CN104487448B

CN104487448B - 纯化抗体的方法

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Publication number: CN104487448B
Application number: CN201280074129.6A
Authority: CN
Inventors: 巴斯蒂安·彼特·阿里安·科克; 埃韦尔迪娜·约瑟菲娜·威廉明娜·维克-巴斯滕万; 托马斯·安东尼厄斯·贝纳杜斯·贝耶尔德; 马里亚·马尔扎佩雷兹; 米歇尔·亨德里克斯·马里亚·埃平克
Original assignee: Synthon Biopharmaceuticals BV
Current assignee: Byodes Private Limited
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2020-04-24
Anticipated expiration: 2032-06-21
Also published as: PL2864346T3; PT2864346T; EP2864346A1; US9845338B2; DK2864346T3; KR20150027807A; LT2864346T; HRP20190030T1; CN104487448A; SG11201408502XA; ES2704487T3; EP2864346B1; CY1121394T1; US20160002289A1; KR101941742B1; WO2013189544A1; HUE043121T2

Abstract

一种纯化抗体组合物的方法，其包括在纯化过程后期应用阴离子交换色谱。对经超滤/渗滤纯化的抗体组合物进行阴离子交换色谱(AEX)以形成药学纯的抗体组合物。

Description

纯化抗体的方法

技术领域

本发明涉及纯化抗体的方法。特别地，所述方法包括在抗体纯化过程的后期使用阴离子交换色谱。

背景技术

单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)是医药工业中最重要的药剂之一。mAb一般使用培养的细胞产生，其中通常使用哺乳动物细胞以确保获得期望的折叠和糖基化。在过去十年内，细胞培养技术已进行了改进，包括生产培养基和给料策略的进步。这些改进已导致高的细胞培养物效价。但是，通常需要将表达的抗体与宿主细胞和表达培养基中的其它组分(杂质)分离以用于其预期的目的。

由于mAb一般通过发酵产生，因此它们伴随有大量的过程相关的杂质，例如宿主细胞蛋白质(HCP)、宿主细胞DNA和培养基成分。例如，哺乳动物细胞对由剪切应力引起的破坏敏感，并且这可导致杂质(例如蛋白酶(即HCP))的释放，其可影响产品稳定性和/或纯度。特别地，HCP是一种重要的污染物，因为其可在低的百万分率(parts per million)水平下引起免疫应答。根据发酵条件，产品相关的杂质(例如降解的、截短的和聚集的mAb)也可见于细胞培养物上清中。因此，从细胞培养基中有效回收和纯化抗体是抗体纯化过程的一个重要部分，特别是在医药应用中。

目前，mAb纯化过程一般包括色谱精制(polishing)步骤，其目标是减少/除去产品相关的以及过程相关的杂质，例如HCP和DNA、高分子量(molecular weight，MW)聚集体、低MW降解产物和渗出物(leachables)。可将纯化过程分解成一系列单元操作，但是所述操作(和其中的步骤)可同时或相继发生。常用的涵盖广泛抗体和条件的基于蛋白A的抗体纯化过程包括下述单元操作：蛋白A捕获→低pH病毒灭活→离子交换色谱(IEX)精制(一般是两个离子交换色谱，接着进行阴离子交换色谱)→病毒过滤→以及最后的超滤-渗滤(UF/DF)。抗体纯化技术的更多细节可见于由Uwe Gottschalk编辑的Process Scale Purificationof Antibodies，John Wiley&Sons，Inc.2009中。最后的UF/DF步骤被认为完成了纯化，并将抗体置于适于终端用途(end-use)应用的组合物中，例如大量填充(bulk fill)和完成、用于医药应用、体内测试、临床用途等的冷冻干燥。

因此，期望提供一种替代的纯化过程来纯化抗体组合物。

发明内容

本发明基于以下发现：常规的抗体纯化过程不如先前认为的那样有效，特别是对于HCP，而在纯化过程后期使用阴离子交换色谱(AEX)可改进纯化过程和/或提供更高质量的抗体组合物。因此，本发明的第一方面涉及纯化抗体组合物的方法，其包括对经UF/DF纯化的抗体组合物进行阴离子交换色谱(AEX)以形成药学纯(pharmaceutically pure)的抗体组合物。此处的“药学纯”在下文中有定义。经UF/DF纯化的抗体组合物的抗体浓度一般为至少1mg/ml，例如至少5mg/ml、至少10mg/ml、5mg/ml至250mg/ml、10mg/ml至150mg/ml、15mg/ml至100mg/ml、20mg/ml至50mg/ml和30mg/ml至35mg/ml。经UF/DF纯化的抗体组合物一般通过对部分纯化的抗体组合物进行UF/DF获得。所述部分纯化的抗体组合物可通过捕获和/或精制步骤形成。

本发明的另一方面涉及纯化抗体组合物的方法，其包括：对抗体细胞培养收获物经进行例如蛋白A色谱的亲和色谱以捕获粗制的抗体组合物；对所述粗制的抗体组合物进行至少一个精制步骤以形成部分纯化的抗体组合物；对所述部分纯化的抗体组合物进行UF/DF步骤以形成经UF/DF纯化的抗体组合物；以及对所述经UF/DF纯化的抗体组合物进行阴离子交换色谱(AEX)以形成药学纯的抗体组合物。所述精制步骤通常为阳离子交换色谱，以及任选的随后的阴离子交换色谱。

本发明的又一方面涉及纯化抗体组合物的方法，其包括对抗体组合物进行足以降低所述抗体组合物中宿主细胞蛋白质之量的阴离子交换色谱(AEX)，所述抗体组合物的抗体浓度为至少1mg/ml，例如至少5mg/ml、至少10mg/ml、5mg/ml至250mg/ml、10mg/ml至150mg/ml、15mg/ml至100mg/ml、20mg/ml至50mg/ml和30mg/ml至35mg/ml，并且具有肠胃外可用的缓冲剂和pH。

