣＮＲＳのＥＰ−Ｂ−０ ４８５ ５７８は、ｐＡｎｔｐのヘリックス３配列を含んで成るホメオペプチドを開示しており、これらは引用により本明細書に組み入れられる。

ＣＮＲＳのＷＯ９７／１２９１２は、ｐＡｎｔｐのヘリックス３の人工配列、及びその変異体を開示している。これらはまた引用により本明細書に組み入れられる。特に、ヘリックス３は、配列：
配列番号４：Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys
を有すると言われている。

当該変異体は、配列：
配列番号５：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16又は
配列番号６：X16-X15-X14-X13-X12-X11-X10-X9-X8-X7-X6-X5-X4-X3-X2-X1
（ここで、各Xはα−アミノ酸を表しており、Ｘ６はトリプトファンを表している；前記ペプチドは、６から１０の間に疎水性アミノ酸を含んで成る）
を有すると言われている。

他の変異体は、例えば、Gehring W (1987) Homeo Boxes in the Study of Developmentにおいて開示されている。Science 236 1245-1252は、６２アミノ酸のホメオドメインを開示しており、すなわち、０位にｇｌｕ、そして６１位にｌｙｓを有している。Bloch-Gallego E et al (1993) Antennapedia Homeobox Peptide Enhances Growth and Branching of Embryonic Chicken Motoneurons In Vitro. The Journal of Cell Biology 120(2) 485-492は、ｐＡｎｔｐ４０Ｐ２と称される突然変異体を開示しており、これは運動ニューロン膜を通じて尚も転位することができ、そして核に到達することができる。この突然変異体において、４０位と４１位にあるロイシン及びスレオニン残基は、２つのプロリン残基で置換されていた。Le Roux, et al. (1993) Neurotrophic activity of the Antennapedia homeodomain depends on its specific DNA-binding properties. Proc Natl Acad Sci 90: 9120-9124においては、図２に示すとおり、２つの突然変異体ｐＡｎｔｐ ５０Ａ及びｐＡｎｔｐ ４０Ｐ２が開示されており、これらはニューロン膜を通じて転位する能力を保持している。上掲のSchutze Redelmeier et al (1996)においては、１６アミノ酸のＣ末端（第三ヘリックス）セグメントを使用してオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドを細胞培養の細胞質と核に向かわせていたことを開示している。

上記引用文献は全て、引用により本明細書に組み入れられる。約６０残基のホメオドメインが使用されることが好ましい。

Ｐ２１タンパク質と転移因子が共有結合しているのが好ましい。共有結合は、化学的なリンカー分子の形態であってもよい。更に好ましくは、Ｐ２１タンパク質と転位因子は、１つの融合タンパク質として生成される。当該融合タンパク質において、Ｐ２１タンパク質と転移因子はどのような順序であってもよい。転移因子は、Ｐ２１タンパク質のアミノ末端に位置するのが好ましい。融合タンパク質の生成方法は当業界で周知であり、Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press)に記載のような標準的な組換え核酸の手順を用いて行われる。この文献の内容は、引用により本明細書に組み入れられる。融合タンパク質をコードする核酸は、本発明の範囲内にあり、当該融合タンパク質をコードする核酸及び少なくとも１つのプロモーター領域を含んで成る発現ベクターと同様である。

Ｐ２１タンパク質及び転移因子を含んで成るコンジュゲートは、少なくとも１つの薬物を追加的に含む組成物中に含めることができる。好ましくは、当該薬物は、癌治療に使用される。好ましい態様において、当該薬物は化学療法薬であり、例えばシスプラチン又はタクソールである。しかしながら、癌治療に使用される他の薬物も、本発明に従うコンジュゲートと組み合わせることができ、例えば抗炎症薬、抗体（モノクローナル抗体を含む）、免疫調節薬、ホルモン及びホルモンアンタゴニスト、抗生物質、抗菌剤及び抗ウイルス剤である。限定しないが、かかる例を以下に示す。

