KR20160005047A - 항체를 정제하기 위한 연속 다단계 공정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 모액으로부터 제조된 단지 4종의 완충제 용액을 사용하는, 단백질, 구체적으로 모노클로날 항체의 소규모 및 대규모 정제를 위한 3-단계 크로마토그래피 공정을 제공한다.
Description
본 발명은 4종의 완충제 용액을 사용하는, 단백질, 구체적으로 모노클로날 항체의 소규모 및 대규모 정제를 위한 3-단계 크로마토그래피 공정에 관한 것이다.
항체 정제는 생물생산의 가장 고가의 측면 중 하나일 수 있다. 모노클로날 항체 (mAb)는 일반적으로 각 단계에서 특정한 완충제 시스템을 사용하는 3-단계, 3개의 수지 크로마토그래피 공정을 사용하여 정제된다. 이러한 통상의 정제 공정은 포획 단계에 이어서 이온성 교환 단계를 포괄하고, 연마 단계로 마치며, 통상적으로 3 내지 5일의 작업일 (저장 및 개방 단계 포함)이 걸린다. 이러한 통상의 공정에서, 이들 3개의 단계는 별개의 유닛 작동의 순서로 수행되고, 이는 pH, 몰농도 및 단백질 농도의 조정이 각 단계 사이에서 필수적이기 때문에 연속 모드로 작동될 수 없다. 이러한 통상의 정제 공정은 도 5에 도식화된다. 따라서, 통상의 정제 공정은 일반적으로 각각의 불연속 단계 사이에 다수의 상이한 완충제 뿐만 아니라 다수의 저장 유닛을 필요로 한다. 따라서, 이들 통상의 정제 공정은 오염, 기술적 실패 및 인간 오류가 발생하기 쉽다. 추가로, 용리액을 농축시키고 pH 및 전도성을 조정하고 후속 단계 이전에 용리액을 저장하기 위해 각 단계 사이에 중단이 필요하기 때문에, 및 단계가 이전의 것의 완결 이전에 출발할 수 없기 때문에, 이러한 통상의 정제 공정은 도 7에서 확인될 수 있는 바와 같이 특히 길며 고가이다.
증가하는 세포 배양 역가 및 보다 큰 세포 배양 부피가 생산을 위해 사용되면서, 하류 가공이 산업 장애로서 관찰된다. 이는 특히 모노클로날 항체 생산과 관련되며, 여기서 주안점은 배치 부피에서 하류 가공 용량으로 이동하였다. 게다가, 초기 전-임상 및 임상 단계 연구는 보다 급속하게 생산될 수 있는 보다 많은 양의 항체를 필요로 한다. 따라서, 항체 정제를 위해, 및 배치를 수득하는데 걸리는 시간의 감소, 오염, 기계적 실패 및 인간 오류의 위험성의 감소 및 공정 스케일-업 요건의 감소 모두를 위해, 산업에 연속 모드로 수행될 수 있는 공정을 위한 필요가 존재한다.
본 발명자들은, 연속 모드의 제한된 수의 단계를 포함하며, 여전히 탁월한 정도의 순도를 갖는 정제된 항체의 높은 수율을 수득하도록 하면서 감소된 양의 수지 및 완충제를 사용하는, 항체를 정제하는 신규 방법을 밝혀내었다. 따라서, 정제된 단백질은 의학적 적용에 적합하다. 따라서, 상기 방법은 임상 시험을 위해 및/또는 단백질을 포함하는 제약 조성물의 마케팅을 위해 단백질을 정제하는데 사용될 수 있다. 추가로, 이 방법은 임의의 단계간 조정이 필요하지 않으며, 따라서 정제될 단백질의 수확물에서 최종 생성물로의 폐쇄 시스템으로 수행될 수 있다.
간략하게는, 이 방법은 연속 모드의 단지 3개의 크로마토그래피 단계를 포함한다: 1개의 친화성 크로마토그래피, 1개의 다중-모드 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피, 및 1개의 음이온-교환 크로마토그래피 (AEX). 이들 3개의 크로마토그래피 단계는 임의의 순서로 실행될 수 있다. 추가로, 이들 3개의 크로마토그래피 단계 동안에 사용된 모든 완충제는 동일한 모액으로부터 출발하여 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이들 완충제는 유리하게는 비스 트리스(Bis Tris)를, 예를 들어 NaCl, 아세트산, 물, 및 임의로 NH4Cl과 조합하여 포함한다. 임의의 완충제 교환이 필요하지 않기 때문에, 상기 방법은 수행하기에 용이하고, 자동화 및/또는 연속 모드의 실행에 매우 적합하다. 보다 특히, 전체 공정에 대해 단지 4종의 완충제를 사용하는 것이 가능하며, 이는 모든 단계 사이에 상용성을 보장하고, 공급 사슬 제조 및 품질 관리 절감 및 감소된 저장 필요성을 가능하게 한다.
본 발명의 방법은 개방 단계 (즉, 신규 완충제를 위한 크로마토그래피 칼럼를 제조하거나, 샘플을 희석하거나, 또는 그의 pH를 조정하는 것과 같이 수동 작동을 수행하기 위해 정제 시스템이 개방된 단계)를 감소시키거나 없애고, 이에 의해 오염의 위험을 감소시키고, 덜 분류된 환경에서 작업하는 가능성을 제공하는 것을 추가로 허용한다. 추가로, 본 발명의 방법의 각각의 크로마토그래피 단계는 재사용가능한 수지를 사용할 수 있거나, 또는 놀랍게도 일회용 막 흡착제를 재사용할 수 있기 때문에, 3개의 크로마토그래피 단계의 순서는 인간 취급 없이 목적하는 정량을 수득할 때까지 재개될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법의 모든 크로마토그래피 단계는 적어도 100회 재사용될 수 있는 수지를 사용하거나 또는 적어도 50회 재사용될 수 있는 막 흡착제를 사용하여 실행될 수 있다. 본 발명자들은 적어도 50회 실행을 통해 동일한 일회용 막 흡착제를 안정성을 상실하지 않으면서 사용하는 것이 가능한 것을 사실상 입증하였다. 따라서, 공정 순환 횟수는 단축되고, 공정 스케일-업 요건은 최소화되며, 수지 및 완충제의 부피가 감소될 수 있고 일회용 막 흡착제가 배치 이후에 저장될 필요가 없기 때문에 작동 및 저장 비용을 감소시키는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 방법은 도 9 및 11과 비교하여 도 10 및 12에서 확인될 수 있는 바와 같이, 배치의 신속한 비용 효과적 생산 및 정제 시스템의 점유 시간의 감소 둘 다를 허용한다. 따라서, 이는 벤치에서 산업적 규모로의 재조합 단백질의 스케일-업 및 정제에 적합하다.
특정한 프로토콜은 4종의 상이한 항체에 대해 설정되고 실행된다. 이 프로토콜에서, 제1 크로마토그래피 단계의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 직접, 즉 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석과 같은 임의의 처리를 거치지 않으면서 통과시키고, 제2 크로마토그래피 단계의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 또한 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 직접, 즉 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석과 같은 임의의 처리를 거치지 않으면서 통과시킨다. 이 방법은 도 6에서 도식화된다. 추가로, 이 프로토콜에서, 도 8에서 확인될 수 있는 바와 같이, 용액을 함유하는 단백질을 연속 실행 (실시예 6 참조), 이전 실행이 제1 크로마토그래피 단계로부터 용리되자마자 출발하는 연속 실행으로 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 로딩한다. 이 프로토콜은 극도로 신속 (한 순서의 경우에 약 2시간)하다는 이점을 가지며, 이는 개선된 수율 (90% 초과), 개선된 순도를 가져오고, 칼럼이 사용되는 경우에는 사용된 완충제 및 수지 부피 둘 다를 감소시키고 막 흡착제가 사용되는 경우에는 사용된 완충제 및 저장 시설 둘 다를 감소시키는 것을 가능하게 한다. 더욱이, 이 공정은 사용된 칼럼의 크기 및/또는 실행의 수가 정제될 단백질의 양에 용이하게 적합화될 수 있기 때문에 극도로 융통성이 있다는 이점을 갖는다. 추가로, 이는 완전히 자동화된, 연속 모드의 실행일 수 있으며, 이는 임의의 개방 단계를 포함하지 않는다. 더욱이, 최적화를 필요로 하지 않으면서 4종의 상이한 항체에 대해 성공적으로 수행되었다.
따라서, 본 발명은, 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 용액을 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 세척 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제로부터 용리시키는 것을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계; 평형 완충제를 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 임의로 평형 완충제를 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제로부터 용리시키는 것을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계; 및 평형 완충제를 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제를 통해 통과시키고, 임의로 세척 완충제를 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 매트릭스의, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제의 유동-관통물로부터 회수하는 것을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계를 포함하는, 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 용액의 일부를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 세척 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제로부터 용리시키고, 임의로 위생처리 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제1 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키는 것을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계; 평형 완충제를 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 임의로 평형 완충제를 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제로부터 용리시키고, 임의로 위생처리 완충제를 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키는 것을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계; 평형 완충제를 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제를 통해 통과시키고, 임의로 세척 완충제를 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키고, 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 매트릭스의, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제의 유동-관통물로부터 회수하고, 임의로 위생처리 완충제를 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 통과시키는 것을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계; 모든 용액이 사용될 때까지 용액의 또 다른 부분으로 제1, 제2 및 제3 크로마토그래피 단계를 연속적으로 재개하는 것, 및 각각의 제3 크로마토그래피 단계의 종결 시에 회수된 정제된 단백질을 수집하는 것을 포함하는, 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 각각의 완충제는 비스 트리스를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 각각의 완충제는 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함한다. 본 발명의 방법에서의 비스 트리스 완충제의 사용은 이것이 3개의 크로마토그래피 단계 사이에서 pH를 조정하는 것을 방지하여, 상기 방법을 제1 단계에서 최종 단계로의 폐쇄 시스템으로 실행하는 것을 가능하게 하기 때문에 특히 중요하다.
한 실시양태에서, 크로마토그래피 매트릭스 중 1개는 단백질 A 매트릭스이다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 매트릭스 중 1개는 다중-모드 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스이다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 매트릭스 중 1개는 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단백질 A 크로마토그래피 매트릭스, 다중-모드 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스 및 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스를 포함하며, 상기 매트릭스는 임의의 순서로 3개의 크로마토그래피 단계에서 사용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A 매트릭스이고, 제2 크로마토그래피 매트릭스는 다중-모드 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스이고, 제3 크로마토그래피 매트릭스는 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 크로마토그래피 칼럼이다. 상기 실시양태 중 특정한 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A 칼럼이고, 제2 크로마토그래피 매트릭스는 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼이고, 제3 크로마토그래피 매트릭스는 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 각각의 크로마토그래피 매트릭스는 크로마토그래피 막 흡착제이다. 상기 실시양태 중 특정한 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A 막 흡착제이고, 제2 크로마토그래피 매트릭스는 양이온-교환 막 흡착제이고, 제3 크로마토그래피 매트릭스는 음이온-교환 막 흡착제이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 정제될 단백질은 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (c) 이후에 나노여과 단계 및/또는 나노여과 단계 이후에 한외여과 및 투석여과 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (c) 이후에, 나노여과 단계 이후에 및/또는 한외여과 및 투석여과 단계 이후에 저 pH 불활성화 단계를 추가로 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 방법은 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하기 위해, 단계 (a) 이전에, 액체 배양 배지, 바람직하게는 생물반응기에서의 세포 배양의 단계를 포함한다. 배양된 세포는 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포일 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 액체 배양 배지로부터 정제된 단백질의 생성을 위한 통합 공정을 제공한다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 제1 용리 완충제는 아세트산으로 pH 3.7로 조정된, 20 mM 비스 트리스, 및 20 mM NaCl을 포함하고; 제2 용리 완충제는 아세트산으로 pH 7.25로 조정된, 20 mM 비스 트리스, 45 mM NaCl 및 25 mM NH4Cl을 포함하거나 또는 아세트산으로 pH 6.2로 조정된, 20 mM 비스 트리스, 80 mM NaCl 및 25 mM NH4Cl을 포함하고; 평형 완충제는 아세트산으로 pH 7.4로 조정된, 20 mM 비스 트리스, 및 20 mM NaCl을 포함하고; 세척 완충제는 아세트산으로 pH 7.4로 조정된, 20 mM 비스 트리스, 및 1 M NaCl을 포함한다. 본 발명의 다른 실시양태에서, 위생처리 완충제는 0.1 N 수산화나트륨을 포함한다.
본 발명은 다중-모드 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스, 단백질 A 매트릭스 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스; 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 적어도 1종의 완충제를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본 발명의 방법을 사용하여 단백질을 용액으로부터 정제하는데 사용된다.
한 실시양태에서, 키트는 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼, 단백질 A 칼럼 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼; 및 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 적어도 1종의 완충제를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 양이온-교환 막 흡착제, 단백질 A 막 흡착제 및/또는 음이온-교환 막 흡착제; 및 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 적어도 1종의 완충제를 포함한다.
