TW202323269A - 方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供了用於蛋白質純化之方法。所揭露的方法有助於避免沈澱事件，並可用於改善蛋白質純化方案的性能和/或效率。該等方法可用於改善或製備用於蛋白質純化和/或蛋白質提取製程的溶液。所揭露的方法的一個特別應用係在親和層析法中，該等方法可以應用於該親和層析法中加載溶液的製備。

Description

方法

本發明提供了用於蛋白質純化之方法。所揭露的方法有助於避免沈澱事件，並可用於改善蛋白質純化方案的性能和/或效率。該等方法可以特別應用於親和層析法中。

用於醫藥的蛋白質和肽通常由重組系統製備。在這樣的情況下，通常需要從複雜的混合物中純化和/或提取有用的蛋白質或肽。需要靈敏且可靠的純化方法以確保能夠將靶蛋白質和肽純化到合適的產量和純度。

可以使用任何數量的不同的且已知的技術來純化特別的（或靶）蛋白質或肽。親和層析法代表了將特定的靶蛋白質/肽提取至高純度的特別準確、可靠且靈敏的方法。然而，該等技術的效率和性能容易受到沈澱事件的影響。

本揭露旨在提供可用於最大程度減少該等沈澱事件並進而改善純化的蛋白質的產量和純度之方法和技術。

本揭露提供了可改善或製備用於蛋白質純化和/或蛋白質提取製程的溶液之方法。

為避免疑義，溶液可含有溶劑和溶質；溶質組分可包含一或多種蛋白質或肽。因此，本文所述之方法可應用於含有一或多種蛋白質或一或多種肽的溶液。

出於方便並且如本文所用，術語「蛋白質」也應被認為包括可另外被稱為「肽」的較短分子。因此，包含蛋白質的溶液可以例如包含一或多種蛋白質和/或一或多種肽。

溶液（特別是含有一或多種蛋白質的溶液）易受沈澱事件的影響或易於發生沈澱事件。例如，當溶液的溶劑組分的溶劑化勢（solvation potential）改變時，可以發生沈澱。不希望受理論的束縛，溶劑化勢的改變可以降低溶質（例如蛋白質和/或肽）的溶解度，導致一些溶質沈澱。

向溶液中添加一或多種試劑可以改變溶液的溶劑化勢。另外或可替代地，改變溶液的pH、溫度和/或組成也可改變其溶劑化勢。

鑒於上述情況，響應於試劑的添加和/或對溶液pH、溫度和/或組成的改變，可發生蛋白質從溶液中沈澱。

本文所述之方法可應用於含有一或多種用於純化或提取的蛋白質的溶液。在下文中，術語「純化」將用於描述所有蛋白質/肽純化和/或提取製程/事件。

一或多種用於純化的蛋白質可稱為「一或多種靶蛋白質」。應當理解，術語「靶蛋白質」係指從溶液中選擇性提取和/或純化的任何蛋白質（或肽）。可以從其他溶質（例如一或多種其他蛋白質）的簡單或複雜混合物中純化或提取任何給定的靶蛋白質。例如，可以從含有一或多種蛋白質的同質或異質混合物的溶液中純化或提取一或多種靶蛋白質。

溶液中存在的靶蛋白質的量可以變化。例如，本文所述之任何溶液（包括例如下文所述之任何加載溶液）可以包含約0.01 mg/ml蛋白質至0.50 mg/ml任何給定的靶蛋白質。例如，本揭露的溶液可以包含約0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL、0.06 mg/mL、0.07 mg/mL、0.08 mg/mL、0.09 mg/mL、0.10 mg/mL、0.11 mg/mL、0.12 mg/mL、0.125 mg/ml、0.13 mg/mL、0.14 mg/mL、0.15 mg/mL、0.16 mg/mL、0.17 mg/mL、0.175 mg/ml、0.18 mg/mL、0.19 mg/mL、0.20 mg/ml、0.25 mg/ml、0.25 mg/mL、0.275 mg/mL、0.30 mg/mL、0.325 mg/mL、0.35 mg/mL、0.375 mg/mL、0.40 mg/mL、0.425 mg/mL、0.45 mg/mL或約0.475 mg/mL的任何給定的靶蛋白質。例如，本揭露的溶液可以包含約0.07至約0.138 mg/ml的靶蛋白質。在一個教導中，本揭露的溶液可以包含約0.09 mg/ml的靶蛋白質。

溶液的總蛋白質含量（即本揭露的溶液中所有蛋白質（包括任何靶蛋白質）的總量）也可以變化，並且可以在約0.5至約2 mg/ml的範圍內，例如約0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/m、1.0 mg/ml、1.1 mg/ml、1.2 mg/ml、1.3 mg/ml、1.4 mg/ml、1.5 mg/ml、1.6 mg/ml、1.7 mg/ml、1.8 mg/ml或1.9 mg/ml。總蛋白質含量可以為約0.7至1.8 mg/mL。在一個實施方式中，總蛋白質含量可為1.3 mg/ml。

可以藉由多種不同的技術從溶液（包括包含蛋白質的異質或同質混合物的溶液）中提取或純化蛋白質。例如，可以使用粒徑排阻層析法、疏水交互作用層析法、離子交換層析法、自由流電泳、親和層析法和高效液相層析法（HPLC）來純化或提取蛋白質。

舉例來說，親和層析法係一種基於靶蛋白質與配體之間的相互作用的分離技術。典型地，親和層析法利用偶合至對一或多種靶蛋白質具有特異性的配體的樹脂或基質。配體可為例如抗體或凝集素。親和純化技術往往非常特異，但也易於發生非特異性結合事件並通過沈澱的溶質發生堵塞；這降低了該製程的總體效率和所得物的純度。

本文所述之方法可應用於旨在在蛋白質純化程序（例如層析法或親和層析製程）中採用的溶液。例如，待經受本文所述之方法的溶液可以含有一或多種靶蛋白質並且可以用於加載到親和層析柱上。該類型的溶液可稱為「加載溶液」。

待從中提取或純化一或多種靶蛋白質的加載溶液也可能需要優化以減少與例如非特異性結合（例如，如加載溶液內的非靶溶質與層析柱的（親和性）基質之間可能發生的）和溶質沈澱（包括靶蛋白質沈澱）相關的問題。熟悉該項技術者將認識到，加載溶液優化可確保所選純化/提取製程的最大蛋白質產量和純度和/或適當的功能。

為避免疑義，術語「蛋白質產量」係指從純化或提取程序中獲得的靶蛋白質的量。很多因素都影響產量；例如，如果加載溶液表現出一或多種溶質的沈澱，則產量可能低於預期。

術語「純度」涉及任何獲得的餾分中的污染水平。含有一或多種靶蛋白質的餾分應含有盡可能低的污染水平。非靶溶質（例如非靶蛋白質）可代表不想要的污染物。純的或基本上純的餾分可含有低或無法檢測的污染水平。本文所述之方法可用於幫助降低任何給定餾分（特別是含有一或多種靶蛋白質的那些餾分）中的污染水平。

鑒於上述情況，高效的蛋白質純化方法係產生足量的靶蛋白質純度和可接受的污染水平之方法。

待從中提取或純化一或多種靶蛋白質的溶液可能需要在送入純化程序之前進行優化；任何優化都需要確保選擇的純化程序給出合適產量和純度的一或多種靶蛋白質。

優化方案可以包括例如在將溶液送入選擇的純化程序之前調節該溶液的組成和/或pH。

在一些情況下，優化方案本身可以誘導蛋白質沈澱。換句話說，確保純化/提取程序的最佳性能以及純度和產量的參數有時與最大程度減少非特異性結合事件和溶質（包括靶蛋白質）沈澱的那些參數相反。事實上，蛋白質沈澱有時作為優化加載溶液所使用的（並且是必要的）方案的結果而發生。

