基於混合模式樹脂(亦稱為多模式樹脂)及層析膜吸附劑之可用性，發明者已使用僅三個層析步驟研發新純化製程。換言之，該方法僅包括三個涉及通過層析基質之步驟。 本發明係關於自溶液純化蛋白質之方法，其包括以下步驟或由其組成： (a) 第一層析步驟，包括： - 使該溶液通過第一層析基質； - 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自第一層析基質之粗製蛋白質洗脫液； (b) 第二層析步驟，包括： - 使在步驟(a)結束時所獲得之粗製蛋白質洗脫液通過第二層析基質； - 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自第二層析基質之蛋白質洗脫物；及 (c) 第三層析步驟，包括： - 使在步驟(b)結束時所獲得之蛋白質洗脫物以流過模式通過第三層析基質； - 自第三層析基質之流過液回收經純化蛋白質； 其中緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 更具體而言，上述兩個第一層析步驟中之每一者可包括以下步驟或由其組成： - 使平衡緩衝液通過層析基質； - 使溶液或粗製蛋白質洗脫液通過層析基質(如上所述)； - 使平衡緩衝液通過層析基質； - 視情況使洗滌緩衝液通過層析基質； - 視情況使平衡緩衝液通過層析基質； - 使用洗脫緩衝液(如上所述)洗脫來自層析基質之粗製蛋白質洗脫液或蛋白質洗脫物， 其中緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 本發明亦係關於自溶液純化蛋白質之方法，其包括以下步驟或由其組成： (a) 第一層析步驟，包括： - 使一部分該溶液通過第一層析基質； - 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自第一層析基質之粗製蛋白質洗脫液；及 - 視情況使衛生緩衝液通過第一層析基質； (b) 第二層析步驟，包括： - 使在步驟(a)結束時所獲得之粗製蛋白質洗脫液通過第二層析基質， - 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自第二層析基質之蛋白質洗脫物，及 - 視情況使衛生緩衝液通過第二層析基質； (c) 第三層析步驟，包括： - 使在步驟(b)結束時所獲得之蛋白質洗脫物以流過模式通過第三層析基質， - 自第三層析基質之流過液回收經純化蛋白質，及 - 視情況使衛生緩衝液通過第三層析基質； 使用另一部分溶液連續重新開始步驟(a)、(b)及(c)直至所有溶液皆使用為止，及 收集在每一步驟(c)結束時所回收之經純化蛋白質； 其中平衡緩衝液、洗滌緩衝液及洗脫緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 在本發明之上下文中，表達「層析基質」係指任一種類之微粒吸收劑介質、樹脂或其他固相(例如膜)，其在純化製程中用作吸收劑來分離擬純化分子與存在於混合物中之其他分子。基質、特定而言由樹脂組成之基質可呈管柱形式，或呈膜吸附劑形式。 在本發明之上下文中，「膜吸附劑」係指具有離子基團且包括附接官能基(例如親和基團及離子交換基團)之丙烯酸系聚合物之平片。樹脂與膜之間之差異之一係流量分佈：樹脂藉由擴散且膜藉由對流。 在本發明方法之一實施例中，第一、第二及第三層析基質係層析管柱。在本發明方法之另一實施例中，第一、第二及第三層析基質係層析膜吸附劑。 因此，在一實施例中，本發明係關於自溶液純化蛋白質之方法，其包括以下步驟或由其組成： (a) 第一層析步驟，包括： - 使該溶液通過第一層析管柱； - 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自第一層析管柱之粗製蛋白質洗脫液； (b) 第二層析步驟，包括： - 使在步驟(a)結束時所獲得之粗製蛋白質洗脫液通過第二層析管柱； - 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自第二層析管柱之蛋白質洗脫物；及 (c) 第三層析步驟，包括： - 使在步驟(b)結束時所獲得之蛋白質洗脫物以流過模式通過第三層析管柱； - 自第三層析管柱之流過液回收經純化蛋白質； 其中緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 更具體而言，上述兩個第一層析步驟中之每一者可包括以下步驟或由其組成： - 使平衡緩衝液通過層析管柱； - 使溶液或粗製蛋白質洗脫液通過層析管柱(如上所述)； - 使平衡緩衝液通過層析管柱； - 視情況使洗滌緩衝液通過層析管柱； - 視情況使平衡緩衝液通過層析管柱； - 使用洗脫緩衝液(如上所述)洗脫粗製蛋白質洗脫液或來自層析管柱之蛋白質洗脫物， 其中緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 本發明亦係關於自溶液純化蛋白質之方法，其包括以下步驟或由其組成： (a) 第一層析步驟，包括： - 使一部分該溶液通過第一層析管柱； - 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自第一層析管柱之粗製蛋白質洗脫液，及 - 視情況使衛生緩衝液通過第一層析管柱； (b) 第二層析步驟，包括： - 使在步驟(a)結束時所獲得之粗製蛋白質洗脫液通過第二層析管柱， - 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自第二層析管柱之蛋白質洗脫物，及 - 視情況使衛生緩衝液通過第二層析管柱； (c) 第三層析步驟，包括： - 使在步驟(b)結束時所獲得之蛋白質洗脫物以流過模式通過第三層析管柱， - 自第三層析管柱之流過液回收經純化蛋白質，及 - 視情況使衛生緩衝液通過第三層析管柱； 使用另一部分溶液連續重新開始步驟(a)、(b)及(c)直至所有溶液皆使用為止，及 收集在每一步驟(c)結束時所回收之經純化蛋白質； 其中平衡緩衝液、洗滌緩衝液及洗脫緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 在另一實施例中，本發明係關於自溶液純化蛋白質之方法，其包括以下步驟或由其組成： (a) 第一層析步驟，包括： - 使該溶液通過第一層析膜吸附劑； - 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自第一層析膜吸附劑之粗製蛋白質洗脫液； (b) 第二層析步驟，包括： - 使在步驟(a)結束時所獲得之粗製蛋白質洗脫液通過第二層析膜吸附劑； - 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自第二層析膜吸附劑之蛋白質洗脫物；及 (c) 第三層析步驟，包括： - 使在步驟(b)結束時所獲得之蛋白質洗脫物以流過模式通過第三層析膜吸附劑； - 自第三層析膜吸附劑之流過液回收經純化蛋白質； 其中緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 更具體而言，上述兩個第一層析步驟中之每一者可包括以下步驟或由其組成： - 使平衡緩衝液通過層析膜吸附劑； - 使溶液或粗製蛋白質洗脫液通過層析膜吸附劑(如上所述)； - 使平衡緩衝液通過層析膜吸附劑； - 視情況使洗滌緩衝液通過層析膜吸附劑； - 視情況使平衡緩衝液通過層析膜吸附劑； - 使用洗脫緩衝液(如上所述)洗脫粗製蛋白質洗脫液或來自層析膜吸附劑之蛋白質洗脫物， 其中緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 本發明亦係關於自溶液純化蛋白質之方法，其包括以下步驟或由其組成： (a) 第一層析步驟，包括： - 使一部分該溶液通過第一層析膜吸附劑； - 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自第一層析膜吸附劑之粗製蛋白質洗脫液，及 - 視情況使衛生緩衝液通過第一層析膜吸附劑； (b) 第二層析步驟，包括： - 使在步驟(a)結束時所獲得之粗製蛋白質洗脫液通過第二層析膜吸附劑， - 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自第二層析膜吸附劑之蛋白質洗脫物，及 - 視情況使衛生緩衝液通過第二層析膜吸附劑； (c) 第三層析步驟，包括： - 使在步驟(b)結束時所獲得之蛋白質洗脫物以流過模式通過第三層析膜吸附劑， - 自第三層析膜吸附劑之流過液回收經純化蛋白質，及 - 視情況使衛生緩衝液通過第三層析膜吸附劑； 使用另一部分溶液連續重新開始步驟(a)、(b)及(c)直至所有溶液皆使用為止，及 收集在每一步驟(c)結束時所回收之經純化蛋白質； 其中平衡緩衝液、洗滌緩衝液及洗脫緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 如上文所指示，上述本發明方法僅包括三個層析步驟。儘管本發明方法僅包括三個層析步驟，但其使得可獲得適用於醫藥目的且尤其適於投與人類之經純化蛋白質。 除在純化製程中不存在人為處置(且由此減小維持純化製程所需之總時間)外，所揭示方法亦減小用於純化之緩衝液及樹脂之量。此外，主要緩衝液包括相同組份(亦即Bis Tris、NaCl、乙酸、水及視情況NH