具体实施方式

本发明涉及纯化抗体的方法，相对于先前已知的纯化技术，所述方法在纯化后期使用AEX。常规的mAb纯化过程使用捕获步骤，接着使用IEX精制步骤，并以最后的UF/DF步骤结束，然后进行大量填充，所述过程被认为擅长于获得期望的低水平HCP。在最后的UF/DF步骤之后，常用的基于ELISA的HCP检测试剂盒通常显示适当低量的HCP。但是，在换成更新的、更灵敏的基于ELISA的HCP检测试剂盒之后，本发明人发现HCP的量实际上比之前认为的高得多，并且超出期望的纯度界限。基于该发现，本发明人试图找到将提供更高纯度之抗体组合物的纯化过程。

本发明人发现，AEX可在最后的UF/DF步骤之后进行，同时提高了纯化效果。如下文的实施例所示，将AEX从UF/DF精制阶段之前移至UF/DF之后可使在其它测量杂质不发生任何不期望的增加的情况下提供出众的HCP去除。与常规过程相比，将AEX步骤置于UF/DF之后提高了纯化效果。从经济和/或时间方面来讲，在最后的超滤之后进行AEX也是有利的。通常，与之前(即在精制阶段期间)相比，在UF/DF之后可更快速地进行AEX步骤，因为抗体组合物在最后的UF/DF之后更加浓缩(例如体积更小)。本发明的另一益处是病毒控制增强；已知AEX去除一些病毒。当将AEX作为精制步骤(UF/DF之前)进行时，后续过程以及操作具有再引入病毒的风险。该风险可通过在纯化方案较后期进行AEX来最小化。

在一个实施方案中，对经UF/DF纯化的抗体组合物进行AEX。“经UF/DF纯化的抗体组合物”为已进行一定程度的纯化并且已进行UF/DF步骤的抗体组合物。在上文描述的典型现有技术纯化过程中，最后的UF/DF步骤产生经UF/DF纯化的抗体组合物。所述组合物不一定是，并且一般不是完全或足够纯的。而是已进行一定程度的杂质去除，并且已通过UF/DF对抗体组合物进行一定程度的浓缩。这使本发明中使用的经UF/DF纯化的抗体组合物与在捕获之前已经进行UF/DF的抗体组合物区别开来，例如作为促进捕获步骤的澄清或准备步骤的一部分，至少因为这样的澄清或准备步骤产生不适于终端用途的浓度不足够低的组合物。这样的抗体组合物一般也具有低浓度。

本发明的经UF/DF纯化的抗体组合物的抗体浓度一般为至少1mg/ml，更一般地为至少5mg/ml，优选为至少10mg/ml，包括至少15mg/ml。出于实际原因，所述抗体浓度一般不大于250mg/ml。因此，所述抗体浓度一般在5mg/ml至150mg/ml的范围内。在一些实施方案中，所述浓度在10mg/ml至65mg/ml的范围内，包括15mg/ml至50mg/ml，例如30mg/ml至35mg/ml。在另一些实施方案中，所述抗体浓度在50mg/ml至150mg/ml的范围内，包括75mg/ml至100mg/ml。

在一些实施方案中，本发明的经UF/DF纯化的抗体组合物含有肠胃外可用的缓冲剂和pH中的抗体。在这样的实施方案中，抗体浓度一般为至少10mg/ml，并且包括上述范围，例如15mg/ml至50mg/ml，例如30mg/ml至35mg/ml。常规地，利用色谱步骤处理接近最终形式的抗体组合物(例如具有适于药物注射的缓冲介质)以进行进一步纯化是与直觉相反的。UF/DF步骤被认为是最后的步骤，并且其将经纯化的抗体组合物置于合适的浓度和缓冲剂中。在UF/DF之后的进一步纯化步骤被认为是不利的，例如，由于与后期损失的产量相关的高费用和/或由于在纯化过程后期引入渗出物和/或可提取物的风险。

肠胃外可用的缓冲剂为一般含有适于肠胃外施用之量(一般为1至50毫摩尔)的醋酸盐、磷酸盐、组氨酸和/或柠檬酸盐缓冲剂的水性组合物。所述组合物的pH同样与肠胃外制剂和施用相一致，其一般为pH 4至pH 8，优选为pH 6至pH 8。相反地，肠胃外可用的缓冲剂不合危险的或肠胃外不可用的量的现有纯化试剂。在一些实施方案中，肠胃外可用的缓冲组合物还含有针对抗体的表面活性剂和/或稳定剂。

根据本发明，对经UF/DF纯化的抗体组合物进行AEX。为了清楚，阴离子交换色谱或“AEX”指以电荷差异为基础，使用阴离子交换基质通过其可分离含有抗体的组合物和一种或更多种杂质(例如，过程相关的杂质，例如宿主细胞蛋白质、DNA和/或内源或外源病毒(例如MulV或MVM))的方法。阴离子交换基质一般包含共价结合的带正电荷的基团。可采用强或弱阴离子交换基质。强阴离子交换基质的实例包括具有季铵离子的那些。弱阴离子交换基质的实例包括具有叔胺或仲胺官能团的那些，例如DEAE(二乙氨乙基)。在某些实施方案中，可使用多模式阴离子交换基质(multimodal anion exchange matrices)，其引入额外的结合机制以及离子相互作用，例如一种或更多种氢键相互作用和疏水相互作用。合适的阴离子交换基质的实例在本领域中是已知的，其可包括，但不限于Sartobind Q、Natrix Q、Chromasorb Q和Mustang Q。一种优选的阴离子交换基质为Mustang Q。

如本领域中公知的那样，针对抗体可采用结合模式或流过模式(flow-throughmode)的阴离子交换色谱过程。在结合模式中，目的抗体被吸附至阴离子交换基质，而一种或更多种杂质则不结合，从而使抗体与杂质分离。在一些实施方案中，在从阴离子交换基质移出吸附的抗体之前，用缓冲剂洗涤阴离子交换基质一次或更多次以除去额外的杂质。利用结合模式的阴离子交换色谱从组合物中除去一种或更多种杂质后，可从阴离子交换基质移出(洗脱)吸附的抗体。相比之下，流过模式意指目的抗体不被显著吸附至阴离子交换基质，而一种或更多种杂质则被吸附(或被阻拦)至基质。抗体流过柱，同时杂质被结合，由此导致杂质与抗体分离。周期性地，基质需要通过去除结合的杂质来再生或用新的基质材料替换。