本揭露提供的方法允許優化含有靶蛋白質的溶液用於純化製程，但同時減少或最大程度減少優化製程導致溶質（即靶蛋白質）沈澱的風險。

此外，此處所述之方法允許在純化程序中針對最大效率、純度和產率優化加載溶液，同時避免與先前技術的優化技術相關的那些沈澱事件。

熟悉該項技術者將認識到，允許優化加載溶液但降低溶質沈澱風險的任何方法都將有助於提高靶蛋白質產量、該產量的純度和純化設備（例如純化柱）的使用壽命。

不希望受理論的束縛，具備該等優點係因為本文所述之方法有助於將蛋白質保留在溶液中，這防止了設備（例如層析法和親和層析法程序中使用的柱）堵塞，並且還減少了非特異性結合。

因此，在第一方面，提供了一種防止從溶液中沈澱之方法，所述方法包括使該溶液與一定量的聚山梨醇酯接觸。

術語「聚山梨醇酯」可包括衍生自用脂肪酸酯化的乙氧基化山梨醇酐（山梨醇的衍生物）的相關類別的油性液體乳化劑的所有成員。術語聚山梨醇酯可進一步包括聚山梨醇酯20（PS20）、聚山梨醇酯40（PS40）、聚山梨醇酯60（PS60）和聚山梨醇酯80（PS80）。術語「聚山梨醇酯」可包括例如商標名為Kolliphor、Scattics、Alkest、Canarcel和Tween的那些已知化合物。

在又另外的方面，提供了一種防止從溶液中沈澱之方法，所述方法包括使該溶液與一定量的聚山梨醇酯20（PS20）接觸。

溶液可以包含一或多種溶質。

溶質可以包含一或多種蛋白質。

溶質可以包含一或多種靶蛋白質——即待從溶液中提取或純化的一或多種蛋白質。

在某些條件下，一或多種溶質（例如一或多種蛋白質（包括一或多種靶蛋白質））可從溶液中沈澱。本文所述之方法可用於防止、減少或抑制溶質從溶液中沈澱。事實上，本文所述之方法可用於防止、減少或抑制溶質在通常預期可能會誘導沈澱的條件下從溶液中沈澱。

溶液可為加載溶液。因此，本文所述之方法可用於防止從加載溶液中沈澱，所述方法包括使該加載溶液與一定量的聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20（PS20））接觸。

例如，所揭露的方法可用於防止一或多種蛋白質從加載溶液中沈澱並且/或者防止一或多種靶蛋白質從加載溶液中沈澱。該類型的方法可以包括使加載溶液與一定量的聚山梨醇酯（例如，聚山梨醇酯20（PS20））接觸。此外，即使當優化溶液（例如，加載溶液）用於層析法或親和層析製程中時，該等方法也可以防止或減少沈澱事件。

然而，聚山梨醇酯（包括PS20）產生的自由基可能會增加用於純化的靶蛋白質的氧化。現在已證明選擇特定的聚山梨醇酯濃度和/或孵育時間會降低這樣的氧化事件的風險。

可以向溶液（例如加載溶液）中添加聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20），使得該溶液中聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20）的最終濃度為約0.1%至5%（% w/v）。例如，可以添加聚山梨醇酯（包括聚山梨醇酯20），使得溶液中聚山梨醇酯（例如聚山梨醇酯20）的最終濃度為約0.2%、約0.3%、約0.4%、約0.5%、約0.6%、約0.7%、約0.8%、約0.9%、約1.0%、約1.1%、約1.2%、約1.3%、約1.4%、約1.5%、約1.6%、約1.7%、約1.8%、約1.9%、約2%、約2.1%、約2.2%、約2.3%、約2.4%、約2.5%、約2.6%、約2.7%、約2.8%、約2.9%、3.0%、約3.1%、約3.2%、約3.3%、約3.4%、約3.5%、約3.6%、約3.7%、約3.8%、約3.9%、約4.0%、約4.1%、約4.2%、約4.3%、約4.4%、約4.5%、約4.6%、約4.7%、約4.8%和約4.9%（所有濃度均為% w/v）。

在本揭露的語境中，術語「約」可以意指 ± 0.05%（% w/v）的聚山梨醇酯/聚山梨醇酯20（在溶液中）的最終濃度。

本文所述之方法可以使用最終濃度（在溶液中）為0.1%、0.25%、0.5%、0.75%或1.0%（% w/v）的聚山梨醇酯/聚山梨醇酯20。

一旦已向溶液中添加了聚山梨醇酯（包括聚山梨醇酯20），就將該聚山梨醇酸酯或PS20/溶液混合物在合適的溫度下孵育預定長度的時間。

可以將聚山梨醇酯或PS20/溶液混合物孵育約1 min至2小時之間的任何時間。例如，可以將PS20/溶液混合物孵育約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約70分鐘、約80分鐘、約90分鐘、約100分鐘、約110分鐘或約115分鐘。在孵育時間長度的語境中，術語「約」可以意指 ± 5 min。例如，可以將聚山梨醇酯或PS20/溶液混合物孵育15至25分鐘之間的任何時間（例如20分鐘）。

可以將聚山梨醇酯或PS20/溶液混合物在約10°C至30°C之間的任何溫度下孵育。例如，可以將聚山梨醇酯或PS20/溶液混合物在約11°C、約12°C、約13°C、約14°C、約15°C、約16°C、約17°C、約18°C、約19°C、約20°C、約21°C、約22°C、約23°C、約24°C、約25°C、約26°C、約27°C、約28°C或約29°C的溫度下孵育。在孵育溫度的語境中，術語約可以意指± 2°C。可以將聚山梨醇酯或PS20/溶液混合物在約21°C至25°C之間的任何溫度（例如23°C）下孵育。

可以向溶液或加載溶液中添加聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20至最終濃度為0.5%（% w/v），並將聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20/（加載）溶液混合物在23°C ± 2°C下孵育20 ± 5分鐘。

如所說明的，可以使溶液（例如加載溶液）經受一些優化方案，然後使其經受純化（例如層析法）製程。選擇用於優化的參數可為對來自蛋白質/肽純化製程（加載溶液被送入其中）的靶蛋白質的效率和/或產量具有一些作用的那些。事實上，用於優化的方案以及溶液的一或多個參數的相關變化可導致加載溶液內的蛋白質聚集和/或集聚，並最終導致沈澱。

可以改變加載溶液的pH，使得其對於親和純化製程係最佳的。對於蛋白質純化製程而言最佳的pH對於加載溶液中的一些或所有蛋白質（包括一些或所有靶蛋白質）的溶解度而言可能是次佳的。因此，作為優化方案的一部分，改變pH可能具有導致加載溶液中的一或多種蛋白質或肽沈澱的作用。

用於蛋白質純化程序（例如基於層析法的純化程序）的溶液（或加載溶液）的最佳pH可以根據溶液的性質、待純化的蛋白質和/或待使用的蛋白質純化程序的特別情況而變化。例如，最佳pH可以在pH 4、pH 4.5、pH 5、pH 5.5、pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 8.5、pH 9或pH 9.5的範圍內。因此，優化可涉及將溶液從一個pH（例如次佳pH）調節（藉由例如滴定）到另一最佳pH。

還可以改變溶液（例如加載溶液）的電導率，使得其對於親和純化製程係最佳的。電導率係指溶液的比電導，並且以單位毫西門子（mS）報告。對於蛋白質純化製程而言最佳的電導率對於加載溶液中的一些或所有蛋白質（包括一些或所有靶蛋白質）的溶解度而言可能是次佳的。因此，作為優化方案的一部分，改變電導率可能具有導致加載溶液中的一或多種蛋白質或肽沈澱的作用。