（１）細胞毒性薬物／細胞増殖抑制剤：アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、メルファラン等）、細胞毒性抗体（ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン等）、代謝拮抗物質（メトトレキサート、カペシタビン、ゲムシタビン、フルオロウラシル、ビンカ・アルカロイド及びエトプシド（ビンブラスチン、ビンクリスチン等）、白金化合物（カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（イリノテカン、トポテカン等）。
（２）免疫応答修飾剤：抗増殖性免疫抑制剤、コルチコステロイド。
（３）免疫修飾剤：インターフェロン、インターロイキン
（４）モノクローナル；トランスツズマブ、リツキシマブ、アレムツズマブ。
（５）抗菌性薬物：ペニシリン、セファロスポリン、セファマイシン、テトラサイクリン、マクロライド、アミノグリコシド、他の抗菌剤（クロラムフェニコール、フシジン酸、バンコマイシン等）。
（６）ホルモン：甲状腺ホルモン、エストロゲン、プロゲステロン、アンドロゲン、及びそれら全てのアンタゴニスト。
（７）その他：ビタミン、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ等）、ワクチン、抗血清、抗菌薬、抗ウイルス薬及びステロイド。

Ｐ２１タンパク質又はそのホモログ若しくは機能的フラグメント、あるいは上述のコンジュゲートも癌の治療に使用されうる。好ましくは、Ｐ２１タンパク質又は上述のコンジュゲート及び追加の薬物を含んで成る組成物が癌の治療に使用される。

前記活性成分を含む医薬組成物は、任意の適当な形態でありうる。好ましくは、Ｐ２１タンパク質又はコンジュゲートは、経皮投与又は静脈投与に適した形態である。適当な医薬として許容される緩衝液、賦形剤、希釈剤等も、当業者がよく知っているように、存在することがある。前記組成物は、罹患組織への直接投与を意図した形態であってもよく、又は罹患組織を間接的に標的にする形態であってもよい。

体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜約２５ｍｇの一日の投与レベルが、上文で示唆した症状の治療に有用である（約８ｍｇ〜約２ｇ／患者／日）。例えば、患者は、一日当たり、体重１ｋｇ当たりＰ２１化合物を約０．２５〜１２．５ｍｇ投与することで効果的に治療されうる（約２０ｍｇ〜約１ｍｇ／患者／日）。

一回分の剤形を製造するために担体材料と組合されうる活性成分量は、治療される宿主及び特定の投与形態によって異なる。投与単位の形態は、通常約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含む。

しかしながら、ある特定の患者のための特別な投与量は、採用する特定の化合物の活性、年齢、体重、総体的な健康、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄の頻度、薬物の組み合わせ、治療を受けている特定の疾患の重篤度、等の種々の因子によって異なる。

更に、Ｐ２１化合物は、機械的手段で疾患の部位に送達することもでき、又は全身性のターゲティング技術、例えばリポソーム（疾患組織への親和性を付与する化学的修飾がされたもの、又はされてないもの）、抗体、アプタマー、レクチン、又は正常な組織にほとんど見られない又は存在していない罹患組織の観点についての親和性を有する化学的リガンド、を使用することで、疾患の部位をターゲティングすることができる。

本発明は更に以下の実施例により説明される。

実施例１
細菌性プラスミドクローンは、Ｐ２１タンパク質単独又はアンテナペディアペプチドとの融合物として構築された。ＡＮＴＰ−Ｐ２１融合物（「融合タンパク質」）の発現は、誘導後最大３時間であり、この後、グアニジン塩酸塩及び尿素を用いた変性条件下でのタンパク質精製を行った。再生及びリフォールディングの間に、タンパク質沈殿が観察された。このことは、種々の緩衝液が試験される必要があることを示唆した。５種類の緩衝液を試験した；２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基／０．５ＭのＮａＣｌ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ８）は、前記タンパク質を溶解状態に維持した。