在本发明中，AEX的应用对抗体组合物具有纯化作用。因此，经UF/DF纯化的抗体组合物在进行根据本发明的AEX后成为药学纯的抗体组合物。本文所用的“药学纯的抗体组合物”意指其产品相关的杂质(例如抗体片段、低聚物等)和过程相关的杂质(例如宿主细胞DNA和HCP等)低于可药用水平的组合物。对于将向人或动物施用的组合物，这样的水平为被医药领域中的工作人员广泛接受的那些水平。对于已批准的抗体产品，美国FDA或欧洲EMA采用的用于限制这些杂质的标准可限定药学纯的上限(如果美国和欧洲的界限不同，取较高者)。通常，药学纯的抗体组合物无需对产品相关的或过程相关的杂质进行进一步纯化，但是可能需要进行无菌过滤或其它的改性以形成最终剂型。简而言之，纯化行为基本完成。在一些实施方案中，根据本发明的药学纯的抗体组合物一般满足以下规格：(1)HCP浓度为10ppm(百万分率)或更低，优选5ppm或更低，并且更优选2ppm或更低；和(2)DNA浓度为20ppb(十亿分率)或更低，优选10ppb或更低，更优选5ppb或更低并且通常低于1ppb。如果在纯化过程上游使用蛋白A或其它蛋白质试剂，那么通常期望的是(渗出的)蛋白A的量被限制在浓度为20ppm或更低，一般为10ppm或更低，通常为5ppm或更低，并且在一些实施方案中为1ppm或更低。而且，在一些实施方案中，药学纯的抗体组合物一般具有基于抗体、二聚体和聚集体的总量的不超过5％，优选不超过2％，并且通常不超过1％的二聚体和聚集体。这些杂质的量还可相对于抗体的量表示。例如，药学纯的抗体组合物中HCP的量一般低于约每mg抗体10ng，优选低于约每mg抗体5ng，更优选低于约每mg抗体2ng。

适用于进行AEX步骤的条件在本领域中是公知的，并且可使用常规的技术和方法确定或最优化。本发明中使用的AEX步骤降低至少一种杂质的浓度或量。因此，通过对经UF/DF纯化的抗体组合物进行AEX，从而减少至少一种杂质来将其转变成药学纯的抗体组合物。通常，但不一定，被减少的杂质为HCP。本发明的一个具体实施方案包括对经UF/DF纯化的抗体组合物(浓度为至少10mg/mi，并且具有肠胃外可用的缓冲剂和pH)进行AEX从而降低HCP的浓度或量。在所有实施方案中，降低程度不受特别限制，并包括由此满足纯度规格的小的但是可检测的纯度提高，例如25ppm至20ppm等。然而，纯度增加的程度一般较为显著。

可在本发明中纯化的抗体不受特别限制。为了清楚，“抗体”以其最广泛的含义使用，包括任何免疫球蛋白(Ig)、其活性或所需变体以及其活性或所需片段(例如，Fab片段、骆驼科抗体(camelid antibody，单链抗体)和纳米抗体(nanobody))。抗体可以是多克隆的或单克隆的，并且可以是天然存在的或重组产生的。因此，人、非人、人源化和嵌合抗体均包括在术语“抗体”内。通常，在本发明的过程中纯化的抗体为属于下述类别之一的单克隆抗体：IgG、IgE、IgM、IgD和IgA，且更通常为IgG或IgA。如本领域中公知的那样，抗体可针对多种抗原，包括但不局限于癌症相关的抗原(例如，HER-2)或促炎抗原(例如，诸如TNF-α的促炎细胞因子)。合适的抗炎抗体的实例包括，但不限于抗TNF-α抗体例如阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普、格里木单抗和赛妥珠单抗；抗IL1-β抗体例如卡那单抗；抗IL12/23(p40)抗体例如优特克单抗(ustekinumab)和布雷奴单抗(briakinumab)；以及抗IL2R抗体，例如达利珠单抗。合适的抗癌抗体的实例包括，但不限于，抗BAFF抗体例如贝利单抗(belimumab)；抗CD20抗体例如利妥昔单抗；抗CD22抗体例如依帕珠单抗；抗CD25抗体例如达利珠单抗；抗CD30抗体例如伊妥木单抗；抗CD33抗体例如吉妥单抗；抗CD52抗体例如阿仑单抗；抗CD152抗体例如伊匹单抗；抗EGFR抗体例如西妥昔单抗；抗HER2抗体例如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗；抗IL6抗体例如司妥昔单抗；以及抗VEGF抗体例如贝伐单抗。

抗体在培养基中的细胞中常规产生或表达。如本领域中公知的那样，所述细胞可以是细菌、植物或哺乳动物细胞。在本发明的一个实施方案中，抗体在例如哺乳动物细胞的真核细胞中产生。本领域技术人员可根据目的抗体的特点选择合适的细胞系。合适的哺乳动物细胞包括，例如CHO、VERO、BHK、HeLa、CV1、MDCK、293、3T3、C127、PC12、HEK-293、PER C6、Sp2/0、NSO、W138细胞和骨髓瘤细胞系(特别是鼠类)。还可使用来自任意前述细胞的哺乳动物细胞。在本发明的一个实施方案中，抗体由CHO细胞产生。