用於蛋白質純化程序（例如基於層析法的純化程序）的溶液（或加載溶液）的最佳電導率可以根據溶液的性質、待純化的蛋白質和/或待使用的蛋白質純化程序的特別情況而變化。例如，最佳電導率可以在8 ± 2 mS/cm、9 ± 2 mS/cm、10 ± 2 mS/cm、12 ± 2 mS/cm、14 ± 2 mS/cm、16 ± 2 mS/cm、18 ± 2 mS/cm、20 ± 2 mS/cm、22 ± 2 mS/cm或24 ± 2 mS/cm的範圍內。因此，優化可涉及將溶液從一個電導率（例如次佳電導率）調節到另一最佳電導率。

雖然單獨改變溶液（例如加載溶液）的pH和/或電導率可能帶來一定水平的蛋白質/肽沈澱，但同時改變pH和電導率兩者的作用可能是顯著的，並且溶液中更多的一或多種蛋白質和/或肽可能會沈澱。

鑒於上述情況，提供了一種防止加載溶液中的蛋白質沈澱之方法，所述方法包括使加載溶液與一定量的聚山梨醇酯接觸。此外，提供了一種防止加載溶液中的蛋白質沈澱之方法，所述方法包括使加載溶液與一定量的聚山梨醇酯20（PS20）接觸。

應注意，術語「防止」可包括在從加載溶液沈澱的情況下相比於從未經受本揭露的方法（即未與聚山梨醇酯/聚山梨醇酯20（PS20）接觸）的加載溶液沈澱的速率或量的任何減少。

可以優化加載溶液（向其中添加了一定量的聚山梨醇酯或PS20）用於親和層析製程。

舉例來說，可能需要優化加載溶液的pH。

另外或可替代地，可能需要優化加載溶液的電導率。

所揭露的方法可以確保緊接在蛋白質純化製程（例如親和層析製程）中使用加載溶液之前，一或多種靶蛋白質或肽至少完全或部分保持在溶液中。

應注意，可以在已經（或將要）向待經受本揭露的方法的溶液（例如加載溶液）應用優化方案之前、期間或之後，使該溶液與一定量的聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20（PS20：量在上面闡述）接觸。本揭露的方法可以進一步包括在應用溶液或使溶液經受純化製程之前，使該溶液與一定量的聚山梨醇酯/PS20接觸。

因此，本揭露提供了一種防止加載溶液中的靶蛋白質沈澱的方法，該沈澱響應於優化該加載溶液用於蛋白質純化方案，所述方法包括使該加載溶液與一定量的聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20（PS20）接觸，然後優化該加載溶液用於蛋白質純化方案。

一種用於防止加載溶液中的靶蛋白質沈澱之方法，該沈澱響應於優化該加載溶液用於蛋白質純化方案，該方法可以包括使該加載溶液與最終濃度為上面闡述的任何濃度的聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20（PS20）接觸。例如，可以使加載溶液與最終濃度為0.5%（% w/v）的聚山梨醇酯或PS20接觸，然後優化該加載溶液用於蛋白質純化方案。

使加載溶液與聚山梨醇酯或PS20（例如最終濃度為0.5%（% w/v）的PS20）接觸的步驟可以進一步包括將聚山梨醇酯或PS20/加載溶液混合物在合適的溫度下孵育一段時間以防止蛋白質（例如靶蛋白質）從該加載溶液中沈澱。合適的孵育時間和溫度在上面闡述並且該等適用於此處。例如，可以將聚山梨醇酯或PS20/加載溶液混合物在23°C ± 2°C下孵育20 ± 5分鐘。

本揭露的任何方法可應用於純化糖蛋白之方法中。也就是說，本文所述之用於防止蛋白質沈澱之方法可應用於含有糖蛋白的溶液，該等糖蛋白用於從溶液中純化。所揭露的方法可用於防止（減少或抑制）那些糖蛋白從溶液中沈澱。

在一些情況下，加載溶液可以包含一或多種糖蛋白。事實上，加載溶液中的一或多種糖蛋白可為靶蛋白質。即，加載溶液可以包含待藉由例如基於層析法的技術從加載溶液中純化的一或多種糖蛋白。

術語「糖蛋白」可以包括被稱為促性腺激素的那些蛋白質。例如，術語「糖蛋白」可以包括促濾泡素（FSH）、人絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體化激素（LH）。許多糖蛋白（包括促性腺激素）都用於治療性治療中。例如，促性腺激素（像FSH、LH和hCG）用於治療不孕症。

應注意，術語「糖蛋白」、「FSH」和「hCG」包括所有其同種型和/或重組或天然存在形式。糖蛋白可為例如在宿主細胞中產生的重組糖蛋白，如重組FSH、重組hCG或重組LH。可以提供呈溶液形式的糖蛋白，該等糖蛋白將藉由親和層析法從該溶液中純化或提取。

鑒於上述情況，本文所述之方法可應用於包含一或多種蛋白質的溶液（例如加載溶液），該一或多種蛋白質選自由以下組成之群組： (i)    糖蛋白； (ii)   FSH； (iii)  重組FSH（rFSH）； (iv)  hCG；以及 (v)   重組hCG（rhCG）； 其中該一或多種蛋白質（選自由上面的蛋白質 (i)-(v) 組成之群組）將從該溶液或加載溶液中純化。

蛋白質/糖蛋白可為尿源性的。

糖蛋白可以作為單一同種型或同種型的混合物存在（於溶液例如加載溶液中），如本領域熟知的。因此，待經受純化或提取靶蛋白質之方法的溶液（或加載溶液）可以包含例如一定量的重組FSH或天然存在形式的FSH（例如，其中FSH作為單一同種型或同種型的混合物存在）。

溶液的糖蛋白組分可以代表待提取並且處於沈澱風險中的靶蛋白質。

因此，本揭露提供了一種防止糖蛋白從溶液中沈澱之方法，所述方法包括使包含糖蛋白的溶液與一定量的聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20（PS20）接觸。

另外，本揭露提供了一種防止糖蛋白從溶液中沈澱之方法，該沈澱響應於優化該溶液用於糖蛋白純化方案，所述方法包括使包含糖蛋白的溶液與一定量的聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20（PS20）接觸，然後優化該溶液用於純化該糖蛋白的程序。

如所說明的，含有糖蛋白的溶液的優化可誘導該糖蛋白從該溶液中沈澱。為了最大程度減少「優化誘導的沈澱」事件的風險，用於純化的包含糖蛋白的溶液可以包括使該溶液與最終濃度為上面闡述的任何濃度的聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20（PS20）接觸。例如，可以使溶液與最終濃度為0.5%（% w/v）的聚山梨醇酯或PS20接觸，然後（或同時）可以優化該溶液用於蛋白質純化方案。使溶液與聚山梨醇酯或PS20（例如最終濃度為0.5%（% w/v）的PS20）接觸的步驟可以進一步包括將聚山梨醇酯或PS20/溶液混合物在合適的溫度下孵育一段時間以防止糖蛋白從該溶液中沈澱。合適的孵育時間和溫度在上面闡述並且該等適用於此處。例如，可以將聚山梨醇酯或PS20/溶液混合物在23°C ± 2°C下孵育20 ± 5分鐘。然後可以根據需要優化溶液，然後將該溶液送入（或用於）蛋白質純化程序中。

優化含有糖蛋白的溶液用於純化其中的一或多種糖蛋白的程序可涉及調節溶液的pH和/或電導率。

例如，可以改變溶液（例如加載溶液）的pH，使得其對於糖蛋白溶質的親和純化係最佳的。對於糖蛋白純化製程而言最佳的pH對於溶液/加載溶液中的一些或所有蛋白質（包括糖蛋白）的溶解度而言可能是次佳的。因此，作為優化方案的一部分，改變pH可能具有導致溶液/加載溶液中的一或多種糖蛋白（和/或一或多種其他蛋白質或肽）沈澱的作用。