본 발명은 또한 다중-모드 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스, 단백질 A 매트릭스 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스; 및 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 적어도 1종의 완충제를 제조하기 위한 지침서를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시양태에서, 키트는 본 발명의 방법을 사용하여 단백질을 용액으로부터 정제하는데 사용된다.
한 실시양태에서, 키트는 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼, 단백질 A 칼럼 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼; 및 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 적어도 1종의 완충제를 제조하기 위한 지침서를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 키트는 양이온-교환 막 흡착제, 단백질 A 막 흡착제 및/또는 음이온-교환 막 흡착제; 및 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어진 적어도 1종의 완충제를 제조하기 위한 지침서를 포함한다.
본 발명은 20 mM 비스 트리스 및 20 mM NaCl의 최종 농도를 갖는 100 L 용액을 생성하고; 아세트산으로 용액의 pH를 7.4로 조정하고; 25 L의 용액을 수집하는 것을 포함하는, 평형 완충제를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 또한 평형 완충제의 제조로부터의 용액의 나머지 75 L 중 25 L를 수집하고, 이들 25 L의 용액에 당량 1 M NaCl을 첨가하는 것을 포함하는, 세척 완충제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 평형 완충제의 제조로부터의 용액의 나머지 50 L 중 25 L를 수집하고, 아세트산으로 이들 25 L의 용액의 pH를 3.7로 조정하는 것을 포함하는, 용리 완충제를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 당량 45 mM NaCl 및 당량 25 mM NH4Cl을 평형 완충제의 제조로부터의 용액의 나머지 25 L에 첨가하고, 아세트산으로 이들 25 L의 pH를 7.25로 조정하는 것을 포함하는, 용리 완충제를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본원에 개시된 방법에 의해 제조된 완충제는 본 발명의 방법을 사용하여 단백질을 용액으로부터 정제하는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에 의해 수득된 단리된 단백질, 제약 작용제 및 제약 조성물이 본원에 또한 제공된다.
개시된 정제 방법의 이들 및 다른 특징 및 이점은 첨부된 청구범위와 함께 하기 상세한 설명으로부터 보다 완전히 이해될 것이다. 청구범위의 범위는 그곳에서의 언급에 의해 정의되며 설명에 제시된 특징 및 이점의 특정한 논의에 의한 것이 아님을 주목한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 "포함하는", "갖는", "비롯한" 및 "함유하는"은 달리 나타내지 않는 한 개방형 용어 (즉, "포함하나, 이에 제한되지는 않는,"을 의미)로서 해석되어야 한다. 추가로, 용어 "포함하는"은 "이루어진" (예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수 있거나 또는 추가의 것, 예를 들어 X+Y를 포함할 수 있음)을 포괄한다.
개시된 정제 방법의 실시양태의 하기 상세한 설명은 하기 도면과 함께 읽는 경우에 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1은 실시예 2 내지 7에 개시된 정제 방법의 완충제를 제제화하는데 사용된 프로토콜의 개략도를 제시한다.
도 2는 3개의 NH4Cl 농도에 대한 제2 용리 완충제에 대한 스위트 스폿을 나타내는 그래프를 제시한다.
도 3은 실시예 5의 15회 실행 각각에서의 HMW, 수율, HCP 및 DNA의 트렌드 분석을 나타내는 그래프를 제시한다.
도 4는 실시예 8의 50회 실행 각각에서의 HMW, LMW, HCP 및 DNA의 트렌드 분석을 나타내는 그래프를 제시한다.
도 5는 단백질을 정제하기 위한 통상의 공정의 상이한 단계의 개략도를 제시한다. BH: 벌크 수확물; EqB#1: 제1 평형 완충제; WB#1: 제1 세척 완충제, ElB#1: 제1 용리 완충제; EqB#2: 제2 평형 완충제; WB#2: 제2 세척 완충제, ElB#2: 제2 용리 완충제; EqB#3: 제3 평형 완충제; WB#3: 제3 세척 완충제; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; pH adjust.: pH 조정; conc. adjust.: 농도 조정; conduct. adjust.: 전도성 조정; samp.: 샘플링; stor.: 저장; filt.: 여과; Nanofilt.: 나노여과; TFF: 접선 흐름 여과.
도 6은 본 발명의 방법의 상이한 단계의 개략도를 제시한다. BH: 벌크 수확물; EqB#1: 제1 평형 완충제; WB#1: 제1 세척 완충제, ElB#1: 제1 용리 완충제; ElB#2: 제2 용리 완충제; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; samp.: 샘플링; stor.: 저장; Nanof.: 나노여과; TFF: 접선 흐름 여과.
도 7은 여러 실행 또는 주기를 포함하는, 단백질을 정제하기 위한 통상의 공정의 상이한 단계의 개략도를 제시한다. Clar.: 정화; EqB#1: 제1 평형 완충제; WB#1: 제1 세척 완충제, ElB#1: 제1 용리 완충제; EqB#2: 제2 평형 완충제; WB#2: 제2 세척 완충제, ElB#2: 제2 용리 완충제; EqB#3: 제3 평형 완충제; WB#3: 제3 세척 완충제; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과.
도 8은 여러 실행 또는 주기를 포함하는, 본 발명의 방법의 상이한 단계의 개략도를 제시한다. Clar.: 정화; EqB#1: 제1 평형 완충제; WB#1: 제1 세척 완충제, ElB#1: 제1 용리 완충제; ElB#2: 제2 용리 완충제; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과.
도 9는 여러 실행 또는 주기를 포함하는 단백질을 정제하기 위한 통상의 공정의 상이한 단계의 시간선의 개략도를 제시한다. 표의 제1 라인은 시간 (시 단위)을 나타낸다. Clar.: 정화; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; 저 pH inact.: 저 pH 불활성화; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과. 원은 공정이 완결된 때의 시간을 나타낸다.
도 10은 여러 실행 또는 주기를 포함하는 본 발명의 방법의 상이한 단계의 시간선의 개략도를 제시한다. Clar.: 정화; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과. 원은 공정이 완결된 때의 시간을 나타낸다.
도 11은 여러 실행 또는 주기를 포함하는 단백질을 정제하기 위한 통상의 공정의 상이한 단계의 시간선의 개략도를 제시한다. 표의 제1 라인은 시간 (시 단위)을 나타낸다. Clar.: 정화; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; 저 pH inact.: 저 pH 불활성화; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과. 공정의 생산성의 추정 수준이 나타내어진다.
도 12는 여러 실행 또는 주기를 포함하는 본 발명의 방법의 상이한 단계의 시간선의 개략도를 제시한다. Clar.: 정화; chr1: 제1 크로마토그래피 단계; chr2: 제2 크로마토그래피 단계; chr3: 제3 크로마토그래피 단계; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과. 공정의 생산성의 추정 수준이 나타내어진다.
도 1은 실시예 2 내지 7에 개시된 정제 방법의 완충제를 제제화하는데 사용된 프로토콜의 개략도를 제시한다.
도 2는 3개의 NH4Cl 농도에 대한 제2 용리 완충제에 대한 스위트 스폿을 나타내는 그래프를 제시한다.
도 3은 실시예 5의 15회 실행 각각에서의 HMW, 수율, HCP 및 DNA의 트렌드 분석을 나타내는 그래프를 제시한다.
도 4는 실시예 8의 50회 실행 각각에서의 HMW, LMW, HCP 및 DNA의 트렌드 분석을 나타내는 그래프를 제시한다.
도 5는 단백질을 정제하기 위한 통상의 공정의 상이한 단계의 개략도를 제시한다. BH: 벌크 수확물; EqB#1: 제1 평형 완충제; WB#1: 제1 세척 완충제, ElB#1: 제1 용리 완충제; EqB#2: 제2 평형 완충제; WB#2: 제2 세척 완충제, ElB#2: 제2 용리 완충제; EqB#3: 제3 평형 완충제; WB#3: 제3 세척 완충제; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; pH adjust.: pH 조정; conc. adjust.: 농도 조정; conduct. adjust.: 전도성 조정; samp.: 샘플링; stor.: 저장; filt.: 여과; Nanofilt.: 나노여과; TFF: 접선 흐름 여과.
도 6은 본 발명의 방법의 상이한 단계의 개략도를 제시한다. BH: 벌크 수확물; EqB#1: 제1 평형 완충제; WB#1: 제1 세척 완충제, ElB#1: 제1 용리 완충제; ElB#2: 제2 용리 완충제; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; samp.: 샘플링; stor.: 저장; Nanof.: 나노여과; TFF: 접선 흐름 여과.
도 7은 여러 실행 또는 주기를 포함하는, 단백질을 정제하기 위한 통상의 공정의 상이한 단계의 개략도를 제시한다. Clar.: 정화; EqB#1: 제1 평형 완충제; WB#1: 제1 세척 완충제, ElB#1: 제1 용리 완충제; EqB#2: 제2 평형 완충제; WB#2: 제2 세척 완충제, ElB#2: 제2 용리 완충제; EqB#3: 제3 평형 완충제; WB#3: 제3 세척 완충제; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과.
도 8은 여러 실행 또는 주기를 포함하는, 본 발명의 방법의 상이한 단계의 개략도를 제시한다. Clar.: 정화; EqB#1: 제1 평형 완충제; WB#1: 제1 세척 완충제, ElB#1: 제1 용리 완충제; ElB#2: 제2 용리 완충제; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과.
도 9는 여러 실행 또는 주기를 포함하는 단백질을 정제하기 위한 통상의 공정의 상이한 단계의 시간선의 개략도를 제시한다. 표의 제1 라인은 시간 (시 단위)을 나타낸다. Clar.: 정화; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; 저 pH inact.: 저 pH 불활성화; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과. 원은 공정이 완결된 때의 시간을 나타낸다.
도 10은 여러 실행 또는 주기를 포함하는 본 발명의 방법의 상이한 단계의 시간선의 개략도를 제시한다. Clar.: 정화; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과. 원은 공정이 완결된 때의 시간을 나타낸다.
도 11은 여러 실행 또는 주기를 포함하는 단백질을 정제하기 위한 통상의 공정의 상이한 단계의 시간선의 개략도를 제시한다. 표의 제1 라인은 시간 (시 단위)을 나타낸다. Clar.: 정화; chrom1: 제1 크로마토그래피 단계; chrom2: 제2 크로마토그래피 단계; chrom3: 제3 크로마토그래피 단계; 저 pH inact.: 저 pH 불활성화; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과. 공정의 생산성의 추정 수준이 나타내어진다.
도 12는 여러 실행 또는 주기를 포함하는 본 발명의 방법의 상이한 단계의 시간선의 개략도를 제시한다. Clar.: 정화; chr1: 제1 크로마토그래피 단계; chr2: 제2 크로마토그래피 단계; chr3: 제3 크로마토그래피 단계; Nanof.: 나노여과; UF/DF: 한외여과/투석여과. 공정의 생산성의 추정 수준이 나타내어진다.
혼합 모드 수지 (다중-모드 수지로도 지칭됨) 및 크로마토그래피 막 흡착제의 이용가능성을 기준으로 하여, 본 발명자들은 단지 3개의 크로마토그래피 단계를 사용하는 신규한 정제 공정을 개발하였다. 즉, 상기 방법은 크로마토그래피 매트릭스 상의 통과를 포함하는 단지 3개의 단계를 포함한다.
본 발명은 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법으로서,
(a)
- 상기 용액을 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
- 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계; 및
(c)
- 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 매트릭스를 통해 통과시키고;
- 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 매트릭스의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 2개의 제1 상기 크로마토그래피 단계 각각은
- 평형 완충제를 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 용액 또는 조 단백질 용리액을 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고 (상기 언급된 바와 같음);
- 평형 완충제를 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 임의로 세척 완충제를 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 임의로 평형 완충제를 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액 또는 단백질 용리액을 용리 완충제를 사용하여 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것 (상기 언급된 바와 같음)
을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있으며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스를 포함한다.
본 발명은 또한 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법으로서,
(a)
- 상기 용액의 일부를 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키고,
- 임의로, 위생처리 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
- 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고,
- 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키고,
- 임의로, 위생처리 완충제를 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c)
- 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 매트릭스를 통해 통과시키고,
- 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 매트릭스의 유동-관통물로부터 회수하고,
- 임의로 위생처리 완충제를 제3 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계;
모든 용액이 사용될 때까지 용액의 또 다른 부분으로 단계 (a), (b) 및 (c)를 연속적으로 재개하는 것, 및
각각의 단계 (c)의 종결 시에 회수된 정제된 단백질을 수집하는 것
을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 평형, 세척 및 용리 완충제 각각은 비스 트리스를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
본 발명의 문맥에서, 표현 "크로마토그래피 매트릭스"는, 정제 공정에서, 혼합물 중에 존재하는 다른 분자로부터 정제될 분자를 분리하도록 흡수제로서 작용하는 임의의 종류의 미립자 흡착제 매질, 수지 또는 다른 고체 상, 예컨대 막을 지칭한다. 매트릭스, 특히 수지로 이루어진 매트릭스는 칼럼의 형태 또는 막 흡착제의 형태일 수 있다.