可使细胞在其中产生抗体的培养基是广泛公知的，其可由本领域技术人员确定。如本领域中公知的那样，培养基一般基于宿主细胞和克隆的特别需求而设计。培养基可含有多种成分，例如无机盐、碳水化合物(例如诸如葡萄糖、半乳糖、麦芽糖或果糖的糖类)、氨基酸、维生素(例如B族维生素(例如B12)、维生素A、维生素E、核黄素、硫胺素和生物素)、脂肪酸和脂质(例如胆固醇和类固醇)、蛋白质和肽或二肽(例如白蛋白、转铁蛋白、纤连蛋白和胎球蛋白)、血清(例如含有白蛋白、生长因子和生长抑制剂的组合物，例如胎牛血清、新生小牛血清和马血清)、痕量元素(例如锌、铜、硒和三羧酸中间体)以及其组合。培养基通常含有缓冲剂，存在的常用缓冲剂包括PBS、Hanks BSS、Earles盐类、DPBS、HBSS、EBSS。培养基中存在的其它组分可包括抗坏血酸盐、柠檬酸盐、半胱氨酸/胱氨酸、谷氨酰胺、叶酸、谷胱甘肽、亚油酸、亚麻酸、硫辛酸、油酸、棕榈酸、吡哆醛/吡哆素、核黄素、硒、硫胺素、转铁蛋白。培养基可商购自，例如Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis，Mo.)、HyClone(Logan，Utah)、Invitrogen Corporation(Carlsbad，Calif.)、Cambrex Corporation(E.Rutherford，N.J.)、JRH Biosciences(Lenexa，Kans.)、Irvine Scientific(SantaAna，Calif.)及其它公司。

抗体的产生一般导致存在大量的不需要物质。例如，诸如HCP、核酸(例如染色体或染色体外DNA、核糖核酸(tRNA或mRNA))和脂质(例如细胞壁物质)的过程相关的杂质即为来自抗体产生细胞(也称为“宿主细胞”)的不需要物质(细胞碎片)的实例。此外，例如其它缓冲剂、培养基添加剂或微生物污染物(例如细菌和/或病毒)的培养基组分也为应与目的抗体分离的不需要物质。产品相关的杂质，例如多聚体(例如二聚体、三聚体等)、目的抗体的截短形式和凝集(agglomerate)形式(例如错误折叠或变性形式)一般为不需要的物质。将抗体组合物中的这些不需要物质称为杂质。通常，在产生(培养)后立即获得的抗体组合物的浓缩程度最低，并且具有最多的杂质。使该初始或原始抗体(raw antibody)组合物进行纯化以回收不含一种或更多种杂质的目的抗体。一般情况下，纯化至少包括捕获步骤和通常至少一个精制步骤以形成部分纯化的抗体组合物。

在捕获步骤之前，有时通过常规方法使原始抗体组合物澄清。为了方便起见，在本文中将原始和澄清的抗体组合物共同称为“初始抗体组合物”，无论抗体组合物是否澄清。

捕获步骤在本领域中是公知的。其目的是快速分离、稳定和浓缩抗体。理想地，高度去除可对活性或产量产生不利影响的主要或有害杂质。适用于进行捕获步骤的技术包括多种类型的色谱，例如亲和色谱(AC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱(IEX)(例如阳离子交换色谱(CEX))、疏水电荷诱导色谱(HCIC)和混合模式色谱。出于本发明的目的，在捕获步骤后获得的抗体组合物为“部分纯化的抗体组合物”。为了命名方便起见，有时也将该捕获的抗体组合物称为“粗制的抗体组合物”。

可对粗制的抗体组合物进行一个或更多个精制步骤。精制的目的是除去大部分杂质。适用于精制的技术包括离子交换色谱(IEX)、疏水相互作用色谱(HIC)和羟基磷灰石色谱。

尽管上述技术在本领域中均是公知的，但是下文将对两种优选的技术亲和色谱(用于捕获)和IEX(用于捕获和/或精制)作详细描述。

亲和色谱指这样的分离方法，通过所述方法使抗体借助于其特异性结合特性与抗体的亲和配体结合。可将所述功能性亲和配体固定在固体或半固体的支持物上，使得当含有抗体的组合物通过配体和固体支持物时，对配体具有特异性结合亲和力的抗体吸附至配体，而一种或更多种其它杂质则不被吸附(或者以较低的亲和力结合)并与抗体分离。一般不结合(或不能良好结合)的杂质的实例包括过程相关的杂质(例如宿主细胞蛋白质、DNA、培养基组分)和一些产品相关的杂质(例如抗体片段)。在一些实施方案中，在从配体和支持物移出吸附的抗体之前，用缓冲剂洗涤含有配体的固体支持物一次或更多次以除去额外的杂质。在已经除去一种或更多种杂质之后，可从配体和支持物移出(洗脱)吸附的抗体，从而导致抗体与初始组合物分离。从配体和支持物移出抗体的方法取决于配体，并且为本领域技术人员已知，其可包括，例如改变环境(例如pH)、添加离液剂或变性剂或者添加市售的洗脱缓冲剂。在一些实施方案中，可对抗体组合物使用一种以上亲和纯化方法。多种亲和配体是已知的。两种最常用的为蛋白A和蛋白G(以及其组合)。固定化配体在市场上有售。例如，蛋白A亲和系统包括MabSelect、MabSelect SuRe、MabSelect Xtra、MabSelect SuRe LX、Sepaharose CL-4B、ProSep vA、ProSep vA Ultra、ProSep vA UltraPlus和CeramicHyperD。

本发明的捕获步骤一般使用蛋白A亲和色谱，特别使用MabSelect SuRe、ProSepvA Ultra或Poros MabSelect。MabSelect和MabSelect SuRe两者均使用高度交联的琼脂糖基质。MabSelect SuRe被开发来更好地耐受强碱性条件，所述条件通常被用于清洗柱。对蛋白A树脂进行改性防止其与抗体的可变结构域发生不需要的相互作用。ProSep vA Ultra是一种基于多孔玻璃珠的树脂。ProSep vA Ultra使高结合力与高通量组合，但是它也可具有缺点，例如高度的蛋白A泄漏并且需要特殊的清洗剂。通常，亲和捕获的最优选实施方案包括MabSelect SuRe。