用於蛋白質純化程序（例如基於層析法的純化程序）的溶液（或加載溶液）的最佳pH可以根據溶液的性質、待純化的糖蛋白和/或待使用的糖蛋白純化程序的特別情況而變化。例如，為了從溶液（例如加載溶液）中純化FSH和/或hCG，最佳pH可以在pH 4、pH 4.5、pH 5、pH 5.5、pH 6、pH 6.5、pH 7、pH 7.5、pH 8、pH 8.5、pH 9或pH 9.5的範圍內。在一個教導中，最佳pH可為pH 8。因此，優化可涉及將用於純化的含有糖蛋白的溶液從一個pH（例如次佳pH）調節（藉由例如滴定）到另一最佳pH。

也可以改變溶液的電導率，使得其對於糖蛋白溶質的親和純化係最佳的（如上面所指出，術語「電導率」係指溶液的比電導，並以毫西門子（mS）為單位進行報告）。對於糖蛋白純化製程而言最佳的電導率對於溶液（或加載溶液）中的一些或所有蛋白質（包括糖蛋白）的溶解度而言可能是次佳的。因此，雖然可能需要改變溶液的電導率以確保其對於選擇的糖蛋白優化製程而言係最佳的，但該優化可能具有導致一或多種糖蛋白（或任何其他蛋白質溶質）沈澱的作用。

用於糖蛋白純化程序（例如基於層析法的純化程序）的溶液（或加載溶液）的最佳電導率可以根據溶液的性質、待純化的糖蛋白和/或待使用的蛋白質純化程序的特別情況而變化。例如，最佳電導率可以在8 ± 2 mS/cm、9 ± 2 mS/cm、10 ± 2 mS/cm、12 ± 2 mS/cm、14 ± 2 mS/cm、16 ± 2 mS/cm、18 ± 2 mS/cm、20 ± 2 mS/cm、22 ± 2 mS/cm或24 ± 2 mS/cm的範圍內。在一個教導中，最佳電導率可為16 ± 2 mS/cm。因此，優化可涉及將溶液從一個電導率（例如次佳電導率）調節到另一最佳電導率。

雖然單獨改變用於純化的含有糖蛋白的溶液（例如加載溶液）的pH和/或電導率可能帶來一定水平的糖蛋白沈澱，但同時改變pH和電導率兩者的作用可能是顯著的，並且溶液中更多的一或多種糖蛋白可能會沈澱。

在糖蛋白係FSH和/或hCG（即，用於純化的溶液包含FSH和/或hCG）的情況下，最佳pH可以在pH 8範圍內，並且最佳電導率可以在16 ± 2 mS/cm範圍內。在優化之前，待從中純化糖蛋白（例如FSH和/或hCG）的溶液可以具有次佳的（高於或低於pH 8）pH和/或（高於或低於16 ± 2 mS/cm）電導率。

用於純化和/或提取的包含糖蛋白並待經受本揭露的方法的溶液（例如加載溶液）的性質和組成可以根據糖蛋白的來源而變化。因此，所需的優化類型的量也將變化。

在糖蛋白係重組的並且在細胞中生成或產生的情況下，獲得包含重組糖蛋白（例如重組FSH和/或hCG）的溶液或加載溶液之方法可以包括提供能夠表現待純化的重組糖蛋白的細胞，在合適的培養基中培養該細胞，然後誘導該重組糖蛋白的表現。然後可以從細胞（經由從該細胞製備的裂解物）和/或培養基（例如藉由例如離心從細胞培養上清液中收穫重組蛋白質）中收穫表現的糖蛋白。在這種情況下，溶液或加載溶液可以包含培養基或衍生自培養基。

培養轉染細胞並誘導其中的異源核酸（或載體）表現的合適方法將是已知的，並且另外的資訊可以獲自例如「Production of Recombinant Proteins: Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems [重組蛋白質的產生：新型微生物和真核表現系統]」: 由Gerd Gellissen博士兼教授編輯; Pub. Wiley [威利出版社] (2004)。

任何合適的宿主細胞都可用於產生重組蛋白質，並且本文所述之重組糖蛋白可使用例如哺乳動物細胞產生。合適的哺乳動物細胞（或細胞系）可以包括例如CHO細胞、PER.C6®細胞（關於PER.C6®細胞的資訊揭露於PCT/EP 2016/064668（公佈為WO 2016/207353）中）、HEK293細胞、HT1080細胞、COS細胞、NOS細胞、SP20細胞等。

可以將細胞系在合適的條件下並在合適的培養基中培養，並且可以從細胞或從培養基中收穫靶蛋白質（例如糖蛋白）。

可以使細胞裂解物和/或培養基經受澄清或過濾方案。該類型的方案可以使用例如深度過濾器。澄清或過濾方案可以幫助淨化或去除可能影響下游製程的污染物。例如，澄清和/或過濾製程可以幫助從細胞培養基中去除宿主細胞蛋白質（HCP）、DNA、潛在的脂質、膠體、細胞碎片、內毒素和其他材料。澄清或過濾步驟可以進一步用於保護下游過濾製程中使用的膜，可能需要該等膜以得到有用的加載溶液。

然後可以進一步加工經過濾和/或澄清的細胞裂解物/培養基以濃縮任何靶蛋白質含量。濃縮的步驟可以通過使用超濾步驟來實現，該超濾步驟被設計為進一步淨化經過濾和/或澄清的細胞裂解物培養基中的另外的低分子量組分（小於 ＜ 10 Kda的組分）。可以使用超濾製程來去除色素等。

熟悉該項技術者將認識到，加載溶液中的非靶蛋白質含量（包括例如任何低分子量化合物或色素）可能會對蛋白質純化或提取製程、特別是基於親和層析法的製程產生不利影響。

可以（視需要）使經過濾/澄清並超濾的細胞培養基經受滅菌程序。例如，可以過濾經過濾/澄清並超濾的細胞培養基以去除污染物。可以使經過濾/澄清並超濾的細胞培養基通過0.2 µm過濾器。

靶蛋白質（例如rFSH或rhCG）的濃度可為例如0.05-2.0 mg/ml。例如，靶蛋白質的濃度可以為約0.06 mg/ml、0.07 mg/ml、0.08 mg/ml、0.09 mg/ml、0.1 mg/ml、0.2 mg/ml、0.3 mg/ml、0.4 mg/ml、0.5 mg/ml、0.6 mg/ml、0.7 mg/ml、0.8 mg/ml、0.9 mg/ml、1.0 mg/ml、1.1 mg/ml、1.2 mg/ml、1.3 mg/ml、1.4 mg/ml、1.5 mg/ml、1.6 mg/ml、1.7 mg/ml、1.8 mg/ml、或約1.9 mg/ml。靶蛋白質濃度可以為約0.4-1.5 mg/mL。

總蛋白質濃度可以為約1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、1.75 mg/ml、2.0 mg/ml、2.25 mg/ml、2.5 mg/ml、2.75 mg/ml、3.0 mg/ml、3.25 mg/ml、3.5 mg/ml、3.75 mg/ml或4.0 mg/ml。經過濾/澄清並超濾的細胞培養基（如上面指出，可以視需要將該培養基滅菌）可以包含或補充有另外的緩衝液和/或賦形劑。例如，經過濾/澄清並超濾的細胞培養基可以包含或補充有甘胺酸（例如100 mM甘胺酸）和/或NaCl（例如50 mM NaCl）。經過濾/澄清並超濾的細胞培養基的pH可以為約9.0 ± 0.2，並且電導率可以為約6 ± 1 mS/cm、或約7 ± 1 mS/cm、或約8 ± 1 mS/cm、或約9 ± 1 mS/cm、或約10 ± 1 mS/cm。

