CN114539351B - 纳米抗体的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米抗体的纯化方法,包括如下步骤:将纳米抗体收获液依次进行阳离子层析和阴离子层析,收集阴离子层析洗脱液;其中,所述阴离子层析采用的洗脱液的pH为7±0.5,所述洗脱液包含:10±2mM的Na2HPO4、10±2mM的NaH2PO4、0.01M~0.03M的精氨酸以及2mM~8mM的(NH4)2SO4。上述纳米抗体的纯化方法能够有效提高纳滤过程中的纳滤膜可滤过载量,同时还能够有效去除纳米抗体制品中的宿主细胞蛋白(HCP),并在层析过程中维持纳米抗体的稳定性,减少聚集体的形成。
Description
技术领域
本发明涉及抗体纯化技术领域,特别是涉及一种纳米抗体的纯化方法。
背景技术
动物源性病毒感染人类的风险性极高,潜在的医源性感染性问题变得日益突出。因此,由人的、动物的组织或者体液提取的制品、动物源性单克隆抗体及真核表达的重组制品,生产工艺中一定要包含能有效地去除/灭活这些潜在病毒的工艺步骤,以确保制品的生物安全性。目前抗体的纯化工艺中,去除这些潜在病毒的主要方法之一为采用20nm孔径的纳滤膜对制品进行纳滤,如此能够有效去除制品中潜在的细小病毒。
纳米抗体(nanobodies,Nbs)因具有较小的相对分子质量,相比较传统的单克隆抗体具有独特的优势,包括免疫原性相对较弱、组织渗透性增强等,其独特的分子结构也使其适用于疾病诊断治疗等诸多领域。
但是,纳米抗体在进行纳滤的过程中可滤过载量低,如此增加了纳滤膜的需求量,同时目前商业化纳滤膜成本较高,导致纳米抗体的纯化成本较高,限制了其推广应用。
发明内容
基于此,本发明提供一种能够有效提高纳滤过程中的纳滤膜可滤过载量的纳米抗体的纯化方法。
具体技术方案如下:
本发明提供一种纳米抗体的纯化方法,包括如下步骤:
将纳米抗体收获液依次进行阳离子层析和阴离子层析,收集阴离子层析洗脱液;其中,所述阴离子层析采用的第一洗脱液的pH为7±0.5,所述第一洗脱液包含:10±2mM的Na2HPO4、10±2mM的NaH2PO4、0.01M~0.03M的精氨酸以及2mM~8mM的(NH4)2SO4。
在其中一个实施例中,所述第一洗脱液的用量为≥3倍柱体积,洗脱的保留时间≥5分钟。
在其中一个实施例中,所述阴离子层析采用的上样载量范围为<200g/L,保留时间≥5分钟。
在其中一个实施例中,所述阴离子层析采用的色谱柱的填料为表面键合有官能团-N+(CH3)3的亲水性聚甲基丙烯酸酯,粒径为60μm。
在其中一个实施例中,所述阴离子层析采用的色谱柱为Monomix HC60 Q。
在其中一个实施例中,所述阳离子层析包括如下步骤:
(1)将所述纳米抗体收获液上样至阳离子层析柱;
(2)采用淋洗液进行淋洗,所述淋洗液的pH为5±0.5,所述淋洗液包含:10±2mM的醋酸钠-醋酸缓冲液以及0.1±0.02M的NaCl,所述淋洗液的用量≥3倍柱体积,保留时间≥5分钟;
(3)采用第二洗脱液进行洗脱,所述第二洗脱液的pH为5.5±0.5,所述第二洗脱液包含:10±2mM的醋酸钠-醋酸缓冲液以及0.3±0.05M的NaCl,所述第二洗脱液的用量≥3倍柱体积,保留时间≥5分钟。
在其中一个实施例中,所述阳离子层析采用的上样载量范围为<200g/L,保留时间≥5分钟。
在其中一个实施例中,所述纳米抗体的分子大小为70KD~80KD。
在其中一个实施例中,所述阴离子层析洗脱液中纳米抗体的粒径≤10nm。
在其中一个实施例中,所述阴离子层析洗脱液的纳滤膜可滤过载量为350L/m2以上。
在其中一个实施例中,所述阴离子层析结束后,还包括对所述阴离子层析洗脱液进行纳滤的步骤。
在其中一个实施例中,所述纳滤采用的纳滤膜为再生纤维素中空纤维膜。
本发明在研究中偶然发现,通过在阴离子层析的洗脱液中配合采用一定量的精氨酸以及(NH4)2SO4,能够使获得的洗脱液中纳米抗体的粒度维持在较小的尺寸范围,且不易聚集,进而可以有效提高后续纯化过程中的纳滤膜可滤过载量,降低纳滤的用量,节约纯化成本,便于纳米抗体制品的推广应用。
另外,上述纳米抗体的纯化方法还能够有效去除纳米抗体制品中的宿主细胞蛋白(HCP),并在层析过程中维持纳米抗体的稳定性,减少聚集体的形成。
附图说明
图1为实施例1制备得到的阴离子层析液的纳滤膜可滤过载量测试结果;
图2为对比例1制备得到的阴离子层析液的纳滤膜可滤过载量测试结果;
图3为对比例2制备得到的阴离子层析液的纳滤膜可滤过载量测试结果;