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Cl)，此大大促進了緩衝製備。除純化各種mAb外，所揭示純化方法亦簡化mAb純化，改良總產率，並減少原材料、儲存設施、物質成本及製程時間。 與上述習用蛋白質純化方法相比，本文所揭示之方法使用以下4種或5種緩衝液：平衡緩衝液、洗滌緩衝液、兩種洗脫緩衝液及視情況衛生緩衝液。所揭示方法中所使用之4種主要緩衝液係使用相同化合物基質自母液製得，此大大促進了緩衝液製備。 如本文中所使用，「本發明緩衝液」係指包括Bis Tris之緩衝液。Bis Tris係熟習此項技術者熟知之化合物，其IUPAC名稱為2-[雙(2-羥乙基)胺基]-2-(羥甲基)丙烷-1,3-二醇，且其CAS編號為6976-37-0。該等本發明緩衝液可對應於平衡緩衝液、洗滌緩衝液及/或洗脫緩衝液。 更具體而言，該等本發明緩衝液可包括不同濃度之相同化學物質(其中之一者係Bis Tris)或由其組成。在一具體實施例中，緩衝液包括Bis Tris、乙酸及水或由其組成。在一更具體實施例中，緩衝液包括Bis Tris、乙酸、NaCl、水及視情況NH
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Cl或由其組成。換言之，該等緩衝液包括不同濃度之Bis Tris、乙酸、NaCl、水及視情況NH
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Cl或由其組成。 洗脫緩衝液可(例如)包括15 mM至25 mM (例如20 mM) Bis Tris及15 mM至25 mM (例如20 mM) NaCl或由其組成，且使用乙酸調節至pH介於3與4之間(例如3.7)。此一洗脫緩衝液尤其適於與親和層析基質、特定而言親和層析管柱或膜吸附劑(例如蛋白質A基質、特定而言蛋白質A管柱或蛋白質A膜吸附劑)一起使用。 洗脫緩衝液亦可包括15 mM至25 mM (例如20 mM) Bis Tris、40 mM至50 mM (例如45 mM) NaCl及20 mM至30 mM (例如25 mM) NH
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Cl或由其組成，且使用乙酸調節至pH介於7及8之間(例如7.25)。此一洗脫緩衝液尤其用於與多模式樹脂層析基質、特定而言多模式樹脂層析管柱(例如Capto MMC)一起使用。 洗脫緩衝液亦可包括15 mM至25 mM (例如20 mM) Bis Tris、50 mM至150 mM (例如80 mM) NaCl及20 mM至30 mM (例如25 mM) NH
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Cl或由其組成，且使用乙酸調節至pH介於6與7之間(例如6.2)。此一洗脫緩衝液尤其用於與陽離子交換層析基質、特定而言陽離子交換膜吸附劑一起使用。 平衡緩衝液可包括15 mM至25 mM (例如20 mM) Bis Tris及15 mM至25 mM (例如20 mM) NaCl或由其組成，且使用乙酸調節至pH介於7與8之間(例如7.4)。 洗滌緩衝液可包括15 mM至25 mM (例如20 mM) Bis Tris及0.9 M至1.1 M (例如1 M) NaCl或由其組成，且使用乙酸調節至pH介於7與8之間(例如7.4)。 更具體而言，一種用於所揭示方法中之平衡緩衝液含有20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，且使用2 mM乙酸調節至pH 7.4。一種用於所揭示方法中之洗滌緩衝液含有20 mM Bis Tris及1 M NaCl，且使用2 mM乙酸調節至pH 7.4。用於所揭示方法中之第一洗脫緩衝液含有20 mM Bis Tris及20 mM NaCl，且使用275 mM乙酸調節至pH 3.7。用於所揭示方法中之第二洗脫緩衝液含有20 mM Bis Tris、45 mM NaCl及25 mM NH
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Cl且使用5 mM乙酸調節至pH 7.25 (尤其用於與多模式樹脂層析管柱一起使用)，或含有20 mM Bis Tris、80mM NaCl及25 mM NH
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Cl且使用5 mM乙酸調節至pH 6.2 (尤其用於與陽離子交換膜吸附劑一起使用)。 上述緩衝調配物之優點包含mAb產物能夠通過以較大相容性用於所揭示方法中之三種層析基質、特定而言三種層析管柱或三種層析膜吸附劑，同時最小化不期望相互作用，限制pH及電導率降低，並促進與傳統純化方法相比增加產率。除使用減小數量之緩衝液外，所揭示方法之另一態樣係使用Bis-Tris緩衝。使用此一緩衝避免在三個層析步驟之間調節pH且由此使得能夠在閉合系統中自收穫至最後純化步驟運行該方法。 視情況用於本發明之上下文中之衛生緩衝液可包括0.05 N至0.15 N (例如0.1 N) NaOH或由其組成。此一衛生緩衝液尤其適於與以下各項一起使用：親和層析基質、特定而言親和層析管柱(例如蛋白質A管柱)或親和層析膜吸附劑(例如Sartobind蛋白質A膜吸附劑)；多模式樹脂或陽離子交換層析基質、特定而言多模式樹脂層析管柱(例如Capto MMC)或陽離子交換層析膜吸附劑(例如Sartobind S膜吸附劑)；及/或陰離子交換層析基質、特定而言陰離子交換層析管柱(例如BioPro Q75)或陰離子交換層析膜吸附劑(例如Sartobind Q膜吸附劑)。 本文所用之術語「多肽」或「蛋白質」係指： 1)具有原始蛋白之序列之分子，亦即a)藉由天然存在及具體而言非重組細胞產生之蛋白質，或b)藉由基因改造或重組細胞產生之蛋白質，或 2)因一或多種胺基酸之缺失、添加及/或取代及/或因至少一種轉譯後改質(例如糖基化)而與原始蛋白之序列有所不同之分子。 在上文段落1)中所提及之分子可稱為原始蛋白。 在上文段落2)中所提及之分子係非天然蛋白。 在某些態樣中，擬純化蛋白係抗體。 本文所用之術語「抗體」係指完整抗體或與完整抗體競爭特異性結合之其結合片段。結合片段包含但不限於F(ab)、F(ab')、F(ab')
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、Fv及單鏈抗體。術語「重鏈」包含具有足夠可變區序列以賦予抗原特異性之任一免疫球蛋白多肽。 本文所用之術語「重鏈」涵蓋全長重鏈及其片段。全長重鏈包含可變區結構域V
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及三個恆定區結構域CH1、CH2及CH3。VH結構域位於多肽之胺基末端處，且CH3結構域位於羧基末端處。 本文所用之術語「輕鏈」涵蓋全長輕鏈及其片段。全長輕鏈包含可變區結構域VL及恆定區結構域CL。如同重鏈，輕鏈之可變區結構域位於多肽之胺基末端處。本文所用之術語「輕鏈」包含具有足夠可變區序列以賦予抗原特異性之任一免疫球蛋白多肽。 天然存在之抗體結構單元通常包括四聚體。每一該四聚體通常由多肽鏈之兩個相同對構成，每一對具有一個全長輕鏈(通常具有約25 kDa之分子量)及一個全長重鏈(通常具有約50-70 kDa之分子量)。每一輕鏈及重鏈之胺基末端部分通常包含通常負責抗原識別之具有約100至110或更多個胺基酸之可變區。每一鏈之羧基末端部分通常界定負責效應子功能之恆定區。人類輕鏈通常分類為κ及λ輕鏈。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε，且將抗體之同種型分別定義為IgM、IgD、IgA及IgE。IgG具有若干亞類，包含但不限於IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有壓類，包含但不限於IgM1及IgM2。類似地，IgA再分為壓類，包含但不限於IgA1及IgA2。在全長輕鏈及重鏈內，可變區及恆定區通常由約12個或更多個胺基酸之「J」區連結，其中重鏈亦包含約10個或更多個胺基酸之「D」區。 每一輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。可變區通常展現由三個超變區(亦稱為互補決定區或CDR)連結之相對保守框架區(FR)之相同通用結構。來自每一對之兩個鏈之CDR通常藉由框架區對準，此使得能夠結合至具體表位。輕鏈及重鏈可變區二者自N末端至C末端通常包括結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。通常根據以下文獻之定義來將胺基酸分配至每一結構域：Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S. Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號。雙特異性或雙功能抗體通常係具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人造雜合抗體。 F(ab)片段包括一個輕鏈及一個重鏈之CH1及可變區。F(ab)分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。F(ab')片段含有一個輕鏈及一個在CH1及CH2結構域之間含有多個恆定區之重鏈，從而可在兩個重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')