본 발명의 문맥에서, "막 흡착제"는, 이온성 기를 보유하고 부착된 관능기, 예컨대 친화성 기 및 이온성 교환 기를 포함하는 아크릴 중합체의 편평한 시트를 지칭한다. 수지와 막의 차이 중 하나는 유량 분포이다: 수지의 경우에는 확산에 의하며 막에서는 대류에 의함.
본 발명의 방법의 한 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 크로마토그래피 매트릭스는 크로마토그래피 칼럼이다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 크로마토그래피 매트릭스는 크로마토그래피 막 흡착제이다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법으로서,
(a)
- 상기 용액을 제1 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
- 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
- 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계; 및
(c)
- 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시키고;
- 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 칼럼의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 2개의 제1 상기 크로마토그래피 단계 각각은
- 평형 완충제를 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
- 용액 또는 조 단백질 용리액을 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고 (상기 언급된 바와 같음);
- 평형 완충제를 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
- 임의로 세척 완충제를 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
- 임의로 평형 완충제를 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액 또는 단백질 용리액을 용리 완충제를 사용하여 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키는 것 (상기 언급된 바와 같음)
을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있으며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스를 포함한다.
본 발명은 또한 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법으로서,
(a)
- 상기 용액의 일부를 제1 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키고,
- 임의로, 위생처리 완충제를 제1 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
- 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고,
- 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키고,
- 임의로, 위생처리 완충제를 제2 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c)
- 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시키고,
- 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 칼럼의 유동-관통물로부터 회수하고,
- 임의로 위생처리 완충제를 제3 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계;
모든 용액이 사용될 때까지 용액의 또 다른 부분으로 단계 (a), (b) 및 (c)를 연속적으로 재개하는 것, 및
각각의 단계 (c)의 종결 시에 회수된 정제된 단백질을 수집하는 것
을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 평형, 세척 및 용리 완충제 각각은 비스 트리스를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법으로서,
(a)
- 상기 용액을 제1 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
- 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고;
- 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계; 및
(c)
- 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 막 흡착제를 통해 통과시키고;
- 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 막 흡착제의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 2개의 제1 상기 크로마토그래피 단계 각각은
- 평형 완충제를 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고;
- 용액 또는 조 단백질 용리액을 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고 (상기 언급된 바와 같음);
- 평형 완충제를 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고;
- 임의로 세척 완충제를 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고;
- 임의로 평형 완충제를 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액 또는 단백질 용리액을 용리 완충제를 사용하여 크로마토그래피 막 흡착제로부터 용리시키는 것 (상기 언급된 바와 같음)
을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있으며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스를 포함한다.
본 발명은 또한 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법으로서,
(a)
- 상기 용액의 일부를 제1 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 막 흡착제로부터 용리시키고,
- 임의로, 위생처리 완충제를 제1 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
- 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키고,
- 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 막 흡착제로부터 용리시키고,
- 임의로, 위생처리 완충제를 제2 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c)
- 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 막 흡착제를 통해 통과시키고,
- 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 막 흡착제의 유동-관통물로부터 회수하고,
- 임의로 위생처리 완충제를 제3 크로마토그래피 막 흡착제 상에 통과시키는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계;
모든 용액이 사용될 때까지 용액의 또 다른 부분으로 단계 (a), (b) 및 (c)를 연속적으로 재개하는 것, 및
각각의 단계 (c)의 종결 시에 회수된 정제된 단백질을 수집하는 것
을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기서 평형, 세척 및 용리 완충제 각각은 비스 트리스를 포함하는 것인 방법에 관한 것이다.
상기 나타낸 바와 같이, 본 발명의 상기 방법은 단지 3개의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 본 발명에 따른 방법은 단지 3개의 크로마토그래피 단계를 포함할지라도, 이는 제약 목적 및 특히 인간에의 투여에 적합한 정제된 단백질을 수득하는 것을 허용한다.
정제 공정에서의 인간 취급의 부재 (및 정제 공정을 완결시키는데 요구되는 전체 시간의 결과적인 감소) 이외에도, 개시된 방법은 정제에 사용된 완충제 및 수지의 양을 감소시킨다. 추가로, 주요 완충제는 동일한 성분 (즉 비스 트리스, NaCl, 아세트산, 물 및 임의로 NH4Cl)을 포함하며, 이는 완충제 제조를 매우 용이하게 한다. 개시된 정제 방법은 또한 다양한 mAb의 정제를 허용하는 것 이외에도 mAb 정제를 간소화시키고, 전체 수율을 개선시키고, 원료, 저장 시설, 상품의 비용 및 공정 시간을 감소시킨다.
통상의 단백질 정제 방법과 대조적으로, 상기 언급된 바와 같이, 본원에 개시된 방법은 4 또는 5종의 완충제를 사용한다: 평형 완충제, 세척 완충제, 2종의 용리 완충제, 및 임의로 위생처리 완충제. 개시된 방법에 사용된 4종의 주요 완충제는 모액으로부터 화합물의 동일한 매트릭스로 제조되며, 이는 완충제 제조를 매우 용이하게 한다.
본원에 사용된 "본 발명에 따른 완충제"는 비스 트리스를 포함하는 완충제를 지칭한다. 비스 트리스는 통상의 기술자에게 널리 공지된 화합물이며, 그의 IUPAC 명칭은 2-[비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올이고, 그의 CAS 번호는 6976-37-0이다. 본 발명에 따른 이러한 완충제는 평형 완충제, 세척 완충제, 및/또는 용리 완충제에 해당할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명에 따른 이러한 완충제는 다양한 농도의 동일한 화학물질 (이들 중 1종은 비스 트리스임)을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 구체적 실시양태에서, 완충제는 비스 트리스, 아세트산 및 물을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 보다 구체적인 실시양태에서, 완충제는 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 즉, 이러한 완충제는 다양한 농도의 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
용리 완충제는 예를 들어, 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 pH (예를 들어 3.7)로 조정된, 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 이러한 용리 완충제는 친화성 크로마토그래피 매트릭스, 특히 친화성 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제, 예컨대 단백질 A 매트릭스, 특히 단백질 A 칼럼 또는 단백질 A 막 흡착제와 함께 사용하기에 특히 적합하다.
용리 완충제는 또한, 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH (예를 들어 7.25)로 조정된, 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) 비스 트리스, 40 내지 50 mM (예를 들어 45 mM) NaCl, 및 20 내지 30 mM (예를 들어 25 mM) NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 이러한 용리 완충제는 다중-모드 수지 크로마토그래피 매트릭스, 특히 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 예를 들어 캅토(Capto) MMC와 함께 사용하기에 특히 적합하다.
용리 완충제는 또한, 아세트산으로 6과 7 사이에 포함된 pH (예를 들어 6.2)로 조정된, 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) 비스 트리스, 50 내지 150 mM (예를 들어 80 mM) NaCl, 및 20 내지 30 mM (예를 들어 25 mM) NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 이러한 용리 완충제는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스, 특히 양이온-교환 막 흡착제와 함께 사용하기에 특히 적합하다.
평형 완충제는, 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH (예를 들어 7.4)로 조정된, 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
세척 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH (예를 들어 7.4)로 조정된, 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) 비스 트리스, 및 0.9 내지 1.1 M (예를 들어 1 M) NaCl을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
보다 구체적으로, 개시된 방법에 사용하기 위한 1종의 평형 완충제는 2 mM 아세트산으로 pH 7.4로 조정된, 20 mM 비스 트리스 및 20 mM NaCl을 함유한다. 개시된 방법에 사용하기 위한 1종의 세척 완충제는 2 mM 아세트산으로 pH 7.4로 조정된, 20 mM 비스 트리스 및 1 M NaCl을 함유한다. 개시된 방법에 사용하기 위한 제1 용리 완충제는 275 mM 아세트산으로 pH 3.7로 조정된, 20 mM 비스 트리스 및 20 mM NaCl을 함유한다. 개시된 방법에 사용하기 위한 제2 용리 완충제는, 특히 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼과 함께 사용한 경우에, 5 mM 아세트산으로 pH 7.25로 조정된, 20 mM 비스 트리스, 45 mM NaCl, 및 25 mM NH4Cl을 함유하거나, 또는 특히 양이온-교환 막 흡착제와 함께 사용한 경우에, 5 mM 아세트산으로 pH 6.2로 조정된, 20 mM 비스 트리스, 80 mM NaCl, 및 25 mM NH4Cl을 함유한다.
상기 완충제 제제의 이점은, 바람직하지 않은 상호작용을 최소화하고, pH 및 전도성 저하를 제한하고, 전통적인 정제 방법에 비해 증가된 수율을 촉진하면서, 보다 큰 상용성을 갖는 개시된 방법에 사용된, mAb 생성물이 3개의 크로마토그래피 매트릭스, 특히 3개의 크로마토그래피 칼럼 또는 3개의 크로마토그래피 막 흡착제를 통과하는 능력을 포함한다. 감소된 수의 완충제를 사용하는 것 이외에도, 개시된 방법의 또 다른 측면은 비스-트리스 완충제의 사용이다. 이러한 완충제의 사용은 3개의 크로마토그래피 단계 사이에서 pH를 조정하는 것을 방지하여 수확물로부터 최종 정제 단계로의 폐쇄 시스템으로 상기 방법을 실행하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 문맥에 임의로 사용된 위생처리 완충제는 0.05 N 내지 0.15 N (예를 들어 0.1 N) NaOH를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 이러한 위생처리 완충제는 친화성 크로마토그래피 매트릭스, 특히 친화성 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 단백질 A 칼럼 또는 친화성 크로마토그래피 막 흡착제, 예컨대 사토바인드(Sartobind) 단백질 A 막 흡착제, 다중-모드 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스, 특히 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 캅토 MMC, 또는 양이온-교환 크로마토그래피 막 흡착제, 예컨대 사토바인드 S 막 흡착제, 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스, 특히 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 바이오프로(BioPro) Q75, 또는 음이온-교환 크로마토그래피 막 흡착제, 예컨대 사토바인드 Q 막 흡착제와 함께 사용하기에 특히 적합하다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질"은 하기를 지칭한다:
1) a) 자연-발생 및 구체적으로 비-재조합 세포에 의해 생산된 단백질, 또는 b) 유전자-조작된 또는 재조합 세포인, 천연 단백질의 서열을 갖는 분자, 또는
2) 1개 이상의 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환에 의한 및/또는 적어도 1종의 번역후 변형 (예를 들어 글리코실화)에 의한 천연 단백질의 서열과 상이한 분자.
상기 단락 1)에서 언급된 분자는 천연 단백질을 지칭할 수 있다.
상기 단락 2)에서 언급된 분자는 비-천연 단백질이다.
특정 측면에서, 정제될 단백질은 항체이다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 항체, 또는 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁하는 그의 결합 단편을 지칭한다. 결합 단편은 F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, 및 단일쇄 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "중쇄"는 항원에 대한 특이성을 부여하는 충분한 가변 영역 서열을 갖는 임의의 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "중쇄"는 전장 중쇄 및 그의 단편을 포괄한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH, 및 3종의 불변 영역 영역, CH1, CH2, 및 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에서 있고, CH3 도메인은 카르복실-말단에 있다.
본원에 사용된 용어 "경쇄"는 전장 경쇄 및 그의 단편을 포괄한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL, 및 불변 영역 도메인, CL을 포함한다. 중쇄와 같이, 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단에서 있다. 본원에 사용된 용어 "경쇄"는 항원에 대한 특이성을 부여하는 충분한 가변 영역 서열을 갖는 임의의 이뮤노글로불린 폴리펩티드를 포함한다.
자연 발생 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 이러한 사량체는 전형적으로 2종의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되고, 각각의 쌍은 1종의 전장 경쇄 (전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 1종의 전장 중쇄 (전형적으로 약 50-70 kDa의 분자량을 가짐)를 갖는다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노-말단 부분은 전형적으로, 항원 인식을 전형적으로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카르복시-말단 부분은 전형적으로, 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소형을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로서 정의한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 하위부류를 갖는다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하위부류를 갖는다. IgA는 유사하게는 IgA1 및 IgA2를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하위부류로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 전형적으로, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 여기서 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다.
각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원-결합 부위를 형성한다. 가변 영역은 전형적으로 3개의 초가변 영역 (상보성 결정 영역 또는 CDR로도 지칭됨)에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되고, 이는 특이적 에피토프에 결합하는 것을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 다는 전형적으로 영역 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 할당은 전형적으로 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]의 정의를 따른다. 이중특이적 또는 이중기능적 항체는 전형적으로 2개의 상이한 중쇄/경쇄 쌍 및 2개의 상이한 결합 부위를 갖는 인공 하이브리드 항체이다.
F(ab) 단편은 1개의 경쇄, 및 1개의 중쇄의 CH1 및 가변 영역으로 구성된다. F(ab) 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. F(ab') 단편은 쇄간 디술피드 결합이 2개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있도록 CH1 및 CH2 영역 사이에 보다 많은 불변 영역을 함유하는 1개의 경쇄 및 1개의 중쇄를 함유한다. Fv 영역은 중쇄 및 경쇄 둘 다로부터의 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 결여된다. 단일쇄 항체는 경쇄 및 경쇄 가변 영역이 가요성 링커에 의해 연결되어 단일 폴리펩티드 쇄를 형성하는 Fv 분자이며, 이는 항원-결합 영역을 형성한다. 특정 실시양태에서, "다중특이적" 또는 "다중기능적" 항체 이외의 2가 항체는 동일한 항원 특이성을 갖는 결합 부위를 포함하는 것으로 이해된다.