融合タンパク質の産生により、細胞転位実験を実施して、アンテナペディア含有融合タンパク質が生体膜の向こう側に転位する能力を試験することが可能となった。ＡＳＰＣ１及びＨｅＬａ（ＡＳＰＣ１−ヒト膵臓腺癌、ＨｅＬａ−ヒト子宮頸部腺癌）の２つの細胞系を本実験では使用した。前記タンパク質は、様々に希釈して１０分、６０分細胞上で３７℃でインキュベートした。融合タンパク質の転位は、両細胞系で明らかであり、これはインキュベーションからわずかに１０分後でもそうであった。Ｐ２１タンパク質のみでは細胞を横断して転位しないようであった。タンパク質の内部移行は、４℃でのインキュベーション後であっても歴然としており、これは転位がエネルギー依存性の機構であり、古典的なエンドサイトーシスを伴わないことを示唆している。

実施例２
融合タンパク質の発現をスケールアップして、十分に材料を精製して細胞毒性アッセイを実施した。タンパク質はＴｒｉｓの代わりにグアニジン塩酸塩溶液中で透析することで、沈殿を防いだ。細胞に取り込まれた場合、細胞内ジスルフィドイソメラーゼ及びシャペロンは機能的タンパク質をもたらすことが予測された。卵巣癌細胞系ＳＫＯＶ−３及び骨肉腫細胞系ＳＡＯＳ−２を、ヒトの体内環境に類似の条件下で、９６穴ＥＬＩＳＡディッシュ内で生育した（細胞培養設備）。

融合タンパク質、Ｐ２１単独を５０ｍｇ／ｍｌの濃度で細胞に２４時間、４８時間与えた。コントロールには、バックグラウンドの細胞死を示すために未処理の細胞を含めた；細胞にはグアニジン塩酸塩のみを添加した；そしてこの細胞を洗浄剤で完全にすすぎ、１００％細胞を死滅させた。本実験は、２４時間、４８時間目に終了させ、そしてプレートをアポトーシスによる細胞死について評価した。結果は、使用した緩衝液（グアニジン塩酸塩）自体が、長期間の曝露後、細胞に対して細胞毒性であったことを示唆していた。このバックグラウンドの細胞死は、融合タンパク質に起因する細胞毒性のいずれの証拠についても考慮しなかった。従って、リフォールディング後、タンパク質は、細胞に対して毒性がないことが知られているＰＢＳ緩衝液中で透析された。あらゆる沈殿材料を遠心で除去した。

続いて、タンパク質を細胞培養にかけた。図１に示すとおり、融合タンパク質の投与時に２つの癌細胞系で重大な細胞死が観察された。

細胞投与の条件についての最適化実験を実施した。投与の期間を試験し、この細胞毒性物質（Ａｎｔｐ−Ｐ２１融合物）と、ＳＫＯＶ−３細胞を死滅させることが知られている他の物質との組み合わせも同様に試験された。本実験では物質としてシスプラチンを使用した。この薬物はＤＮＡにおいて鎖内と鎖間の架橋を生み出すことでＤＮＡ合成を阻害する。タンパク質とＲＮＡの合成も、若干阻害される。結果は、２つの治療形態間での相乗効果と、そして、比較的低濃度で両者が存在することにおける細胞毒性効果の驚くべき増大とを示し、これらは、in vivoでの状況に類似しているはずである。

Ａｎｔｐ−Ｐ２１分子の殺傷能力、並びに殺傷剤であるシスプラチンとのその相乗効果を明確に示すデータセットを図２に示す。

続いて、融合タンパク質をシスプラチン及びタクソールとの組み合わせにおいて試験した。タクソールは、微小管系内の動的平衡を崩壊させ、そして細胞周期の後期Ｇ２期及びＭ期において細胞をブロックして、細胞の複製を阻害する。結果は、前記３つの治療形態の間の相乗効果と、比較的低濃度での薬物と融合タンパク質の存在下での細胞毒性効果の増強を示す。

融合タンパク質の死滅能力と、それ以外の死滅をさせる物質とのその相乗効果とを示すデータを図３に示す。Ａｎｔｐ−Ｐ２１融合タンパク質は、細胞毒性物質であるシスプラチンとタクソールと一緒にインキュベートした場合に細胞死の増大をもたらした。Ａｎｔｐ−Ｐ２１、シスプラチン及びタクソールは、併用した場合に相乗的に働く。