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分子。Fv區包括重鏈及輕鏈二者之可變區，但無恆定區。單鏈抗體係Fv分子，其中重鏈及輕鏈可變區由撓性連接體連接以形成單一多肽鏈，該單一多肽鏈形成抗原結合區。在某些實施例中，除「多特異性」或「多功能」抗體外之雙價抗體應理解為包括具有相同抗原特異性之結合位點。 可藉由所揭示方法純化之單株抗體(mAb)可藉由各種技術產生，包含習用單株抗體方法，例如業內熟知之標準體細胞雜合技術。儘管體細胞雜合程序較佳，但原則上可採用其他用於產生單株抗體之技術，例如B淋巴球之病毒或致癌性轉變。單株抗體可(例如)對應於鼠類、嵌合、人類化或全人類抗體。 在一具體實施例中，藉由本發明方法純化之抗體係選自由以下組成之群之單株抗體：特異性結合至人類β-澱粉樣蛋白之原纖維體形式之抗體(例如人類化抗體)、特異性結合至細菌表面多醣聚-N-乙醯基葡糖胺(PNAG)之抗體(例如全人類抗體)、特異性結合至癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)之抗體及特異性結合至CD38跨膜醣蛋白之抗體(例如人類化抗體)。 可藉由本發明方法純化之抗體之非限制性實例亦包括：帕尼單抗(panitumumab)、奧馬珠單抗(omalizumab)、阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿克蘇單抗(actoxumab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿夫土珠單抗(afutuzumab)、阿拉珠單抗(alacizumab)、阿侖珠單抗(alemtuzumab)、阿裡羅單抗(alirocumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿瑪西單抗(amatuximab)、阿納莫單抗(anatumomab)、阿普珠單抗(apolizumab)、阿替奴單抗(atinumab)、托珠單抗(tocilizumab)、巴息紫單抗(basilizimab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝利木單抗(belimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比西單抗(biciromab)、卡那單抗(canakinumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、達珠單抗(daclizumab)、登蘇單抗(densumab)、艾庫珠單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依法珠單抗(efalizumab)、依芬古單抗(efungumab)、厄妥索單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木單抗(golimumab)、英夫利昔單抗(infliximab)、那他珠單抗(natalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗、帕妥珠單抗(pertuzumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托珠單抗(tocilizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、杜匹魯單抗(dupilumab)、撒裡路單抗(sarilumab)或夫蘇木單抗(fresolimumab)。 在某些態樣中，擬純化蛋白係酶。 可藉由本發明方法純化之酶之非限制性實例包括酸性α-葡糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙醯肝素N-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙醯基葡糖胺-1-磷酸轉移酶、α-N-乙醯基半乳糖胺酶(α-半乳糖苷酶B)、酸性酯酶、溶酶體酸性神經醯胺酶、酸性鞘磷酯酶、β-葡糖苷酶、半乳糖神經醯胺酶、α-半乳糖苷酶A、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神經胺酸酶、己糖胺酶A或己糖胺酶B。 可藉由本發明方法純化之蛋白質之其他非限制性實例包括人類紅細胞生成素、腫瘤壞死因子(例如TNF-α、TNF-β或TNF-K)、干擾素α或干擾素β。 含有擬純化蛋白之溶液可為培養基、較佳地經澄清培養基。含有擬純化蛋白之溶液係(例如)在灌注生物反應器或補料分批生物反應器中所獲得之培養基。 灌注生物反應器或補料分批生物反應器之實例揭示於美國臨時專利申請案第61/775,060號(其全部內容以引用方式併入本文中)中。 術語「經澄清培養基」意指自實質上不含(例如至少80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%或99%不含)哺乳動物、細菌或酵母細胞之哺乳動物、細菌或酵母細胞培養液獲得之液體培養基。 本文所用之片語「回收蛋白質」係指在使用所揭示純化方法之後收集蛋白質。可使用各種標準蛋白質層析技術來達成所揭示純化方法，例如但不限於親和層析、離子交換層析、疏水性相互作用層析、凝膠過濾層析及多模式樹脂層析。 在所揭示方法之某些實施例中，第一層析基質係蛋白質A基質。在所揭示方法之特定實施例中，第一層析基質係蛋白質A管柱。在所揭示方法之其他特定實施例中，第一層析基質係蛋白質A膜吸附劑。蛋白質A基質、特定而言蛋白質A管柱或蛋白質A膜吸附劑經由樹脂配體與蛋白質之間之親和力發揮作用，從而使得高效去除雜質。在所揭示方法中使用蛋白質A基質、特定而言使用蛋白質A管柱或蛋白質A膜吸附劑之另一優點在於，mAb具有朝向蛋白質A之通用親和力。在所揭示方法之一實施例中，蛋白質A管柱係MabSelect Sure樹脂(GE Healthcare)。在所揭示方法之另一實施例中，蛋白質A管柱係Absolute High Cap (Novasep)。在所揭示方法之一實施例中，蛋白質A膜吸附劑係Sartobind蛋白質A膜吸附劑(Sartorius)。 在所揭示方法之其他實施例中，第二層析基質係多模式(混合模式)樹脂或陽離子交換層析基質。在所揭示方法之特定實施例中，第二層析基質係多模式(混合模式)樹脂層析管柱。多模式樹脂與所關注蛋白質經由若干使用mAb:離子、疏水性及氫鍵相互作用之機制來發生相互作用。更具體而言，在多模式樹脂層析管柱中，mAb:離子相互作用係mAb:陰離子相互作用，與之相反，mAb:陰離子相互作用發生於經典陰離子交換層析(AEX)管柱中。 在所揭示方法之一具體實施例中，多模式樹脂係Capto MMC樹脂(GE Healthcare)。Capto MMC係具有高度交聯瓊脂糖基質之多模式陽離子交換劑。Capto MMC之特性匯總於下文中(參見GE Healthcare Life Sciences，數據文件：11-0035-45 AA)。
在所揭示方法之其他特定實施例中，第二層析基質係陽離子交換膜吸附劑。 在所揭示方法之一其他具體實施例中，陽離子交換膜吸附劑係Sartobind S膜吸附劑(Sartorius)。在所揭示方法之另一具體實施例中，陽離子交換膜吸附劑係NatriPur HD-C膜吸附劑(Natrix)。 在所揭示方法之其他實施例中，第三層析基質係陰離子交換層析基質。在所揭示方法之特定實施例中，第三層析基質係陰離子交換層析管柱。在所揭示方法之其他特定實施例中，第三層析基質係陰離子交換膜吸附劑。共價交聯至陰離子交換基質、特定而言陰離子交換樹脂之惰性聚合載體之帶正電荷有機部分與所關注蛋白質經由mAb:陰離子相互作用來發生相互作用。在所揭示方法之一實施例中，陰離子交換層析管柱係BioPro Q75 (YMC)。BioPro Q75之特性匯總於下文中(參見YMC-BioPro Q75及S75數據表)。