개시된 방법에 의해 정제될 수 있는 모노클로날 항체 (mAb)는 통상의 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 체세포 혼성화 기술을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 바람직할지라도, 원칙적으로, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B-림프구의 바이러스 또는 종양원성 형질전환이 사용될 수 있다. 모노클로날 항체는, 예를 들어 뮤린, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체에 해당할 수 있다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 항체는, 인간 β-아밀로이드 단백질의 원시섬유 형태에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어 인간화 항체), 박테리아 표면 폴리사카라이드 폴리-N-아세틸 글루코사민 (PNAG)에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어 완전 인간 항체), 암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 5 (CEACAM5)에 특이적으로 결합하는 항체 및 CD38 막횡단 당단백질에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어 인간화 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된 모노클로날 항체이다.
본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 항체의 비제한적 예는 또한 파니투무맙, 오말리주맙, 아바고보맙, 압식시맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라치주맙, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아폴리주맙, 아티누맙, 토실리주맙, 바실릭시맙, 벡투모맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 비시로맙, 카나키누맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에쿨리주맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에펀구맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에타네르셉트, 골리무맙, 인플릭시맙, 나탈리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 두필루맙, 사릴루맙 또는 프레솔리무맙을 포함한다.
특정 측면에서, 정제될 단백질은 효소이다.
본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 효소의 비제한적 예는 산 α-글루코시다제, α-L-이두로니다제, 이두로네이트 술파타제, 헤파란 N-술파타제, 갈락토스-6-술파타제, 산 β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, N-아세틸글루코사민-1-포스포트랜스퍼라제, α-N-아세틸갈락토사미니다제 (α-갈락토시다제 B), 산 리파제, 리소솜 산 세라미다제, 산 스핑고미엘리나제, β-글루코시다제, 갈락토실세라미다제, α-갈락토시다제 A, 산 β-갈락토시다제, β-갈락토시다제, 뉴라미니다제, 헥소사미니다제 A 또는 헥소사미니다제 B를 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 정제될 수 있는 단백질의 다른 비제한적 예는 인간 에리트로포이에틴, 종양 괴사 인자 (예를 들어 TNF-α, TNF-β 또는 TNF-K), 인터페론 알파 또는 인터페론 베타를 포함한다.
정제될 단백질을 함유하는 용액은 배양 배지, 바람직하게는 정화된 배양 배지일 수 있다. 정제될 단백질을 함유하는 용액은 예를 들어 관류 생물반응기 또는 유가식 생물반응기에서 수득된 배양 배지이다.
관류 생물반응기 또는 유가식 생물반응기의 예는 미국 특허 가출원 번호 61/775,060 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
용어 "정화된 배양 배지"는, 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포를 실질적으로 함유하지 않는 (예를 들어, 적어도 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 또는 99% 무함유) 포유동물, 박테리아 또는 효모 세포 배양로부터 수득된 액체 배양 배지를 의미한다.
본원에 사용된 어구 "단백질을 회수하는 것"은 개시된 정제 방법을 사용한 후 단백질을 수집하는 것을 지칭한다. 개시된 정제 방법은 다양한 표준 단백질 크로마토그래피 기술, 예컨대, 비제한적으로, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 및 다중-모드 수지 크로마토그래피를 사용하여 달성될 수 있다.
개시된 방법의 특정 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A 매트릭스이다. 개시된 방법의 특정한 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A 칼럼이다. 개시된 방법의 다른 특정한 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 매트릭스는 단백질 A 막 흡착제이다. 단백질 A 매트릭스, 특히 단백질 A 칼럼 또는 단백질 A 막 흡착제, 수지 리간드와 단백질 사이의 친화도를 통해 기능하여 높은 효율의 불순물 제거를 가져온다. 개시된 방법에서 단백질 A 매트릭스, 특히 단백질 A 칼럼 또는 단백질 A 막 흡착제를 사용하는 또 다른 이점은 mAb가 단백질 A에 대한 보편적인 친화도를 갖는다는 것이다. 개시된 방법의 한 실시양태에서, 단백질 A 칼럼은 맙셀렉트 슈어(MabSelect Sure) 수지 (지이 헬스케어(GE Healthcare))이다. 개시된 방법의 또 다른 실시양태에서, 단백질 A 칼럼은 앱솔루트 하이 캡(Absolute High Cap) (노바셉(Novasep))이다. 개시된 방법의 한 실시양태에서, 단백질 A 막 흡착제는 사토바인드 단백질 A 막 흡착제 (사토리우스(Sartorius))이다.
개시된 방법의 추가 실시양태에서, 제2 크로마토그래피 매트릭스는 다중-모드 (혼합-모드) 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스이다. 개시된 방법의 특정한 실시양태에서, 제2 크로마토그래피 매트릭스는 다중-모드 (혼합-모드) 수지 크로마토그래피 칼럼이다. 다중-모드 수지는 mAb:이온성, 소수성 및 수소 결합 상호작용에 의한 여러 메카니즘을 통해 관심 단백질과 상호작용한다. 보다 구체적으로, 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼에서, mAb:이온성 상호작용은, 전형적인 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 칼럼에서 발생하는 mAb:음이온성 상호작용과는 대조적으로 mAb:양이온성 상호작용이다
개시된 방법의 한 구체적 실시양태에서, 다중-모드 수지는 캅토 MMC 수지 (지이 헬스케어)이다. 캅토 MMC는 고도로 가교된 아가로스 염기 매트릭스를 갖는 다중모드 양이온 교환체이다. 캅토 MMC의 특징은 하기에 요약된다 (지이 헬스케어 라이프 사이언시스, 데이터 파일 11-0035-45 AA 참조).
개시된 방법의 다른 특정한 실시양태에서, 제2 크로마토그래피 매트릭스는 양이온-교환 막 흡착제이다.
개시된 방법의 하나의 다른 구체적 실시양태에서, 양이온-교환 막 흡착제는 사토바인드 S 막 흡착제 (사토리우스)이다. 개시된 방법의 또 다른 구체적 실시양태에서, 양이온-교환 막 흡착제는 나트리퓨어(NatriPur) HD-C 막 흡착제 (나트릭스(Natrix))이다.
개시된 방법의 추가 실시양태에서, 제3 크로마토그래피 매트릭스는 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스이다. 개시된 방법의 특정한 실시양태에서, 제3 크로마토그래피 매트릭스는 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼이다. 개시된 방법의 다른 특정한 실시양태에서, 제3 크로마토그래피 매트릭스는 음이온-교환 막 흡착제이다. 음이온-교환 매트릭스, 특히 음이온-교환 수지의 불활성 중합체 지지체에 공유 가교된 양으로-하전된 유기 모이어티는 mAb:음이온성 상호작용을 통해 관심 단백질과 상호작용한다. 개시된 방법의 한 실시양태에서, 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼은 바이오프로 Q75 (YMC)이다. 바이오프로 Q75의 특징은 하기에 요약된다 (YMC-바이오프로 Q75 & S75 데이터 시트 참조).
개시된 방법의 또 다른 실시양태에서, 음이온-교환 막 흡착제는 사토바인드 Q 막 흡착제 (사토리우스)이다. 개시된 방법의 또 다른 실시양태에서, 음이온-교환 막 흡착제는 사토바인드 STIC 막 흡착제 (사토리우스)이다. 개시된 방법의 또 다른 실시양태에서, 음이온-교환 막 흡착제는 HD-Q 막 흡착제 (나트릭스)이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 제1 크로마토그래피 단계의 종결 시에 및/또는 제2 크로마토그래피 단계의 종결 시에 조 단백질 용리액 및/또는 단백질 용리액의 pH를 조정하는 것을 포함하지 않는다.
특정한 실시양태에서, 제1 크로마토그래피 단계의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액은 제2 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제2 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 직접 통과된다. 보다 구체적으로, 이어서 2개의 단계 사이에 어떠한 처리 (예컨대 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석)도 수행되지 않는다. 이러한 방법에서, 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼은 예를 들어 캅토 MMC 칼럼에 해당할 수 있다. 이러한 방법에서, 양이온-교환 막 흡착제 예를 들어 사토바인드 S 막 흡착제에 해당할 수 있다. 추가로, 특정한 실시양태에서, 제2 크로마토그래피 단계의 종결 시에 수득된 단백질 용리액은 제3 크로마토그래피 매트릭스, 특히 제3 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제를 통해 직접 통과된다. 보다 구체적으로, 이어서 2개의 단계 사이에 어떠한 처리 (예컨대 pH 조정, 완충제 교환 또는 희석)도 수행되지 않는다. 이러한 방법에서, 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼은 예를 들어 캅토 MMC 칼럼에 해당할 수 있고/거나 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼은 예를 들어 바이오프로 Q75 칼럼에 해당할 수 있다. 이 방법의 구체적 예는 실시예 4에 개시된다. 이러한 방법에서, 양이온-교환 막 흡착제는 예를 들어 사토바인드 S 막 흡착제에 해당할 수 있고/거나 음이온-교환 크로마토그래피 막 흡착제는 예를 들어 사토바인드 Q 막 흡착제에 해당할 수 있다. 이 방법의 구체적 예는 실시예 8에 개시된다.
이러한 방법에서, 수동 개입 및 정제 시스템의 개방을 필요로 하는 단계간 처리 (예를 들어, 불활성화 용기에서의 희석, 불활성화후 여과 및 단백질 A 풀 용기에서의 pH 조정)는 전혀 없다.
본 방법에 사용되는 크로마토그래피 매트릭스는 환원된 바이오버든 크로마토그래피 매트릭스 (예를 들어, 감마-조사 크로마토그래피 매트릭스)일 수 있다. 환원된 바이오버든 크로마토그래피 매트릭스의 예는 그의 전문이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 가출원 61/928,906에 개시되어 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 제1, 제2 및 제3 크로마토그래피 매트릭스를 포함하는 MCCS에서 수행될 수 있다.
용어 "다중-칼럼 크로마토그래피 시스템" 또는 "MCCS"는 총 2개 이상의 상호연결 또는 스위칭 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막의 시스템을 의미한다. 다중-칼럼 크로마토그래피 시스템의 비제한적 예는 총 2개 이상의 상호연결 또는 스위칭 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막을 함유하는 주기적 향류 크로마토그래피 시스템 (PCCS)이다. 다중-칼럼 크로마토그래피 시스템의 추가의 예는 본원에 기재되어 있고 관련 기술분야에 공지되어 있다.
MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 스위칭 메카니즘 (예를 들어, 칼럼-스위칭 메카니즘)에 의해 서로에 대해 연결되거나 또는 이동될 수 있다. MCCS는 또한 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 펌프 (예를 들어, 자동화, 예를 들어 자동화 연동 펌프)를 포함할 수 있다. 칼럼-스위칭 사건은 MCCS를 통해 통과하는 유체 (예를 들어, MCCS에서의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막 중 1개 이상으로부터의 유입액 및/또는 용리액) 중의 특정 수준의 단백질에 상응하는 UV 흡광도, 액체 (예를 들어, 완충제)의 비부피, 또는 경과된 특정한 시간에 의해 검출된 정제될 단백질의 수준의 검출에 의해 유발될 수 있다. 칼럼 스위칭은 일반적으로 MCCS에서의 적어도 2개의 상이한 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막 (예를 들어, MCCS에 존재하는 2개 이상의 상이한 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막)이 공정의 적어도 일부 동안에 실질적으로 동일한 시간에서 상이한 단계 (예를 들어, 평형, 로딩, 용리, 또는 세척)를 통해 통과하도록 허용되는 메카니즘을 의미한다.
MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 본원에 기재된 예시적인 형상, 크기, 부피 (층 부피), 및/또는 유닛 작동(들) 중 임의의 것 중 1개 이상을 가질 수 있다.
MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들)은 본원에 기재되거나 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 예시적인 수지 중 1개 이상을 함유할 수 있다. 예를 들어, MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상에 함유된 수지는 포획 메카니즘 (예를 들어, 단백질 A-결합 포획 메카니즘, 단백질 G-결합 포획 메카니즘, 항체- 또는 항체 단편-결합 포획 메카니즘, 기질-결합 포획 메카니즘, 보조인자-결합 포획 메카니즘, 압타머-결합 포획 메카니즘, 및/또는 태그-결합 포획 메카니즘)을 이용하는 수지일 수 있다. MCCS의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상에 함유된 수지는 양이온 교환 수지, 음이온 교환 수지, 분자체 수지, 또는 소수성 상호작용 수지, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 단백질을 정제하는데 사용될 수 있는 수지의 추가의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상에 함유될 수 있다. MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막은 동일한 및/또는 상이한 수지 (예를 들어, 재조합 단백질 정제에 사용하기 위한 본원에 기재되거나 관련 기술분야에 공지되어 있는 임의의 수지)를 함유할 수 있다.