离子交换色谱包括阳离子交换色谱(CEX)和阴离子交换色谱(AEX)。AEX在上文中已描述。CEX与之类似并在下文中对其进行描述。阳离子交换色谱指以电荷差异为基础，利用阳离子交换基质通过其可分离抗体和某种杂质或某些杂质的任何方法。阳离子交换基质一般含有共价结合的带负电荷的基团。可采用弱或强阳离子交换树脂。根据pH，强阳离子交换树脂通常包含含有磺酸或磺酸盐/酯基团的支持性有机基团。根据pH，弱阳离子交换树脂通常包含含有羧酸或羧酸盐/酯基团的支持性有机基团。在某些实施方案中，可使用多模式阳离子交换树脂，其引入额外的结合机制以及离子相互作用，例如一种或更多种氢键相互作用和疏水相互作用。合适的阳离子交换树脂的实例在本领域中是公知的，其可包括，但不限于，Fractogel、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸盐/酯(P)和磺酸盐/酯(S)、PROPAC WCX-10TM(Dionex)、Capto S、S-Sepharose FF、Fractogel EMD S03M、ToyopearlMegacap II SP 550C、Poros 50HS和SP-琼脂糖凝胶基质。在一些优选实施方案中，阳离子树脂选自Capto S、S-Sepharose FF、Fractogel EMD S03M、Toyopearl Megacap II SP550C、Poros 50HS，最优选Poros 50HS。在一些实施方案中，可对组合物使用一种以上的阳离子交换色谱方法。

如本领域中公知的那样，对于抗体，可采用结合模式或流过模式的阳离子交换色谱过程。在结合模式中，目的抗体被吸附至阳离子交换基质，而一种或更多种杂质则不结合，由此使抗体与杂质分离。在一些实施方案中，在从阳离子交换基质移出吸附的抗体之前，用缓冲剂洗涤阳离子交换基质一次或更多次以除去另外的杂质。利用结合模式的阳离子交换色谱从组合物中除去一种或更多种杂质后，可从阳离子交换基质移出(洗脱)吸附的抗体。相比之下，流过模式意指目的抗体不被显著吸附至阳离子交换基质，而一种或更多种杂质则被吸附(或被阻拦)至基质。抗体流过柱，同时杂质被结合，从而导致杂质与抗体分离。周期性地，基质需要通过去除结合的杂质来再生或用新的基质材料替换。

将从捕获步骤或精制步骤得到的抗体组合物视为部分纯化的抗体组合物。一般如下形成所述部分纯化的抗体组合物：对初始抗体组合物进行作为捕获步骤的亲和色谱(例如蛋白、CEXA或混合模式色谱)，接着进行至少一个精制步骤。所述精制步骤通常为IEX，特别是CEX步骤。在一些实施方案中，精制步骤包括以任意顺序的CEX和AEX(即AEX在CEX之后、CEX在AEX之后)。然后，通常对部分纯化的抗体组合物(经或不经其它处理)进行UF/DF从而形成经UF/DF纯化的抗体组合物。

除上文讨论的捕获和精制步骤外，可对抗体组合物进行一个或更多个病毒去除步骤。当病毒被灭活或通过物理方法将其从组合物中去除(或两者)时，病毒被“去除”。在本发明的一些实施方案中，病毒去除步骤在捕获过程之后与精制之前和/或精制之后与UF/DF之前进行。通常，病毒灭活步骤在捕获之后与精制之前进行。病毒物理去除步骤通常在精制之后与UF/DF之前进行。

当涉及病毒的灭活时，所述病毒可保留在最终产品中，但以非感染性形式。病毒灭活步骤可包括pH灭活步骤和/或化学灭活步骤。pH灭活步骤可包括将组合物的pH调节至pH为约5.0或更小，通常为约4.0或更小，且一般为约1.5至约4.5，更一般为约2.0至约4.0。pH灭活步骤可包括在足以发生病毒去除(例如病毒灭活)的多种时间长度范围内(例如1分钟至2小时，且一般为45分钟至75分钟)的一个或更多个pH值下孵育组合物。化学灭活步骤可包括用溶剂或去污剂处理、辐射和/或将其短暂暴露在足以灭活病毒的高温下。病毒灭活的这些方法为本领域技术人员已知的，并且本领域技术人员可选择合适的处理条件。

当病毒去除步骤包括通过从组合物中物理去除病毒时，一般涉及过滤。特别地，纳米过滤包括使组合物通过孔尺寸为例如，小于75nm例如小于50nm，甚至小于15nm的基质，从而使病毒与抗体分离。多种纳米过滤器在市场上有售，并且在本领域中是已知的。

可对部分纯化的抗体组合物(经或不经病毒去除步骤)进行UF/DF从而形成经UF/DF纯化的抗体组合物。UF/DF是超滤和渗滤(diafiltration)的组合操作。所述步骤去除颗粒、浓缩抗体并更换/改性抗体组合物的水性或缓冲组合物。尽管在本领域中是公知的，但是为了清楚，术语“超滤”指通过使组合物通过具有特定孔尺寸直径的一种或更多种半渗透过滤器(或膜或介质)使杂质与抗体分离的过程，其中较大的分子(一般＞103Da至＞106Da)被保留在过滤器上，而水和较低分子量的分子则通过过滤器。这些较低分子量的分子可以是培养基组分、抗体片段和/或其它污染物(杂质)例如脂多糖类。通常，本发明的抗体基本在滞留流(retentate stream)中，而杂质基本在渗透流(permeate stream)中。当指过滤时，术语“渗透流”指在过滤期间通过过滤器的组合物级分。当指过滤时，术语“滞留流”指在过滤期间留在过滤器上或不能通过过滤器孔的组合物级分。该过程还浓缩抗体组合物。

合适的UF/DF装置类型是本领域人员已知的，并且可基于多种因素进行选择，例如待过滤抗体的分子量、待过滤组合物组分的量和尺寸、待过滤组合物的体积以及待过滤组合物的细胞密度和生存力。在一些实施方案中，可使用诸如膜超滤器、板式超滤器、筒式(cartridge)超滤器、袋式超滤器或真空超滤器的过滤器。可采用的市售超滤器由多个供应商制造，例如Millipore Corporation(Billerica，Mass.)、Pall Corporation(EastHills，N.Y.)、GE Healthcare Sciences(Piscataway，N.J.)和Sartorius Corporation(Goettingen，Germany)。

