CN116003579A - 用于纯化抗体的连续多步骤方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供仅使用从母液制得的4种缓冲溶液的三步层析方法，用于蛋白质具体而言单克隆抗体的小规模和大规模纯化。

Description

用于纯化抗体的连续多步骤方法
本申请是申请号为201480038360.9的中国专利申请(申请日：2014年5月6日，发明名称：用于纯化抗体的连续多步骤方法)的分案申请。
技术领域
本发明涉及使用4种缓冲溶液的三步层析方法，其用于小规模和大规模纯化蛋白质，具体而言单克隆抗体。
发明背景
抗体纯化可为生物生产中的最昂贵方面之一。通常使用三步、三树脂层析过程(在每一步骤中使用特定缓冲体系)来纯化单克隆抗体(mAb)。该惯用纯化过程涵盖捕获步骤，随后进行离子交换步骤，且以精制步骤(polishing step)结束，且通常耗费3至5个工作日(包含储存和开放阶段(open phase))。在这些惯用过程中，这三个步骤在不同单元操作组成的序列(sequence)中实施，其不能以连续模式操作，这是由于需要在每一步骤之间调节pH、摩尔浓度和蛋白质浓度。这一惯用纯化过程示于图5中。因此，惯用纯化过程通常需要多种不同缓冲液以及位于每一不连续步骤之间的多种储存单元。这些惯用纯化过程因此易于产生污染、技术故障和人为错误。另外，因在用于浓缩洗脱物、调节pH和电导率及在下一步骤前储存洗脱物的每一步骤间需要打断，且因步骤不能在完成先前步骤之前开始，因此这些惯用纯化过程特别的长且昂贵，如在图7中可见。
随着逐渐增加的细胞培养物滴度和更大的细胞培养体积被用于生产，下游处理被视为工业瓶颈。其与单克隆抗体生产尤其相关，其中焦点已从批料体积转移，且转向下游处理能力。另外，早期临床前及临床阶段研究需要较大量可更快速产生的抗体。因此，在工业中需要可以连续模式实施的过程/方法/工艺用于抗体纯化，且用于缩短获得批料所耗费的时间，减小污染、技术故障及人为错误的风险并减小工艺规模放大的需求。
发明简述
发明人发现了一种用于纯化抗体的新方法，所述方法包含呈连续模式的有限数量的步骤，其使用减小的量的树脂和缓冲液，同时仍允许获得高产率的具有极佳纯度水平的纯化抗体。纯化的蛋白质因此适用于医学应用。因此，所述方法可用于纯化蛋白质以供临床试验和/或营销包含该蛋白质的药物组合物。另外，这种方法无需任何步骤间调节且因此能够从待纯化的蛋白的收获直至最终产物都在闭合系统中实施。
简而言之，该方法以连续模式仅包含以下三个层析步骤：一个亲和层析、一个多模式树脂或阳离子交换层析和一个阴离子交换层析(AEX)。这三个层析步骤可以任一顺序实施。此外，已发现在这三个层析步骤期间所使用的所有缓冲液都可从同一母液起始而制得。有利地，这些缓冲液包含Bis Tris，例如与NaCl、乙酸、水和任选地NH4Cl组合。因无需任何缓冲交换，所述方法易于实施，且高度适于自动化和/或以连续模式运行。更具体地，整个过程可仅使用4种缓冲液，确保了所有步骤之间的兼容性且允许供应链制造和质量控制上的节约并减小储存需要。
本发明的方法进一步允许减少或废除开放阶段(即打开纯化系统以实施人工操作(例如为新缓冲液准备层析柱、稀释样品或调节其pH)的步骤)，由此减小污染风险并提供了在较低等级的环境(less classified environment)中工作的可能性。此外，由于本发明方法的每一层析步骤可使用可重复使用的树脂，或令人吃惊地可重复使用丢弃式膜吸附剂，因此可重新开始三个层析步骤组成的序列直至获得期望的量为止，而无须人操作。具体而言，本发明方法的所有层析步骤可使用可重复使用至少100次的树脂或使用可重复使用至少50次的膜吸附剂来实施。发明人事实上证实了同一丢弃式膜吸附剂可在至少50次运行的过程中使用而并不丧失稳定性。过程循环次数可由此缩短，使过程规模放大需求最小化，且可减少操作和储存消耗，这是由于可减小树脂和缓冲液的体积且丢弃式膜吸附剂无需在一个批次之后进行储存。因此，本发明的方法允许快速、成本有效地产生批料并减小纯化系统所占据的时间，如在图10和12中可见(与图9和11相比)。其因此适于从工作台规模放大至工业规模并纯化重组蛋白。
已针对4种不同抗体来设定和实施了具体的方案。在该方案中，使在第一层析步骤结束时获得的粗制蛋白质洗脱液直接通过第二层析基质，具体而言通过第二层析柱或膜吸附剂，即不经任何处理(例如pH调节、缓冲交换或稀释)，且使在第二层析步骤结束时获得的蛋白质洗脱物也直接通过第三层析基质，具体而言通过第三层析柱或膜吸附剂，即不经任何处理(例如pH调节、缓冲液交换或稀释)。该方法示于图6中。此外，在该方案中，将含有蛋白质的溶液以连续运行加载于第一层析基质，具体而言第一层析柱或膜吸附剂上(参见实施例6)，在先前运行从第一层析步骤洗脱后立即开始后续运行，如在图8所见。该方案的优点为：极其快速(一个序列约2小时)，实现改进的产率(大于90％)、改进的纯度，并允许减小在使用柱时所使用的缓冲液和树脂体积，并减少在使用膜吸附剂时所使用的缓冲液和储存设施。另外，这种过程具有极其灵活的优点，这是由于所用柱的大小和/或运行的数目可容易地适配于待纯化蛋白的量。此外，其可完全自动化，以连续模式运行，且其不包含任何开放阶段。另外，其已经成功地实施于4种不同抗体而无需优化。