MCCS에 존재하는 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 수지(들)는 1개 이상의 유닛 작동 (예를 들어, 단백질 포획, 단백질 정제, 단백질 연마, 바이러스 불활성화, 단백질을 함유하는 유체의 이온성 농도 및/또는 pH 조정, 또는 단백질을 함유하는 유체 여과)을 수행할 수 있다. 비제한적 예에서, MCCS는 유체 (예를 들어, 액체 배양 배지)로부터 단백질을 포획하고 재조합 치료 단백질을 함유하는 유체에 존재하는 바이러스를 불활성화시키는 유닛 작동을 수행할 수 있다. MCCS는 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 2개 이상의 유닛 작동의 임의의 조합을 수행할 수 있다.
MCCS는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 UV 모니터, 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 밸브, 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 pH 미터, 및/또는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 전도성 미터가 장착될 수 있다. MCCS는, 또한 칼럼-스위칭이 발생해야 하는 시점을 감지하고 (예를 들어, UV 흡광도, 액체의 부피, 또는 경과된 시간에 기초함) 칼럼-스위칭 사건에 영향을 미치는 (촉발하는) 소프트웨어 (예를 들어, 유니콘(Unicorn)-기반 소프트웨어, 지이 헬스케어 (뉴저지주 피스카타웨이))를 이용하는 작동 시스템이 장착될 수 있다. MCCS가 1개 이상의 UV 검출기를 포함하는 예에서, UV 검출기는 임의로 MCCS에서의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 유입구에서, 및/또는 MCCS에서의 크로마토그래피 칼럼(들) 및/또는 크로마토그래피 막(들) 중 1개 이상의 유출구에서 위치될 수 있다.
MCCS는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개)의 인-라인 완충제 조정 저장소(들) 및/또는 완충제 저장소(들)를 추가로 포함할 수 있다. 다른 예에서, MCCS는 MCCS에서의 크로마토그래피 칼럼 및/또는 크로마토그래피 막 중 1개 이상 내로 용이하게 통과시킬 수 없는 유체를 보유할 수 있는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개)의 브레이크 탱크를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 시스템은 1개 이상의 브레이크 탱크를 함유할 수 있다. 본원에 기재된 시스템의 다른 예는 브레이크 탱크를 포함하지 않는다.
MCCS는 유체 (예를 들어, 세포를 실질적으로 함유하지 않는 액체 배양 배지)가 상기 MCCS 내로 통과할 수 있는 유입구를 포함할 수 있다. 유입구는 이러한 목적을 위한 관련 기술분야에 공지된 임의의 구조일 수 있다. 이는, 예를 들어 유입구 내로의 유체 도관의 삽입 이후에 유입구 밖으로의 유체의 상당한 누수 없이 유체가 유입구를 통해 MCCS에 들어가도록 유체 도관이 삽입되는 것을 허용하는 스레딩, 리빙, 또는 실링을 포함할 수 있다. 본 시스템에 사용될 수 있는 비제한적 유입구는 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 이해될 것이다. 본원에 제공된 시스템의 일부 예는 또한 MCCS의 유입구와 유체적으로 연결된 생물반응기를 포함한다. 본원에 기재되거나 관련 기술분야에 공지된 임의의 예시적인 생물반응기는 본 시스템에 사용될 수 있다.
MCCS는 단백질이 시스템을 빠져나갈 수 있는 유출구를 포함할 수 있다. 유출구는, 예를 들어 유체 도관이 삽입되도록 허용하는 스레딩, 리빙, 또는 실링, 또는 단백질을 함유하거나 또는 저장하도록 설계된 바이알을 포함할 수 있다. 유출구는 단백질이 멸균 바이알 또는 저장 용기 내로 직접 유동하도록 하기 위해, 멸균 바이알 또는 다른 이러한 저장 용기를 유출구 상에 실링하는데 사용될 수 있는 표면을 함유할 수 있다. 본 시스템에 사용될 수 있는 비제한적 유출구는 통상의 기술자에게 공지되어 있으며 이해될 것이다.
본원에 제공된 시스템의 일부 예는 또한 펌프 시스템을 포함한다. 펌프 시스템은 1개 이상의 하기를 포함할 수 있다: 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 펌프 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 펌프), 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 필터 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 필터), 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)의 UV 검출기, 및 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 또는 5개)의 브레이크 탱크.
본원에 기재된 시스템의 일부 예는 MCCS의 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 연결된 추가의 유체 도관을 추가로 포함하며, 여기서 추가의 유체 도관 중 1개의 말단은 생물반응기에 유체적으로 연결되고, 다른 말단은 펌프와 유입구 사이의 유체 도관에 유체적으로 연결된다. 이러한 추가의 유체 도관은 생물반응기 (예를 들어, ATF 세포 체류 시스템)로부터 제거된 액체 배양 배지로부터 세포를 제거하는 것이 가능한 필터를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 이러한 특정한 유체 도관은 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 펌프 (예를 들어, 본원에 기재되거나 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 펌프) 및/또는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 또는 4개)의 브레이크 탱크 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 예시적인 브레이크 탱크)를 포함할 수 있으며, 여기서 이들 펌프(들) 및/또는 브레이크 탱크(들)는 유체 도관에 존재하는 유체와 유체적으로 연결된다.
본원에 기재된 시스템은 임의로 최종 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막과 유출구 사이에 배치된 유체 도관을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 시스템은 필터가 MCCS에서의 최종 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막과 유출구 사이에 배치된 유체 도관에 존재하는 유체로부터, 예를 들어 침전된 물질, 미립자 물질, 또는 박테리아를 제거할 수 있도록 최종 크로마토그래피 칼럼 또는 크로마토그래피 막과 유출구 사이에 배치된 유체 도관과 유체적으로 연결된 1개 이상의 필터를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 연속 모드로 실행될 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 단백질을 용액으로부터 정제하는 연속 방법일 수 있다.
용어 "연속 방법" 또는 "연속 모드의 방법"은 시스템의 적어도 일부를 통해 유체를 연속적으로 공급하는 방법을 의미한다.
용어 "유체"는 본원에서 임의의 액체, 예컨대 정제될 단백질을 함유하는 용액, 완충제 또는 바이러스 불활성화를 위한 저 또는 산성 pH 용액을 의미한다.
바람직한 실시양태에서, 제1, 제2 및 제3 매트릭스는 유체에 의해 연속적으로 공급된다.
용어 "통합 공정"은 특정한 결과 (예를 들어 액체 배양 배지로부터의 정제된 단백질의 생성)를 달성하기 위해 공동으로 기능하는 구조적 요소를 사용하여 수행되는 공정을 의미한다.
통합 공정의 예는 미국 특허 가출원 번호 61/775,060 (그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시되어 있다.
본 발명의 방법의 스케일-업은 또한 각각의 크로마토그래피 칼럼의 층 부피를 칼럼-스위칭 및/또는 증가시키는 사용을 포함할 수 있다.
게다가, 본 발명의 방법은 방법의 제1 단계에서 최종 단계로의 폐쇄 시스템으로 실행될 수 있다. 특히, 크로마토그래피 단계 및 임의의 여과 단계(들) (예를 들어, 나노여과 단계 및/또는 한외여과 및 투석여과 단계)는 폐쇄 시스템으로 실행될 수 있다. 본 발명의 방법의 구체적 실시양태에서, 단백질을 포함하는 용액은 3개의 크로마토그래피 매트릭스, 특히 3개의 크로마토그래피 칼럼 또는 막 흡착제 상에 차례로 통과되고, 용액 일부의 각 통과는 1회 실행에 해당한다. 이어서, 각각의 실행의 종결 시에 회수된 단백질은 수집되고 합쳐진다. 이 방법의 구체적 예는 실시예 5, 6 및 8에 개시된다. 이러한 방법에서, 크로마토그래피 단계의 칼럼 또는 막 흡착제는 수회 사용되고, 예를 들어 상기 정의된 바와 같은 위생처리 완충제를 사용하여 임의로 위생처리되어, 필요한 수지 또는 막 흡착제 장치, 및 완충제의 양을 감소시키는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 3 내지 50회 실행 (예를 들어 3 내지 30회 실행, 5 내지 25회 실행, 10 내지 20회 실행, 또는 15회 실행)의 순서는 연속적으로 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8회 실행이 연속 모드로 수행된 후, 3개의 칼럼 또는 막 흡착제를 (예를 들어 위생처리 완충제를 사용하여) 위생처리할 수 있다. 이는 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과 횟수로 반복될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 정제된 단백질을 회수하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "정제된"은 시험관내, 생체외, 또는 생체내 단백질의 효과적인 사용을 허용하는 순도를 지칭한다. 시험관내, 생체외, 또는 생체내 적용에 유용한 단백질의 경우에, 이는 이러한 적용에서 상기 단백질의 사용과 상호작용할 수 있거나 또는 적어도 관심 단백질의 포함이 바람직하지 않을 오염물, 다른 단백질, 및/또는 화학물질을 실질적으로 함유하지 않아야 한다. 이러한 적용은 치료 조성물의 제조, 치료 조성물 중 단백질의 투여, 및 본원에 개시된 다른 방법을 포함한다. 바람직하게는, 본원에 언급된 "정제된" 단백질은, 임의의 방법에 의해 (즉, 천연 공급원으로부터의 직접 정제에 의해, 재조합적으로, 또는 합성적으로) 생산될 수 있으며 단백질이 주어진 조성물 중 총 단백질의 중량당 적어도 약 80% 중량, 보다 바람직하게는, 주어진 조성물 중 총 단백질의 중량당 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 보다 바람직하게는 적어도 약 91%, 보다 바람직하게는 적어도 약 92%, 보다 바람직하게는 적어도 약 93%, 보다 바람직하게는 적어도 약 94%, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%, 보다 바람직하게는 적어도 약 96%, 보다 바람직하게는 적어도 약 97%, 보다 바람직하게는 적어도 약 98%, 보다 바람직하게는 적어도 약 99% 중량을 차지하도록 다른 단백질 성분으로부터 정제된 단백질이다.
본원에 사용된 "조 단백질"은, 임의의 방법에 의해 (즉, 천연 공급원으로부터의 직접 정제에 의해, 재조합적으로, 또는 합성적으로) 생산될 수 있으며 단백질이 주어진 조성물 중 총 단백질의 중량당 약 80% 중량 미만을 차지하도록 다른 단백질 성분으로부터 정제된 단백질을 지칭한다.
특정한 실시양태에서, 단백질을 본 발명에 따른 용액으로부터 정제하는 방법은
(a)
(i) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 용액을 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
(i) 평형 완충제를 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c)
(i) 평형 완충제를 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 정제된 단백질을 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하며, 여기서 평형 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고, 세척 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 0.9 내지 1.1 M NaCl을 포함하고, 제1 용리 완충제는 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고, 제2 용리 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 40 내지 50 mM NaCl, 및 20 내지 30 mM NH4Cl을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 단백질을 본 발명에 따른 용액으로부터 정제하는 방법은
(a)
(i) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 용액의 일부를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
(i) 평형 완충제를 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c)
(i) 평형 완충제를 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 정제된 단백질을 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계;
(d) 모든 용액이 사용될 때까지 용액의 또 다른 부분으로 단계 a), b) 및 c)를 연속적으로 재개하는 것, 및
(e) 각각의 제3 크로마토그래피 단계의 종결 시에 회수된 정제된 단백질을 수집하는 것
을 포함하며, 여기서 평형 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고, 세척 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 0.9 내지 1.1 M NaCl을 포함하고, 제1 용리 완충제는 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고, 제2 용리 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 40 내지 50 mM NaCl, 및 20 내지 30 mM NH4Cl을 포함한다.
또 다른 특정한 실시양태에서, 단백질을 본 발명에 따른 용액으로부터 정제하는 방법은
(a)
(i) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 용액을 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
(i) 평형 완충제를 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 양이온-교환 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c)
(i) 평형 완충제를 음이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 음이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 정제된 단백질을 음이온-교환 막 흡착제의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하며, 여기서 평형 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고, 세척 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 0.9 내지 1.1 M NaCl을 포함하고, 제1 용리 완충제는 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고, 제2 용리 완충제는 아세트산으로 6과 7 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 50 내지 150 mM NaCl, 및 20 내지 30 mM NH4Cl을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 단백질을 본 발명에 따른 용액으로부터 정제하는 방법은
(a)
(i) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 용액의 일부를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
(i) 평형 완충제를 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 양이온-교환 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c)
(i) 평형 완충제를 음이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 음이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 정제된 단백질을 음이온-교환 막 흡착제의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계;
(d) 모든 용액이 사용될 때까지 용액의 또 다른 부분으로 단계 a), b) 및 c)를 연속적으로 재개하는 것, 및
(e) 각각의 제3 크로마토그래피 단계의 종결 시에 회수된 정제된 단백질을 수집하는 것
을 포함하며, 여기서 평형 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고, 세척 완충제는 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 0.9 내지 1.1 M NaCl을 포함하고, 제1 용리 완충제는 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고, 제2 용리 완충제는 아세트산으로 6과 7 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 50 내지 150 mM NaCl, 및 20 내지 30 mM NH4Cl을 포함한다.