在所揭示方法之另一實施例中，陰離子交換膜吸附劑係Sartobind Q膜吸附劑(Sartorius)。在所揭示方法之另一實施例中，陰離子交換膜吸附劑係Sartobind STIC膜吸附劑(Sartorius)。在所揭示方法之另一實施例中，陰離子交換膜吸附劑係HD-Q膜吸附劑(Natrix)。 在一實施例中，本發明方法並不包括在第一層析步驟結束時及/或在第二層析步驟結束時調節粗製蛋白質洗脫液及/或蛋白質洗脫物之pH。 在一特定實施例中，使在第一層析步驟結束時所獲得之粗製蛋白質洗脫液直接通過第二層析基質、特定而言第二層析管柱或膜吸附劑。更具體而言，然後並不在兩個步驟之間實施處理(例如pH調節、緩衝液交換或稀釋)。在此一方法中，多模式樹脂層析管柱可(例如)對應於Capto MMC管柱。在此一方法中，陽離子交換膜吸附劑可(例如)對應於Sartobind S膜吸附劑。另外，在一特定實施例中，使在第二層析步驟結束時所獲得之蛋白質洗脫物直接通過第三層析基質、特定而言第三層析管柱或膜吸附劑。更具體而言，然後並不在兩個步驟之間實施處理(例如pH調節、緩衝液交換或稀釋)。在此一方法中，多模式樹脂層析管柱可(例如)對應於Capto MMC管柱及/或陰離子交換層析管柱可(例如)對應於BioPro Q75管柱。此方法之具體實例揭示於實例4中。在此一方法中，陽離子交換膜吸附劑可(例如)對應於Sartobind S膜吸附劑及/或陰離子交換層析膜吸附劑可(例如)對應於Sartobind Q膜吸附劑。此方法之具體實例揭示於實例8中。 在此一方法中，完全不存在需要人工干預並打開純化系統之步驟間處理(例如在鈍化器皿中稀釋、後惰性過濾及在蛋白質A池器皿中調節pH)。 本發明方法中所使用之層析基質可為較小生物負荷層析基質(例如γ輻照之層析基質)。較小生物負荷層析基質之實例揭示於美國臨時專利申請案61/928,906中，其全部內容以引用方式併入本文中。 本發明方法可由此在包括第一、第二及第三層析基質之MCCS中實施。 術語「多管柱層析系統」或「MCCS」意指總共具有兩個或更多個互連或切換層析管柱及/或層析膜之系統。多管柱層析系統之非限制性實例係含有總共兩個或更多個互連或切換層析管柱及/或層析膜之週期性逆流層析系統(PCCS)。多管柱層析系統之其他實例闡述於本文中且為業內已知。 存在於MCCS中之層析管柱及/或層析膜可藉由切換機制(例如管柱切換機制)彼此連接或移動。MCCS亦可包含一或多個(例如兩個、三個、四個或五個)幫浦(例如自動化幫浦，例如自動化蠕動幫浦)。可藉由檢測擬純化蛋白之濃度(藉由對應於通過MCCS流體(例如MCCS中一或多個層析管柱及/或層析膜之輸入物及/或洗脫物)中之某一蛋白質濃度之UV吸光度來檢測)、液體(例如緩衝液)之比體積或逝去之特定時間來觸發管柱切換事件。管柱切換通常意指如下機制：使MCCS中之至少兩個不同層析管柱及/或層析膜(例如存在於MCCS中之兩個或更多個不同層析管柱及/或層析膜)在至少一部分製程期間於實質上相同時間通過不同步驟(例如平衡、裝載、洗脫或洗滌)。 存在於MCCS中之層析管柱及/或層析膜可具有本文所闡述任一實例性形狀、大小、體積(床體積)及/或單元操作中之一或多者。 存在於MCCS中之層析管柱及/或層析膜可含有本文所闡述或業內已知任一實例性樹脂中之一或多者。舉例而言，含於一或多種存在於MCCS中之層析管柱及/或層析膜中之樹脂可為利用捕獲機制(例如蛋白質A結合捕獲機制、蛋白質G結合捕獲機制、抗體或抗體片段結合捕獲機制、受質結合捕獲機制、輔因子結合捕獲機制、適配體結合捕獲機制及/或標籤結合捕獲機制)之樹脂。含於MCCS之一或多種層析管柱及/或層析膜中之樹脂可為陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、分子篩樹脂或疏水性相互作用樹脂或其任一組合。業內已知可用於純化蛋白質之樹脂之其他實例且可含於存在於MCCS中之一或多種層析管柱及/或層析膜中。存在於MCCS中之層析管柱及/或層析膜可含有相同及/或不同樹脂(例如本文所闡述或業內已知用於重組蛋白純化之任一樹脂)。 存在於MCCS中之層析管柱及/或層析樹脂可實施一或多個單元操作(例如捕獲蛋白質、純化蛋白質、精製蛋白質、鈍化病毒、調節含有蛋白質之流體之離子濃度及/或pH或過濾含有蛋白質之流體)。在非限制性實例中，MCCS可實施自流體(例如液體培養基)捕獲蛋白質及使存在於含有重組治療性蛋白之流體中之病毒不活化之單元操作。MCCS可實施本文所闡述或業內已知之兩個或更多個單元操作之任一組合。 MCCS可配備有以下部分：一或多個(例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個) UV監測器、一或多個(例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)閥門、一或多個(例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個) pH計及/或一或多個(例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)電導率計。MCCS亦可配備有利用在應發生管柱切換時感測(例如基於UV吸光度、液體體積或逝去時間)及影響(觸發)管柱切換事件之軟體(例如基於Unicorn之軟體，GE Healthcare, Piscataway, NJ)之操作系統。在MCCS包含一或多個UV檢測器之實例中，可視情況將UV檢測器置於MCCS中之一或多個(例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)層析管柱及/或層析膜之入口處及/或MCCS中之一或多個層析管柱及/或層析膜之出口處。 MCCS可進一步包含一或多個(例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個、十二個、十三個、十四個、十五個、十六個、十七個、十八個、十九個、二十個、二十一個、二十二個、二十三個或二十四個)在線緩衝液調節儲存器及/或緩衝液儲存器。在其他實例中，MCCS可包含一或多個(例如二個、三個、四個、五個或六個)斷流箱，其可容納不能易於進入MCCS中之一或多個層析管柱及/或層析膜之流體。本文所闡述之系統可含有一或多個斷流箱。本文所闡述系統之其他實例並不包含斷流箱。 MCCS可包含入口，流體(例如實質上不含細胞之液體培養基)可穿過入口進入MCCS中。入口可具有業內已知用於該等目的之任一結構。其可包含(例如)容許插入流體導管之螺紋、肋材或密封，從而在將流體導管插入至入口中之後，流體經由入口進入MCCS且流體並不自入口顯著滲出。彼等熟習此項技術者已知且理解可用於本發明系統中之非限制性入口。本文所提供系統之一些實例亦包含與MCCS入口流體連接之生物反應器。本文所闡述或業內已知之任一實例性生物反應器可用於本發明系統中。 MCCS可包含出口，蛋白質可穿過該出口離開系統。出口可包含(例如)容許插入流體導管之螺紋、肋材或密封或經設計以含有或儲存蛋白質之小瓶。出口可含有可用於將無菌小瓶或其他該儲存容器密封於出口上之表面以使蛋白質直接流入無菌小瓶或儲存容器中。藉由彼等熟習此項技術者已知且理解可用於本發明系統中之非限制性出口。 本文所提供系統之一些實例亦包含幫浦系統。幫浦系統可包含一或多個下列部分：一或多個(例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個)幫浦(例如本文所闡述或業內已知之任一幫浦)、一或多個(例如二個、三個、四個或五個)過濾器(例如本文所闡述或業內已知之任一過濾器)、一或多個(例如二個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個) UV檢測器及一或多個(例如二個、三個、四個或五個)斷流箱。 本文所闡述系統之一些實例進一步包含連接至幫浦與MCCS入口之間之流體導管的另一流體導管，其中另一流體導管之一端流體連接至生物反應器且另一端流體連接至幫浦與入口之間之流體導管。此另一流體導管可包含過濾器，其能夠自在生物反應器(例如ATF細胞滯留系統)中去除之液體培養基去除細胞。在一些實例中，此特定流體導管可包含一或多個(例如二個、三個或四個)幫浦(例如本文所闡述或業內已知之任一幫浦)及/或一或多個(例如二個、三個或四個)斷流箱(例如本文所闡述之任一實例性斷流箱)，其中該等幫浦及/或斷流箱與存在於流體導管中之流體流體連接。 本文所闡述之系統可視情況包含佈置於最終層析管柱或層析膜與出口之間之流體導管。本文所闡述之系統可進一步包含一或多個與佈置於最終層析管柱或層析膜與出口之間之流體導管流體連接之過濾器，從而過濾器可自存在於佈置於MCCS中之最終層析管柱或層析膜與出口之間之流體導管中的流體去除(例如)沈澱材料、微粒物質或細菌。 可以連續模式運行本發明方法。換言之，本發明方法可為自溶液純化蛋白質之連續方法。 術語「連續方法」或「呈連續模式之方法」意指經由至少一部分系統連續供給流體之方法。 