KR20150027807A

KR20150027807A - 항체의 정제 방법

Info

Publication number: KR20150027807A
Application number: KR20157001645A
Authority: KR
Inventors: 바스티앙 피테르 아리아나 코케; 반 에버디나 조세피나 빌헬미나 비즈크-바스텐; 데 토마스 안토니우스 버나두스 베이제르; 페레즈 마리아 마르자; 마이클 헨드리쿠스 마리아 엡핑크
Original assignee: 신톤 바이오파머슈티칼즈 비.브이.
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2015-03-12
Also published as: EP2864346B1; WO2013189544A1; CN104487448B; ES2704487T3; CN104487448A; HUE043121T2; EP2864346A1; US20160002289A1; LT2864346T; SG11201408502XA; CY1121394T1; HRP20190030T1; PL2864346T3; DK2864346T3; PT2864346T; KR101941742B1; US9845338B2

Abstract

항체 조성물의 정제 방법은 음이온 교환 크로마토그래피를 정제 공정 후반에 적용하는 것을 포함한다. 한외여과/다이아필트레이션-정제된 항체 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)로 처리되어 약학적으로 순수한 항체 조성물을 형성한다.

Description

항체의 정제 방법{METHOD OF PURIFYING AN ANTIBODY}

본 발명은 항체의 정제 방법에 관한 것이다. 특히, 본 방법은 항체 정제 공정에서 음이온 교환 크로마토그래피를 후기(late-stage)에 이용하는 것을 포함한다.

단클론 항체(mAb)는 제약 산업에서 가장 중요한 물질 중 하나이다. mAb는 배양된 세포를 사용하여 생산되는 것이 통상적인데, 포유류 세포가 목적하는 폴딩과 글리코실레이션을 보장하는데 흔히 이용된다. 지난 10년간, 생산 배지 및 공급 전략의 개선을 포함하는 세포 배양 기술의 발전이 있었다. 이러한 발전은 높은 세포 배양 역가를 초래했다. 그러나 발현된 항체가 의도된 목적에 사용되기 위해서는 일반적으로 발현 배지 내 다른 성분(불순물) 및 숙주 세포로부터 분리되어야 한다.

mAb는 일반적으로 발효에 의해 생산되므로, 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 DNA 및 배지 성분과 같은 다량의 공정 관련된 불순물을 동반한다. 포유류 세포는 예를 들어, 전단 응력에 의한 파괴에 민감하고, 이는 생산물 안정성 및/또는 순도에 영향을 미칠 수 있는 프로테아제(즉, HCP)와 같은 불순물 방출의 원인이 될 수 있다. 특히 HCP는 중요한 오염물질인데, 낮은 백만분의 일 수준에서 면역 반응을 유발할 수 있기 때문이다. 발효 조건에 따라, 생산물 관련된 불순물, 예를 들어, 분해된, 불완전한 그리고 응집된 mAb와 같은 생산물 관련된 불순물이 세포 배양 상청액에서 발견될 수도 있다. 따라서, 특히 제약 분야에서 세포 배양 배지로부터 항체의 효율적인 회수 및 정제는 항체 정제 공정의 중요한 부분이다.

현재의 mAb 정제 공정은 일반적으로 생산물 관련된 불순물 및 공정 관련된 불순물, 예를 들어, HCP 및 DNA, 고 분자량(MW) 응집체, 저 MW 분해 생산물 및 여과물의 감소/제거를 목적으로 하는 크로마토그래픽 폴리싱(polishing) 단계를 포함한다. 정제 공정은 일련의 단위 작업으로 구분될 수 있지만, 작업 (및 이의 단계)은 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 넓은 범위의 항체 및 조건을 커버하는, 통상적인 단백질 A 기반의 항체 정제 공정은 하기 단위 작업을 포함한다: 단백질 A 포획 → 저-pH 바이러스 불활성화 → 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 폴리싱 (일반적으로, 2번의 이온 교환 크로마토그래피 후 음이온 교환 크로마토그래피) → 바이러스 여과 → 및 최종 한외여과(ultrafiltration)-다이아필트레이션(diafiltration)(UF/DF). 항체 정제 기술의 추가 상세한 설명은 문헌 [Process Scale Purification of Antibodies, Edited by Uwe Gottschalk, John Wiley & Sons, Inc. 2009]에서 찾을 수 있다. 최종 UF/DF 단계는 정제를 완성하고 항체를 최종 사용 분야, 예를 들어, 약학적 적용을 위한 동결 건조, 마감 및 벌크 충전, 생체 내(in vivo) 시험, 임상 용도 등에 적합한 조성물로 되게 한다고 여겨진다.

따라서, 항체 조성물을 정제하기 위한 대안적인 정제 공정을 제공하는 것이 바람직하다.

본 발명은 종래의 항체 정제 공정이 특히 HCP에 관해서는 종래 여겨졌던만큼 효과적이지 않고, 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 정제 공정에서 나중에 이용하는 것이 정제 공정을 개선하고/개선하거나 더 고품질의 항체 조성물을 제공할 수 있다는 발견에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명의 제1 측면은 UF/DF-정제된 항체 조성물에 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 적용하여 약학적으로 순수한 항체 조성물을 형성하는 것을 포함하는, 항체 조성물의 정제 방법에 관한 것이다. 본 명세서에서 "약학적으로 순수한"은 이하 정의된다. UF/DF-정제된 항체 조성물은 전형적으로 항체 농도가 1 ㎎/㎖ 이상, 예를 들어, 5 ㎎/㎖ 이상, 10 ㎎/㎖ 이상, 5 내지 250 ㎎/㎖, 10 내지 150 ㎎/㎖, 15 내지 100 ㎎/㎖, 20 내지 50 ㎎/㎖ 및 30 내지 35 ㎎/㎖이다. UF/DF-정제된 항체 조성물은 부분 정제된(partially-purified) 항체 조성물에 UF/DF를 적용하여 얻는 것이 전형적이다. 부분 정제된 항체 조성물은 포획 및/또는 폴리싱 단계에 의해 형성될 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 항체 세포 배양 수확물에 친화성 크로마토그래피, 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피를 적용하여 조(crude) 항체 조성물을 포획하는 단계; 조 항체 조성물에 하나 이상의 폴리싱 단계를 적용하여 부분 정제된 항체 조성물을 형성하는 단계; 부분 정제된 항체 조성물에 UF/DF 단계를 적용하여 UF/DF-정제된 항체 조성물을 형성하는 단계; 및 UF/DF-정제된 항체 조성물에 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 적용하여 약학적으로 순수한 항체 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 항체 조성물의 정제 방법에 관한 것이다. 폴리싱 단계는 양이온 교환 크로마토그래피가 흔하고, 선택적으로 음이온 교환 크로마토그래피가 뒤따른다.

본 발명의 추가의 측면은 항체 농도가 1 ㎎/㎖ 이상, 예를 들어, 5 ㎎/㎖ 이상, 10 ㎎/㎖ 이상, 5 내지 250 ㎎/㎖, 10 내지 150 ㎎/㎖, 15 내지 100 ㎎/㎖, 20 내지 50 ㎎/㎖ 및 30 내지 35 ㎎/㎖이고 비경구적으로 허용 가능한 완충액 및 pH를 갖는 항체 조성물에, 항체 조성물 내의 숙주 세포 단백질의 양을 감소시키기에 충분한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 적용하는 것을 포함하는, 항체 조성물의 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명은 정제에서 AEX를 종래 공지된 정제 기술에 비해 늦게 이용하는 항체의 정제 방법에 관한 것이다. 포획 단계 후 IEX 폴리싱 단계 및 벌크 충전 전에 최종 UF/DF 단계로 끝나는 종래의 mAb 정제 공정이 바람직하게 낮은 수준의 HCP를 얻는데 유능하다고 여겨졌다. 일반적인 ELISA 기반의 HCP 검출 키트는 최종 UF/DF 단계 후, 적절하게 낮은 양의 HCP를 흔히 보여주었다. 그러나, 더 새롭고 더 민감한 ELISA 기반의 HCP 검출 키트로 전환한 후에, 본 발명자들은 HCP의 양이 종래에 생각했던 것보다 실제로는 훨씬 높았고 바람직한 순도 한계치 이상임을 발견했다. 이러한 발견에 기초하여, 발명자들은 고순도 항체 조성물을 제공할 수 있는 정제 공정을 찾기 위해 시도했다.