実施例３
腫瘍無しのマウスにおける、精製され、放射性標識がされたアンテナペディアタンパク質（単独）の動力学及び生体内分布を試験した。これは、当該タンパク質が血液を介して身体の組織全部に転位するということを示す。結果の要約を図４Ａに示す。

アンテナペディアタンパク質は、迅速な初期クリアランス(initial clearance)を有するようであったが、循環血液から取り除かれるのに１５時間以上かかった。この挙動は、正電荷タンパク質に起因することが予測される。この間隔は、血管から出て行き、そして組織に蓄積するのに十分な時間を与えるはずである。マウスの全ての器官と組織を解剖して別々にし、そして計数した結果、器官と血液の比率及び種々の器官におけるタンパク質の蓄積が算出された（図５Ａに示すとおり）。

前記タンパク質は、何らかの特定の組織の型について親和性を有していなかった。これは、高度に血管新生した組織において蓄積するようであった。

続いて、腫瘍のないマウスにおいて、精製され、放射性標識がなされたアンテナペディアＰ２１融合タンパク質の動力学及び生体内分布を試験した。結果を図４Ｂ及び５Ｂに示す。融合タンパク質は、迅速な初期クリアランスを有しているようであったが、循環から完全に除去されるのには１７時間超かかるようであった（図４Ｂ）。この挙動は、前記アンテナペディアタンパク質のみを試験した場合に観察されたものと類似しており、そして正電荷タンパク質に由来することが予測された。この間隔は、血管から出て行き、そして組織に蓄積するのに十分な時間を与えることが予測された。マウスの全ての器官と組織を解剖して別々にし、そして計数した後、図５Ｂに示すように、器官と血液の比率を算出し、前記タンパク質の生体内分布をプロットすることが可能となった。

前記融合タンパク質は、予測どおり、何らかの特定の型の組織について親和性を有していなかった。これは、高度に血管新生した組織において蓄積するようであった。抗タンパク質抗体（抗ＨＩＳ抗体−Ｑｉａｇｅｎ）で染色することで前記タンパク質を前記組織内で位置づけることを可能にする実験を実施した。これらの免疫組織化学研究は、凍結組織切片上で実施した。

結果は、前記融合タンパク質が主要な器官で蓄積したこと（表１）、そして完全長の分子として見られたことを示した。前記分子の挙動は、実際の腫瘍において大量に蓄積していたことを除き、担癌マウスにおいて本質的に未変化のままのようである。

続いて、担癌マウスにおいて１つの実験を行い、これは、腫瘍においてタンパク質が蓄積する最適の時間、延いては融合タンパク質が血液循環から出て行って、そして隣接組織に進入するのにかかる時間を示した。この情報は、反復投与及び各投与間の間隔を関連付けるための実験を設計する場合に望ましい。

放射性標識融合タンパク質を、尾静脈を介した単回投与として担癌マウスに投与し、そして腫瘍を種々の時点で試験した。結果は、腫瘍の局在化の最適時間が投与から３時間後であったことを示した。この期間の後、染色強度、延いてはタンパク質量が低下した。結果は、以下の表に選択的に示す。

担癌雌マウスに安全に投与することができる最大耐量を続いて試験した。３つの異なる濃度の融合タンパク質を、コントロールと同様に、静脈内及び腫瘍内の両方から試験した。動物は、苦痛及び毒性の兆候についてモニタリングされ、そして腫瘍の直径、マウスの体重及び白血球数の測定値が記録された。２．５ｍｇ／ｍｌの濃度の融合タンパク質は、使用可能な最高の値を繰り返し示し、毒性の効果は示さなかったので、当該タンパク質を次の研究に使用した。

ＳＫＯＶ３卵巣腺癌担持異種移植片を使用した。アンテナペディアＰ２１処理動物は８匹の動物の大集団に含まれ、そして当該実験には、コントロール、例えば生理食塩水を受ける８匹の動物、そしてアンテナペディアタンパク質のみを漸増用量で受けている８匹の動物を含めた。一週間に６回の注射を実施した。図６の０日は、注射の初日である。