단백질을 용액으로부터 정제하는 방법은 적어도 1개의 여과 단계, 예컨대 나노여과 단계, 한외여과 단계 및/또는 투석여과 단계를 포함할 수 있다. 여과 단계(들)는 크로마토그래피 단계 이전에 및/또는 이후에 수행될 수 있다. 제약 목적을 위한 재조합 단백질을 정제하는 경우에, 크로마토그래피 단계는 전형적으로 여과 단계가 이어진다. 따라서, 본 발명의 방법은 단계 (c) 이후에 나노여과 단계를 추가로 포함할 수 있다. 한외여과 및 투석여과 단계는 나노여과 단계 이후에 추가로 수행될 수 있다. 본원에 사용된 "한외여과" 또는 "UF"는 입자 크기 및 UF 막에서의 기공의 크기를 기준으로 용액으로부터 입자 및/또는 이온을 물리적으로 및 선택적으로 제거하기 위해 반투과성 막을 사용하는 여과 기술을 지칭한다. 본원에 사용된 "나노여과"는, 예를 들어 바이러스 입자를 제거하는데 사용되는 나노필터를 통한 용액의 여과를 지칭한다. 본원에 사용된 "투석여과"는 용액으로부터 염 또는 용매를 완전히 제거하거나 대체하거나 또는 그의 농도를 낮추기 위해 한외여과 막을 사용하는 기술을 지칭한다.
본 발명의 방법은 또한 적어도 1개의 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적어도 1개의 바이러스 불활성화 단계는 본 발명의 방법의 임의의 단계에서, 예를 들어 단계 (a) 이전에, 단계 (a) 이후에, 단계 (b) 이후에, 단계 (c) 이후에, 나노여과 단계 이후에 및/또는 한외여과 및 투석여과 단계 이후에 수행될 수 있다. 이러한 바이러스 불활성화 단계는 전형적으로 저 또는 산성 pH 불활성화 단계일 수 있다. 본원에 사용된 "저 또는 산성 pH 불활성화"는 바이러스, 특히 외피보유 바이러스를 변성시키기 위해 산성 pH를 사용하는 바이러스 불활성화 기술을 지칭한다. 전형적으로, 저 또는 산성 pH 불활성화 단계는 회수된 단백질을 약 3.0 내지 5.0 (예를 들어, 약 3.5 내지 약 4.5, 약 3.5 내지 약 4.25, 약 3.5 내지 약 4.0, 예를 들어 4.0)의 pH에서 적어도 30분의 기간 (예를 들어, 1시간 내지 21일의 기간, 약 2시간 내지 21일의 기간, 또는 약 4시간 내지 21일의 기간) 동안 인큐베이션함으로써 수행된다. 예를 들어, 저 또는 산성 pH 불활성화 단계는 회수된 단백질을 4의 pH에서 예를 들어 6시간 내지 21일 동안 인큐베이션함으로써 수행된다.
본 발명의 방법은 또한, 단계 (a) 이전에, 세포를 실질적으로 함유하지 않는 정제될 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 액체 배양 배지는 제1 크로마토그래피 매트릭스 내에 공급된다.
예를 들어, 단백질을 용액으로부터 정제하는 본 발명의 방법은
(a-이전) 세포를 실질적으로 함유하지 않는 정제될 단백질을 함유하는 액체 배양 배지를 제공하는 단계,
(a)
- 단계 (a-이전)의 상기 액체 배양 배지를 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b)
- 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계; 및
(c)
- 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 매트릭스를 통해 통과시키고;
- 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 매트릭스의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스를 포함한다.
최종적으로, 정제된 단백질은 저장에 적합한 조성물, 및/또는 동물 및/또는 인간에게 투여하는데 적합한 제약 조성물로 제제화될 수 있다.
개시된 방법의 다수의 이점 중 하나는 이것이 우수한 수율의 고도로 순수한 단백질을 수득하는 것을 허용한다는 것이다. 본 발명의 방법으로 회수된 정제된 단백질은, 예를 들어 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.5%, 또는 99.9%의 순도를 나타낼 수 있다. 보다 특히, 개시된 방법의 다수의 이점 중 하나는 이것이 오염 DNA, 고분자량 (HMW) 종 (이는 단백질 응집체에 해당함) 및/또는 숙주 세포 단백질 (HCP)의 감소된 양을 함유하는 고도로 순수한 단백질의 용액을 수득하는 것을 허용한다는 것이다. 본 발명의 방법으로 회수된 정제된 단백질을 포함하는 용액은, 예를 들어 0.4 ppb 미만, 0.3 ppb 미만, 0.2 ppb 미만 또는 0.1 ppb 미만의 오염 DNA의 양을 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법으로 회수된 정제된 단백질을 포함하는 용액은 또한 예를 들어 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만 또는 0.4% 미만의 HMW 종의 농도를 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법으로 회수된 정제된 단백질을 포함하는 용액은 또한 예를 들어 23 ppm 미만, 22 ppm 미만, 21 ppm 미만, 20 ppm 미만, 19 ppm 미만 또는 18 ppm 미만의 HCP의 농도를 나타낼 수 있다. 추가로, 본 발명의 방법은 정제된 단백질을 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 수율로 회수하는 것을 허용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 방법에 사용하는데 적합한 완충제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 사실상, 모든 이들 완충제는 단일 모액으로부터 출발하여 매우 용이하게 및 급속하게 제조될 수 있다.
완충제를 제조하는 이러한 방법은
i) 15 내지 25 mM (예를 들어 20mM) 비스 트리스 및 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) NaCl의 최종 농도를 갖는 용액 (예를 들어 100 L의 용액)을 생성하는 단계;
ii) 용액의 pH를 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 값 (예를 들어 7.4)으로 조정하는 단계;
iii) 용액의 4분의 1을 수집함으로써, 평형 완충제를 수득하는 단계;
iv) 단계 (iii)으로부터의 용액의 나머지 4분의 3 중 4분의 1의 pH를 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 값 (예를 들어 3.7)으로 조정함으로써, 용리 완충제를 수득하는 단계;
v) 단계 (iii)으로부터의 용액의 나머지 4분의 2 중 4분의 1을 수집하고, NaCl을 첨가하여 40과 50 mM 사이에 포함된 최종 NaCl 농도 (예를 들어 45mM)를 수득하고, NH4Cl을 추가로 첨가하여 20과 30 mM 사이에 포함된 최종 NH4Cl 농도 (예를 들어 25mM)를 수득하고, pH를 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 값 (예를 들어 7.25)으로 조정함으로써, 추가 용리 완충제를 수득하는 단계;
vi) NaCl을 단계 (iii)으로부터의 용액의 나머지 4분의 1에 첨가하고, NaCl을 첨가하여 0.9와 1.1 M 사이에 포함된 최종 NaCl 농도 (예를 들어 1M)를 수득하함으로써, 세척 완충제를 수득하는 단계
를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
이러한 방법은 개략적으로 도 1에 도시된다.
완충제를 제조하는 또 다른 방법은
i) 15 내지 25 mM (예를 들어 20mM) 비스 트리스 및 15 내지 25 mM (예를 들어 20 mM) NaCl의 최종 농도를 갖는 용액 (예를 들어 100 L의 용액)을 생성하는 단계;
ii) 용액의 pH를 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 값 (예를 들어 7.4)으로 조정하는 단계;
iii) 용액의 4분의 1을 수집함으로써, 평형 완충제를 수득하는 단계;
iv) 단계 (iii)으로부터의 용액의 나머지 4분의 3 중 4분의 1의 pH를 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 값 (예를 들어 3.7)으로 조정함으로써, 용리 완충제를 수득하는 단계;
v) 단계 (iii)으로부터의 용액의 나머지 4분의 2 중 4분의 1을 수집하고, NaCl을 첨가하여 70과 90 mM 사이에 포함된 최종 NaCl 농도 (예를 들어 80 mM)를 수득하고, NH4Cl을 추가로 첨가하여 20과 30 mM 사이에 포함된 최종 NH4Cl 농도 (예를 들어 25mM)를 수득하고, pH를 아세트산으로 6과 7 사이에 포함된 값 (예를 들어 6.2)으로 조정함으로써, 추가 용리 완충제를 수득하는 단계;
vi) NaCl을 단계 (iii)으로부터의 용액의 나머지 4분의 1에 첨가하고, NaCl을 첨가하여 0.9와 1.1 M 사이에 포함된 최종 NaCl 농도 (예를 들어 1M)를 수득함으로써, 세척 완충제를 수득하는 단계
를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
완충제를 제조하는 상기 방법은 또한 3개의 크로마토그래피 단계를 수행하기 전에 본 발명의 방법의 바로 제1 단계에 해당할 수 있다.
본 발명은 추가로
(a) 다중-모드 수지 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스, 친화성 크로마토그래피 매트릭스, 예컨대 단백질 A 매트릭스, 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스; 및
(b) 본 발명에 따른 적어도 1종의 완충제 (예를 들어 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어짐), 및/또는 본 발명에 따른 적어도 1종의 완충제 (예를 들어 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어짐)를 제조하기 위한 지침서
를 포함하거나 또는 이로 이루어진 키트에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 키트는
(a) 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼, 친화성 크로마토그래피 칼럼, 예컨대 단백질 A 칼럼, 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼; 및
(b) 본 발명에 따른 적어도 1종의 완충제 (예를 들어 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어짐), 및/또는 본 발명에 따른 적어도 1종의 완충제 (예를 들어 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어짐)를 제조하기 위한 지침서
를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 키트는
(a) 양이온-교환 막 흡착제, 친화성 크로마토그래피 막 흡착제, 예컨대 단백질 A 막 흡착제, 및/또는 음이온-교환 크로마토그래피 막 흡착제; 및
(b) 본 발명에 따른 적어도 1종의 완충제 (예를 들어 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어짐), 및/또는 본 발명에 따른 적어도 1종의 완충제 (예를 들어 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl을 포함하거나 또는 이로 이루어짐)를 제조하기 위한 지침서
를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
실시예
하기 실시예는 개시된 방법의 구체적 실시양태, 및 그의 다양한 용도를 예시한다. 이들은 단지 설명의 목적으로 제시되고, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1: 정제 완충제의 최적화
비스 트리스 완충제는 유리하게는 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼과 함께 완충제로서 사용할 수 있다.
단백질 A 크로마토그래피 칼럼을 통한 통과 이후에 수득된 조 단백질 용리액을 캅토 MMC 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼을 통해 통과시켰다.
이 수지는 단백질 A 칼럼 상의 크로마토그래피 단계 이후에 수득된 것과 같이 심지어 저 pH에서 mAb를 고정할 수 있다. 그러나, 이 수지는 또한 우수한 용리를 수득하기 위해 염을 필요로 한다. 그럼에도 불구하고, 너무 높은 농도의 염은 이것이 용리된 샘플 중에 고분자량 (HMW) 종의 수준을 증가시키기 때문에 mAb 안정성에 유해하며, 배지 상에 고정된 불순물에 너무 효율적이어서, mAb의 감소된 순도를 초래한다.
이러한 결점을 방지하기 위해, 본 발명자들은 단계 (a)의 용리 완충제에서의 염 농도 및 pH를 감소시키기 위해 실험 설계 (DOE)를 만들었다.
이 때문에, 본 발명자들은 NaCl과 동일한 전도성을 갖지만 상호작용의 관점에서 Na+보다 강한 신규한 종류의 염, 염화암모늄을 도입하였다.
DOE 파라미터
중심 복합 면 설계 (CCF)를 MODDE 9 소프트웨어 (유메트릭스(UMETRICS))를 사용하여 용리 조건의 최적화에 적용하였다. CCF 설계는 완전 요인 설계 및 3개의 중심점으로 구성되었다 (모든 17개의 실험에서). 용리 pH는 7.2 내지 7.8로 변화시키고, 동일한 방식으로 NaCl 농도는 0 내지 100 mM로 변화시키고, NH4Cl 농도는 0 내지 50 mM로 변화시켰다.
요인 및 반응을 하기에 요약하였다.
DOE 실험
17개의 실험을 하기 표에 요약하였다.
DOE 결과
실행 동안에 4개의 실험이 생성물 회수의 관점에서 부합하지 않는 것으로 나타났다. N1 및 N2 실행은 조건으로 인해 용리하지 않았고, N5 및 N11 실행 동안에는, 10개의 칼럼 부피 (CV) 이후에 용리를 중지하여야 했다. 따라서, 이들 실험을 분석으로부터 배제하였다.
모든 실험을 SEC-HPLC 및 HCP 분석에 적용하였다.
결과를 하기 표에 요약하였다.
MODDE 9.0 예측 도구에서, 본 발명자들은 하기 반응을 고정함으로써 스위트 스폿 (적용되는 조건을 함유하는 공간을 의미함)을 결정하였다:
- 수율: 95 내지 100%
- HCP: 20 내지 30 ppm
- HMW: 0.4 내지 0.8%
스위트 스폿은 도 2에서 3종류의 NH4Cl 농도 (0, 25 및 50 mM)에 대해 나타났다.
흑색 공간은 제1 기준 충족을 함유하는 공간이다: 90 내지 100%의 수율. 담회색 공간은 수율 및 HCP 비율 (20 내지 30 ppm) 둘 다를 함유하는 공간이다. 암회색 공간은 3개의 기준 충족을 함유하는 공간인 스위트 스폿이다: 수율, HCP 비율 및 HMW 비율 (0.4 내지 0.8%).