본 발명자들은 AEX가 최종 UF/DF 단계 후 수행되고 정제 효과가 개선됨을 발견했다. 하기 실시예에 입증된 바와 같이, AEX를 전-UF/DF(pre-UF/DF) 폴리싱 단계에서 후-UF/DF(post-UF/DF) 단계로 옮기는 것은 다른 측정된 불순물의 임의의 불필요한 증가없이 우수한 HCP 제거를 제공했다. AEX 단계를 UF/DF 후에 위치시키는 것은 종래의 공정에 비해 정제 효과를 증가시켰다. AEX를 최종 한외여과 후에 수행하는 것은 경제성 및/또는 시간 관점에서도 유리하다. 항체 조성물은 최종 UF/DF 후에 더 농축(예를 들어, 더 적은 부피)되기 때문에, AEX 단계는 일반적으로 UF/DF 전(즉, 폴리싱 단계 동안)보다 후에 더 빠르게 수행될 수 있다. 본 발명의 다른 이점은 강화된 바이러스 제어력이다. AEX는 일부 바이러스를 제거한다고 알려져 있다. AEX이 폴리싱 단계(전-UF/DF)로서 수행될 경우, 후속 공정 및 취급이 바이러스의 재도입의 위험을 초래할 수 있다. 그러한 위험성은 AEX를 정제 단계에서 나중에 수행함으로써 최소화될 수 있다.

일 구체예에서, UF/DF-정제된 항체 조성물이 AEX로 처리된다. "UF/DF-정제된 항체 조성물"은 일정 수준의 정제를 거치고 UF/DF 단계를 거친 것이다. 상기 기재된 전형적인 종래 기술 정제 공정에서는, 최종 UF/DF 단계가 UF/DF-정제된 항체 조성물을 제조한다. 그러한 조성물은 완전히 또는 충분히 순수할 필요가 없고 전형적으로 완전히 또는 충분히 순수하지 않다. 오히려, 일정 수준의 불순물 제거가 수행되었고 UF/DF를 통해 항체 조성물의 일부 농축이 발생하였다. 이는 본 발명에서 이용된 UF/DF-정제된 항체 조성물과 포획 전에 UF/DF 적용된 항체 조성물; 예를 들어, 포획 단계를 용이하게 하기 위한 정화 또는 준비 단계의 일부로서 UF/DF의 대상이 된 항체 조성물을 구별하는데, 적어도 그러한 정화 또는 준비 단계가 최종 용도에 적합하지 않은 불충분하게 낮은 농도의 조성물을 초래하기 때문이다. 그러한 항체 조성물은 또한 농도가 낮은 것이 전형적이다.

본 발명의 UF/DF-정제된 항체 조성물은 전형적으로 항체 농도가 15 ㎎/㎖ 이상을 포함하여, 1 ㎎/㎖ 이상, 더 전형적으로 5 ㎎/㎖ 이상, 바람직하게는 10 ㎎/㎖ 이상이다. 현실적인 이유로 인해, 항체 농도는 전형적으로 250 ㎎/㎖ 이하이다. 따라서, 항체 농도는 전형적으로 5 내지 150 ㎎/㎖의 범위이다. 일부 구체예에서, 농도는 30 내지 35 ㎎/㎖와 같은 15 내지 50 ㎎/㎖를 포함하여 10 내지 65 ㎎/㎖의 범위이다. 다른 구체예에서, 항체 농도는 75 내지 100 ㎎/㎖를 포함하여 50 내지 150 ㎎/㎖의 범위이다.

일부 구체예에서, 본 발명의 UF/DF-정제된 항체 조성물은 비경구적으로 허용 가능한 완충액 및 pH에서 항체를 포함한다. 전형적으로 항체 농도는 그러한 구체예에서 10 ㎎/㎖ 이상이고, 상기 언급한 범위, 예를 들어, 30 내지 35 ㎎/㎖와 같은 15 내지 50 ㎎/㎖를 포함한다. 종래에는 최종에 가까운 형태(예를 들어, 약학적 주입에 적합한 완충액 배지를 갖는)의 항체 조성물을 추가적인 정제를 위해 크로마토그래피 단계로 처리하는 것은 반직관적이었다. UF/DF 단계는 최종 단계로 여겨졌고, 정제된 항체 조성물을 적절한 농도 및 완충액으로 되게 하였다. 후-UF/DF의 추가적인 정제 단계가 불리하다고 여겨졌는데, 예를 들어, 후기 손실률에 관련된 고비용 및/또는 정제 공정에서 여과물 및/또는 추출물을 늦게 도입하는 위험성 때문이다.

비경구적으로 허용 가능한 완충액은, 비경구적 투여에 적절한 양, 전형적으로 1-50 밀리몰랄(millimolar)의 아세테이트, 포스페이트, 히스티딘 및/또는 시트레이트 완충액을 전형적으로 포함하는 수성 조성물이다. 조성물의 pH는 마찬가지로 비경구 제제 및 투여와 일치하고, 전형적으로 pH 4 내지 8, 바람직하게는 pH 6 내지 8의 범위 내이다. 반대로, 비경구적으로 허용 가능한 완충액은 위험하거나 또는 비경구적으로 허용되지 않는 양의 종래 정제 시약을 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 비경구적으로 허용 가능한 완충액 조성물은 항체를 위한 안정화제 및/또는 계면활성제를 추가로 포함한다.

본 발명에 대하여, UF/DF-정제된 항체 조성물이 AEX로 처리된다. 명확성을 위해, 음이온 교환 크로마토그래피 또는 "AEX"는, 항체 및 하나 이상의 불순물 (예를 들어, 숙주 세포 단백질, DNA 및/또는 내인성 또는 외래성 바이러스 (예를 들어, MulV 또는 MVM)와 같은 공정 관련된 불순물)을 포함하는 조성물이 음이온 교환 매트릭스를 이용하여 전하 차이에 기초하여 분리될 수 있는 방법을 지칭한다. 음이온 교환 매트릭스는 일반적으로 공유 결합된, 양으로 하전된 기를 포함한다. 강 또는 약 음이온 교환 매트릭스가 이용될 수 있다. 강 음이온 교환 매트릭스의 예는 4차 암모늄 이온을 갖는 것을 포함한다. 약 음이온 교환 매트릭스의 예는 3차 또는 2차 아민 작용기, 예를 들어, DEAE(디에틸아미노에틸)를 갖는 것을 포함한다. 특정 구체예에서는, 이온성 상호 작용, 예를 들어, 하나 이상의 수소 결합 상호 작용 및 소수성 상호 작용 뿐만 아니라 추가적인 결합 메커니즘을 포함하는, 다모드 음이온 교환 매트릭스가 이용될 수 있다. 적합한 음이온 교환 매트릭스의 예는 당업계에 공지되어 있고, 사르토바인드(Sartobind) Q, 나트릭스(Natrix) Q, 크로마솝(Chromasorb) Q 및 무스탕(Mustang) Q를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 무스탕 Q가 바람직한 음이온 교환 매트릭스이다.

음이온 교환 크로마토그래피 공정은 당업계에 공지된 바와 같이 항체에 대하여 결합 모드 또는 유동식 모드로 이용될 수 있다. 결합 모드에서는, 하나 이상의 불순물은 결합하지 않는 반면, 관심 항체는 음이온 교환 매트릭스에 흡착되어 불순물로부터 항체가 분리된다. 일부 구체예에서, 음이온 교환 매트릭스는 흡착된 항체가 음이온 교환 매트릭스로부터 분리되기 전에 추가적인 불순물을 제거하기 위해 완충액으로 한 번 이상 세척된다. 결합 모드에서 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 조성물로부터 하나 이상의 불순물을 제거한 후, 흡착된 항체는 음이온 교환 매트릭스로부터 제거(용리)될 수 있다. 이와는 반대로, 유동식 모드는 하나 이상의 불순물이 매트릭스에 흡착(또는 저지)되는 반면, 관심 항체는 음이온 교환 매트릭스에 상당히 흡착되지 않는 것을 의미한다. 불순물이 결합되는 동안 항체는 컬럼을 통과하고, 따라서 항체로부터 불순물이 분리된다. 정기적으로 매트릭스는 결합된 불순물을 제거함으로써 활성화시키거나 새로운 매트릭스 물질로 교체시켜야 할 것이다.