結果は、前記融合タンパク質が最大の腫瘍の遅れのプロファイルを証明したことを示した。２．５ｍｇ／ｍｌの融合タンパク質の濃度は、最大の有効性の示すものであることが示された。結果を更に解析した場合、本発明の治療剤の作用形態を更に支持した生存プロファイルが同定された。腫瘍サイズと、そして開始時に小さな腫瘍を有する動物を開始時により大きな腫瘍を有する動物と切り離して見ることで動物を分類した場合、小さな腫瘍の動物における治療の利益が、より大きな腫瘍を有する動物よりも高いことに注目すべきである。タンパク質の調製及び治療効果は、より小さな腫瘍において改善されることが示された。この背後にある論拠は、間質圧が大きな腫瘍のコアにおいてより高く、そしてその環境が標的とされていない分子が侵入するのがより困難であることにある。従って、治療上の利益は、より低い間質圧を有するより小さい腫瘍においてより高い。

この理論は、カプラン−マイヤーのデータで証明される。全ての動物を一まとめにして解析した結果、図７に示すとおり、最高濃度で融合タンパク質を受けている群に対しては明確な生存の利益が与えられる。

常用の化学療法薬であるシスプラチンとタクソールは、標準的な公開されている用量で治療プロトコールに添加された。in vitroで、ポジティブな効果が見られた。結果によると、３つの治療形態間での相乗効果、そして前記薬物と融合タンパク質とが選択した濃度で存在している状態での腫瘍増殖の遅延の増強が示された（図８に示す）。

前記融合タンパク質及び化学療法を受けている動物についてのカプラン−マイヤー生存曲線を図９に示す。最良の生存の利益が、融合タンパク質及び化学療法の補助の両方を受けている動物により証明されたことは明らかである。

融合タンパク質を受けている動物の生存曲線対融合タンパク質＋化学療法の補助を受けている動物の生存曲線とを図１０において比較した場合、化学療法を追加することで、全ての時点で動物の生存率が増大したことは明らかである。これにより、in vitroでの結果がin vivoで観察された状況とよく相関していることが証明された。

実施例４
ＳＫＯ−Ｖ３腫瘍の実験の後、融合タンパク質であるアンテナペディア−Ｐ２１は、結腸癌ＲＫＯ−Ｅ６細胞を異種移植したヌードマウスにおいて試験した。これらの細胞は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の制御下で安定的に組み込まれたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６発癌遺伝子を含む。ＨＰＶ Ｅ６発癌遺伝子は、この系がかなりの機能的ｐ５３を欠くまで、正常なｐ５３レベル及び機能の低下をもたらす。

ｐ５３を欠いていることで、標的遺伝子、例えばＣｄｋ−阻害剤Ｐ２１の下流ｐ５３媒介転位が阻止される。Ｐ２１の発現は、Ｒｂのリン酸化の阻害をもたらし、その結果、Ｅ２Ｆ−依存遺伝子のその後の発現が阻止される。

ＲＫＯ−Ｅ６細胞系は、細胞性パラメーター、例えばｐ５３媒介転写及びアポトーシスに対するｐ５３の損失の効果を研究するためにしばしば使用されてきた。ここに記載する実験においては、Ｐ２１を細胞に投与する、延いてはｐ５３を活性化する必要性を回避する効果を研究するために使用した。アポトーシスは、腫瘍の細胞死及び腫瘍サイズの減少として測定する。

ヌードマウスにＲＫＯ Ｅ６腫瘍を異種移植し、４つの群に無作為に割り当て、そして以下のものを尾静脈注射により投与した：
ｉ．リン酸緩衝溶液（一週間に一回、５週間）
ｉｉ．２．５ｍｇ／ｍｌアンテナペディア−Ｐ２１融合物（一週間に一回、５週間）
ｉｉｉ．２ｍｇの５−フルオロウラシル／１ｍｇのロイコボリン、０．２ｍｇのオキサリプラチン（一週間に一回、５週間）
ｉｖ．２．５ｍｇ／ｍｌのアンテナペディア−Ｐ２１融合物＋２ｍｇの５−フルオロウラシル／１ｍｇのロイコボリン、０．２ｍｇのオキサリプラチン（一週間に一回、５週間）