图4为对比例3制备得到的阴离子层析液的纳滤膜可滤过载量测试结果;
图5为对比例4制备得到的阴离子层析液的纳滤膜可滤过载量测试结果;
图6为对比例5制备得到的阴离子层析液的纳滤膜可滤过载量测试结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的纳米抗体的纯化方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施方式。相反地,提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本发明中,以开放式描述的技术特征中,包括所列举特征组成的封闭式技术方案,也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中,涉及到数值区间,如无特别说明,上述数值区间内视为连续,且包括该范围的最小值及最大值,以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地,当范围是指整数时,包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外,当提供多个范围描述特征或特性时,可以合并该范围。换言之,除非另有指明,否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中涉及的百分比含量,如无特别说明,对于固液混合和固相-固相混合均指质量百分比,对于液相-液相混合指体积百分比。
本发明中涉及的百分比浓度,如无特别说明,均指终浓度。所述终浓度,指添加成分在添加该成分后的体系中的占比。
本发明中的温度参数,如无特别限定,既允许为恒温处理,也允许在一定温度区间内进行处理。所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。
本发明中,“纳滤膜可滤过载量”是指持续过滤一定料液体积,通量衰减至初始通量的90%以下。
若无特别说明,本发明中涉及的溶液的溶剂均为注射用水。
本发明中涉及的缩写的含义如下:
HCP:宿主细胞蛋白;
Na2HPO4:磷酸氢二钠;
NaH2PO4:磷酸二氢钠;
Arg:精氨酸;
(NH4)2SO4:硫酸铵;
NaAc:醋酸钠;
HAc:醋酸;
NaAc-HAc:醋酸钠-醋酸缓冲液;
WFI:注射用水;
ppm:浓度单位,表示ng/mg;
M:浓度单位,表示mol/L;
mM:浓度单位,表示mmol/L;
L/m2:流速单位,升/平方米;
SE-HPLC:凝胶过滤色谱;
DLS:动态光的散射。
本发明提供一种纳米抗体的纯化方法,包括如下步骤:
将纳米抗体收获液依次进行阳离子层析和阴离子层析,收集阴离子层析洗脱液;其中,阴离子层析采用的第一洗脱液的pH为7±0.5,第一洗脱液包含:10±2mM的Na2HPO4、10±2mM的NaH2PO4、0.01M~0.03M的精氨酸以及2mM~8mM的(NH4)2SO4。
在其中一个具体的示例中,第一洗脱液的用量为≥3倍柱体积,洗脱的保留时间≥5分钟。进一步地,第一洗脱液的用量为3~5倍柱体积,保留时间为5min~10min。
在其中一个具体的示例中,阴离子层析采用的上样载量范围为<200g/L,保留时间≥5分钟。进一步地,保留时间为5min~10min。
在其中一个具体的示例中,阴离子层析采用的色谱柱的填料为表面键合有官能团-N+(CH3)3的亲水性聚甲基丙烯酸酯,粒径为60μm。进一步地,阴离子层析采用的色谱柱为Monomix HC60 Q。
在其中一个具体的示例中,阴离子层析包括如下步骤:
S1-1:上样:取阳离子层析后的样品上样,上样载量<200g/L,保留时间≥5分钟;
S1-2:洗脱:使用第一洗脱液进行洗脱,第一洗脱液的pH为7±0.5,第一洗脱液包含:10±2mM的Na2HPO4、10±2mM的NaH2PO4、0.01M~0.03M的精氨酸以及2mM~8mM的(NH4)2SO4,第一洗脱液的用量为≥3倍柱体积,洗脱的保留时间≥5分钟。
进一步地,步骤S1-2中,第一洗脱液的pH为7,第一洗脱液包含:10mM的Na2HPO4、10mM的NaH2PO4、0.03M的精氨酸以及6mM的(NH4)2SO4。
另外,在其中一个具体的示例中,阳离子层析采用的上样载量范围为<200g/L,保留时间≥5分钟。进一步地,保留时间为5min~10min。