可以使用經過濾/澄清並超濾的細胞培養基（如上面指出，可以視需要將該培養基滅菌）來製備加載溶液。

可以藉由將一定體積的上述（以及視需要滅菌的）經過濾/澄清並超濾的細胞培養基與一定體積的另一「加載儲備溶液」組合來製備加載溶液。

加載儲備溶液可以包含例如某些賦形劑、稀釋劑和/或緩衝液。例如，加載儲備溶液可以包含一定量的Tris和NaCl。例如，加載儲備溶液可以包含0.8 M的Tris和3 M的NaCl。加載儲備溶液的pH可以為約8.3，例如pH 8.3 ± 0.2。加載儲備溶液的電導率可以為約164 mS/cm，例如164 ± 2 mS/cm。

可以向每升上述（以及視需要滅菌的）經過濾/澄清並超濾的細胞培養基中添加一定體積（例如40 ml）的加載儲備溶液以提供組合溶液，該組合溶液為加載溶液。可以用例如1 M HCl將所得加載溶液的pH調節至pH 8.0 ± 0.2。加載溶液的電導率可以為16 ± 2 mS/cm。可以優化用於純化的經製備並含有糖蛋白的溶液/加載溶液，使得加載溶液可以用於設計為純化靶（重組）糖蛋白的製程中。如所說明的，優化該類型的加載溶液的行為（藉由調節溶液的一或多個參數）可能誘導蛋白質沈澱（包括糖蛋白沈澱），這可能對蛋白質純化程序的產量和純度產生不利影響。本文所述之方法（在優化方案之前、期間或之後）使溶液或加載溶液與一定量的PS20接觸，該等方法可以防止、抑制並且/或者減少該等沈澱事件。

應注意，可以確定用於純化的任何溶液或加載溶液（包括含有（重組）糖蛋白的那些）的pH和/或電導率，並應用任何優化（以使pH和/或電導率在可接受的且最佳的參數內）。在實施任何確定的優化要求之前，可以使溶液與一定量的PS20接觸以最大程度減少優化誘導的沈澱事件的風險。

鑒於上述情況，純化或提取重組蛋白質之方法可以包括： 獲得或提供包含該重組蛋白質的溶液； 向該溶液中添加聚山梨醇酯或聚山梨醇酯20；以及 將該溶液加載到設計為純化或提取該重組蛋白質的親和層析柱上。

重組蛋白質可為重組FSH或重組hCG。

該方法可以進一步包括確定該溶液的pH和/或電導率的步驟。如果確定溶液的pH和/或電導率係次佳的，則可以添加一定量的聚山梨醇酯或PS20，然後優化該溶液，使得該pH和/或者電導率係最佳的。

用於製備重組糖蛋白（包括例如重組FSH和重組hCG）之方法描述於WO 2009/127826、WO 2013/020996、WO 2016207353和WO 2011042688中，並且將所有該等文件的全部內容藉由引用併入本文。在該等方法使用蛋白質純化程序（例如層析法和/或親和層析法程序）來提取重組FSH和/或hCG的程度上，可以使待使用的任何加載溶液經受本發明之方法。例如，可以使加載溶液與揭露的量的PS20接觸，使得其可以經優化用於純化程序，最大程度減少優化程序誘導（FSH和/或hCG）沈澱事件的風險。

本文揭露了一種防止、減少或抑制優化誘導的FSH和/或hCG從溶液中沈澱之方法，所述方法包括使該溶液與一定量的PS20接觸。PS20的量足以在整個優化方案中將FSH和/或hCG保留在溶液中。

熟悉該項技術者將認識到，純化的蛋白質可以存在於從層析製程收集的一或多個餾分中。任何給定餾分中的靶蛋白質的量可以變化，其中一些餾分比其他餾分含有更多的靶蛋白質。為了增加收集的靶蛋白質的量，可以合併餾分。可以使收集的和/或合併的餾分經受另外的純化和/或濃縮方案。

從蛋白質純化製程（例如親和層析製程）獲得的餾分可藉由合併進一步加工，以組合包含一或多種靶蛋白質的餾分並且/或者增加一或多種靶蛋白質的濃度。

現在將參考以下實例描述本發明。 實例 1 PS20 優化實驗以實現最佳條件

在證明QS層析法有能力去除潛在的包膜病毒之前，有一個專門的步驟用於滅活包膜病毒，其中將收穫物-AD與最終濃度為1%（% w/v）的PS20一起添加，隨後在23°C ± 2°C下孵育1 h。請注意，術語「收穫物-AD」通常包括從蛋白質純化/提取方案中收穫的材料。該材料可以包含如本文所定義的加載溶液（該加載溶液包含一或多種靶蛋白質用於純化/提取）。在一個實施方式中，「收穫物-AD」係從任何一或多個超濾/滲濾步驟產生的材料——術語「AD」係指「滲濾後」。 PS20 作為增溶劑：

可以加載pH 8且電導率為16 ± 2 mS/cm的含有例如rhCG的親和加載物（或「加載溶液」）。較低的電導率可以允許非特異性蛋白質結合到樹脂上並阻斷與rhCG的結合位點；如果該非特異性結合係不可逆的，則rhCG的能力或產量將隨時間下降。

可以從收穫物-AD製備pH 9.0且電導率為約5 mS/cm的親和加載物。

當將收穫物-AD的pH滴定至8.0並將電導率升高至16 ± 2 mS/cm（= 親和加載物）時，在無PS20（例如，最終濃度為1%（% w/v））的情況下，出現蛋白質沈澱（參見下面的結果）。

當在調節pH和電導率之前將收穫物-AD與最終濃度為1%（% w/v）的PS20一起添加並在23°C ± 2°C下孵育1 h時，沒有沈澱。因此，PS20有助於防止親和加載物中的蛋白質沈澱。

開展實驗以找到獲得穩定化的親和加載物（pH 8.0和16 ± 2 mS/cm）所需的最小PS20濃度。

在發現將PS20添加至0.5%（% w/v）的最終濃度產生穩定的親和加載物後，將孵育時間從1 h減少至20 min，並且親和加載物中沒有出現沈澱（數據未顯示）

然而，PS20產生的自由基可能增加靶蛋白質的氧化（在本實例中係rhCG的氧化）。因此，減少PS20的濃度和孵育時間將降低這樣的氧化事件的風險。

實驗表明，PS20的最終濃度為0.5%（% w/v）並且孵育時間/溫度為23°C ± 2°C下20 ± 5 min有助於減少靶蛋白質（例如rhCG）從加載溶液中沈澱，並降低添加PS20導致的氧化事件的風險。 H-AD ：係一種含有 rhCG 的收穫物，其體積濃縮平均 50 倍（最小 - 最大範圍在 37-66 倍之間），含有 0.8 mg/mL （最小 - 最大範圍在 0.4-1.5 mg/mL 之間）的平均 rhCG 濃度和 3 mg/mL （最小 - 最大範圍在 2-5 mg/mL 之間）的平均總蛋白質濃度（根據 Bradford ）。 H-AD 稀釋劑由 100 mM 的甘胺酸、 50 mM 的 NaCl （ pH 9.0 ± 0.2 ， 6 ± 1 mS/cm ）組成。 實驗 1