본 발명에서, AEX의 적용은 항체 조성물에 정제 효과를 제공한다. 따라서, UF/DF-정제된 항체 조성물은 본 발명에 따라 AEX로 처리된 후에 약학적으로 순수한 항체 조성물이 된다. 본 명세서에서 사용된 "약학적으로 순수한 항체 조성물"은 생산물 관련된 불순물 (예를 들어, 항체 단편, 올리고머 등) 및 공정 관련된 불순물 (예를 들어, 숙주 세포 DNA 및 HCP 등)이 약학적으로 허용 가능한 수준 이하인 조성물을 의미한다. 그러한 수준은 인간 또는 동물에 투여되는 조성물에 대해 약학 분야의 기술자에게 일반적으로 허용되는 것이다. 승인된 항체 생산물의 경우, 그러한 불순물을 한정하기 위해 미국 FDA 또는 유럽 EMA에 의해 채택된 기준이 약학적으로 순수한의 상한을 정의할 수 있다(만일, 미국과 유럽간에 한계치가 상이하다면, 더 높은 쪽이다). 일반적으로, 약학적으로 순수한 항체 조성물은 생산물 관련된 또는 공정 관련된 불순물로부터 추가적인 정제를 요구하지 않지만, 최종 제형을 형성하기 위해 무균(sterile) 여과 또는 다른 변형을 필요로 할 수 있다. 요약하면, 정제 행위는 본질적으로 완료되었다. 구체예에서, 본 발명에 따른 약학적으로 순수한 항체 조성물은 전형적으로 이하 조건을 만족할 것이다: (1) HCP 농도가 10 ppm (parts per million) 이하, 바람직하게는 5 ppm 이하, 더욱 바람직하게는 2 ppm 이하; 및 (2) DNA 농도가 20 ppb (parts per billion) 이하, 바람직하게는 10 ppb 이하, 더욱 바람직하게는 5 ppb 이하 및 흔히 1 ppb 이하. 단백질 A 또는 다른 단백질 시약이 정제 공정에서 초반부(upstream)에서 이용되면, (침출) 단백질 A의 양이 20 ppm 이하, 전형적으로 10 ppm 이하, 흔히 5 ppm 이하, 및 일부 구체예에서 1 ppm 이하의 농도로 제한되는 것이 대개 바람직하다. 또한, 일부 구체예에서, 약학적으로 순수한 항체 조성물은 항체, 이량체 및 응집체의 총량을 기준으로, 이량체 및 응집체가 전형적으로 5% 이하, 바람직하게는 2% 이하 및 흔히 1% 이하일 것이다. 그러한 불순물의 양은 항체의 양에 대해 상대적으로 표현될 수도 있다. 예를 들어, 약학적으로 순수한 항체 조성물 내 HCP의 양은 전형적으로 항체의 약 10 ng/mg 이하, 바람직하게는 약 5 ng/mg 이하, 더욱 바람직하게는 약 2 ng/mg 이하이다.

AEX 단계를 수행하기 위해 적합한 조건은 일반적으로 당업계에 알려져 있고, 통상적인 기술 및 절차를 이용하여 측정되거나 최적화될 수 있다. 본 발명에서 이용된 AEX 단계는 하나 이상의 불순물의 농도 또는 양을 감소시킨다. 따라서, UF/DF-정제된 항체 조성물은, AEX로 처리됨으로써 하나 이상의 불순물을 감소시켜 약학적으로 순수한 항체 조성물로 변형된다. 전형적으로는, 반드시 그런 것은 아니지만, 감소되는 불순물은 HCP이다. 본 발명의 특별한 구체예는 HCP의 농도 또는 양을 감소시키기 위해 (10 ㎎/㎖ 이상의 농도 및 비경구적으로 허용 가능한 완충액 및 pH를 갖는) UF/DF-정제된 항체 조성물에 AEX를 적용하는 것을 포함한다. 모든 구체예에서, 감소 정도는 특별히 한정되지 않고, 25 ppm에서 20 ppm과 같은 작지만 검출 가능한 개선을 포함하여, 순도 규격 등을 만족시킨다. 그러나, 전형적으로는, 순도 향상의 폭(magnitude)이 더욱 중요하다.

본 발명에서 정제될 수 있는 항체는 특별히 제한되지 않는다. 명확성을 위해, "항체"는 가장 넓은 의미로 해석되고, 임의의 면역글로불린(Ig), 이들의 활성 또는 목적하는 변이체 및 이들의 활성 또는 바람직한 단편 (예를 들어, Fab 단편, 카멜리드(camelid) 항체 (단일쇄 항체) 및 나노바디)를 포함한다. 항체는 다클론성 또는 단클론성일 수 있고, 자연 발생 또는 재조합으로 생산 가능하다. 따라서, 인간, 비 인간, 인간화 및 키메라 항체는 모두 용어 "항체"에 포함된다. 전형적으로, 본 발명의 방법에서 정제되는 항체는 하기 분류중 하나의 단일클론 항체이다: IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA; 그리고 보다 전형적으로는 IgG 또는 IgA이다. 항체는 당업계에 공지된 바와 같이, 다양한 항원으로 향할 수 있고, 암 관련된 항원 (예를 들어, HER-2) 또는 전-염증성 항원 (예를 들어, TNF-α와 같은 전-염증성 사이토카인)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적절한 항염증성 항체의 예는 항 TNF알파 항체, 예를 들어, 아달리무맙(alimumab), 인플리시맙(infliximab), 에타너셉트(etanercept), 골리무맙(golimumab) 및 서툴리주맙 페골(certolizumab pegol); 항 IL1 베타 항체, 예를 들어, 카나키누맙(canakinumab); 항 IL12/23 (p40) 항체, 예를 들어, 우스테키누맙(ustekinumab) 및 브리아키누맙(briakinumab); 및 항 IL2R 항체, 예를 들어, 다클리주맙(daclizumab)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적절한 항암 항체의 예는 항 BAFF 항체, 예를 들어, 벨리무맙(belimumab); 항 CD20 항체, 예를 들어, 리툭시맙(rituximab); 항 CD22 항체, 예를 들어, 에프라투주맙(epratuzumab); 항 CD25 항체, 예를 들어, 다클리주맙(daclizumab); 항 CD30 항체, 예를 들어, 이라투무맙(iratumumab), 항 CD33 항체, 예를 들어, 젬투주맙(gemtuzumab), 항 CD52 항체, 예를 들어, 알렘투주맙(alemtuzumab); 항 CD 152 항체, 예를 들어, 이플리무맙(ipilimumab); 항 EGFR 항체, 예를 들어, 세툭시맙(cetuximab); 항 HER2 항체, 예를 들어, 트라스투주맙(trastuzumab) 및 퍼투주맙(pertuzumab); 항 IL6 항체, 예를 들어, 실툭시맙(siltuximab); 및 항 VEGF 항체, 예를 들어, 베바시투맙(bevacizumab)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

항체는 통상적으로 배양 배지 내 세포에서 생산 또는 발현된다. 세포는 당업계에 공지된 바와 같이 박테리아, 식물 또는 포유류 세포일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 항체는 진핵 세포, 예를 들어, 포유류 세포 내에서 생산된다. 당업자는 관심 항체의 특성에 따라 적절한 세포주를 선택할 수 있다. 적절한 포유류 세포는, 예를 들어, CHO, VERO, BHK, HeLa, CV1, MDCK, 293, 3T3, C127, PC12, HEK-293, PER C6, Sp2/0, NSO, W138 세포 및 골수종 세포주(특히 쥐(murine))를 포함한다. 앞서 언급한 임의의 세포로부터 유래된 포유류 세포도 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 항체는 CHO 세포에 의해 생산된다.

세포가 항체를 생산하는 배양 배지는 일반적으로 잘 알려져 있고 당업자에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 배지는 당업계에 공지된 바와 같이 숙주 세포 및 클론의 특정 요구사항에 기초하여 설계된다. 배지는 다양한 성분, 예를 들어, 무기염, 탄수화물 (예를 들어, 글루코스, 갈락토스, 말토스 또는 과당과 같은 당류), 아미노산, 비타민 (예를 들어, B군 비타민(예를 들어, B12), 비타민 A, 비타민 E, 리보플라빈, 티아민 및 바이오틴), 지방산 및 지질 (예를 들어, 콜레스테롤 및 스테로이드), 단백질 및 펩티드 또는 디펩티드 (예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 피브로넥틴 및 페투인), 혈청 (예를 들어, 소태아 혈청, 갓난 송아지 혈청 및 말 혈청과 같은 알부민, 성장인자 및 성장 억제제를 포함하는 조성물), 미량 원소 (예를 들어, 아연, 구리, 셀레늄 및 트리카르복실산 중간체) 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 배지는 흔히 완충액을 함유하고, 알려진 통상적인 완충액은 PBS, 한크스액(Hanks BSS), 얼 염(Earles salt), DPBS, HBSS, EBSS를 포함한다. 배양 배지 내에서 발견된 다른 성분은 아스코르베이트, 시트레이트, 시스테인/시스틴, 글루타민, 엽산, 글루타치온, 리놀레산, 리놀렌산, 리포산, 올레산, 팔미트산, 피리독살/피리독신, 리보플라빈, 셀레늄, 티아민, 트랜스페린을 포함할 수 있다. 배양 배지는 예를 들어, 시그마-알드리치 코퍼레이션(Sigma-Aldrich Corporation, 미주리 세인트 루이스), 하이 클론(HyClone, 유타 로건), 인비트로젠 코퍼레이션(Invitrogen Corporation, 캘리포니아 칼스배드), 캠브렉스 코퍼레이션(Cambrex Corporation, E. 뉴저지 러더포드), JRH 바이오사이언스(JRH Biosciences, 캔사스 레넥사), 어바인 사이언티픽(Irvine Scientific, 캘리포니아 산티아나) 등으로부터 상업적으로 입수 가능하다.