在其中一个具体的示例中,阳离子层析采用的色谱柱的填料为表面键合有官能团-SO3H的亲水性聚甲基丙烯酸酯,粒径为60μm。进一步地,阳离子层析采用的色谱柱为Monomix HC60 SP。
在其中一个具体的示例中,阳离子层析包括如下步骤:
S2-1:上样:将纳米抗体收获液上样至阳离子层析柱;
S2-2:淋洗:采用淋洗液进行淋洗,淋洗液的pH为5±0.5,淋洗液包含:10±2mM的醋酸钠-醋酸缓冲液以及0.1±0.02M的NaCl,淋洗液的用量≥3倍柱体积,保留时间≥5分钟;进一步地,淋洗液的用量为3~5倍柱体积,保留时间为5min~10min;
S2-3:洗脱:采用第二洗脱液进行洗脱,第二洗脱液的pH为5.5±0.5,第二洗脱液包含:10±2mM的醋酸钠-醋酸缓冲液以及0.3±0.05M的NaCl,所述第二洗脱液的用量≥3倍柱体积,保留时间≥5分钟;进一步地,洗脱液的用量为3~5倍柱体积,保留时间为5min~10min。
进一步地,步骤S2-2中,淋洗液的pH为5,第二洗脱液包含:10mM的醋酸钠-醋酸缓冲液以及0.1M的NaCl。
进一步地,步骤S2-3中,第二洗脱液的pH为5.5,第二洗脱液包含:10mM的醋酸钠-醋酸缓冲液以及0.3M的NaCl。
在其中一个具体的示例中,纳米抗体收获液的制备方法包括如下步骤:取细胞培养液进行离心、除菌和过滤,收集上清液。
在其中一个具体的示例中,纳米抗体的分子大小为70KD~80KD。具体地,纳米抗体的分子大小包括但不限于:70KD、71KD、72KD、73KD、74KD、75KD、76KD、77KD、78KD、79KD、80KD。
在其中一个具体的示例中,阴离子层析洗脱液中纳米抗体的粒径≤10nm。进一步地,阴离子层析洗脱液中纳米抗体的粒径为7nm~10nm。
在其中一个具体的示例中,阴离子层析洗脱液的纳滤膜可滤过载量为350L/m2以上。进一步地,阴离子层析洗脱液的纳滤膜可滤过载量为350L/m2~450L/m2。
在其中一个具体的示例中,阴离子层析结束后,还包括对阴离子层析洗脱液进行纳滤的步骤。
在其中一个具体的示例中,纳滤采用的纳滤膜为再生纤维素中空纤维膜。进一步地,纳滤采用的纳滤膜为PLANOVA 20N。
以下为具体的实施例。
实施例中阳离子层析采用的填料名称:Monomix HC60 SP;货号:280660950;厂家:赛分科技有限公司。
实施例中阴离子层析采用的填料名称:Monomix HC60 Q;货号:280860950;厂家:赛分科技有限公司。
实施例中的纳米抗体为CHO细胞系表达的(中国仓鼠卵巢细胞)IgG4类型纳米抗体,分子大小约为80KD。
实施例中NaAc-Hac的配制方法为:配置10mM NaAC,然后加入规定量的氯化钠,再加冰醋酸调节pH至5.0。
实施例1
本实施例为一种纳米抗体的纯化方法,步骤如下:
(1)阳离子层析
1.1柱冲洗:使用注射用水冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
1.2前消毒:使用0.5M NaOH冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
1.3平衡:使用平衡液(10mM NaAc-HAc+0.1MNaCl,pH5.0)冲洗层析柱8倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
1.4上样:上样载量180g/L,工艺保留时间8分钟;
1.5淋洗:使用平衡液进行淋洗(10mM NaAc-HAc+0.1M NaCl,pH5.0)冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间8分钟;
1.6洗脱:使用洗脱液(10mM NaAc-HAc+0.3M NaCl,pH5.5)冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间8分钟;收集阳离子层析液;
1.7再生:使用再生液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl pH5.5)冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
1.8消毒:使用0.5M NaOH冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
1.9保存:使用0.1M NaOH冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟。