渗滤的作用是准备抗体组合物以用于其终端用途，例如储存、冷冻干燥、肠胃外制剂等。缓冲体系一般通过添加/去除/替换缓冲剂和/或其浓度来更换和/或改性。可引入额外的添加剂，以例如调节pH、张力、溶解度和/或稳定性。稳定性可指使抗体组合物稳定在液体状态或可指在冷冻干燥或重构期间保护抗体。例如，可在曲妥珠单抗组合物中添加海藻糖作为稳定剂。

如果抗体组合物的终端用途是肠胃外制剂，那么可通过渗滤步骤添加一些或所有的所需制剂赋形剂。这些赋形剂可包括磷酸盐缓冲液(例如磷酸钠溶液)、盐水(例如0.8％)、Ringer′s葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸Ringer′s、电解质、表面活性剂(聚山梨醇酯)、稳定剂和防腐剂例如抗微生物剂或抗氧化剂。

渗滤不必使组合物处于最终的药物形式也不必提供每一种赋形剂。可在UF/DF之后或接下来的AEX处理步骤之后添加赋形剂或完成组合物改变。然而，UF/DF步骤通常使抗体组合物置于接近最终药物形式，并因此可在UF/DF期间向经UF/DF纯化的抗体组合物中引入一种或更多种上述添加剂。

对经UF/DF纯化的抗体组合物进行上述AEX以减少例如HCP的一种或更多种杂质，并形成药学纯的抗体组合物。出于效率原因，AEX处理通常直接跟着UF/DF步骤进行。然而，可能发生插入步骤(intervening step)。这些步骤可包括额外的UF步骤或病毒去除步骤。在一些优选实施方案中，不在UF/DF步骤和AEX步骤之间插入其它色谱纯化步骤。该优选不排除多个AEX步骤。

在本发明的AEX步骤之后，可对抗体组合物进行进一步改性以用于其终端用途。尽管在AEX步骤之后进行额外的步骤是可能的，但是一般不进行另外的色谱纯化步骤。可进行病毒去除步骤以及组合物改性。在填充到块(bulk)或填充到小瓶之前，可进行任意的下述步骤中：(a)向所述药学纯的抗体组合物中添加赋形剂；(b)浓缩所述药学纯的抗体组合物；(c)稀释所述药学纯的抗体组合物；(d)调节所述药学纯的抗体组合物的pH；和/或(e)无菌过滤所述药学纯的抗体组合物。在进行或不进行额外的步骤的情况下，可将抗体组合物作为肠胃外制剂准备用于大量填充或分散在小瓶中。或者，可冷冻干燥所述组合物以用于储存和后期重构。

在一些实施方案中，已经进行根据本发明之AEX的药学纯的抗体组合物的抗体浓度为5mg/ml至150mg/ml，例如15mg/ml至50mg/ml和20mg/ml至25mg/ml。

含有通过本发明方法制备之抗体的药物组合物可含有可药用载体(carrier)，包括例如离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾)、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐类或电解质(例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁)、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物和聚乙二醇。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水或非水溶液、混悬剂和乳剂。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油的植物油和例如油酸乙酯的可注射有机酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外制剂可以是单一的推注(bolus)剂量、输注或负荷推注剂量继之以维持剂量。

在分离抗体时，在一些实施方案中，可存在大体积的组合物，例如在商业制造过程期间。表达待分离之抗体的细胞培养物可在尺寸适合用于大规模制造的容器(例如生物反应器)中生长。大体积对分离过程提出了许多挑战。例如，使用大体积时，可放大通过过滤器的流速(flow rate)的小变化对回收分离的抗体的影响。同样地，使用大体积时，还可放大提高初始组合物中的细胞密度对回收产品的影响。因此，使用大体积组合物存在着可被放大的独特问题，并且与使用更小的体积相比，其具有更大的后果。因此，在一些实施方案中，本发明涉及分离在大体积组合物中存在之抗体的方法。术语“大体积”指与抗体的商业和/或工业生产相关的体积。在一些实施方案中，术语“大体积”指10升至2,000升、20升至1,000升或50升至500升。在一些实施方案中，术语“大体积”指至少500升、至少750升、至少1,000升、至少1,250升、至少1,500升、至少2,000升、至少5,000升或至少10,000升。

在一些实施方案中，本发明涉及通过本文所述的任意方法制备的抗体。

在一些实施方案中，所述抗体或含有通过本文所述的任意方法制备的抗体的组合物是可药用的。“可药用”指在合理的医学判断范围内、适于与人类和动物组织接触且不会有过度的毒性或其它并发症，同时具有合理的收益/风险比的抗体或组合物。

在一些实施方案中，通过本发明的方法分离的抗体可用于治疗对象。本文所用的“对象”指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类和非人类，例如，但不限于，家养和农场动物、动物园动物、运动动物和宠物。在一些实施方案中，对象指人。

术语“治疗”及类似用语指治疗性治疗和预防性、维持性或防御性措施两种，其中目的是预防或缓解(减轻)不期望的生理病症、障碍或疾病，或者获得有益的或期望的临床结果。

本发明方法分离之抗体产品的施用途径可以是，经由例如经口、肠胃外、吸入或表面模式的施用。

通过下述非限制性实施例对本发明进行进一步说明。

实施例

实施例1

常规纯化

使用下述方法纯化四次。使含有由CHO细胞产生的曲妥珠单抗的组合物在蛋白A柱上进行捕获、病毒灭活、使用AEX随后使用CEX的精制、病毒过滤，然后进行UF/DF。如下进行所述步骤：

如下进行蛋白A步骤(MabSelect SuRe，GE Healthcare)：开始用0.1M的NaOH清洗柱15分钟，接着用经Milli Q纯化的水(MQ)漂洗。然后，用pH 7.4的PBS平衡柱。将收获物以每ml MabSelectSure≤25mg曲妥珠单抗的比加样到柱上。然后，用平衡缓冲剂洗涤柱，接着用25mM NaAc pH 5.0洗涤。然后，用25mM醋酸盐pH 3.0洗脱抗体。