步驟 1	含有 rhCG 的收穫物：[pH 7.2，13.5 mS/cm]：（20 μg/mL rhCG，163 μg/mL Bradford）
步驟 2	由帶正電深度過濾器進行收穫物澄清
步驟 3	10 kDa UF1 （超濾）
步驟 4	在100 mM甘胺酸 + 50 mM NaCl中的 收穫物 -AD （ = H-AD ），pH 9.13，5.06 mS/cm：體積：3.257 L，A 280：5.208，Bradford：4.93 mg/mL，rhCG：0.910 mg/mL
	1	2	3	4	5	6	7	8
步驟 4a	40 mL H-AD	40 mL H-AD	40 mL H-AD	40 mL H-AD	40 mL H-AD	40 mL H-AD	40 mL H-AD	40 mL H-AD
步驟 4b	添加40 mL的[0.8 M Tris，3 M NaCl]溶液/1 L H-AD。 調節至 pH 8.0 和 16 mS	↓	↓	↓	↓	↓	添加5 M NaCl。 調節至 pH 9.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	添加5 M NaCl。 調節至 pH 8.5 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]
步驟 4c	↓	添加20%的PS20至最終 0.1% PS20孵育1 h，23°C，伴隨攪拌	添加20%的PS20至最終 0.25% PS20孵育1 h，23°C，伴隨攪拌	添加20%的PS20至最終 0.5% PS20孵育1 h，23°C，伴隨攪拌	添加20%的PS20至最終 0.75% PS20孵育1 h，23°C，伴隨攪拌	添加20%的PS20至最終 1% PS20孵育1 h，23°C，伴隨攪拌	↓	↓
步驟 4d	↓	添加40 mL的[0.8 M Tris 3 M NaCl]溶液/1 L H-AD 調節至 pH 8.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	添加40 mL的[0.8 M Tris 3 M NaCl]溶液/1 L H-AD 調節至 pH 8.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	添加40 mL的[0.8 M Tris 3 M NaCl]溶液/1 L H-AD 調節至 pH 8.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	添加40 mL的[0.8 M Tris 3 M NaCl]溶液/1 L H-AD 調節至 pH 8.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	添加40 mL的[0.8 M Tris 3 M NaCl]溶液/1 L H-AD 調節至 pH 8.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	↓	↓
步驟 4e	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： 1)時間零 2)在室溫下8 h後 3)在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： 1)時間零 2)在室溫下8 h後 3)在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： 1)時間零 2)在室溫下8 h後 3)在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： 1)時間零 2)在室溫下8 h後 3)在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： 1)時間零 2)在室溫下8 h後 3)在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： 1)時間零 2)在室溫下8 h後 3)在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： 1)時間零 2)在室溫下8 h後 3)在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： 1)時間零 2)在室溫下8 h後 3)在4°C下孵育過夜

* 縮寫：sol.：溶液incu.：孵育；VI：目視檢查；R.T：室溫；O.N：過夜；trans：透射 最終製程處的親和加載物的製備為： •   在PS20處理（0.5% PS20，在23°C ± 2°C下伴隨攪拌孵育20 ± 5 min）結束時，每1 L的收穫物-AD添加40 mL溶液[0.8 M Tris，3 M NaCl pH 8.3 ± 0.2，164 ± 2 mS/cm]，並用1 M HCl將pH調節至8.0 ± 0.2。 •   驗證獲得的親和加載物的電導率在16 ± 2 mS/cm內（0.8 M Tris，3 M NaCl溶液的添加體積設計為在該電導率範圍內）

樣本名稱	H-AD體積 （mL）	最終參數	溶液澄清性	在660 nm處的透射%
最終pH	最終電導率（mS/cm）	在時間0處	在室溫下8 h後	在4°C下過夜後
0.	不經處理的 H-AD係pH 9.0，約5 mS/cm	40	NR	澄清	澄清	澄清	99.50
1.	H-AD pH 9.0，約5 mS/cm → 至 pH 8 和 16 mS/cm ，不加 PS20	40	8.00	16.25	略白++	略白+++	略白+++	35.38
2.	H-AD →添加最終 0.1% PS20→ 1 h，攪拌，23°C ± 2°C → 至pH 8 ± 0.2和16 ± 2 mS/cm	40	7.93	16.25	澄清	澄清	非常輕微的白色+	96.11
3.	H-AD →添加最終 0.25% PS20→ 1 h，攪拌，23°C ± 2°C → 至pH 8 ± 0.2和16 ± 2 mS/cm	40	8.02	16.10	澄清	澄清	難確定	96.63
4.	H-AD → 添加最終 0.5% PS20→ 1 h，攪拌，23°C ± 2°C至pH 8 ± 0.2和16 ± 2 mS/cm	40	8.02	15.77	澄清	澄清	澄清	98.59
5.	H-AD →添加最終 0.75% PS20→ 1 h，攪拌，23°C ± 2°C → 至pH 8 ± 0.2和16 ± 2 mS/cm	40	8.03	15.70	澄清	澄清	澄清	98.18
6.	H-AD →添加最終 1.0% PS20→ 1 h，攪拌，23°C ± 2°C → 至pH 8 ± 0.2和16 ± 2 mS/cm	40	8.01	15.75	澄清	澄清	澄清	98.03
7.	H-AD pH 9.0 ，約 5 mS/cm→ 至 16 mS/cm ，不加 PS20	40	9.05	15.90	澄清	澄清	略白+	97.40
8.	H-AD pH 8.5 ，約 5 mS/cm→ 至 16 mS/cm ，不加 PS20	40	8.50	15.70	略白+	略白++	略白++	78.89

注意：在實驗 1 中：在 H-AD 中的 rhCG 濃度係 0.91 mg/mL 並且總蛋白質濃度（ Bradford ）係 4.9 mg/mL 。 實驗 2

步驟 1	含有 rhCG 的收穫物[pH 7.2，13.5 mS/cm] （20 μg/mL rhCG，163 μg/mL Bradford）
步驟 2	由帶正電深度過濾器進行收穫物澄清
步驟 3	10 kDa UF1 （超濾）
步驟 4	收穫物 -AD （ = H-AD ）在100 mM甘胺酸 + 50 mM NaCl中，pH 9.13，5.06 mS/cm 體積：3.257 L，A 280：5.208，Bradford：4.93 mg/mL，rhCG：0.910 mg/mL
步驟 4a	40 mL H-AD	40 mL H-AD	40 mL H-AD	40 mL H-AD
步驟 4b	添加5 M NaCl 調節至 pH 8.5 和 10 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	添加5 M NaCl 調節至 pH 8.5 和 12 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	添加5 M NaCl 調節至 pH 8.5 和 15 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	↓
步驟 4c	↓	↓	↓	添加20% PS20 至最終0.4% PS20 孵育1 h，23°C，伴隨攪拌
步驟 4d	↓	↓	↓	添加40 mL的[0.8 M Tris 3 M NaCl]溶液/1 L H-AD 調節至 pH 8.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]
步驟 4e	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： • 時間零 • 在室溫下8 h後 • 在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： • 時間零 • 在室溫下8 h後 • 在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： • 時間零 • 在室溫下8 h後 • 在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： • 時間零 • 在室溫下8 h後 • 在4°C下孵育過夜

* 縮寫：sol.：溶液incu.：孵育；VI：目視檢查；R.T：室溫；O.N：過夜；trans：透射

樣本名稱	H-AD體積（mL）	最終參數	溶液澄清性	在660 nm處的透射%
最終pH	最終電導率（mS/cm）	在時間0處	在室溫下8 h後	在4°C下過夜後
0.	不經處理的 H-AD係pH 9.0，約5 mS/cm	40	NR	澄清	澄清	澄清	99.0
1.	H-AD pH 9.0，約5 mS/cm → 至 pH 8.5 和 10 mS/cm ，不加 PS20	40	8.50	10.00	澄清	略白+	略白+	97.8
2.	H-AD pH 9.0，約5 mS/cm → 至 pH 8.5 和 12 mS/cm ，不加 PS20	40	8.47	12.00	澄清	略白+	略白+	97.2
3.	H-AD pH 9.0，約5 mS/cm → 至 pH 8.5 和 15 mS/cm ，不加 PS20	40	8.50	15.20	略白+	略白++	略白+++	95.9
4.	H-AD 添加最終 0.4% PS20→ 1 h，攪拌，23°C ± 2°C至 pH 8 和 16 mS/cm	40	8.00	16.20	澄清	澄清	澄清	98.2