항체의 생산은 전형적으로 다량의 불필요한 물질의 존재를 초래한다. 예를 들어, 공정 관련된 불순물, 예를 들어, HCP, 핵산 (예를 들어, 염색체 또는 염색체외 DNA; 리보핵산 (t-RNA 또는 mRNA)) 및 지질 (예를 들어, 세포벽 물질)이 항체 생산 세포("숙주 세포"로도 알려진)로부터의 불필요한 물질(세포 잔해)의 예이다. 또한, 다른 완충액, 배지 첨가제 또는 세균 오염물질 (예를 들어, 박테리아 및/또는 바이러스)과 같은 배지 성분도 목적하는 항체로부터 분리되어야 할 불필요한 물질이다. 다량체 (예를 들어, 이량체, 삼량체 등)와 같은 생산물 관련된 불순물, 목적하는 항체의 불완전한 형태 및 응집된 형태 (예를 들어, 미스폴드 또는 변성된 형태)는 전형적으로 불필요한 물질이다. 항체 조성물 내의 이러한 불필요한 물질이 불순물로 지칭된다. 생산(배양) 직후에 얻은 항체 조성물은 일반적으로 가장 덜 농축되고 가장 불순물이 많다. 이러한 초기 또는 원시 항체 조성물은 정제 처리되어 하나 이상의 불순물을 제외하고 목적하는 항체를 회수한다. 보통 정제는 부분 정제된 항체 조성물을 형성하기 위해 적어도 하나의 포획 단계 및 흔히 하나 이상의 폴리싱 단계를 포함한다.

포획 단계 전, 원시 항체 조성물은 때때로 종래의 절차에 의해 정화된다. 편의상, 항체 조성물이 정화되었는지 여부에 관계없이, 원시 및 정화된 항체 조성물을 포괄하여 본 명세서에서는 "초기 항체 조성물"로 지칭한다.

포획 단계는 당업계에 공지되어 있다. 목적은 항체를 신속하게 단리, 안정화 및 농축하는 것이다. 이상적으로는, 활성이나 수율에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 중요한 또는 유해한 불순물이 높은 수준으로 제거된다. 포획 단계를 수행하기 위해 적합한 기술은 다양한 유형의 크로마토그래피, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피 (AC), 소수성 상호 작용 (HIC), 이온 교환 (IEX) (예를 들어, 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)), 소수성 전하 유도 크로마토그래피 (HCIC) 및 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다. 포획 단계 후 얻어진 항체 조성물이 본 발명의 목적을 위한 "부분 정제된 항체 조성물"이다. 편의상 명명법에서는, 이 포획된 항체 조성물을 때때로 "조(crude) 항체 조성물"로도 지칭한다.

조 항체 조성물은 하나 이상의 폴리싱 단계로 처리 될 수 있다. 폴리싱의 목적은 불순물의 대부분을 제거하는 것이다. 폴리싱을 위해 적합한 기술은 이온 교환 크로마토그래피 (IEX), 소수성 상호 작용 크로마토그래피 (HIC) 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 포함한다.

상기 기술은 각각 당업계에 공지되어 있지만, 친화성 크로마토그래피(포획용) 및 IEX (포획 및/또는 폴리싱용), 바람직한 두 가지 기술에 대해서는 아래에서 더욱 상세히 기재된다.

친화성 크로마토그래피는 항체의 특이적 결합 특성 때문에 항체가 항체 친화성 리간드에 결합하는 분리 방법을 지칭한다. 기능적 친화성 리간드는 고체 또는 반고체 지지체 위에 고정될 수 있고, 따라서 항체를 포함하는 조성물이 리간드 및 고체 지지체를 통과할 때 리간드에 특이적 결합 친화성을 갖는 항체가 리간드에 흡착되고 하나 이상의 다른 불순물은 흡착되지 않고 (또는 낮은 친화성으로 결합되고) 항체로부터 분리된다. 통상적으로 결합하지 않는 (또는 잘 결합하지 않는) 불순물의 예는 공정 관련된 불순물 (예를 들어, 숙주 세포 단백질, DNA, 배지 성분) 및 일부 생산물 관련된 불순물 (예를 들어, 항체 단편)을 포함한다. 일부 구체예에서, 리간드를 포함하는 고체 지지체는 흡착된 항체가 리간드 및 지지체로부터 제거되기 전에 완충액을 사용하여 한 번 이상 세척하여 추가적인 불순물이 제거된다. 하나 이상의 불순물이 제거된 후에, 흡착된 항체는 리간드 및 지지체로부터 제거 (용출)될 수 있고, 원래의 조성물로부터 항체의 단리를 초래한다. 리간드 및 지지체로부터 항체를 제거하는 방법은 리간드에 좌우되고 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어, 환경, 예컨대 pH의 변화, 무질서화제 또는 변성제의 첨가 또는 상업적으로 입수 가능한 용출 완충액의 첨가를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체 조성물에 대하여 하나 이상의 친화성 정제 공정이 사용될 수 있다. 다양한 친화성 리간드가 알려져 있다. 가장 일반적인 두 가지는 단백질 A 및 단백질 G (및 이들의 혼합물)이다. 고정화된 리간드는 상업적으로 입수 가능하다. 예를 들어, 단백질 A 친화성 시스템은 맙셀렉트(MabSelect), 맙셀렉트 슈어(MabSelect SuRe), 맙셀렉트 엑스트라(MabSelect Xtra), 맙셀렉트 슈어 LX(MabSelect SuRe LX), 세파로스 CL-4B(Sepaharose CL-4B), 프로셉 vA(ProSep vA), 프로셉 vA 울트라(ProSep vA Ultra), 프로셉 vA 울트라플러스(ProSep vA UltraPlus) 및 세라믹 하이퍼D(Ceramic HyperD)를 포함한다.

일반적으로 본 발명의 포획 단계는 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하고, 구체적으로는 맙셀렉트 슈어, 프로셉 vA 울트라 또는 프로스 맙셀렉트(Poros MabSelect)를 이용한다. 맙셀렉트 및 맙셀렉트 슈어 둘 다 고 가교된 아가로스 매트릭스를 이용한다. 맙셀렉트 슈어는 강한 알칼리 조건에 더 잘 견디도록 개발되어 왔고, 통상적으로는 컬럼의 정화에 이용되었다. 단백질 A 수지의 변형은 다양한 항체 도메인과의 불필요한 상호 작용을 방지한다. 프로셉 vA 울트라는 다공성 글래스 비드를 기초로 한 수지이다. 이는 고 처리량과 함께 고 결합 용량을 갖추고 있으나, 단백질 A 누출 및 특수 세정제의 요구와 같은 단점도 있다. 전형적으로 친화성 포획의 가장 바람직한 구체예는 맙셀렉트 슈어를 포함한다.