随后进行病毒灭活。用0.1M HCl将蛋白A洗脱池(elution pool)的pH调至pH 3.5，并使其在该pH下保持60分钟至75分钟。用0.1MNaOH将pH再升至pH 4.5，接着用0.22μm过滤器进行无菌过滤。

随后进行阴离子交换色谱。用MQ预冲洗阴离子交换膜(Mustang Q过滤器，Pall)，然后用5个膜体积(MV)的1.0M NaOH清洗。用25mM H₃PO₄+1M NaCl中和，然后用pH 4.5的25mMNaAc+10mM NaCl平衡过滤器。将来自上述病毒灭活步骤的最多(≤)3.0g(ml MV)-1抗体加样至过滤器。抗体流过过滤器，同时例如残留的CHO蛋白和DNA的污染物则结合至过滤器。用25mM NaAc+10mM NaCl pH 4.5冲洗过滤器，并通过0.22μm无菌过滤器过滤洗脱的产品。

随后进行阳离子交换色谱。用0.5M NaOH清洗阳离子交换色谱柱(Poros HS 50柱；Applied Biosystems)，并用MQ漂洗。用25mMNaAcpH 4.5+10mM NaCl完成平衡。以10g至20g抗体/ml树脂的浓度，加样经阴离子交换色谱过程纯化的抗体块。然后，用平衡缓冲剂洗涤柱，接着用25mM NaAc pH 4.5+200mM NaCl洗涤。然后，使用3个柱体积的25mM NaAc pH 4.5+200mM NaCl至25mM pH 4.5NaAc+290mM NaCl的梯度洗脱抗体产品。用25mM NaAc pH 4.5+290mM NaCl继续洗脱。

随后进行病毒过滤。利用使用加压过滤系统的Viresolve Pro膜(Millipore)，根据供应商的说明书对阳离子交换色谱抗体产品进行病毒过滤。用MQ预冲洗Viresolve pro装置，并用25mM NaAc+290mM NaCl pH 4.5平衡。在应用加样量为＜565g m-2(Planova)、＜2kg m-2(Viresolve Pro)的CEX块后，用25mM NaAc+290mM NaCl pH 4.5冲洗过滤器。停止过滤后，使用0.22μm过滤器对抗体产品进行病毒过滤。

使用分子量截断为30kDa的Biomax 50KD(运行1)或30KD(运行2至4)的UFDF过滤器(Millipore)进行超滤/渗滤(UF/DF)。用MQ预冲洗过滤器，用0.1M NaOH清洗，然后用MQ漂洗以除去NaOH。然后，用25mM醋酸盐pH 4.5+290mM NaCl平衡过滤器。随后，以≤730g抗体/m²膜的加样量，将经病毒过滤的抗体产品加样至过滤器。在浓度达到25mg/ml至35mg/ml后，将抗体产品的缓冲剂更换成50mM海藻糖+4.2mM组氨酸(pH 6.0)。使用10个渗滤体积来更换缓冲剂。

测定每次运行(run)之最终产品的含量、产品相关的杂质(二聚体、聚集体)和过程相关的杂质(HCP、残留蛋白A、残留DNA)。将这些结果总结于表1中(LOQ意指量化的界限)。

表1：从4次运行获得之结果的总结

¹针对使用F015CHO试剂盒(Cygnus)的这些值。

²针对使用F550CHO试剂盒(Cygnus)的这些值。

本发明人注意到，使用较早的试剂盒F015CHO试剂盒(Cygnus)时，宿主细胞蛋白质(HCP)值表现出低于10ppm。然而，当使用更新的、更灵敏的F550CHO试剂盒(Cygnus)重复测定时，发现宿主细胞蛋白质实际上与之前观察到的相比，以不适当的更高的水平存在。使HCP水平降低至低于10ppm正是本发明人所期望的。

对于产品相关的杂质(如FTMB的二聚体、聚集体)，四个样品均具有适当低水平的产品相关的杂质(表1)。所有的产品或过程相关的杂质(除CHO蛋白质之外)均被除去至期望的阈值水平。

实施例2

在最后的超滤过程之后用阴离子交换色谱方法纯化

按照实施例1所述纯化含有由CHO细胞产生的曲妥珠单抗的组合物，其具有以下不同。对于运行5，将蛋白A步骤修改为包括1M氯化钠洗涤、去掉病毒过滤步骤、UF/DF步骤使用Vivaspin装置，以及使用1000个渗滤体积来更换缓冲剂。对于运行6，将蛋白A步骤修改为包括1M氯化钠洗涤、病毒过滤步骤使用Plenova 15N过滤器(Asahi Kasei)以及UF/DF步骤使用Ultracel 30KD过滤器。此外，去掉实施例1中发生在UF/DF之前的阴离子交换色谱(AEX)步骤，并将下述的AEX步骤添加在UF/DF步骤之后。

使用AEX浓缩和渗滤物质：使用Mustang Q过滤器(Pall)来进行阴离子交换色谱。用MQ预冲洗膜，然后用5个膜体积(MV)的1.0MNaOH清洗。用25mM H₃PO₄+1M NaCl中和，接着用MQ冲洗后，用50mM海藻糖+4.2mM组氨酸pH 6.0平衡过滤器。对于运行5，向过滤器加样0.36g曲妥珠单抗(ml MV)-1；对于运行6，向过滤器加样最多(≤)3.0g曲妥珠单抗(ml MV)-1。抗体流过过滤器，同时例如残留的CHO蛋白质和DNA的污染物结合至过滤器。用50mM海藻糖+4.2mM组氨酸pH 6.0冲洗过滤器，并通过0.22μm无菌过滤器过滤收集的流出物。