在實驗 2 中：在 H-AD 中的 rhCG 濃度係 0.91 mg/mL 並且總蛋白質濃度（ Bradford ）係 4.9 mg/mL 。 實驗 3

步驟 1	含有 rhCG 的收穫物；[pH 7.2，13.5 mS/cm]（20 μg/mL rhCG，163 μg/mL Bradford）
步驟 2	由帶正電深度過濾器進行收穫物澄清
步驟 3	10 kDa UF1 （超濾）
步驟 4a	220 mL 收穫物 -AD	220 mL 收穫物 -AD
步驟 4b	添加20% PS20 至最終 0.25% PS20孵育1 h，23°C，伴隨攪拌	添加20% PS20 至最終 0.5% PS20孵育1 h，23°C，伴隨攪拌
步驟 4c	添加40 mL的[0.8 M Tris， 3 M NaCl]溶液/1 L H-AD 調節至 pH 8.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]	添加40 mL的[0.8 M Tris 3 M NaCl]溶液/1 L H-AD 調節至 pH 8.0 和 16 mS [ 用 1 M HCl 滴定 pH]
步驟 4d	藉由V和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： • 時間零 • 在室溫下8 h後 • 在4°C下孵育過夜	藉由VI和在660 nm處的透射檢查澄清性 在以下處： • 時間零 • 在室溫下8 h後 • 在4°C下孵育過夜

* 縮寫：sol.：溶液incu.：孵育；VI：目視檢查；R.T：室溫；O.N：過夜；trans：透射

樣本名稱	H-AD體積（mL）	最終參數	溶液澄清性	在660 nm處的透射%
最終pH	最終電導率（mS/cm）	在時間0處	在室溫下8 h後	在4°C下過夜後
0.	不經處理的 H-AD係pH 9.0，約5 mS/cm	40	NR	澄清	澄清	澄清	99.0
1.	H-AD 添加最終 0.25% PS20→1 h，攪拌，23°C ± 2°C→ 至 pH 8 和 16 mS/cm	220	8.01	16.12	非常輕微的白色+	略白+	略白 + 但有一些沈澱出現	98.0
2.	H-AD 添加最終 0.5% PS20→1 h，攪拌，23°C ± 2°C →至 pH 8 和 16 mS/cm	220	8.03	15.90	澄清	澄清	澄清但有一些沈澱出現	98.9

在實驗3中：在H-AD中的rhCG濃度係0.91 mg/mL並且總蛋白質濃度（Bradford）係4.9 mg/mL。 純化運行

H-AD：係含有rhCG的收穫物，其由UF1進行體積濃縮平均50倍（最小-最大範圍在37-66倍之間），含有0.8 mg/mL（最小-最大範圍在0.4-1.5 mg/mL之間）的平均rhCG濃度和3 mg/mL（最小-最大範圍在2-5 mg/mL之間）的平均總蛋白質濃度（根據Bradford）。

H-AD稀釋劑由100 mM甘胺酸、50 mM NaCl（pH 9.0 ± 0.2，6 ± 1 mS/cm）[最終改為100 mM甘胺酸、50 mM NaCl，pH和電導率相同]組成。 加載溶液 的製備

在PS20處理（0.5% PS20，在23°C ± 2°C下伴隨攪拌孵育20 ± 5 min）後，每1 L的收穫物-AD添加40 mL溶液，該溶液包含0.8 M Tris、3 M NaCl（pH 8.3 ± 0.2，164 ± 2 mS/cm）。用1 M HCl將pH調節至8.0 ± 0.2。獲得的親和加載溶液的電導率經驗證在16 ± 2 mS/cm內（0.8 M Tris，3 M NaCl溶液的添加體積設計為在該電導率範圍內）。 實例 3 ： FSH 製造流程圖：

製程步驟	步驟目的
解凍小瓶的rFSH WCB	接種前的細胞生長
細胞增殖 （搖瓶和波浪生物反應器）
50 L BR中的接種和細胞生長 使用微濾（ATF 10）系統的rFSH產生和連續收穫	以所需的數量和品質產生rFSH。
用深度過濾器（PDE2）進行線上收穫物澄清	去除宿主細胞蛋白質（HCP）、DNA、潛在的脂質和膠體、細胞碎片和內毒素。為UF1膜提供保護
10 KDa UF 1	濃縮rFSH以縮短親和層析製程時間；去除可能對親和樹脂產生不利影響的色素和低分子量組分（＜ 10 KDa）
生物負荷控制	生物負荷控制
捕獲	親和層析法	加載物處理： 添加0.5%（% w/v）的聚山梨醇酯20（PS 20）以在調節pH之前增加溶解度。 層析法：捕獲rFSH並去除：HCP、LMW亞基、PS 20、內毒素和宿主細胞DNA。

實例 4 ： hCG 製造流程圖

製程步驟	步驟目的
解凍小瓶的rhCG WCB	接種前的細胞生長
細胞增殖 （搖瓶和波浪生物反應器）
50 L BR中的接種和細胞生長 使用微濾（ATF 10）系統的rhCG產生和連續收穫	以所需的數量和品質產生rhCG。
用深度過濾器（PDE2）進行線上收穫物澄清	去除宿主細胞蛋白質（HCP）、DNA、潛在的脂質和膠體、細胞碎片和內毒素。為UF1膜提供保護
濃縮rhCG收穫物以縮短親和層析製程時間；去除可能對親和樹脂產生不利影響的色素和低分子量組分（＜ 10 KDa）	濃縮rhCG以縮短親和層析製程時間；去除可能對親和樹脂產生不利影響的色素和低分子量組分（＜ 10 KDa）
生物負荷控制	生物負荷控制
捕獲	親和層析法	加載物處理：添加0.5%（% w/v）的聚山梨醇酯20（PS 20）以在調節pH之前增加溶解度。 層析法：捕獲rhCG並去除：HCP、β-hCG亞基、PS 20、內毒素和宿主細胞DNA。

實例5

為了製備rFSH，應用經開發用於rhCG製備的製程和技術。

使用0.5%或1%（% w/v）PS20的rFSH收穫物產生澄清的溶液（無沈澱）。 •   體積濃縮平均39倍（最小-最大範圍在34-47倍之間），平均rFSH濃度為0.09 mg/mL（最小-最大範圍在0.07-0.138 mg/mL之間） •   平均總蛋白質濃度（根據Bradford）為1.3 mg/mL（最小-最大範圍在0.7-1.8 mg/mL之間）。 •   H-AD稀釋劑由100 mM的甘胺酸、60 mM的NaCl（pH 9.0 ± 0.2，9.0 ± 0.5 mS/cm）組成

藉由參考以下編號的條款進一步描述本發明：

1.     一種防止蛋白質從溶液中沈澱之方法，所述方法包括使該溶液與一定量的聚山梨醇酯20（PS20）接觸。

2.     一種防止蛋白質從溶液中沈澱之方法，所述方法包括使該溶液與一定量的聚山梨醇酯接觸。

3.     如條款2所述之方法，其中該聚山梨醇酯選自由以下組成之群組：聚山梨醇酯20（PS20）；聚山梨醇酯40（PS40）；聚山梨醇酯60（PS60）；和聚山梨醇酯80（PS80）。

4.     如條款1-3所述之方法，其中該溶液用於蛋白質純化製程或與蛋白質純化製程一起使用。

5.     如條款1-4所述之方法，其中該溶液係加載溶液，用於與蛋白質純化製程一起使用。

6.     如條款4-5所述之方法，其中該蛋白質純化製程包括親和層析法。

7.     如任一前述條款所述之方法，其中該溶液包含一或多種蛋白質，該一或多種蛋白質選自由以下組成之群組： (i) 糖蛋白或重組糖蛋白； (iii) FSH或重組FSH；以及 (iv) hCG或重組hCG。

8.     如任一前述條款所述之方法，其中該蛋白質純化製程用於純化選自由以下組成之群組的蛋白質： (i) 糖蛋白或重組糖蛋白； (iii) FSH或重組FSH；以及 (iv) hCG或重組hCG。