이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 및 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 포함한다. AEX는 상기 기재되었다. CEX는 이와 유사하고 이하 기재한다. 양이온 교환 크로마토그래피는 양이온 교환 매트릭스를 이용하는 전하 차이에 기초하여 항체 및 일부 불순물 또는 불순물들이 분리될 수 있는 임의의 방법을 지칭한다. 양이온 교환 매트릭스는 일반적으로 공유 결합된, 음으로 하전된 기를 포함한다. 약 또는 강 양이온 교환 수지가 이용될 수 있다. 일반적으로, 강 양이온 교환 수지는 pH에 따라 설폰산 또는 설포네이트 기를 포함하는 지지된 유기 기를 포함한다. 일반적으로, 약 양이온 교환 수지는 pH에 따라 카르복실산 또는 카르복실레이트 기를 포함하는 지지된 유기 기를 포함한다. 일부 구체예에서, 이온성 상호 작용, 예를 들어, 하나 이상의 수소 결합 상호 작용 및 소수성 상호 작용 뿐만 아니라 추가적인 결합 메커니즘을 포함하는, 다모드 양이온 교환 수지가 이용될 수 있다. 적합한 양이온 교환 수지의 예는 당업계에 공지되어 있고, 프락토겔(Fractogel), 카르복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 포스페이트(P) 및 설포네이트(S), 프로팍 WCX-10TM(PROPAC WCX-10TM, Dionex), 캅토 S(Capto S), S-세파로스 FF(S-Sepharose FF), 프락토겔 EMD S03M(Fractogel EMD S03M), 토요펄 메가캅 II SP 550C(Toyopearl Megacap II SP 550C), 포로스 50 HS(Poros 50 HS) 및 SP-세파로스(SP-sepharose) 매트릭스를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 양이온 수지는 캅토 S, S-세파로스 FF, 프락토겔 EMD S03M, 토요펄 메가캅 II SP 550C, 포로스 50 HS에서 선택되고, 가장 바람직하게는 포로스 50 HS이다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 양이온 교환 크로마토그래피 공정이 조성물에 사용될 수 있다.

양이온 크로마토그래피 공정은 당업계에 공지된 바와 같이 항체에 대하여 결합 모드 또는 유동식 모드로 이용될 수 있다. 결합 모드에서는, 하나 이상의 불순물은 결합하지 않는 반면, 관심 항체는 양이온 교환 매트릭스에 흡착되어 불순물로부터 항체가 분리된다. 일부 구체예에서, 양이온 교환 매트릭스는 흡착된 항체가 양이온 교환 매트릭스로부터 분리되기 전에 추가적인 불순물을 제거하기 위해 완충액으로 한 번 이상 세척된다. 결합 모드에서 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 조성물로부터 하나 이상의 불순물을 제거한 후, 흡착된 항체는 양이온 교환 매트릭스로부터 제거(용리)될 수 있다. 이와는 반대로, 유동식 모드는 하나 이상의 불순물이 매트릭스에 흡착(또는 저지)되는 반면, 관심 항체는 양이온 교환 매트릭스에 상당히 흡착되지 않는 것을 의미한다. 불순물이 결합되는 동안 항체는 컬럼을 통과하고, 따라서 항체로부터 불순물이 분리된다. 정기적으로 매트릭스는 결합된 불순물을 제거함으로써 활성화시키거나 새로운 매트릭스 물질로 교체시켜야 할 것이다.

포획 단계 또는 폴리싱 단계로부터 얻어진 항체 조성물은 부분 정제된 항체 조성물로 여겨진다. 전형적으로 부분 정제된 항체 조성물은 초기 항체 조성물에 하나 이상의 폴리싱 단계가 후행되는 포획 단계로서 친화성 크로마토그래피, 예를 들어, 단백질 A, CEX 또는 혼합 모드 크로마토그래피를 적용함으로써 형성된다. 폴리싱 단계는 흔히 IEX 및 특히 CEX 단계이다. 일부 구체예에서, 폴리싱 단계는 CEX 및 AEX를 임의의 순서 (즉, CEX 다음에 AEX; AEX 다음에 CEX)로 포함한다. 부분 정제된 항체 조성물은, 추가적인 처리를 하거나 하지 않고, 그 다음에 전형적으로 UF/DF-정제된 항체 조성물을 형성하기 위해 UF/DF로 처리된다.

상기 기술한 포획 및 폴리싱 단계에 더하여, 항체 조성물은 하나 이상의 바이러스 제거 단계로 처리될 수 있다. 바이러스는 불활성화되거나 또는 조성물로부터 물리적으로 제거될 때 (또는 둘 다인 경우) "제거"된다. 본 발명의 일부 구체예에서, 바이러스 제거 단계는 포획 공정 후 및 폴리싱 전에 및/또는 폴리싱 후 및 UF/DF 전에 수행된다. 전형적으로는, 바이러스 불활성화 단계는 포획 후 및 폴리싱 전에 수행된다. 바이러스의 물리적 제거 단계는 전형적으로 폴리싱 후 및 UF/DF 전에 수행된다.

바이러스 불활성화에 대해 지칭하면, 바이러스는 최종 생산물에 잔류할 수 있으나, 비 감염성 형태로 잔류할 수 있다. 바이러스 불활성화 단계는 pH 불활성화 단계 및/또는 화학적 불활성화 단계를 포함할 수 있다. pH 불활성화 단계는 조성물의 pH를 약 5.0 이하, 흔히 약 4.0 이하 및 전형적으로 약 1.5 내지 약 4.5의 범위, 더욱 전형적으로 약 2.0 내지 약 4.0의 pH로 조정하는 것을 포함할 수 있다. pH 불활성화 단계는 조성물을, 바이러스 제거(예를 들어, 바이러스 불활성화)가 일어나기에 충분한 다양한 길이의 시간, 예를 들어, 1분 내지 2시간, 그리고 전형적으로는 45분 내지 75분 동안 상기 범위 내의 하나 이상의 pH 값에서 배양하는 것을 포함할 수 있다. 화학적 불활성화 단계는 용매 또는 세제를 사용하는 처리, 방사선 조사 및/또는 바이러스를 불활성화하는데 충분한 고온에의 순간 노출을 포함할 수 있다. 이러한 바이러스 불활성화 방법은 당업자에게 알려져 있으며 당업자는 적절한 처리 조건을 선택할 수 있다.

바이러스 제거 단계가 조성물로부터의 바이러스의 물리적 제거를 포함하는 경우, 전형적으로는 여과가 포함된다. 구체적으로, 나노여과는 항체로부터 바이러스를 분리하기 위해, 기공 크기가 예를 들어, 50 nm 미만 및 심지어 15 nm 미만과 같은 75 nm 미만인 매트릭스에 조성물을 통과시키는 것을 포함한다. 다양한 나노필터는 상업적으로 입수 가능하고 당업계에 알려져 있다.

부분 정제된 항체 조성물은, 바이러스 제거 단계를 거치거나 거치지 않고, UF/DF로 처리되어 UF/DF-정제된 항체 조성물을 형성할 수 있다. UF/DF는 한외여과 및 다이아필트레이션이 결합된 작업이다. 이 단계는 입자를 제거하고, 항체를 농축시키고 항체 조성물의 수성 또는 완충액 조성물을 교환/변형한다. 당업계에 공지되어 있지만, 명확성을 위해 용어 "한외여과"는 물 및 저 분자량 분자는 필터를 통과하는 반면에 큰 분자(일반적으로 >103-106 Da)는 필터에 남는 특정 기공 크기 직경의 하나 이상의 반투과성 필터(또는 막 또는 배지)에 조성물을 통과시켜 항체로부터 불순물을 분리하는 공정을 지칭한다. 이러한 저 분자량 분자는 배지 성분, 항체 단편 및/또는 예를 들어, 리포폴리사카라이드와 같은 다른 오염물(불순물)을 포함할 수 있다. 전형적으로, 불순물은 대체로 투과물(permeate) 스트림에 있는 반면, 본 발명의 항체는 대체로 잔류물(retentate) 스트림에 있다. 여과를 지칭할 때 용어 "투과물 스트림"은 여과 동안 필터 기공을 통해 통과하는 조성물의 분획을 지칭한다. 여과를 지칭할 때 용어 "잔류물 스트림"은 여과 동안 필터에 남아있거나 필터 기공을 통과하지 못하는 조성물의 분획을 지칭한다. 이 공정도 항체 조성물을 농축시킨다.

적절한 유형의 UF/DF 장치는 당업자에게 알려져 있고, 다양한 요인, 예를 들어, 여과될 항체의 분자량, 여과될 조성물 성분의 양 및 크기, 여과될 조성물의 부피, 및 여과될 조성물의 생존력 및 세포 밀도에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, 필터, 예를 들어, 막 울트라필터, 플레이트 울트라필터, 카트리지 울트라필터, 백 울트라필터 또는 진공 울트라필터가 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 상업적으로 입수 가능한 울트라필터는 다양한 회사, 예를 들어, 밀리포어 코퍼레이션(Millipore Corporation, 매사추세츠 빌러리카), 폴 코퍼레이션(Pall Corporation, 뉴저지 이스트 힐즈), GE 헬스케어 사이언스(GE Healthcare Sciences, 뉴저지 피스카타웨이) 및 사토리우스 코퍼레이션(Sartorius Corporation, 독일 괴팅겐)에 의해 제조된다.