術語「流體」在本文中意指任一液體，例如含有擬純化蛋白之溶液、緩衝液或用於病毒鈍化之低或酸性pH溶液。 在一較佳實施例中，向第一、第二及第三基質連續供給流體。 術語「整合製程」意指使用協同發揮作用以達成特定結果(例如自液體培養基生成經純化蛋白質)之結構要素實施之製程。 整合製程之實例揭示於美國臨時專利申請案第61/775,060號(其全部內容以引用方式併入本文中)中。 本發明方法之按比例放大亦可包含使用管柱切換及/或增加每一層析管柱之床體積。 另外，本發明方法可在閉合系統中自方法之第一步驟至最後步驟來運行。特定而言，層析步驟及視情況過濾步驟(例如奈米過濾步驟及/或超濾及透析過濾步驟)可在閉合系統中運行。在本發明方法之一具體實施例中，使包括蛋白質之溶液逐份通過三種層析基質、特定而言三種層析管柱或膜吸附劑，每次通過一部分溶液對應於一個試驗。然後收集並彙集在每一試驗結束時所回收之蛋白質。此方法之具體實例揭示於實例5、6及8中。在此一方法中，將層析步驟之管柱或膜吸附劑使用若干次，並視情況使用(例如)如上文所定義之衛生緩衝液實施衛生化，由此使得能夠減小樹脂或膜吸附劑裝置及所需緩衝液之量。舉例而言，可連續實施3至50個試驗(例如3至30個試驗、5至25個試驗、10至20個試驗或15個試驗)之序列。更具體而言，可以連續模式實施3、4、5、6、7或8個試驗，隨後對3個管柱或膜吸附劑實施衛生化(例如使用衛生緩衝液)。此可重複(例如) 2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。 本文所揭示之方法可用於回收經純化蛋白質。如本文中所使用，「經純化」係指容許有效活體外、離體或活體內使用蛋白質之純度。對於擬可用於活體外、離體或活體內應用中之蛋白質而言，其應實質上不含污染物、其他蛋白質及/或可干擾該蛋白質在該等應用中之使用或至少為所關注蛋白質不期望包含之化學物質。該等應用包含製備治療組合物、以治療組合物投與蛋白質及本文所揭示之其他方法。較佳地，如本文所提及之「經純化」蛋白係如下蛋白質：可藉由任一方法(亦即，藉由自天然來源直接純化、以重組方式或以合成方式)產生，且已自其他蛋白質組份純化從而該蛋白質佔給定組合物中總蛋白質之至少約80%重量/重量及更佳地佔給定組合物中總蛋白質之至少約85%及更佳地至少約90%及更佳地至少約91%及更佳地至少約92%及更佳地至少約93%及更佳地至少約94%及更佳地至少約95%及更佳地至少約96%及更佳地至少約97%及更佳地至少約98%及更佳地至少約99%重量/重量。 如本文中所使用，「粗製蛋白」係指如下蛋白質：可藉由任一方法(亦即，藉由自天然來源直接純化、以重組方式或以合成方式)產生，且已自其他蛋白質組份純化從而該蛋白質佔給定組合物中總蛋白質之小於約80%重量/重量。 在一特定實施例中，根據本發明自溶液純化蛋白質之方法包括： (a) 第一層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過蛋白質A管柱； (ii) 使溶液通過蛋白質A管柱； (iii) 使平衡緩衝液通過蛋白質A管柱； (iv) 使洗滌緩衝液通過蛋白質A管柱； (v) 使平衡緩衝液通過蛋白質A管柱；及 (vi) 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自蛋白質A管柱之粗製蛋白質洗脫液； (b) 第二層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過多模式樹脂層析管柱； (ii) 使來自步驟(a)之粗製蛋白質洗脫液通過多模式樹脂層析管柱； (iii) 使平衡緩衝液通過多模式樹脂層析管柱；及 (iv) 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自多模式樹脂層析管柱之蛋白質洗脫物； (c) 第三層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過陰離子交換層析管柱； (ii) 使來自步驟(b)之蛋白質洗脫物以流過模式通過陰離子交換層析管柱；及 (iii) 自陰離子交換層析管柱之流過液回收經純化蛋白質， 其中平衡緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間，洗滌緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及0.9 M至1.1 M NaCl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間，第一洗脫緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl且使用乙酸調節至pH介於3與4之間且第二洗脫緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris、40 mM至50 mM NaCl及20 mM至30 mM NH
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Cl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間。 在另一實施例中，根據本發明自溶液純化蛋白質之方法包括： (a) 第一層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過蛋白質A管柱； (ii) 使一部分溶液通過蛋白質A管柱； (iii) 使平衡緩衝液通過蛋白質A管柱； (iv) 使洗滌緩衝液通過蛋白質A管柱； (v) 使平衡緩衝液通過蛋白質A管柱；及 (vi) 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自蛋白質A管柱之粗製蛋白質洗脫液； (b) 第二層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過多模式樹脂層析管柱； (ii) 使來自步驟(a)之粗製蛋白質洗脫液通過多模式樹脂層析管柱； (iii) 使平衡緩衝液通過多模式樹脂層析管柱；及 (iv) 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自多模式樹脂層析管柱之蛋白質洗脫物； (c) 第三層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過陰離子交換層析管柱； (ii) 使來自步驟(b)之蛋白質洗脫物以流過模式通過陰離子交換層析管柱；及 (iii) 自陰離子交換層析管柱之流過液回收經純化蛋白質， (d)使用另一部分溶液連續重新開始步驟a)、b)及c)直至所有溶液皆使用為止，及 (e)收集在每一第三層析步驟結束時所回收之經純化蛋白質； 其中平衡緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間，洗滌緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及0.9 M至1.1 M NaCl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間，第一洗脫緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl且使用乙酸調節至pH介於3與4之間且第二洗脫緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris、40 mM至50 mM NaCl及20 mM至30 mM NH
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Cl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間。 在另一特定實施例中，根據本發明自溶液純化蛋白質之方法包括： (a) 第一層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過蛋白質A膜吸附劑； (ii) 使溶液通過蛋白質A膜吸附劑； (iii) 使平衡緩衝液通過蛋白質A膜吸附劑； (iv) 使洗滌緩衝液通過蛋白質A膜吸附劑； (v) 使平衡緩衝液通過蛋白質A膜吸附劑；及 (vi) 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自蛋白質A膜吸附劑之粗製蛋白質洗脫液； (b) 第二層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過陽離子交換膜吸附劑； (ii) 使來自步驟(a)之粗製蛋白質洗脫液通過陽離子交換膜吸附劑； (iii) 使平衡緩衝液通過陽離子交換膜吸附劑；及 (iv) 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自陽離子交換膜吸附劑之蛋白質洗脫物； (c) 第三層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過陰離子交換膜吸附劑； (ii) 使來自步驟(b)之蛋白質洗脫物以流過模式通過陰離子交換膜吸附劑；及 (iii) 自陰離子交換膜吸附劑之流過液回收經純化蛋白質， 其中平衡緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間，洗滌緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及0.9 M至1.1 M NaCl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間，第一洗脫緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl且使用乙酸調節至pH介於3與4之間且第二洗脫緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris、50 mM至150 mM NaCl及20 mM至30 mM NH