化学療法薬は、予め文書にした用量で投与されることで、測定可能なほどの腫瘍の減少をもたらした。腫瘍の緩解を評価して、これを延命効果に翻訳した。

結果を図１１に示す。ＰＢＳ、融合タンパク質又は化学療法単独による治療は、これらの全ての群について、生存期間の中央値が３０日の範囲であり、全生存に対しほとんど効果がなかった。前記融合物と化学療法との併用で処理された動物においては、生存期間の中央値が４５日と、生存における著しい改善が観察され、これは相乗効果を証明するものである。

結腸直腸癌に倒れる患者の多くは、二次的な全身性の転位疾患にもそのような症状を有するため、転移性疾患に対して効果を有することがある治療ストラテジーは、この癌に対し、有意な影響を及ぼすことが必要とされる。アンテナペディア−Ｐ２１融合タンパク質は、投与すると種々の組織に蓄積されることがこれまで証明されており、また、その適用が用量依存性の毒性によって制限されないことが証明されているため、かかる効果を有することが予想される。

図面を参照して本発明を以下説明する。

図１は、ヒトの体内環境に類似の条件下で、９６穴ＥＬＩＳＡディッシュにおいて生育した、ＳＫＯＶ−３の卵巣癌細胞系及びＳＡＯＳ−２の骨肉腫系に投与したアンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質の細胞毒性を示す。 図２は、アンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質の細胞毒性と、シスプラチン、及びＳＫＯＶ−３細胞とのその相乗効果を示す。 図３は、アンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質と、シスプラチン及びタクソールとの併用によるＳＫＯＶ−３細胞に対する細胞毒性を示しており、これはアンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質と、シスプラチン及びタクソールとが併用した場合に、相乗効果することを示している。 図４Ａは、腫瘍が無い細胞において、精製され、放射性標識されたアンテナペディアタンパク質（４Ａ）が血液からクリアランスされることを示す。 図４Ｂは、腫瘍が無い細胞において、精製され、放射性標識されたアンテナペディア−Ｐ２１融合タンパク質（４Ｂ）が血液からクリアランスされることを示す。 図５Ａは、アンテナペディアタンパク質（５Ａ）についての、器官対血液の比率と、種々の器官におけるタンパク質蓄積とを示す。 図５Ｂは、アンテナペディア−Ｐ２１融合タンパク質（５Ｂ）についての、器官対血液の比率と、種々の器官におけるタンパク質蓄積とを示す。 図６は、及びアンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質を用いた、腫瘍の増殖の減少を示す。 図７は、カプラン−マイヤーの生存曲線を示しており、これはマウスの生存が、アンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質をその最高濃度で受けている場合に最高であることを示している。 図８は、アンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質、タクソール及びシスプラチンを用いた場合のin vivoでの相乗効果を証明するものである。 図９は、アンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質及び化学療法を受けているマウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示すものである。ここで、最良の延命効果が当該融合タンパク質及び化学療法の補助の両方を受けている動物によって証明されていることは明らかである。 図１０は、アンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質を受けているマウスと、シスプラチンとタクソールも受けている動物のカプラン−マイヤー生存曲線を示す。 図１１は、アンテナペディア／Ｐ２１融合タンパク質と、更に化学療法を受けているマウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。

Claims (4)

1. （ｉ）ａ）配列番号１で規定されているアミノ酸配列から成るＰ２１タンパク質、又は配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、且つ天然のＰ２１タンパク質の機能を有するそのホモログ、を含んで成る第一領域；及び
   ｂ）配列番号３で規定されているアミノ酸配列から成るアンテナペディアホメオドメインを含んで成る第二領域、
   を含んで成るコンジュゲート；及び
   （ｉｉ）化学療法薬、
   を含んで成り、前記機能が腫瘍抑制タンパク質として作用し、そしてｃｙｃ／ＣＤＫ４複合体の形成を阻止し、それにより真核生物細胞のＧ１期停止を生じさせる能力である、組成物。
2. 前記コンジュゲートが融合タンパク質の形態である、請求項１に記載の組成物。
3. 薬剤として使用するための請求項１又は２に記載の組成物。
4. 癌の治療のための医薬の製造のための、請求項１又は２に記載の組成物の使用。

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