다이아필트레이션은 최종 용도, 예를 들어, 저장, 동결 건조, 비경구 제제 등을 위한 항체 조성물을 완성시키는데 도움이 된다. 완충액 시스템은 전형적으로 완충제 및/또는 이의 농축물의 첨가/제거/교체에 의해 교환 및/또는 변형된다. 추가적인 첨가제는 예를 들어, pH, 독성, 용해도 및/또는 안정성을 조정하도록 포함될 수 있다. 안정성은 액체 상태에서 항체 조성물이 안정화되거나, 또는 동결 건조 또는 재구성 동안 항체를 보호하는 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 트라스투주맙 조성물에서는 트레할로스가 안정화제로서 첨가될 수 있다.

항체 조성물의 최종 용도가 비경구 제제인 경우, 다이아필트레이션 단계를 통해 원하는 제제 부형제의 일부 또는 전부를 첨가하는 것이 가능하다. 이러한 부형제는 포스페이트 완충액 (예를 들어, 인산나트륨 용액), 식염수 (예를 들어, 0.8%), 링거스 덱스트로스(Ringer's dextrose), 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이티드 링거스(lactated Ringer's), 전해질, 계면활성제(폴리소르베이트), 안정화제 및 항균제 또는 항산화제와 같은 방부제를 포함할 수 있다.

다이아필트레이션은 조성물을 최종 약학적 형태로 되게 하거나 모든 부형제를 제공할 필요도 없다. 추가적인 부형제 또는 조성물의 완전한 변화는 UF/DF 또는 후속 AEX 처리 단계 후 수행될 수 있다. 그럼에도 불구하고, UF/DF 단계는 일반적으로 항체 조성물을 최종에 가까운 약학적 형태로 되게 하므로, 상기 첨가제의 하나 이상은 UF/DF 동안 UF/DF-정제된 항체 조성물로 도입될 수 있다.

UF/DF-정제된 항체 조성물은 상기 기재된 바와 같이 AEX로 처리되어 HCP와 같은 하나 이상의 불순물을 감소시키고 약학적으로 순수한 항체 조성물을 형성한다. 효율성의 이유로, AEX 처리는 보통 UF/DF 단계 직후 수행된다. 그러나, 단계를 개입하는 것도 가능하다. 그러한 단계는 추가적인 UF 단계 또는 바이러스 제거 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서는, 다른 크로마토그래픽 정제 단계가 UF/DF 단계와 AEX 단계 사이에 삽입되지 않는다. 이러한 선호성이 복수의 AEX 단계를 배제하지는 않는다.

본 발명의 AEX 단계 후, 항체 조성물은 최종 용도를 위해 추가적으로 변형될 수 있다. AEX 단계 후 추가적인 단계가 가능하지만, 전형적으로는 추가적인 크로마토그래픽 정제 단계는 수행되지 않는다. 조성물 변형 뿐만 아니라 바이러스 제거 단계가 수행될 수 있다. 벌크 또는 바이알 내로 충전하기 전에, 임의의 하기 단계가 수행될 수 있다: (a) 부형제를 약학적으로 순수한 항체 조성물에 첨가; (b) 약학적으로 순수한 항체 조성물을 농축; (c) 약학적으로 순수한 항체 조성물을 희석; (d) 약학적으로 순수한 항체 조성물의 pH를 조정; 및/또는 (e) 약학적으로 순수한 항체를 무균 여과. 추가적인 단계를 거치거나 거치지 않고, 항체 조성물은 비경구 제제로서 벌크 충전 또는 바이알 내부로의 조제를 위해 준비될 수 있다. 대안적으로는, 조성물은 저장 및 추후 재구성을 위해 동결 건조될 수 있다.

구체예에서, 본 발명에 따라 AEX 처리된 약학적으로 순수한 항체 조성물은 항체 농도가 5 내지 150 ㎎/㎖, 예를 들어, 15 내지 50 ㎎/㎖ 및 20-25 ㎎/㎖이다.

본 발명의 방법으로 제조된 항체를 함유하는 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 예를 들어, 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트와 같은 완충액 물질, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌-폴리프로필렌-블록 폴리머 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있다. 비경구적 투여를 위한 제제는 무균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유화액을 포함한다. 비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 식염수 및 완충 배지를 포함하는 물, 알콜계/수계 용액, 유화액 또는 현탁액을 포함한다. 비경구 제제는 단일 볼루스(bolus) 투여량(dose), 주입제(infusion) 또는 로딩 볼루스 투여 후 유지 투여량일 수 있다.

항체를 단리하는 경우, 일부 구체예에서, 예를 들어, 상업적 제조 공정 동안에는 큰 용적(large volume)의 조성물이 존재할 수 있다. 단리될 항체를 발현하는 세포 배양물은 대규모 제조에 적절한 크기의 용기, 예를 들어, 미생물 반응기에서 자랄 수 있다. 큰 용적은 단리 공정에 몇 가지 과제를 제시한다. 예를 들어, 큰 용적이 이용되는 경우, 필터를 통한 유속의 작은 변화가 분리된 항체의 회수에 미치는 효과가 증대된다. 마찬가지로, 큰 용적을 사용할 때, 원래의 조성물에서 세포 밀도의 증가가 생산물 회수에 미치는 효과도 증대된다. 따라서, 큰 용적의 조성물의 사용은 작은 용적의 사용에 비해서 증대되고 더 큰 파생 결과를 갖는 독특한 문제점을 나타낸다. 따라서, 일부 구체예에서 본 발명은 큰 용적의 조성물에 존재하는 항체를 단리하는 방법에 관한 것이다. 용어 "큰 용적"은 상업적 및/또는 공업적 항체 생산에 관련된 부피를 지칭한다. 일부 구체예에서, 용어 "큰 용적"은 10 내지 2,000 리터, 20 내지 1,000 리터 또는 50 내지 500 리터를 지칭한다. 일부 구체예에서, 용어 "큰 용적"은 500 리터 이상, 750 리터 이상, 1,000 리터 이상, 1,250 리터 이상, 1,500 리터 이상, 2,000 리터 이상, 5,000 리터 이상 또는 10,000 리터 이상을 지칭한다.

일부 구체예에서, 본 발명은 여기에 기재된 임의의 방법으로 제조된 항체에 관한 것이다.

일부 구체예에서, 항체 또는 여기에 기재된 임의의 방법으로 제조된 항체를 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능하다. "약학적으로 허용 가능"은 올바른 의학적 판단 범위 내에서 과도한 독성 또는 합리적인 실익/위험 비율에 상응하는 다른 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 항체 또는 조성물을 지칭한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 방법으로 단리된 항체는 개체의 치료에 사용될 수 있다. 여기에 이용된 "개체"는 인간 및 비-인간을 포함하는, 포유류로 분류된 임의의 동물, 예를 들어, 가축 및 농장 가축, 동물원 동물, 스포츠용 동물 및 애완동물을 지칭하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 개체는 인간을 지칭한다.

용어 "치료하다" 및 "치료"는, 원치않는 생리적인 상태, 장애 또는 질환을 예방 또는 완화(경감)하거나 유익한 또는 원하는 임상 결과를 얻는 것을 목적으로 하는, 치료법상의 치료 뿐만 아니라 예방, 유지 또는 예방책을 지칭한다.

본 발명의 방법에 따른 단리된 항체 생산물의 투여 경로는 예를 들어, 경구, 비경구, 흡입 또는 국소 투여 형태를 통해 가능하다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가적으로 설명된다.

실시예

실시예 1. 종래의 정제

정제하기 위해 하기 절차를 이용하여 4번 수행하였다. CHO 세포로부터 생산된 트라스투주맙을 포함하는 조성물은 단백질 A 칼럼에서의 포획, 바이러스 불활성화, AEX 다음으로 CEX를 이용하는 폴리싱, 바이러스 여과 및 그 다음에 UF/DF로 처리하였다. 다음과 같이 단계를 수행하였다:

단백질 A 단계(맙셀렉트 슈어, GE 헬스케어)는 컬럼을 0.1 M NaOH로 15 분간 위생 처리하고 밀리 Q 정제수(MQ)로 세척하여 시작했다. 그 후 컬럼은 PBS를 이용하여 pH 7.4에서 평형화되었다. 수확물이 맙셀렉트 슈어 ml당 < 25 mg 트라스투주맙의 비율로 컬럼에 로딩되었다. 그 후 컬럼은 평형 완충액으로 세척된 후 25 mM NaAc pH 5.0으로 세척되었다. 그 후 항체는 25 mM 아세테이트 pH 3.0으로 용출되었다.

바이러스 불활성화가 뒤를 이었다. 단백질 A 용출 풀의 pH는 0.1 M HCl를 이용하여 pH 3.5로 조정되었고, 60-75분간 이 pH로 유지시켰다. pH는 0.1 M NaOH를 이용하여 다시 pH 4.5로 높아졌고, 그 후 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 무균 여과하였다.