(2)阴离子层析
2.1柱冲洗:使用注射用水冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
2.2前消毒:使用0.1M NaOH冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
2.3平衡:使用平衡液(10mM Na2HPO4+10mM NaH2PO4+0.03M Arg+6mM(NH4)2SO4,pH7.0)冲洗层析柱8倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
2.4上样:取阳离子层析液上样,上样载量180g/L,工艺保留时间8分钟;
2.5洗脱:使用平衡液进行洗脱(10mM Na2HPO4+10mM NaH2PO4+0.03MArg+6mM(NH4)2SO4,pH7.0)冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间8分钟;
2.6再生:使用再生液(50mM NaAc-HAc+1M NaCl pH5.5)冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
2.7消毒:使用0.1M NaOH冲洗层析柱4倍柱体积,工艺保留时间4分钟;
2.8保存:使用体积分数20%乙醇冲洗层析柱8倍柱体积,工艺保留时间4分钟;收集取阴离子层析液。
分别取本实施例的阳离子层析液和阴离子层析液通过DLS检测蛋白分子粒径及分布,同时对阴离子层析液进行纳滤。纳滤采用的除病毒过滤器名称:PLANOVA 20N货号:20NZ-001(10cm2);厂家:旭化成;过滤方式:恒压过滤(1bar)。
另外,分别对本实施例的阳离子层析液和阴离子层析液进行SE-HPLC纯度和HCP残留检测。
结果如下表1和图1所示:
表1
注:质量要求范围为HCP<100ppm和HCD<10ppb。
对比例1
本对比例为一种纳米抗体的纯化方法,其步骤同实施例1,主要区别在于:步骤2.3和2.5中,不采用精氨酸(Arg),即平衡液(10mM Na2HPO4+10mM NaH2PO4+6mM(NH4)2SO4,pH7.0)。
结果如下表2和图2所示:
表2
与实施例1比较可知,SE-HPLC纯度下降2%,HCP去除效果明显,但分子平均粒径增大,纳滤流速严重衰减。
对比例2
本对比例为一种纳米抗体的纯化方法,其步骤同实施例1,主要区别在于:步骤2.3和2.5中,不采用硫酸铵((NH4)2SO4),即平衡液为10mM Na2HPO4+10mM NaH2PO4+0.03M Arg,pH7.0。
结果如下表3和图3所示:
表3
与实施例1比较可知,SE-HPLC纯度较好,HCP去除效果不明显,且分子平均粒径仍较大,纳滤流速严重衰减。
对比例3
本对比例为一种纳米抗体的纯化方法,其步骤同实施例1,主要区别在于:步骤2.3和2.5中,用0.8M氯化钠替代硫酸铵和精氨酸。即平衡液为10mM Na2HPO4+10mM NaH2PO4+0.8M NaCl,pH7.0。
结果如下表4和图4所示:
表4
与实施例1比较可知,SE-HPLC纯度下降5%,对HCP有一定去除效果,但分子平均粒径明显增大,纳滤流速严重衰减。
对比例4
本对比例为一种纳米抗体的纯化方法,其步骤同实施例1,主要区别在于:步骤2.3和2.5中,精氨酸的浓度为0.1M。即平衡液为10mM Na2HPO4+10mM NaH2PO4+0.1M Arg+6mM(NH4)2SO4,pH7.0。
结果如下表5和图5所示:
表5
与实施例1比较可知,SE-HPLC纯度无变化,HCP去除效果不明显,分子平均粒径明显减少,但大于10nm,纳滤流速严重衰减。
对比例5
本对比例为一种纳米抗体的纯化方法,其步骤同实施例1,主要区别在于:步骤2.3和2.5中,硫酸铵的浓度为50mM。即平衡液为10mM Na2HPO4+10mM NaH2PO4+0.03M Arg+50mM(NH4)2SO4,pH7.0。
结果如下表6和图6所示:
表6