따라서, 본 발명자들은, 이러한 그래프 설명으로, NaCl이 더 많이 사용될수록, HMW 및 수율이 더 많이 증가하는 것을 입증하였다. 추가로, pH가 더 많이 증가할수록, HCP 비율이 더 중요해진다. 따라서, 본 발명자들은, 우수한 순도로 높은 수율을 수득하기 위해, 용리가 저 pH 및 저 NaCl 농도에서 수행되어야 하는 것을 입증하였다.
본 발명자들은 NH4Cl이 NaCl 농도를 감소시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 가장 적절한 NH4Cl 농도는 25 mM이었으며, 이는 95% 초과의 수율, 약 30 ppm의 HCP 비율 및 0.6%의 HMW 비율을 갖는 스위트 스폿을 제공하였다.
따라서, 본 발명자들은 제2 크로마토그래피 단계에 대한 최적 용리 완충제가 20 mM 비스 트리스, 45 mM NaCl, 25 mM NH4Cl, qsp 아세트산 pH 7.25인 것을 입증하였다.
실시예 2: 제3 크로마토그래피 단계의 최적화
2개의 제1 크로마토그래피 단계 이후에 불순물을 연마하고 바이러스를 제거하기 위해, 사토바인드 STIC 막을 그의 염 내성 특성으로 인해 제3 단계로서 사용하는 정제 공정을 처음에 설계하였다.
그러나, 연속 공정에서, 각 단계를 충분한 시간 수행하였다. 일회용 막, 예컨대 사토바인드 STIC 막은 재사용할 수 없었다. 따라서, 본 발명자들은 불순물을 연마하고, 바이러스를 제거하고, 재사용가능한 것을 가능하게 하여 연속 공정에서 사용할 수 있는 대안적 제3 크로마토그래피 단계를 설계하였다.
3종류의 배지를 연마 단계로서 시험하였다:
- 사토바인드 STIC (사토리우스)
- 사토바인드 Q (사토리우스), 및
- 바이오프로 Q75 (YMC), AEX 수지.
먼저, 본 발명자들은 캅토 MMC 용리 (100 mM NaCl, 20 mM 비스 트리스 pH 8.0) 이후에 이들 수지를 시험하여 심지어 100 mM NaCl 조건으로 불순물을 제거하는 제3 단계의 능력을 평가하였다. 사토바인드 STIC 및 Q 막을 단일 실행으로 평가하였다. 바이오프로 Q75는 3회 실행으로 평가하였다: 100 mM, 50 mM 및 25 mM NaCl 농도. 결과를 하기 표에 제시하였다.
따라서 이들 결과는 사토바인드 STIC 막이 그의 염 내성 특성으로 인해 우수한 불순물 제거를 제공하는 것으로 제시하였다. 그러나, 1에서 3 bar로의 실행 동안의 압력의 증가는, 1M NaCl 세척 이후에 및 0.1N NaOH 위생처리 이후에 압력이 감소하지 않기 때문에 더욱 재사용가능한 기술에서 이러한 막을 사용하는 것이 가능하지 않는 것으로 제시하였다. 불순물의 관점에서 최상의 결과는 사토바인드 Q 막에 의해 수득되었다. 그러나, 재사용가능성 및 이용가능성 사안으로 인해, 이 막은 본 발명자들에게 적합하지 않은 것으로 간주되었다.
최종적으로, 바이오프로 Q75 수지는 불순물 제거의 관점에서 중급의 결과를 제공하였다. 게다가, 실행 동안에 압력이 관찰되지 않았다. 최종적으로, 전형적인 수지 기술로 인해 재사용가능성이 완결되었다.
따라서, 본 발명자들은 연속 공정에 의해 단백질 정제를 수행하기 위해 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼이 연마 단계에서 막에 대한 우수한 대안인 것을 입증하였다.
실시예 3: 정제 완충제의 제제화
본원에 기재된 3-단계 정제 방법은 4종의 완충제를 이용하였다: 평형 완충제, 세척 완충제, 및 2종의 용리 완충제, 모두 동일한 모액으로부터 제조됨. 프로토콜의 개략도를 도 1에 제시하였으며, 하기와 같다: 당량 20mM 비스 트리스 및 당량 20mM NaCl을 모액으로서 최대 100L 주사용수 (WFI)로 만들고, 이어서 용액의 pH를 아세트산을 사용하여 7.4로 조정하였다. 이어서, 생성된 용액 중 25L를 수집하고, 평형 완충제로서 저장하였다. 이어서, 모액 중 25L를 꺼내고, 당량 1M NaCl을 첨가하였다. 이 생성된 25L 용액은 세척 완충제였다. 이어서, 모액 중 25L의 pH를 아세트산으로 3.7로 조정하였다. 이 생성된 25L 용액은 제1 용리 완충제였다. 이어서, 모액 중 나머지 25L는 아세트산을 사용하여 pH를 7.25로 조정하였으며, 당량 45mM NaCl 및 당량 25mM NH4Cl을 첨가하여, 다른 용리 완충제를 생성하였다.
실시예 4: 소규모 연속 다단계 공정
본 발명의 방법은 CD38 막횡단 당단백질 (항-CD38 mAb)에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체의 소형-배치 정제에 이용하였다.
물질 및 방법
물질
- 제1 단계: 빠른 유동 배관으로 주문제작한 XK50/20 칼럼에서의 60 mL 앱솔루트 하이 캡 수지
- 제2 단계: 빠른 유동 배관으로 주문제작한 XK50/20 칼럼에서의 100 mL 캅토 MMC 수지
- 제3 단계: 빠른 유동 배관으로 주문제작한 XK50/20 칼럼에서의 50 mL 바이오프로 Q75 수지
- i.d. 1.0 mm 튜닝된 PEEK로 변형된 Akta 정제기 배관
제1 단계 세부사항
XK50/20 칼럼을 앱솔루트 하이 캡 수지 (Ref. AbSHC 35 P1-A-V-00200)로 패킹하였다. 최종 부피는 60 mL였다. HETP는 13538 N/m였으며, 비대칭은 1.2였다.
3종류의 완충제를 이 단계에 사용하였다:
- 20mM 비스 트리스, 2 mM NaCl, qsp 아세트산 pH 7.4로 제조된 평형 완충제
- 20mM 비스 트리스, 1 M NaCl, qsp 아세트산 pH 7.4로 제조된 세척 완충제
- 20mM 비스 트리스, 20mM NaCl, qsp 아세트산 pH 3.7로 제조된 용리 완충제.
칼럼 크기에 따른 유량은 평형, 세척, 로딩 및 용리 단계에 대해 24 mL/분 (RT 2.5분)으로 설정하였다.
제2 단계 세부사항
XK50/20 칼럼을 캅토 MMC 수지 (Ref 17-5317-02)로 패킹하였다. 최종 부피는 100 mL였다. HETP는 5686 N/m였으며, 비대칭은 1.3이었다.
2종류의 완충제를 이 단계에 사용하였다:
- 40mM 비스 트리스, 20mM NaCl, qsp 아세트산 pH 7.4로 제조된 평형 완충제
- 20mM 비스 트리스, 45mM NaCl, 25mM NH4Cl, qsp 아세트산 pH 7.25로 제조된 용리 완충제.
칼럼 크기에 따른 유량은 평형, 로딩 및 용리 단계에 대해 24 mL/분 (RT 4.8분)으로 설정하였다.
제3 단계 세부사항
XK50/20 칼럼을 바이오프로 Q75 수지 (Ref QAA0S75)로 패킹하였다. 최종 부피는 50 mL였다. HETP는 4875 N/m였으며, 비대칭은 1.6이었다.
1종류의 완충제를 이 단계에 사용하였다:
- 40mM 비스 트리스, 20mM NaCl, qsp 아세트산 pH 7.4로 제조된 평형 완충제.
칼럼 크기에 따른 유량은 평형 및 용리 단계에 대해 24 mL/분 (RT 2.1분)으로 설정하였다.
결과
2.325 g의 벌크 수확물 (1.71 g/L의 농도에서)을 앱솔루트 하이 캡 수지 상에 로딩하였다. 2.325 g을 정제하기 위한 총 지속기간은 2시간 10분이었다. 2.125 g을 회수하였으며, 이는 수율이 91%인 것을 의미하였다. 기술적으로, 심지어 칼럼이 연속 구성으로 사용된 경우에 배압 없이 정제를 성공적으로 달성하였다.
이러한 3-단계 공정으로 수득된 최종 생성물의 불순물 제거를 하기 표에서 요약하고, PCT/EP2012/059528에 기재된 2-단계 공정으로 수득된 것과 비교하였다.
따라서, 본 발명자들은 신규한 연속 다단계 공정이 동일한 생성물에 적용된, PCT/EP2012/059528에 기재된 2-단계 공정만큼 효율적인 것으로 제시하였다.
각 단계 이후에 수득된 불순물 비율을 평가하기 위해 소규모 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 하기 표에 요약된 바와 같이 모든 단계가 불순물을 제거하는데 효율적인 것으로 제시하였다.
따라서, 본 실시예는 본 발명자들에 의해 설계된 연속 공정이 배치 공정만큼 효율적인 것으로 제시하였다.
실시예 5: 실규모 연속 다단계 공정
상기 방법을 CD38 막횡단 당단백질 (항-CD38 mAb)에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체의 대규모 정제에 적용하였다.
물질 및 방법
물질
- 제1 단계: 50 mg/mL의 동적 결합 능력 (DBC)을 갖는 50 mL 앱솔루트 하이 캡 수지
- 제2 단계: 35 mg/mL의 DBC를 갖는 100 mL 캅토 MMC 수지
- 제3 단계: 170 mg/mL의 DBC를 갖는 50 mL 바이오프로 Q75 수지
- 라인 상에 상기 3개의 칼럼을 포함하고 모든 칼럼을 모니터링하는 것을 가능하게 하는 지이로부터의 주기적 향류 시스템 (주문제작된 Akta 정제기).
방법
15회 실행의 순서를 연속적으로 수행하였다. 보다 구체적으로, 5회 실행을 연속 모드로 수행한 후 0.1N NaOH로 3개의 칼럼을 위생처리하고, 이어서 새로운 순서로 출발하였다.
결과
순서는 500분 미만으로 10g의 항-CD38 mAb를 정제하는 것을 가능하게 하였다.
29.5g의 벌크 수확물을 로딩하고, 28g의 정제된 mAb를 회수하였다. 따라서, 본 발명의 연속 다단계 공정은 95%의 평균 수율을 도달하는 것을 가능하게 하였다. 이들 28g의 정제된 mAb를 25시간에 수득하였다.
추가로, 최종 생성물의 분석 결과를 PCT/EP2012/059528에 기재된 2-단계 공정으로 수득된 최종 생성물의 것과 비교하였다. 이들 분석 결과를 하기 표에 요약하였다.
이는 또한 하기 표에 제시된 바와 같이 각 단계를 개별적으로 분석한 경우였다.
추가로, 도 3에 제시된 바와 같이, 트렌드는 각 실행 사이에 임의의 유의차를 제시하지 않았다.
실시예 6: 연속 모드의 배치 정제
실시예 5에 기재된 공정을 실규모 연속 배치에서 항-CD38 mAb를 정제하는데 사용하였다.
본 실시예에서, 1.66 g/L의 농도에서의 43L의 mAb를 69시간 동안 연속적으로 정제하였다. 보다 구체적으로, 45회 실행을 수행하였으며, 960 mL의 정화된 생성물을 각 실행에 로딩하였다. 이는 단지 70 L의 완충제를 사용하여 3.42 g/L의 농도에서의 19.5 L의 정제된 mAb의 회수로 이어졌으며, 이는 93%의 수율을 나타내었다.
하기 표는 PCT/EP2012/059528에 기재된 2-단계 정제 공정의 것과 비교하여 이 정제 방법의 특징을 요약하였다.
따라서, 본 발명의 연속 다단계 공정은 사용된 완충제의 부피의 33% 및 사용된 수지의 부피의 97%를 감소시키는 것을 가능하게 한다.
실시예 7: 상이한 모노클로날 항체의 정제
인간화 항-CD38 항체 이외에도, 상기 기재된 연속 다단계 공정을 추가의 항체, 즉 박테리아 표면 폴리사카라이드 폴리-N-아세틸 글루코사민 (PNAG)에 특이적으로 결합하는 완전 인간 항체, 암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 5 (CEACAM5)에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 및 국제 공개 번호 WO 2009/065054에 기재된 바와 같은 인간 β-아밀로이드 단백질의 원시섬유 형태에 결합하는 인간화 13C3 mAb를 정제하는데 사용하였다.
하기 표는 이들 3종의 항체의 정제 시 수득된 전체 수율 및 순도를 제시하였다.
결과적으로, 연속 다단계 공정 방법이 탁월한 정도의 순도를 갖는 우수한 수율의 정제된 항체, 인간에게 투여하는데 적합한 품질을 갖는 정제된 항체를 수득하는 것을 허용하는 것을 4종의 상이한 항체를 사용하여 확인하였다.