음이온 교환 크로마토그래피가 뒤를 이었다. 음이온 교환막(무스탕 Q 필터, Pall)은 MQ를 이용하여 사전 세척되었고, 그 후 5 막 부피(MV)에 대해 1.0 M NaOH로 위생 처리되었다. 25 mM H₃P0₄ + 1 M NaCl로 중화한 후에, 필터는 25 mM NaAc + 10 mM NaCl를 이용하여 pH 4.5로 평형화되었다. 필터에는 상기 바이러스 불활성화 단계로부터 최대(≤) 3.0 g (ml MV)-1 항체가 로딩되었다. 잔존 CHO 단백질 및 DNA와 같은 오염물은 필터에 결합한 반면, 항체는 필터를 통과했다. 필터는 25 mM NaAc + 10 mM NaCl pH 4.5로 세척되었고 용출 생산물은 0.22 ㎛ 무균 필터를 통해 여과되었다.

양이온 교환 크로마토그래피가 뒤를 이었다. 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼(포로스 HS 50 컬럼; Applied Biosystems)은 0.5 M NaOH로 살균되었고 MQ로 세척되었다. 25 mM NaAc pH 4.5 + 10 mM NaCl로 평형이 되었다. 음이온 교환 크로마토그래피 공정으로 정제된 항체 벌크는 10 - 20 g 항체/mL 수지의 농도로 로딩되었다. 컬럼은 평형 완충액으로 세척되었고, 그 후 25 mM NaAc pH 4.5 + 200 mM NaCl로 세척되었다. 그 후 항체 생산물은 3 컬럼 부피에서 25 mM NaAc pH 4.5 + 200 mM NaCl로부터 25 mM NaAc pH 4.5 + 290 mM NaCl까지의 농도 구배를 이용하여 용출되었다. 용출은 25 mM NaAc pH 4.5 + 290 mM NaCl로 계속되었다.

바이러스 여과가 뒤를 이었다. 공급 회사의 지시에 따라, 양이온 교환 크로마토그래피 항체 생산물은 가압 여과 시스템을 이용하는 비레솔브 프로(Viresolve Pro) 막(밀리포어)을 이용함으로써 바이러스 여과되었다. 비레솔브 프로 장치는 MQ로 사전 세척되었고 25 mM NaAc + 290 mM NaCl pH 4.5로 평형화되었다. < 565 g m-2 (플라노바(Planova)), < 2 kg m-2 (비레솔브 프로)의 로드로 CEX 벌크를 가한 후에, 필터는 25 mM NaAc + 290 mM NaCl pH 4.5로 세척되었다. 여과가 멈춘 후, 항체 생산물은 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 바이러스 여과되었다.

한외여과/다이아필트레이션(UF/DF)는 바이오맥스 50KD (수행 1) 또는 30 KD (수행 2-4), 분자량 컷오프가 30 kDa인 UFDF 필터 (밀리포어)를 이용하여 수행되었다. 필터는 MQ로 사전 세척되었고, 0.1 M NaOH로 살균되었고, 그 후 NaOH를 제거하기 위해 MQ로 세척되었다. 그 후 필터는 25 mM 아세테이트 pH 4.5 + 290 mM NaCl로 평형화되었다. 바이러스 여과된 항체 생산물은 그 후에 < 730 g 항체/m² 막의 로드를 이용하여 필터에 로드되었다. 25 - 35 ㎎/㎖로 농축한 후에, 항체 생산물의 완충액은 50 mM 트레할로스 + 4.2 mM 히스티딘 pH 6.0으로 교환되었다. 10 다이아필트레이션 부피가 완충액 교환에 이용되었다.

각각의 수행에 대한 최종 생산물은 함량, 생산물 관련된 불순물(이량체, 응집체) 및 공정 관련된 불순물(HCP, res Prot A, res DNA)에 대해 시험되었다. 그 결과에 대한 요약이 표 1에 기재되어 있다(LOQ는 정량 한계를 의미한다).

4번의 수행에서 얻은 결과 요약

수행	트라스투주맙 함량	이량체/응집체	HCP¹	HCP²	res Prot A
수행	(mg/ml)	(%)	ppm	ppm	ppm
수행 1	20.3	0.34/0	3.3	43.7	〈LOQ
수행 2	19.9	0.15/0	4.2	80.8	2.0
수행 3	19.9	0.37/0	7.4	62.9	〈LOQ
수행 4	19.5	0.25/0	6.0	24.3	〈LOQ

¹ 이 값을 위해 F015 CHO 키트(Cygnus)가 이용되었다.

² 이 값을 위해 F550 CHO 키트(Cygnus)가 이용되었다.

본 발명자들은 종래 키트인 F015 CHO 키트(Cygnus)를 사용하면 숙주 세포 단백질(HCP) 값이 10 ppm 미만으로 나타났음에 주목한다. 그러나, 더 신규하고 더 민감한 F550 CHO 키트(Cygnus)를 이용하여 시험을 반복한 경우, 숙주 세포 단백질은 실제로는 종래 알려진 것보다 부적절하게 더 높은 수준으로 존재한다는 것이 밝혀졌다. HCP 수준을 10 ppm 미만으로 낮추는 것은 본 발명자들이 목적하는 바였다.

생산물 관련된 불순물(FTMB의 이량체, 응집체 같은)에 관하여, 4개의 모든 샘플은 생산물 관련된 불순물이 적절하게 낮은 수준이었다(표 1). 모든 생산물 또는 공정 관련된 불순물(CHO 단백질 제외)은 원하는 임계치 수준으로 제거되었다.

실시예 2. 최종 한외여과 공정 후, 음이온 교환 크로마토그래피 공정으로 정제

하기 차이점을 제외하고는, CHO 세포로부터 생산된 트라스투주맙을 포함하는 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제하였다. 수행 5의 경우, 단백질 A 단계는 1M 염화나트륨 세척을 포함하도록 변경되었고, 바이러스 여과 단계는 생략하였고, UF/DF 단계는 비바스핀(Vivaspin) 장치를 이용하였고, 완충액 교환을 위해 1000 다이아필트레이션 부피를 이용하였다. 수행 6의 경우, 단백질 A 단계는 1M 염화나트륨 세척을 포함하도록 변경되었고, 바이러스 여과 단계는 플레노바(Plenova) 15 N 필터(아사이 카세이)를 이용하였고, UF/DF 단계는 울트라셀(Ultracel) 30 KD 필터를 이용하였다. 추가적으로, 실시예 1의 전-UF/DF 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 단계는 생략하였고 하기 AEX 단계가 UF/DF 단계 후 추가되었다.

농축된 및 다이아필트레이션된 물질에 대한 AEX: 음이온 교환 크로마토그래피를 위해, 무스탕 Q 필터(폴)를 이용하였다. 막은 MQ로 사전 세척되었고 그 후 5 막 부피(MV)에 대해 1.0 M NaOH로 위생 처리되었다. 25 mM H₃P0₄ + 1 M NaCl로 중화하고 MQ로 세척한 후에, 필터는 50 mM 트레할로스 + 4.2 mM 히스티딘 pH 6.0로 평형화되었다. 수행 5를 위해, 필터에는 0.36 g 트라스투주맙 (ml MV)-1이 로딩되었고 ; 수행 6을 위해, 필터에는 최대(≤) 3.0 g 트라스투주맙 (ml MV)-1이 로딩되었다. 잔존 CHO 단백질 및 DNA와 같은 오염물은 필터에 결합한 반면, 항체는 필터를 통과했다. 필터는 50 mM 트레할로스 + 4.2 mM 히스티딘 pH 6.0로 세척되었고 수집된 통과물은 0.22 ㎛ 무균 필터를 통해 여과되었다.

2번의 개별 수행으로부터의 최종 샘플은 함량, 생산물 관련된 불순물(이량체, 응집체) 및 공정 관련된 불순물(HCP, res Prot A, res DNA)에 대해 시험되었다. 그 결과에 대한 요약이 표 2에 기재되어 있다.

2번의 수행에서 얻은 결과 요약

수행	트라스투주맙 함량	이량체/응집체	HCP¹	res Prot A	DNA
수행	(mg/ml)	(%)	ppm	ppm	ppm
5	7.90	0.5/0	〈1	n/d	〈10
6	23.4	nd	〈0.65	〈0.04	〈0.07

¹ 이 값을 위해 F550 CHO 키트(Cygnus)가 이용되었다.

nd: 검출되지 않음(not determined)

숙주 세포 단백질 수준은, 검출을 위해 더 신규하고 더 민감한 F550 CHO 키트(Cygnus)를 이용했을 때, 원하는 HCP 수준보다 낮았다(10 ppm 미만). 샘플 둘 다 생산물 관련된 불순물(예를 들어, 트라스투주맙의 이량체, 응집체)이 적절하게 낮은 수준이었다. 이 결과는 최종 UF/DF 단계 후로 AEX 단계를 재배치함으로써 같은 수의 단계를 사용하여 전반적인 순도가 개선되었음을 나타낸다.