9.     如條款1和4-8中任一項所述之方法，其中該PS20的量係使該溶液中的PS20達到約0.1%（% w/v）至5%（% w/v）的最終濃度的量。

10.   如條款1和4-9中任一項所述之方法，其中該PS20的量係使該溶液中的PS20達到0.5%（% w/v）的最終濃度的量。

11.   如條款1和4-10中任一項所述之方法，其中使該PS20與該溶液接觸約1分鐘至2小時之間的任何時間。

12.   如條款1和4-11中任一項所述之方法，其中使該PS20與該溶液接觸15-25分鐘。

13.   如條款1和4-12中任一項所述之方法，其中使該PS20與該溶液在約10°C至30°C之間的任何溫度下接觸。

14.   如條款1和4-13中任一項所述之方法，其中使該PS20與該溶液在約21°C至25°C之間的任何溫度下接觸。

15.   如條款1和4-14中任一項所述之方法，其中在與PS20接觸後，優化該溶液或加載溶液用於與蛋白質純化製程一起使用。

16.   如條款15所述之方法，其中該溶液或加載溶液的優化涉及調節pH和/或電導率。

17.   如條款15或16所述之方法，其中將該溶液製備為pH 8且電導率為14至18 mS/cm。

18.   如任一前述條款所述之方法，其中該溶液衍生自細胞培養基。

19.   如條款18所述之方法，其中在與PS20接觸之前，從衍生自該細胞培養基的溶液中去除宿主細胞蛋白質、DNA、潛在的脂質、膠體、細胞碎片和/或內毒素。

20.   一種防止蛋白質在優化加載溶液用於親和層析法期間沈澱之方法，所述方法包括： 使待優化用於親和層析法的加載溶液與一定量的PS20接觸以提供PS20/加載溶液；以及 優化該PS20/加載溶液混合物用於親和層析法。

21.   如條款20所述之方法，其中與該加載溶液接觸的PS20的量產生PS20的最終濃度為約0.1%（% w/v）至5%的加載溶液。

22.   如條款20或21所述之方法，其中將該PS20/加載溶液混合物在21°C至25°C的溫度下持續15-25分鐘之間的任何時間。

23.   如條款20-22所述之方法，其中該加載溶液衍生自細胞培養基並含有重組糖蛋白。

24.   如條款20-23所述之方法，其中該加載溶液衍生自細胞培養基並含有重組FSH或重組hCG。

25.   一種製備用於與親和層析製程一起使用的加載溶液之方法；所述方法包括使該加載溶液與一定量的PS20接觸以提供PS20/加載溶液混合物。

26.   如條款25所述之方法，其中該PS20/加載溶液混合物包含0.1%至5%（% w/v）的PS20。

27.   如條款25或26所述之方法，其中將該PS20/溶液混合物在21°C至25°C的溫度下孵育15-25分鐘之間的任何時間。

28.   如條款25-27所述之方法，其中該加載溶液衍生自細胞培養基並含有重組糖蛋白。

29.   如條款25-28所述之方法，其中該加載溶液衍生自細胞培養基並含有重組FSH或重組hCG。

30.   如條款25-29中任一項所述之方法，其中在與PS20接觸後，優化該加載溶液用於與蛋白質純化製程一起使用。

31.   如條款30所述之方法，其中該加載溶液的優化涉及調節該加載溶液的pH和/或電導率。

32.   如條款30至31所述之方法，其中將該加載溶液製備為pH 8且電導率為14至18 mS/cm。

33.   一種純化蛋白質之方法，所述方法包括： (a)       獲得或提供含有待純化蛋白質的溶液； (b)       使該溶液與一定量的PS20接觸；以及 (c)       從該溶液中純化該蛋白質。

34.   如條款33所述之方法，其中該待純化蛋白質係選自由以下組成之群組的蛋白質： (i) 糖蛋白或重組糖蛋白； (ii)       FSH或重組FSH；以及 (iii)      hCG或重組hCG。

35.   如條款33和34所述之方法，其中該溶液衍生自細胞培養基。

36.   如條款35所述之方法，其中在與PS20接觸之前，將該溶液澄清和/或過濾。

37.   如條款36所述之方法，其中在使該溶液與PS20接觸之前，從該溶液中去除宿主細胞蛋白質、DNA、潛在的脂質和膠體、細胞碎片和內毒素。

38.   如條款33-37中任一項所述之方法，其中藉由親和層析法純化該蛋白質。

39.   如條款33-38中任一項所述之方法，其中洗脫並收集該純化的蛋白質。

40.   如條款39所述之方法，其中不用辛酸和乙醇的組合處理該洗脫並收集的蛋白質。

41.   如條款39和40中任一項所述之方法，其中不使用玻璃纖維過濾器過濾該洗脫並收集的蛋白質。

42.   如條款39-41中任一項所述之方法，其中該洗脫並收集的蛋白質不經受磺丙基瓊脂糖凝膠層析法和/或疏水交互作用層析法。

(無)

Claims (16)

1. 一種防止蛋白質從加載溶液中沈澱之方法，所述方法包括使該溶液與一定量的聚山梨醇酯20（PS20）接觸。
2. 如請求項1所述之方法，其中該加載溶液用於與蛋白質純化製程一起使用。
3. 如請求項1或2所述之方法，其中該加載溶液係親和層析法加載溶液。
4. 如任一前述請求項所述之方法，其中該方法係防止一或多種蛋白質從溶液中沈澱之方法，該一或多種蛋白質選自由以下組成之群組： (i) 糖蛋白或重組糖蛋白； (iii) FSH或重組FSH；以及 (iv) hCG或重組hCG。
5. 如任一前述請求項所述之方法，其中該PS20的量係使該溶液中的PS20達到約0.1%（% w/v）至5%（% w/v）的最終濃度的量，視需要其中該PS20的量係使該溶液中的PS20達到0.5%（% w/v）的最終濃度的量。
6. 如前述請求項中任一項所述之方法，其中使該PS20與該溶液接觸約1分鐘至2小時之間的任何時間，視需要其中使該PS20與該溶液接觸15-25分鐘。
7. 如任一前述請求項所述之方法，其中使該PS20與該溶液在約10°C至30°C之間的任何溫度下接觸，視需要其中使該PS20與該溶液在約21°C至25°C之間的任何溫度下接觸。
8. 如任一前述請求項所述之方法，其中使該溶液與最終濃度為0.5%（% w/v）的PS20接觸，並在23°C ± 2°C下持續20 ± 5 min。
9. 如任一前述請求項所述之方法，其中在與PS20接觸後，優化該溶液用於與蛋白質純化製程一起使用，視需要其中將該溶液製備為pH 8且電導率為14至18 mS/cm。
10. 一種防止蛋白質在優化加載溶液用於親和層析法期間沈澱之方法，所述方法包括： 使待優化用於親和層析法的加載溶液與一定量的PS20接觸以提供PS20/加載溶液；以及 優化該PS20/加載溶液混合物用於親和層析法。
11. 如請求項10所述之方法，其中與該加載溶液接觸的PS20的量產生PS20的最終濃度為約0.1%（% w/v）至5%（% w/v）的加載溶液。
12. 如請求項10或11所述之方法，其中將該PS20/加載溶液混合物在21°C至25°C的溫度下持續15-25分鐘之間的任何時間。
13. 如請求項10-12所述之方法，其中該加載溶液包含重組FSH或重組hCG。
14. 一種純化蛋白質之方法，所述方法包括： (a)   獲得或提供含有待純化蛋白質的溶液； (b)   使該溶液與一定量的PS20接觸；以及 (c)   從該溶液中純化該蛋白質。
15. 如請求項14所述之方法，其中該待純化蛋白質係選自由以下組成之群組的蛋白質： (i)    糖蛋白或重組糖蛋白； (ii)   FSH或重組FSH；以及 (iii)  hCG或重組hCG。
16. 如請求項14或15中任一項所述之方法，其中該方法包括使該溶液與最終濃度為0.5%（% w/v）的PS20接觸，並在23°C ± 2°C下持續20 ± 5 min。