测定两个独立运行之最终样品的含量、产品相关的杂质(二聚体、聚集体)和过程相关的杂质(HCP、残留蛋白A、残留DNA)。在表2中提供了这些结果的总结。

表2：从2个运行获得之结果的总结

¹：针对使用F550CHO试剂盒(Cygnus)的这些值。

nd：未测定

使用更新的、更灵敏的F550CHO试剂盒(Cygnus)检测时，宿主细胞蛋白质水平低于期望的HCP水平(低于10ppm)。两个样品均具有适当低水平的过程和产品相关的杂质(例如曲妥珠单抗的二聚体、聚集体)。该结果证明通过将AEX步骤重新布置在最后的UF/DF步骤之后，使用相同数目的步骤可提高总纯度。

实施例3

在最后的超滤过程之前和之后用阴离子交换色谱方法纯化

按照实施例1所述纯化含有由CHO细胞产生之曲妥珠单抗的组合物，其具有以下不同。对于运行7至10，病毒过滤步骤使用Plenova 15N过滤器(Asahi Kasei)，并且UF/DF步骤使用Ultracel 30KD过滤器。此外，在UF/DF步骤之后进行另一个AEX步骤，并且按照实施例2中运行2所述进行所述另一个AEX步骤。

测定四个独立运行之最终样品的含量、产品相关的杂质(二聚体、聚集体)和过程相关的杂质(HCP、残留蛋白A、残留DNA)。将这些结果总结于表3中。

表3：从4个运行获得之结果的总结

²：针对使用F550CHO试剂盒(Cygnus)的这些值。

nd：未测定

当使用更新的、更灵敏的F550CHO试剂盒(Cygnus)检测测试的四次运行时，宿主细胞蛋白质水平(来自具有两个阴离子交换色谱过程的方法：一个在UF/DF步骤之前，一个在UF/DF步骤之后)均低于期望的HCP水平(低于10ppm)。过程和产品相关的杂质也适当地低。

这些实施例证明，可通过在最后的UF/DF过程之后进行阴离子交换色谱过程来实现抗体纯度的提高(例如降低宿主细胞蛋白质浓度)。

结论

本文描述的所有多种实施方案或选择可以以任意和所有变化的形式组合。尽管已参考其一些实施方案对本发明进行了特别地展示和描述，但是本领域技术人员应当理解这些实施方案仅通过实例的方式呈现而非限制，并且可在不背离本发明之精神和范围的情况下可对其中的形式和细节作多种改变。因此，本发明的宽度和范围不应受上述任何示例性实施方案的限制，而应当仅根据随后所附权利要求及其等同方案来限定。

本文引用的所有文件，包括期刊文章或摘要、公开的或相应的美国或国外专利申请、授权的或国外专利或任何其它文件均通过引用整体各自并入本文，包括所引用的文件中存在的所有数据、表格、图和文本。

Claims

1.一种纯化抗体组合物的方法，其包括对经超滤-渗滤UF/DF纯化的抗体组合物进行阴离子交换色谱AEX以形成药学纯的抗体组合物，其中所述经UF/DF纯化的抗体组合物的抗体浓度为5mg/ml至250mg/ml，并且所述抗体在真核细胞中产生，其中所述AEX是最后的色谱纯化步骤并且在最后的UF/DF步骤后以流过模式进行所述AEX，并且其中所述药学纯的抗体组合物的宿主细胞蛋白质浓度为不超过10ppm且DNA浓度为不超过20ppb。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体浓度为10mg/ml至150mg/ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体浓度为15mg/ml至100mg/ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其还包括将所述药学纯的抗体组合物填充到小瓶中。

5.根据权利要求4所述的方法，其还包括在所述填充步骤之前无菌过滤所述药学纯的抗体组合物。

6.根据权利要求5所述的方法，其还包括在所述填充步骤之前的至少一个下述步骤：(a)向所述药学纯的抗体组合物添加赋形剂；(b)浓缩所述药学纯的抗体组合物；(c)稀释所述药学纯的抗体组合物；和/或(d)调节所述药学纯的抗体组合物的pH。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其还包括对部分纯化的抗体组合物进行UF/DF以形成所述经UF/DF纯化的抗体组合物。

8.根据权利要求7所述的方法，其还包括使抗体细胞培养收获物进行抗体捕获步骤和任选的至少一个精制步骤以形成所述部分纯化的抗体组合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述捕获步骤利用亲和色谱。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述亲和色谱是蛋白A色谱。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述捕获步骤利用阳离子交换色谱CEX、疏水电荷诱导色谱HCIC或混合模式色谱。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其中在所述捕获步骤之后进行至少一个精制步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述至少一个精制步骤选自离子交换色谱IEX、疏水相互作用色谱HIC和羟基磷灰石色谱。

14.一种纯化抗体组合物的方法，其包括：

对抗体真核细胞培养收获物进行亲和色谱以形成粗制的抗体组合物；

对所述粗制的抗体组合物进行至少一个精制步骤以形成部分纯化的抗体组合物；

对所述部分纯化的抗体组合物进行UF/DF步骤以形成经UF/DF纯化的抗体组合物；以及

对所述经UF/DF纯化的抗体组合物进行阴离子交换色谱AEX以形成药学纯的抗体组合物，其中所述经UF/DF纯化的抗体组合物的抗体浓度为5mg/ml至250mg/ml，其中所述AEX是最后的色谱纯化步骤并且在最后的UF/DF步骤后以流过模式进行所述AEX，并且其中所述药学纯的抗体组合物的宿主细胞蛋白质浓度为不超过10ppm且DNA浓度为不超过20ppb。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述亲和色谱是蛋白A色谱。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体浓度为10mg/ml至150mg/ml。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体浓度为15mg/ml至100mg/ml。

18.根据权利要求14所述的方法，其还包括对所述药学纯的抗体组合物进行病毒去除步骤。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述病毒去除步骤为纳米过滤。

20.根据权利要求14所述的方法，其中所述至少一个精制步骤包括使所述粗制的抗体组合物进行至少一个离子交换色谱IEX步骤。

21.根据权利要求1或14中任一项所述的方法，其中所述抗体为曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。