실시예 3. 최종 한외여과 공정 전과 후, 음이온 교환 크로마토그래피 공정으로 정제

하기 차이점을 제외하고는, CHO 세포로부터 생산된 트라스투주맙을 포함하는 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제하였다. 수행 7-10의 경우, 바이러스 여과 단계는 플레노바 15 N 필터(아사이 카세이)를 이용하였고, UF/DF 단계는 울트라셀 30 KD 필터를 이용하였다. 추가적으로, 추가적인 AEX 단계가 UF/DF 단계 전, 수행되었고, 추가적인 AEX 단계가 실시예 2의 수행 2에 기재된 바와 같이 수행되었다.

4번의 개별 수행으로부터의 최종 샘플은 함량, 생산물 관련된 불순물(이량체, 응집체) 및 공정 관련된 불순물(HCP, res Prot A, res DNA)에 대해 시험되었다. 그 결과에 대한 요약이 표 3에 기재되어 있다.

4번의 수행에서 얻은 결과 요약

수행	트라스투주맙 함량	이량체/응집체	HCP²	res Prot A	DNA
수행	(mg/ml)	(%)	ppm	ppm	ppm
7	23.3	0.31/0.03	7.47	〈0.3	nd
8	21	단량체:99.4	〈0.47	〈0.83	〈1.0
9	24	단량체:99.5	〈0.50	〈0.81	〈1.0
10	23	단량체:97.4	〈1.4	〈0.88	〈1.0

² 이 값을 위해 F550 CHO 키트(Cygnus)가 이용되었다.

nd: 검출되지 않음

숙주 세포 단백질 수준(2번의 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 갖는 공정으로부터: UF/DF 단계 전에 한 번 및 후에 한 번)은, 시험된 4번의 수행에 대한 검출을 위해 더 신규하고 더 민감한 F550 CHO 키트(Cygnus)를 이용한 경우, 원하는 HCP 수준보다 낮았다(10 ppm 미만). 공정 및 생산물 관련된 불순물도 적절하게 낮았다.

이러한 실시예는 항체의 향상된 순도(예를 들어, 감소된 숙주 세포 단백질 농도)가 최종 UF/DF 공정 후에 음이온 교환 크로마토그래피 공정을 수행함으로써 얻어질 수 있다는 것을 나타낸다.

결론

본 명세서에 기재된 모든 다양한 구체예 또는 선택사항은 임의의 및 모든 변형에 결합될 수 있다. 본 발명은 특히, 본 발명의 일부 구체예들을 참조하여 도시되고 설명되었지만, 당업자에게는 이들은 단지 예시 방법으로 기재된 것일 뿐 제한하는 것이 아니고, 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않는 한, 형태 및 상세 내용에서 다양한 변경이 가능하다고 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 폭과 범위는 상기 기재된 예시적인 구체예에 의해 제한되는 것이 아니라, 하기 청구 범위 및 그 등가물에 따라서만 정의되어야 한다.

논문 기사 또는 요약, 공개된 또는 상응하는 미국 또는 외국의 특허 출원, 발행된 또는 외국의 등록 특허 또는 임의의 다른 문헌을 포함하는 여기 인용된 모든 문헌은, 인용된 문헌 내에 나타난 모든 데이터, 표, 도면 및 글을 포함하여, 각각 본 명세서에서 참조로서 완전히 포함된다.

Claims

UF/DF-정제된 항체 조성물에 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 적용하여 약학적으로 순수한 항체 조성물을 형성하는 것을 포함하는, 항체 조성물의 정제 방법.
제1항에 있어서, 상기 UF/DF-정제된 항체 조성물은 항체 농도가 1 ㎎/㎖ 이상, 예를 들어, 5 ㎎/㎖ 이상 및 10 ㎎/㎖ 이상인 것인 항체 조성물의 정제 방법.
제2항에 있어서, 상기 UF/DF-정제된 항체 조성물은 항체 농도가 5 내지 250 ㎎/㎖, 예를 들어, 10 내지 150 ㎎/㎖ 및 15 내지 100 ㎎/㎖인 것인 항체 조성물의 정제 방법.
제3항에 있어서, 상기 UF/DF-정제된 항체 조성물은 항체 농도가 250 ㎎/㎖ 이하인 것인 항체 조성물의 정제 방법.
제4항에 있어서, 상기 UF/DF-정제된 항체 조성물은 항체 농도가 20 내지 50 ㎎/㎖, 예를 들어, 30 내지 35 ㎎/㎖인 것인 항체 조성물의 정제 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적으로 순수한 항체 조성물을 바이알 내로 충전하는 단계를 추가로 포함하는 항체 조성물의 정제 방법.
제6항에 있어서, 상기 충전하는 단계 전, 상기 약학적으로 순수한 항체 조성물을 무균적으로(aseptically) 여과하는 단계를 추가로 포함하는 항체 조성물의 정제 방법.
제7항에 있어서, 상기 충전하는 단계 전, 하기 단계들 중 하나 이상을 추가로 포함하는 항체 조성물의 정제 방법:
(a) 부형제를 상기 약학적으로 순수한 항체 조성물에 첨가하는 단계;
(b) 상기 약학적으로 순수한 항체 조성물을 농축하는 단계;
(c) 상기 약학적으로 순수한 항체 조성물을 희석하는 단계; 및/또는
(d) 상기 약학적으로 순수한 항체 조성물의 pH를 조정하는 단계.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 부분 정제된 항체 조성물에 UF/DF를 적용하여 상기 UF/DF-정제된 항체 조성물을 형성하는 것을 추가로 포함하는 항체 조성물의 정제 방법.
제9항에 있어서, 세포 배양 수확물에 항체 포획 단계 및 선택적으로 하나 이상의 폴리싱 단계를 적용하여 상기 부분 정제된 항체 조성물을 형성하는 것을 추가로 포함하는 항체 조성물의 정제 방법.
제10항에 있어서, 상기 포획 단계는 친화성 크로마토그래피, 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피를 활용하는 것인 항체 조성물의 정제 방법.
제10항에 있어서, 상기 포획 단계는 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC) 또는 혼합 모드 크로마토그래피를 활용하는 것인 항체 조성물의 정제 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 폴리싱 단계는 상기 포획 단계 후 수행되는 것인 항체 조성물의 정제 방법.
제13항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리싱 단계는 이온 교환 크로마토그래피(IEX), 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC) 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체 조성물의 정제 방법.
세포 배양 수확물에 친화성 크로마토그래피, 예를 들어, 단백질 A 크로마토그래피를 적용하여 조(crude) 항체 조성물을 형성하는 단계;
상기 조 항체 조성물에 하나 이상의 폴리싱 단계를 적용하여 부분 정제된 항체 조성물을 형성하는 단계;
상기 부분 정제된 항체 조성물에 UF/DF 단계를 적용하여 UF/DF-정제된 항체 조성물을 형성하는 단계; 및
상기 UF/DF-정제된 항체 조성물에 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 적용하여 약학적으로 순수한 항체 조성물을 형성하는 단계를 포함하는, 항체 조성물의 정제 방법.
제15항에 있어서, 상기 약학적으로 순수한 항체 조성물에, 나노여과와 같은 바이러스 제거 단계를 적용하는 것을 추가로 포함하는 항체 조성물의 정제 방법.
제15항에 있어서, 상기 하나 이상의 폴리싱 단계는 상기 조 항체 조성물에 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 단계를 적용하는 것을 포함하는 항체 조성물의 정제 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 트라스투주맙 또는 퍼투주맙인 것인 항체 조성물의 정제 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 CHO 세포에서 생산되는 것인 항체 조성물의 정제 방법.
항체 농도가 10 ㎎/㎖ 이상, 예를 들어, 20 내지 50 ㎎/㎖ 및 30 내지 35 ㎎/㎖이고 비경구적으로 허용 가능한 완충액 및 pH를 갖는 항체 조성물에, 상기 항체 조성물 내의 하나 이상의 불순물, 예를 들어, 숙주 세포 단백질의 양을 감소시키기에 충분한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 적용하는 것을 포함하는, 항체 조성물의 정제 방법.