실시예 8: 막 흡착제 연속 다단계 공정
일회용 막 흡착제를 사용한 본 발명의 방법을 CD38 (항-CD38 mAb)에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체의 대규모 정제에 적용하였다.
물질 및 방법
물질
- 제1 단계: 각각 2 mL의 4종의 사토바인드 단백질 A 막 흡착제 (사토리우스)
- 제2 단계: 각각 3 mL의 2종의 사토바인드 S "나노" 막 흡착제 (사토리우스)
- 제3 단계: 3 mL의 1종의 사토바인드 Q "나노" 막 흡착제 (사토리우스)
사용된 완충제는 20 mM 비스 트리스, 80 mM NaCl, 25mM NH4Cl, qsp 아세트산 pH 6.2로 제조된 제2 단계의 용리 완충제를 제외하고는 실시예 4에 기재된 것과 동일하였다.
방법
공정을 연속 모드의 3개의 상기 단계를 거쳐 각각 30 mg의 50회 실행을 통해 1.5 g의 항체를 정제하는데 수행하였다.
간략하게는, 단백질 A 막 흡착제를 평형 완충제로 평형화시키고, 이어서 로딩하였다. 로딩 후, 막 흡착제를 다시 평형화시킨 후, 제1 용리 완충제로 용리시켰다. 단백질 A 막 흡착제의 용리액을 양이온-교환 막 흡착제 상에 직접 로딩하였다. 양이온-교환 막을 평형 완충제로 평형화시키면서, 단백질 A 막 흡착제를 위생처리 완충제로 위생처리한 후 후속 로딩하였다. 양이온-교환 막 흡착제를 제2 용리 완충제로 용리시키고, 용리액을 음이온-교환 막 흡착제 상에 직접 로딩하였다.
결과
1.5 g의 항체를 750분 (실행당 15분)으로 정제하는 것을 가능하게 하였다. 회수는 약 80%였다.
분석 결과를 하기 표에 요약하였다.
따라서, 일회용 막 흡착제를 사용한 본 발명에 따른 연속 다단계 공정은, 내부 명세서 내에서, 재사용가능한 수지를 사용한 공정과 비교하여 공정 및 완충제의 추가 최적화 없이, 만족스러운 불순물 제거율을 수득하는 것을 가능하게 한다.
추가로, 도 4에 제시된 바와 같이, 트렌드는 각 실행 사이에 임의의 유의차를 제시하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 일회용 막 흡착제가 사실상 안정하며 임의의 성능 감소 없이 50회 실행에 걸쳐 재사용될 수 있다는 것을 입증하였다.
본 발명의 방법에서 칼럼보다 막 흡착제를 사용하는 주요 이점을 하기에 요약하였다:
- 비슷한 규모에서, 막 흡착제는 칼럼보다 10배 높은 유량에서 사용되어, 공정의 지속기간을 대폭 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 수지로 패킹된 5 mL-칼럼은 1 mL/분의 유량에서 사용될 것인 반면에, 상응하는 5 mL-막 흡착제는 10 mL/분의 최소 유량에서 사용될 것이다. 따라서, 본 발명의 3개의 크로마토그래피 단계 공정이 수지로 패킹된 3개의 칼럼을 사용하여 2시간 30분에 수행되는 경우에, 이는 막 흡착제를 사용하여 15분에 완결될 수 있다.
- 이들이 재사용가능할지라도, 막 흡착제는 일회용 장치이며, 따라서 배치 이후에 폐기될 수 있으며 장기간에 걸쳐 저정될 필요가 없다. 따라서, 장기 안정성을 보장하기 위해 이들을 시험하는 것이 필수적이지 않다.
- 막 흡착제를 사용하는 본 발명의 방법은 칼럼 비용, 칼럼 패킹 및 칼럼 저장을 방지함으로써 보다 저렴하다.
실시예 9: GMP 규모 연속 다단계 공정
상기 방법을 CD38 막횡단 당단백질 (항-CD38 mAb)에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체의 대규모 정제에 적용하였다.
물질 및 방법
물질
- 제1 단계: 35 mg/mL의 동적 결합 능력 (DBC)을 갖는 6L 맙셀렉트 슈어 수지
- 제2 단계: 35 mg/mL의 DBC를 갖는 6L 캅토 MMC 수지
- 제3 단계: 170 mg/mL의 DBC를 갖는 6L 바이오프로 Q75 수지
- 라인 상에 상기 3개의 칼럼을 포함하고 모든 칼럼을 모니터링하는 것을 가능하게 하는, 지이로부터의 2개의 Akta프로세스(AktaProcess) (3개의 칼럼을 시험사용함) 및 사토리우스로부터의 1개의 플렉스액트(Flexact) (제1 단계와 제2 단계 사이에 저 pH에서 불활성화시키는 단계를 완결함).
방법
7회 실행의 순서를 연속적으로 수행하였다.
결과
순서는 16시간 미만으로 1.3Kg의 항-CD38 mAb를 정제하는 것을 가능하게 하였다.
14.4Kg의 벌크 수확물을 로딩하고, 1.30Kg의 정제된 mAb를 회수하였다. 따라서, 본 발명의 연속 다단계 공정은 90%의 평균 수율을 도달하는 것을 가능하게 하였다. 이들 1.3Kg의 정제된 mAb를 16시간에 수득하였다.
비교의 대상으로서, 2-단계 공정에 의한 500L 배치의 정제는 3일 걸리고, 20L 칼럼을 사용하였다.
따라서, 본 발명에 따른 연속 접근은 시간 및 원료를 절감시키는 것 (66% 초과의 수지 부피를 절감함)을 허용하는 결과물이다.
추가로, 최종 생성물의 분석 결과를 PCT/EP2012/059528에 기재된 2-단계 공정으로 수득된 최종 생성물의 것과 비교하였다. 이들 분석 결과를 하기 표에 요약하였다.
Claims (32)
- 단백질을 용액으로부터 정제하는 방법으로서,
(a) - 상기 용액을 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b) - 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계; 및
(c) - 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 매트릭스를 통해 통과시키고;
- 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 매트릭스의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스(Bis Tris)를 포함하는 것인 방법. - 제1항에 있어서, 단계 (a)의 종결 시에 수득된 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 직접, pH 조정, 완충제 교환 또는 희석과 같은 임의의 처리를 거치지 않으면서 통과시키는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (b)의 종결 시에 수득된 단백질 용리액을 제3 크로마토그래피 매트릭스 상에 직접, pH 조정, 완충제 교환 또는 희석과 같은 임의의 처리를 거치지 않으면서 통과시키는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단계에서 최종 단계로의 폐쇄 시스템으로 실행되는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2개의 제1 크로마토그래피 단계 중 각각의 1개가
- 평형 완충제를 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 용액 또는 조 단백질 용리액을 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 평형 완충제를 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 임의로 세척 완충제를 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 임의로 평형 완충제를 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
- 조 단백질 용리액 또는 단백질 용리액을 용리 완충제를 사용하여 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하며, 여기서 각각의 완충제가 비스 트리스를 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 완충제가 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl로 이루어지는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) (i) 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(ii) 용액을 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 제1 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 제1 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b) (i) 평형 완충제를 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 제2 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 제2 크로마토그래피 매트릭스로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
및
(c) (i) 평형 완충제를 제3 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 제3 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(iii) 임의로 세척 완충제를 제3 크로마토그래피 매트릭스 상에 통과시키고;
(iv) 정제된 단백질을 제3 크로마토그래피 매트릭스의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하는 방법. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 크로마토그래피 매트릭스가 크로마토그래피 칼럼인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2 및 제3 크로마토그래피 매트릭스가 크로마토그래피 막 흡착제인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 크로마토그래피 매트릭스가 친화성 크로마토그래피 매트릭스인 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 매트릭스가 단백질 A 매트릭스인 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 크로마토그래피 매트릭스가 다중-모드 수지 크로마토그래피 매트릭스 또는 양이온-교환 크로마토그래피 매트릭스인 방법.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 크로마토그래피 매트릭스가 음이온-교환 크로마토그래피 매트릭스인 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 모노클로날 항체인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 모노클로날 항체가 인간 β-아밀로이드 단백질의 원시섬유 형태에 특이적으로 결합하는 항체, 박테리아 표면 폴리사카라이드 폴리-N-아세틸 글루코사민 (PNAG)에 특이적으로 결합하는 항체, 암배아성 항원-관련 세포 부착 분자 5 (CEACAM5)에 특이적으로 결합하는 항체 및 CD38 막횡단 당단백질에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c) 이후에 나노여과 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제16항에 있어서, 나노여과 단계 이후에 한외여과 및 투석여과 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 용리 완충제가 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 및 제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용리 완충제가 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 40 내지 50 mM NaCl, 및 20 내지 30 mM NH4Cl을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 및 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 용리 완충제가 아세트산으로 6과 7 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 50 내지 150 mM NaCl, 및 20 내지 30 mM NH4Cl을 포함하는 것인 방법.
- 제5항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 평형 완충제가 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하는 것인 방법.
- 제5항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세척 완충제가 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 0.9 내지 1.1 M NaCl을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 단백질이 적어도 95%의 수율로 회수되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 정제된 단백질이 적어도 99%의 순도를 나타내는 것인 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 회수된 정제된 단백질을 제약 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 단백질을 용액으로부터 연속 모드로 정제하는 방법으로서,
(a) (i) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 용액을 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b) (i) 평형 완충제를 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c) (i) 평형 완충제를 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 정제된 단백질을 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl로 이루어지는 것인 방법. - 단백질을 용액으로부터 연속 모드로 정제하는 방법으로서,
(a) (i) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 용액의 일부를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 단백질 A 칼럼 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b) (i) 평형 완충제를 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 다중-모드 수지 크로마토그래피 칼럼으로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c) (i) 평형 완충제를 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼 상에 통과시키고;
(iii) 정제된 단백질을 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계;
(d) 모든 용액이 사용될 때까지 용액의 또 다른 부분으로 단계 a), b) 및 c)를 연속적으로 재개하는 것, 및
(e) 각각의 제3 크로마토그래피 단계의 종결 시에 회수된 정제된 단백질을 수집하는 것
을 포함하며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl로 이루어지는 것인 방법. - 단백질을 용액으로부터 연속 모드로 정제하는 방법으로서,
(a) (i) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 용액을 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b) (i) 평형 완충제를 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 양이온-교환 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c) (i) 평형 완충제를 음이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 음이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 정제된 단백질을 음이온-교환 막 흡착제의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계
를 포함하며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl로 이루어지는 것인 방법. - 단백질을 용액으로부터 연속 모드로 정제하는 방법으로서,
(a) (i) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 용액의 일부를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iv) 세척 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(v) 평형 완충제를 단백질 A 막 흡착제 상에 통과시키고;
(vi) 조 단백질 용리액을 제1 용리 완충제를 사용하여 단백질 A 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제1 크로마토그래피 단계;
(b) (i) 평형 완충제를 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (a)로부터의 조 단백질 용리액을 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 평형 완충제를 양이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iv) 단백질 용리액을 제2 용리 완충제를 사용하여 양이온-교환 막 흡착제로부터 용리시키는 것
을 포함하는 제2 크로마토그래피 단계;
(c) (i) 평형 완충제를 음이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(ii) 단계 (b)로부터의 단백질 용리액을 유동-관통 모드로 음이온-교환 막 흡착제 상에 통과시키고;
(iii) 정제된 단백질을 음이온-교환 막 흡착제의 유동-관통물로부터 회수하는 것
을 포함하는 제3 크로마토그래피 단계;
(d) 모든 용액이 사용될 때까지 용액의 또 다른 부분으로 단계 a), b) 및 c)를 연속적으로 재개하는 것, 및
(e) 각각의 제3 크로마토그래피 단계의 종결 시에 회수된 정제된 단백질을 수집하는 것
을 포함하며, 여기서 각각의 완충제는 비스 트리스, 아세트산, NaCl, 물, 및 임의로 NH4Cl로 이루어지는 것인 방법. - 제26항 또는 제27항에 있어서,
- 상기 평형 완충제가 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고,
- 상기 세척 완충제가 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 0.9 내지 1.1 M NaCl을 포함하고,
- 상기 제1 용리 완충제가 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고,
- 상기 제2 용리 완충제가 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 40 내지 50 mM NaCl, 및 20 내지 30 mM NH4Cl을 포함하는 것인
방법. - 제28항 또는 제29항에 있어서,
- 상기 평형 완충제가 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고,
- 상기 세척 완충제가 아세트산으로 7과 8 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 0.9 내지 1.1 M NaCl을 포함하고,
- 상기 제1 용리 완충제가 아세트산으로 3과 4 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 및 15 내지 25 mM NaCl을 포함하고,
- 상기 제2 용리 완충제가 아세트산으로 6과 7 사이에 포함된 pH로 조정된, 15 내지 25 mM 비스 트리스, 50 내지 150 mM NaCl, 및 20 내지 30 mM NH4Cl을 포함하는 것인
방법. - 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 단계에서 최종 단계로의 폐쇄 시스템으로 실행되는 방법.
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