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Cl且使用乙酸調節至pH介於6與7之間。 在另一實施例中，根據本發明自溶液純化蛋白質之方法包括： (a) 第一層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過蛋白質A膜吸附劑； (ii) 使一部分溶液通過蛋白質A膜吸附劑； (iii) 使平衡緩衝液通過蛋白質A膜吸附劑； (iv) 使洗滌緩衝液通過蛋白質A膜吸附劑； (v) 使平衡緩衝液通過蛋白質A膜吸附劑；及 (vi) 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自蛋白質A膜吸附劑之粗製蛋白質洗脫液； b) 第二層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過陽離子交換膜吸附劑； (ii) 使來自步驟(a)之粗製蛋白質洗脫液通過陽離子交換膜吸附劑； (iii) 使平衡緩衝液通過陽離子交換膜吸附劑；及 (iv) 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自陽離子交換膜吸附劑之蛋白質洗脫物； (c) 第三層析步驟，包括： (i) 使平衡緩衝液通過陰離子交換膜吸附劑； (ii) 使來自步驟(b)之蛋白質洗脫物以流過模式通過陰離子交換膜吸附劑；及 (iii) 自陰離子交換膜吸附劑之流過液回收經純化蛋白質， (d)使用另一部分溶液連續重新開始步驟a)、b)及c)直至所有溶液皆使用為止，及 (e)收集在每一第三層析步驟結束時所回收之經純化蛋白質； 其中平衡緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間，洗滌緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及0.9 M至1.1 M NaCl且使用乙酸調節至pH介於7與8之間，第一洗脫緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris及15 mM至25 mM NaCl且使用乙酸調節至pH介於3與4之間且第二洗脫緩衝液包括15 mM至25 mM Bis Tris、50 mM至150 mM NaCl及20 mM至30 mM NH
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Cl且使用乙酸調節至pH介於6與7之間。 自溶液純化蛋白質之方法可包括至少一個過濾步驟，例如奈米過濾步驟、超濾步驟及/或透析過濾步驟。過濾步驟可在層析步驟之前及/或之後實施。在純化重組蛋白以用於醫藥目的時，在層析步驟後通常進行過濾步驟。因此，本發明方法可進一步在步驟(c)之後包括奈米過濾步驟。可另外在奈米過濾步驟之後實施超濾及透析過濾步驟。如本文中所使用，「超濾」或「UF」係指基於UF膜中孔隙之粒徑及大小使用半滲透膜以物理方式且選擇性地自溶液去除顆粒及/或離子之過濾技術。如本文中所使用，「奈米過濾」係指經由用於去除(例如)病毒顆粒之奈米過濾器過濾溶液。如本文中所使用，「透析過濾」係指使用超濾膜自溶液完全去除、置換鹽或溶劑或降低其濃度之技術。 本發明方法亦可進一步包括至少一個病毒鈍化步驟。該至少一個病毒鈍化步驟可在本發明方法之任一階段中實施，例如在步驟(a)之前、在步驟(a)之後、在步驟(b)之後、在步驟(c)之後、在奈米過濾步驟之後及/或在超濾及透析過濾步驟之後。此一病毒鈍化步驟可通常係低或酸性pH鈍化步驟。如本文中所使用，「低或酸性pH鈍化」係指使用酸性pH使病毒、特定而言包膜病毒變性之病毒鈍化技術。通常，藉由將所回收蛋白在介於約3.0至5.0之間(例如介於約3.5至約4.5之間、介於約3.5至約4.25之間、介於約3.5至約4.0之間，例如4.0)之pH下培育至少30分鐘之時段(例如介於1小時至21天之間之時段、介於約2小時至21天之間之時段或介於間約4小時至21天之間之時段)來實施低或酸性pH鈍化步驟。舉例而言，藉由將所回收蛋白在pH 4下於(例如) 6 h至21天期間培育來實施低或酸性pH鈍化步驟。 本發明方法亦可在步驟(a)之前包括提供含有擬純化蛋白且實質上不含細胞之液體培養基之步驟，其中將該液體培養基供給至第一層析基質中。 舉例而言，自溶液純化蛋白質之本發明方法可包括： (pre-a) 提供含有擬純化蛋白且實質上不含細胞之液體培養基之步驟， (a) 第一層析步驟，包括： - 使步驟(pre-a)之該液體培養基通過第一層析基質； - 使用第一洗脫緩衝液洗脫來自第一層析基質之粗製蛋白質洗脫液； (b) 第二層析步驟，包括： - 使在步驟(a)結束時所獲得之粗製蛋白質洗脫液通過第二層析基質； - 使用第二洗脫緩衝液洗脫來自第二層析基質之蛋白質洗脫物；及 (c) 第三層析步驟，包括： - 使在步驟(b)結束時所獲得之蛋白質洗脫物以流過模式通過第三層析基質； - 自第三層析基質之流過液回收經純化蛋白質； 其中緩衝液中之每一者包括Bis Tris。 最後，可將經純化蛋白質調配成適於儲存之組合物，及/或調配成適於投與動物及/或人類之醫藥組合物。 所揭示方法之諸多優點之一係其使得可獲得良好產率之高純蛋白。使用本發明方法回收之經純化蛋白質可(例如)展現至少95%、96%、97%、98%、99%、99.2%、99.5%或99.9%之純度。更尤其而言，所揭示方法之諸多優點之一係使得可獲得含有減小量之污染DNA、高分子量(HMW)物質(其對應於蛋白質聚集物)及/或宿主細胞蛋白(HCP)之高純蛋白溶液。包括使用本發明方法回收之經純化蛋白質之溶液可(例如)展現小於0.4 ppb、小於0.3 ppb、小於0.2 ppb或小於0.1 ppb之污染DNA量。包括使用本發明方法回收之經純化蛋白質之溶液可(例如)展現小於0.9%、小於0.8%、小於0.7%、小於0.6%、小於0.5%或小於0.4%之HMW物質濃度。包括使用本發明方法回收之經純化蛋白質之溶液可(例如)展現小於23 ppm、小於22 ppm、小於21 ppm、小於20 ppm、小於19 ppm或小於18 ppm之HCP濃度。此外，本發明方法使得可回收產率為至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之經純化蛋白質。 本發明之另一態樣係關於製備適用於本發明方法之緩衝液之方法。實際上，所有該等緩衝液可極容易且快速地自單一母液開始來製得。 製備緩衝液之此一方法可包括以下步驟或由其組成： i) 產生最終濃度為15 mM至25 mM (例如20 mM) Bis Tris及15 mM至25 mM (例如20 mM) NaCl之溶液(例如100 L溶液)； ii) 使用乙酸將溶液之pH值調節至介於7與8之間(例如7.4)； iii) 收集1/4之溶液，由此獲得平衡緩衝液； iv) 使用乙酸將來自步驟(iii)之剩餘3/4溶液中之1/4之pH值調節至介於3與4之間(例如3.7)，由此獲得洗脫緩衝液； v) 收集來自步驟(iii)之剩餘2/4溶液中之1/4，添加NaCl以獲得介於40 mM與50 mM之間(例如45 mM)之最終NaCl濃度，另外添加NH
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Cl以獲得介於20 mM與30 mM之間(例如25 mM)之最終NH