与实施例1比较可知,SE-HPLC纯度无变化,HCP去除效果较好,分子平均粒径明显减少,但大于10nm,纳滤流速严重衰减。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,便于具体和详细地理解本发明的技术方案,但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。应当理解,本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上,通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案,均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准,说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (12)
1.一种纳米抗体的纯化方法,其特征在于,包括如下步骤:
将纳米抗体收获液依次进行阳离子层析和阴离子层析,收集阴离子层析洗脱液;其中,所述阴离子层析采用的第一洗脱液的pH为7±0.5,所述第一洗脱液包含:10±2mM的Na2HPO4、10±2mM的NaH2PO4、0.01M~0.03M的精氨酸以及2mM~8mM的(NH4)2SO4;
其中,所述纳米抗体收获液中的纳米抗体为CHO细胞系表达的IgG4类型纳米抗体;
所述阴离子层析采用的色谱柱的填料为表面键合有官能团-N+(CH3)3的亲水性聚甲基丙烯酸酯,粒径为60μm;
所述第一洗脱液的用量为≥3倍柱体积,洗脱的保留时间≥5分钟;
所述阴离子层析采用的上样载量范围为<200g/L,保留时间≥5分钟。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述第一洗脱液的pH为7,所述第一洗脱液包含:10mM的Na2HPO4、10mM的NaH2PO4、0.03M的精氨酸以及6mM的(NH4)2SO4。
3.根据权利要求1所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述阴离子层析采用的色谱柱为Monomix HC60 Q。
4.根据权利要求1~3任一项所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述阳离子层析包括如下步骤:
(1)将所述纳米抗体收获液上样至阳离子层析柱;
(2)采用淋洗液进行淋洗,所述淋洗液的pH为5±0.5,所述淋洗液包含:10±2mM的醋酸钠-醋酸缓冲液以及0.1±0.02M的NaCl,所述淋洗液的用量≥3倍柱体积,保留时间≥5分钟;
(3)采用第二洗脱液进行洗脱,所述第二洗脱液的pH为5.5±0.5,所述第二洗脱液包含:10±2mM的醋酸钠-醋酸缓冲液以及0.3±0.05M的NaCl,所述第二洗脱液的用量≥3倍柱体积,保留时间≥5分钟。
5.根据权利要求4所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述阳离子层析采用的色谱柱的填料为表面键合有官能团-SO3H的亲水性聚甲基丙烯酸酯,粒径为60μm。
6.根据权利要求5所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述阳离子层析采用的色谱柱为Monomix HC60 SP。
7.根据权利要求4所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述阳离子层析采用的上样载量范围为<200g/L,保留时间≥5分钟。
8.根据权利要求1~3及5~7任一项所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述纳米抗体的分子大小为70KD~80KD。
9.根据权利要求1~3及5~7任一项所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述阴离子层析洗脱液中纳米抗体的粒径≤10nm。
10.根据权利要求1~3及5~7任一项所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述阴离子层析洗脱液的纳滤膜可滤过载量为350L/m2以上。
11.根据权利要求1~3及5~7任一项所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述阴离子层析结束后,还包括对所述阴离子层析洗脱液进行纳滤的步骤。
12.根据权利要求11所述的纳米抗体的纯化方法,其特征在于,所述纳滤采用的纳滤膜为再生纤维素中空纤维膜。
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