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Cl濃度，且使用乙酸將pH值調節至介於7與8之間(例如7.25)，由此獲得另一洗脫緩衝液； vi) 向來自步驟(iii)之剩餘1/4溶液中添加NaCl並添加NaCl以獲得介於0.9 M與1.1 M之間(例如1 M)之最終NaCl濃度，由此獲得洗滌緩衝液。 此一方法示意性繪示於圖1中。 製備緩衝液之另一方法可包括以下步驟或由其組成： i) 產生最終濃度為15 mM至25 mM (例如20 mM) Bis Tris及15 mM至25 mM (例如20 mM) NaCl之溶液(例如100 L溶液)； ii) 使用乙酸將溶液之pH值調節至介於7與8之間(例如7.4)； iii) 收集1/4之溶液，由此獲得平衡緩衝液； iv) 使用乙酸將來自步驟(iii)之剩餘3/4溶液中之1/4之pH值調節至介於3與4之間(例如3.7)，由此獲得洗脫緩衝液； v) 收集來自步驟(iii)之剩餘2/4溶液中之1/4，添加NaCl以獲得介於70 mM與90 mM之間(例如80 mM)之最終NaCl濃度，另外添加NH
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Cl以獲得介於20 mM與30 mM之間(例如25 mM)之最終NH
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Cl濃度，且使用乙酸將pH值調節至介於6與7之間(例如6.2)，由此獲得另一洗脫緩衝液； vi) 向來自步驟(iii)之剩餘1/4溶液中添加NaCl並添加NaCl以獲得介於0.9 M與1.1 M之間(例如1 M)之最終NaCl濃度，由此獲得洗滌緩衝液。 製備緩衝液之上述方法亦可對應於本發明方法在實施三個層析步驟之前之最初始步驟。 本發明另外係關於包括以下部分或由其組成之套組： (a) 多模式樹脂或陽離子交換層析基質、親和層析基質(例如蛋白質A基質)及/或陰離子交換層析基質；及 (b) 至少一種本發明緩衝液(例如包括Bis Tris、乙酸、NaCl、水及視情況NH
4
Cl或由其組成)，及/或用於製備至少一種本發明緩衝液(例如包括Bis Tris、乙酸、NaCl、水及視情況NH
4
Cl或由其組成)之說明。 在一實施例中，套組包括以下部分或由其組成： (a) 多模式樹脂層析管柱、親和層析管柱(例如蛋白質A管柱)及/或陰離子交換層析管柱；及 (b) 至少一種本發明緩衝液(例如包括Bis Tris、乙酸、NaCl、水及視情況NH
4
Cl或由其組成)，及/或用於製備至少一種本發明緩衝液(例如包括Bis Tris、乙酸、NaCl、水及視情況NH
4
Cl或由其組成)之說明。 在另一實施例中，套組包括以下部分或由其組成： (a) 陽離子交換膜吸附劑、親和層析膜吸附劑(例如蛋白質A膜吸附劑)及/或陰離子交換層析膜吸附劑；及 (b) 至少一種本發明緩衝液(例如包括Bis Tris、乙酸、NaCl、水及視情況NH
4
Cl或由其組成)，及/或用於製備至少一種本發明緩衝液(例如包括Bis Tris、乙酸、NaCl、水及視情況NH
4
Cl或由其組成)之說明。
實例
下列實例係用於闡釋所揭示方法之具體實施例及其各種用途。其僅出於闡釋性目的而陳述，且不應解釋為以任何方式限制本發明範圍。
實例 1 ： 純化緩衝液之優化
Bis Tris緩衝液可有利地用作用於多模式樹脂層析管柱之緩衝液。 使在通過蛋白質A層析管柱之後所獲得之粗製蛋白質洗脫液通過Capto MMC多模式樹脂層析管柱。 此樹脂即使在低pH下亦能夠固定mAb，例如彼等在層析步驟之後於蛋白質A管柱上所獲得者。然而，此樹脂亦需要鹽以獲得良好洗脫。然而，過高鹽濃度對mAb穩定性有害，此乃因其增加了經洗脫試樣中高分子量(HMW)物質之含量，且亦對固定於培養基上之雜質有效，從而降低mAb之純度。 為避免該等缺點，發明者進行實驗設計(DOE)以減小步驟(a)之洗脫緩衝液中之鹽濃度及pH。 為此，發明者引入新種類之鹽氯化銨，其帶來與NaCl相同之電導率但在相互作用方面強於Na
+
。
DOE 參數
應用中心複合表面設計(CCF)以使用MODDE 9軟體(UMETRICS)優化洗脫條件。CCF設計由完全析因設計及三個中心點構成(在所有17個實驗中)。洗脫pH在7.2與7.8之間有所變化，且同樣NaCl濃度自0 mM至100 mM有所變化且NH
4
Cl濃度自0 mM至50 mM有所變化。 因子及反應匯總於下文中。
縮寫： Quant.：定量；Control.：控制；Transf.：轉變；Prec.：精確度；MLR：多元線性回歸；Orthog.：正交；PLS：偏最小二乘；Unit Var.：單位變異數；HCP：宿主細胞蛋白；HMW：高分子量物質
DOE 實驗
17個實驗匯總於下表中。
DOE 結果
在試驗期間，4個實驗似乎在產物回收率方面不一致。N1及N2試驗因條件而並無洗脫，且在N5及N11試驗期間，必須在10個管柱體積(CV)之後停止洗脫。由此自分析排除該等實驗。 將所有實驗呈遞至SEC-HPLC及HCP分析。 結果匯總於下表中。
在MODDE 9.0預測工具中，發明者藉由固定下列反應來測定甜蜜點(其意指含有擬應用條件之空間)： -產率：95%至100% - HCP：20 ppm至30 ppm - HMW：0.4%至0.8% 三種NH
4
Cl濃度(0 mM、25 mM及50 mM)之甜蜜點表示於圖2中。 黑色空間係含有以下所符合第一準則之空間：產率介於90%與100%之間。淺灰色空間係含有產率及HCP率(20 ppm至30 ppm)之空間。深灰色空間係甜蜜點，其係含有以下所符合之3個準則之空間：產率、HCP率及HMW率(0.4%至0.8%)。 發明者由此使用此圖解說明顯示，使用之NaCl愈多，則增加之HMW及產率愈多。另外，pH增加愈多，則HCP率愈多。因此，發明者顯示，為獲得高產率以及良好純度，必須在低pH及低NaCl濃度下實施洗脫。 發明者顯示，可使用NH
4
Cl來降低NaCl濃度。最適當NH
4
Cl濃度為25 mM，從而得到產率大於95%、HCP率約為30 ppm且HMW率為0.6%之甜蜜點。 發明者由此顯示，用於第二層析步驟之最佳洗脫緩衝液為20 mM Bis Tris、45 mM NaCl、25 mM NH
4
Cl且使用乙酸補足至pH為7.25。
實例 2 ： 第三層析步驟之優化
首先設計純化製程，其中使用Sartobind STIC膜作為第三步驟(因其鹽耐受性質)以在兩個第一層析步驟之後精製雜質並去除病毒。 然而，在連續製程中，實施每一步驟多次。可棄式膜(例如Sartobind STIC膜)不能再利用。發明者由此設計使得能夠精製雜質、去除病毒及再利用之替代第三層析步驟，其由此可用於連續製程中。 測試用於精製步驟之以下三種介質： - Sartobind STIC (Sartorius) - Sartobind Q (Sartorius)及 - BioPro Q75 (YMC)，其係AEX樹脂。 首先，發明者在Capto MMC洗脫(100 mM NaCl、20 mM Bis Tris，pH 8.0)之後測試該等樹脂以評估第三步驟即使在使用100 mM NaCl條件下去除雜質之能力。在單一試驗中評估Sartobind STIC及Q膜。在以下三種試驗中評估BioPro Q75：100 mM、50 mM及25 mM NaCl濃度。結果展示於下表中。
該等結果由此展示，Sartobind STIC膜因其鹽耐受性質而得到良好雜質去除。然而，在試驗期間將壓力自1巴增加至3巴展示，該等膜不能用於再利用技術中，此尤其係由於壓力在1 M NaCl洗滌之後及在0.1 N NaOH衛生化之後並不降低。使用Sartobind Q膜獲得關於雜質之最佳結果。然而，因再利用及可用性問題，發明者認為此膜並不適宜。 最後，BioPro Q75樹脂得到關於雜質去除之中間結果。另外，在試驗期間觀察到並無壓力。最後，因經典樹脂技術而完成再利用。 發明者由此顯示，陰離子交換層析管柱在精製步驟中係膜之良好替代方式以藉由連續製程實施蛋白質純化。
實例 3 ： 純化緩衝液之調配
本文所闡述之三步驟純化方法利用4種緩衝液：平衡緩衝液、洗滌緩衝液及兩種洗脫緩衝液，其皆自同一母液製得。方案示意圖展示於圖1中且如下所述：將當量20 mM Bis Tris及當量20 mM NaCl與100 L注射用水(WFI)混合至一起作為母液，且然後使用乙酸將溶液pH調節至7.4。然後收集25 L所得溶液並儲存作為平衡緩衝液。然後取出25 L母液且添加當量1 M NaCl。此所得25L溶液係洗滌緩衝液。然後使用乙酸將25 L母液之pH調節至3.7。此所得25 L溶液係第一洗脫緩衝液。然後使用乙酸將剩餘25 L母液之pH調節至7.25，且添加當量45 mM NaCl及當量25 mM NH
4
Cl，從而得到另一洗脫緩衝液。
實例 4 ： 小規模連續多步驟製程
利用本發明方法小批純化特異性結合至CD38跨膜醣蛋白之人類化單株抗體(抗CD38 mAb)。
材料及方法 材料
-第一步驟：60 mL Absolute High Cap樹脂，在定製有Fast Flow管道之XK50/20管柱中 -第二步驟：100 mL Capto MMC樹脂，在定製有Fast Flow管道之XK50/20管柱中 -第三步驟：50 mL BioPro Q75樹脂，在定製有Fast Flow管道之XK50/20管柱中 - Akta Purifier管道，其使用PEEK管道(內徑1.0 mm)進行修改
第一步驟細節
使用Absolute High Cap樹脂(參考AbSHC 35 P1-A-V-00200)填充XK50/20管柱。最終體積為60 mL。HETP為13538 N/m且不對稱度為1.2。 在此步驟中使用以下三種緩衝液： -平衡緩衝液，使用20 mM Bis Tris、2 mM NaCl製得且使用乙酸補足至pH 7.4 -洗滌緩衝液，使用20 mM Bis Tris、1 M NaCl製得且使用乙酸補足至pH 7.4 -洗脫緩衝液，使用20 mM Bis Tris、20 mM NaCl製得且使用乙酸補足至pH 3.7。 根據管柱大小，將用於平衡、洗滌、裝載及洗脫步驟之流速設置為24 mL/min (滯留時間：2.5 min)。
第二步驟細節
使用Capto MMC樹脂(參考17-5317-02)填充XK50/20管柱。最終體積為100 mL。HETP為5686 N/m且不對稱度為1.3。 在此步驟中使用以下兩種緩衝液： -平衡緩衝液，使用40 mM Bis Tris、20 mM NaCl製得且使用乙酸補足至pH 7.4 -洗脫緩衝液，使用20 mM Bis Tris、45 mM NaCl、25 mM NH
4
Cl製得且使用乙酸補足至pH 7.25。 根據管柱大小，將用於平衡、裝載及洗脫步驟之流速設置為24 mL/min (滯留時間：4.8 min)。
第三步驟細節
使用BioPro Q75樹脂(參考QAA0S75)填充XK50/20管柱。最終體積為50 mL。HETP為4875 N/m且不對稱度為1.6。 在此步驟中使用以下一種緩衝液： -平衡緩衝液，使用40 mM Bis Tris、20 mM NaCl製得且使用乙酸補足至pH 7.4。 根據管柱大小，將用於平衡及洗脫步驟之流速設置為24 mL/min (滯留時間：2.1 min)。
結果
將2.325 g批量收穫液(在1.71 g/L之濃度下)載於Absolute High Cap樹脂上。純化2,325 g之總持續時間為2 h10 min。回收2.125 g，從而意味著產率為91%。在技術上，在並無反壓下成功達成純化，即使以連續組態使用管柱。 使用此3步驟製程獲得之最終產物之雜質去除匯總於下表中並與使用PCT/EP2012/059528中所闡述之2步驟製程獲得者進行比較。
發明者由此展示，新連續多步驟製程與PCT/EP2012/059528中所闡述應用於同一產物上之2步驟製程同等有效。 實施小規模研究以評估在每一步驟之後所獲得之雜質率。發明者展示，每一步驟可有效去除雜質，如下表中所匯總。
此實例由此展示，由發明者設計之連續製程與批式製程同等有效。
實例 5 ：全尺寸連續多步驟製程
應用上述方法以大規模純化特異性結合至CD38跨膜醣蛋白之人類化單株抗體(抗CD38 mAb)。
材料及方法 材料
-第一步驟：50 mL動態結合容量(DBC)為50 mg/mL之Absolute High Cap樹脂 -第二步驟：100 mL DBC為35 mg/mL之Capto MMC樹脂 -第三步驟：50 mL DBC為170 mg/mL之BioPro Q75樹脂 -來自GE之週期性逆流系統(專用Akta純化器)，其包括上述3個在線管柱且使得能夠監測所有管柱。
方法
連續實施15個試驗之序列。更具體而言，以連續模式實施5個試驗，隨後使用0.1 N NaOH對3個管柱實施衛生化，然後開始新序列。
結果
序列使得能夠在小於500 min內純化10 g抗CD38 mAb。 裝載29.5g批量收穫液且回收28g經純化mAb。本發明之連續多步驟製程由此使得能夠達成95%之平均產率。在25 h內獲得該等28 g經純化mAb。 另外，最終產物之分析結果與使用PCT/EP2012/059528中所闡述2步驟製程獲得之最終產物之分析結果相當。該等分析結果匯總於下表中。
在單獨分析每一步驟時之情形亦如此，如下表中所展示。
另外，如圖3中所展示，趨勢並不展示每一試驗之間之任一顯著差異。
實例 6 ： 呈連續模式之批料純化
使用實例5中所闡述之製程以全尺寸連續批料形式純化抗CD38 mAb。 在此實例中，在69 h期間連續純化43 L濃度為1.66 g/L之mAb。更具體而言，實施45個試驗，在每一試驗中裝載960 mL澄清產物。此使得僅使用70 L緩衝液即回收19.5 L濃度為3.42 g/L之經純化mAb，其代表93%之產率。 下表匯總此純化方法與PCT/EP2012/059528中所闡述之2步驟純化製程相比之特徵。
因此，本發明之連續多步驟製程使得能夠將所用緩衝液之體積減小33%且將所用樹脂之體積減小97%。
實例 7 ：不同單株抗體之純化
除人類化抗CD38抗體外，使用上述連續多步驟製程來純化其他抗體，亦即特異性結合至細菌表面多醣聚-N-乙醯基葡糖胺(PNAG)之全人類抗體、特異性結合至癌胚抗原相關細胞黏附分子5 (CEACAM5)之單株抗體及結合至人類β-澱粉樣蛋白之原纖維體形式之人類化13C3 mAb，如國際公開案第WO 2009/065054號中所闡述。 下表展示在純化該三種抗體後所獲得之總產率及純度。
1
總產率對應於在奈米過濾、超濾及透析過濾步驟之前之產率。 總而言之，使用4種不同抗體證實，連續多步驟製程方法使得可獲得良好產率之純化抗體以及極佳純度，經純化抗體具有適於投與人類之品質。
實例 8 ： 膜吸附劑連續多步驟製程
應用本發明方法使用可棄式膜吸附劑來大規模純化特異性結合至CD38之人類化單株抗體(抗CD38 mAb)。
材料及方法 材料
-第一步驟：4種Sartobind蛋白質A膜吸附劑(Sartorius)，各2 mL -第二步驟：2種Sartobind S 「奈米」膜吸附劑(Sartorius)，各3 mL -第三步驟：1種Sartobind Q 「奈米」膜吸附劑(Sartorisu)，3 mL 所用緩衝液與彼等闡述於實例4中者相同，只是第二步驟之洗脫緩衝液係使用20 mM Bis Tris、80 mM NaCl、25 mM NH
4
Cl製得且使用乙酸補足至pH 6.2。
方法
經由50個試驗(各30 mg)在3個上述步驟中以連續模式實施製程以純化1.5 g抗體。 簡言之，使用平衡緩衝液平衡蛋白質A膜吸附劑，然後裝載。在裝載之後，將膜吸附劑再次平衡，然後使用第一洗脫緩衝液洗脫。將蛋白質A膜吸附劑之洗脫物直接載於陽離子交換膜吸附劑上。儘管使用平衡緩衝液平衡陽離子交換膜，但在下一裝載之前使用衛生緩衝液對蛋白質A膜吸附劑實施衛生化。使用第二洗脫緩衝液洗脫陽離子交換膜吸附劑且將洗脫物直接載於陰離子交換膜吸附劑上。
結果
可在750 min (每一試驗15 min)內純化1.5 g抗體。回收率約為80%。 分析結果匯總於下表中。
因此，與使用再利用樹脂之製程相比，使用可棄式膜吸附劑之本發明之連續多步驟製程使得能夠在內部說明內且無需另外優化製程及緩衝液即獲得滿意雜質去除率。 另外，如圖4中所展示，趨勢並不展示每一試驗之間之任一顯著差異。因此，發明者令人吃驚地顯示，可棄式膜吸附劑實際上較為穩定並可再利用於50個試驗中且並無任何性能降低。 在本發明方法中使用膜吸附劑而非管柱之主要優點匯總如下： -在同等規模下，可以10倍於管柱之流速來使用膜吸附劑，由此顯著減小製程之持續時間。舉例而言，以1 mL/ min之流速來使用5 mL經樹脂填充之管柱，而以最小10 mL/ min之流速來使用相應5 mL膜吸附劑。因此，在使用經樹脂填充之3根管柱於2 h 30 min內實施本發明之3層析步驟製程時，其可使用膜吸附劑在15 min內完成。 -即使再利用，膜吸附劑亦係可棄式裝置，其可由此在一批之後棄除且無需長期儲存。由此無需對其進行測試以確保長期穩定性。 -使用膜吸附劑之本發明方法因避免管柱成本、管柱填充及管柱儲存而較為便宜。
實例 9 ： GMP 規模連續多步驟製程
應用上述方法以大規模純化特異性結合至CD38跨膜醣蛋白之人類化單株抗體(抗CD38 mAb)。
材料及方法 材料
-第一步驟：6 L動態結合容量(DBC)為35 mg/mL之MabSelect Sure樹脂 -第二步驟：6 L DBC為35 mg/mL之Capto MMC樹脂 -第三步驟：6 L DBC為170 mg/mL之BioPro Q75樹脂 -來自GE之2個AktaProcess (操縱3個管柱)及來自Sartorius之一個Flexact (於第一步驟與第二步驟之間完成在低pH下不活化之步驟)，包括上述3個上線管柱且使得能夠監測所有管柱。
方法
連續實施7次運行之序列。
結果
序列使得能夠在小於16 h內純化1.3 Kg抗CD38 mAb。 裝載14.4 Kg批量收穫液且回收1.30 Kg經純化mAb。本發明之連續多步驟製程由此使得能夠達成90%之平均產率。在16 h內獲得該等1.3 Kg經純化mAb。 與之相比，使用2步驟製程之500 L批料之純化耗費3天並使用20 L管柱。 本發明之連續方式由此係使得可節約時間及原材料(節約66%以上之樹脂體積)之進展。 另外，最終產物之分析結果與使用PCT/EP2012/059528中所闡述2步驟製程獲得之最終產物之分析結果相當。該等分析結果匯總於下表中。