本发明由此提供从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：第一层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使所述溶液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使洗涤缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，和使用第一洗脱缓冲液从第一层析基质具体而言从第一层析柱或膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；第二层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使粗制蛋白质洗脱液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，任选地使平衡缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，和使用第二洗脱缓冲液从第二层析基质具体而言从第二层析柱或膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；和第三层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，使蛋白质洗脱物以流过模式(in the flow-through mode)通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，任选地使洗涤缓冲液通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，和从第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂的流过液回收纯化的蛋白质。
本发明还提供从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：第一层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使一部分溶液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使洗涤缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使用第一洗脱缓冲液从第一层析基质具体而言从第一层析柱或膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液，和任选地使卫生缓冲液(sanitation buffer)通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂；第二层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使粗制蛋白质洗脱液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，任选地使平衡缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使用第二洗脱缓冲液从第二层析基质具体而言从第二层析柱或膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物，和任选地使卫生缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂；第三层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，使蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，任选地使洗涤缓冲液通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，从第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂的流过液回收纯化的蛋白质，和任选地使卫生缓冲液通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂；使用另一部分溶液连续重新开始第一、第二和第三层析步骤直至使用所有溶液，并收集在每一第三层析步骤结束时所回收的纯化的蛋白质。
在本发明的一个实施方案中，每一缓冲液都包含Bis Tris。在另一个实施方案中，每一缓冲液都包含Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl。在本发明方法中使用Bis Tris缓冲液尤其重要，这是由于其允许避免在三个层析步骤之间调节pH且由此在闭合系统中从第一步骤至最后步骤运行该方法。
在一个实施方案中，一种层析基质是蛋白质A基质。在一个实施方案中，一种层析基质是多模式树脂或阳离子交换层析基质。在一个实施方案中，一种层析基质是阴离子交换层析基质。
在一个特定的实施方案中，本发明的方法包含蛋白质A层析基质、多模式树脂或阳离子交换层析基质和阴离子交换层析基质，所述基质以任一顺序用于三个层析步骤中。
在本发明的一个实施方案中，第一层析基质是蛋白质A基质，第二层析基质是多模式树脂或阳离子交换层析基质且第三层析基质是阴离子交换层析基质。
在本发明的一个实施方案中，每一层析基质是层析柱。在该实施方案的一个特定的实施方案中，第一层析基质是蛋白质A柱，第二层析基质是多模式树脂层析柱且第三层析基质是阴离子交换层析柱。
在本发明的另一实施方案中，每一层析基质是层析膜吸附剂。在该实施方案的一个特定实施方案中，第一层析基质是蛋白质A膜吸附剂，第二层析基质是阳离子交换膜吸附剂且第三层析基质是阴离子交换膜吸附剂。
在本发明的一个实施方案中，所纯化蛋白质是抗体。在另一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在本发明的一个实施方案中，所述方法进一步在步骤(c)后包含纳米过滤步骤和/或在纳米过滤步骤后包含超滤和渗滤步骤。在本发明的另一实施方案中，所述方法进一步在步骤(c)后、在纳米过滤步骤后和/或在超滤及渗滤步骤后包含低pH灭活步骤。在本发明的一个实施方案中，该方法在步骤(a)之前包含在液体培养基中、优选地在生物反应器中进行细胞培养的步骤以提供含有蛋白质的液体培养基。培养的细胞可为哺乳动物、细菌或酵母细胞。
本发明因此还提供从液体培养基生成纯化蛋白质的整合的过程。
在本发明的某些实施方案中，第一洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，使用乙酸调节至pH 3.7；第二洗脱缓冲液包含20mM Bis Tris、45mM NaCl和25mM NH4Cl，使用乙酸调节至pH 7.25或包含20mM Bis Tris、80mM NaCl和25mM NH4Cl，使用乙酸调节至pH6.2；平衡缓冲液包含20mM Bis Tris和20mM NaCl，使用乙酸调节至pH 7.4；且洗涤缓冲液包含20mM Bis Tris和1M NaCl，使用乙酸调节至pH 7.4。在本发明的其他实施方案中，卫生缓冲液包含0.1N氢氧化钠。
本发明提供一种试剂盒，其包含多模式树脂或阳离子交换层析基质、蛋白质A基质和/或阴离子交换层析基质；和至少一种包含或其组成为Bis Tris、乙酸、NaCl、水及任选地NH4Cl的缓冲液。在一些实施方案中，该试剂盒用于使用本发明方法从溶液纯化蛋白质。
在一个实施方案中，该试剂盒包含多模式树脂层析柱、蛋白质A柱和/或阴离子交换层析柱；和至少一种包含或其组成为Bis Tris、乙酸、NaCl、水及任选地NH4Cl的缓冲液。
在另一个实施方案中，该试剂盒包含阳离子交换膜吸附剂、蛋白质A膜吸附剂和/或阴离子交换膜吸附剂；和至少一种包含或其组成为Bis Tris、乙酸、NaCl、水及任选地NH4Cl的缓冲液。
本发明还提供一种试剂盒，其包含多模式树脂或阳离子交换层析基质、蛋白质A基质和/或阴离子交换层析基质；和用于制备至少一种包含或其组成为Bis Tris、乙酸、NaCl、水及任选地NH4Cl的缓冲液的说明。在一些实施方案中，该试剂盒用于使用本发明方法从溶液纯化蛋白质。
在一个实施方案中，该试剂盒包含多模式树脂层析柱、蛋白质A柱和/或阴离子交换层析柱；和用于制备至少一种包含或其组成为Bis Tris、乙酸、NaCl、水及任选地NH4Cl的缓冲液的说明。
在另一个实施方案中，该试剂盒包含阳离子交换膜吸附剂、蛋白质A膜吸附剂和/或阴离子交换膜吸附剂；和用于制备至少一种包含或其组成为Bis Tris、乙酸、NaCl、水及任选地NH4Cl的缓冲液的说明。
本发明进一步提供制备平衡缓冲液的方法，其包含产生最终浓度为20mM BisTris和20mM NaCl的100L溶液；使用乙酸将溶液pH调节至7.4；并收集25L溶液。本发明还提供制备洗涤缓冲液的方法，其包含收集来自平衡缓冲液的制备的剩余75L溶液的25L并向这25L溶液中添加等量的1M NaCl。本发明进一步提供制备洗脱缓冲液的方法，其包含收集来自平衡缓冲液的制备的剩余50L溶液的25L并使用乙酸将这25L溶液的pH调节至3.7。本发明另外提供制备洗脱缓冲液的方法，其包含将等量(e.q.)45mM NaCl和等量25mM NH4Cl添加至来自平衡缓冲液的制备的剩余25L溶液中并使用乙酸将这25L的pH调节至7.25。通过本文公开的方法制得的缓冲液可用于使用本发明方法从溶液纯化蛋白质。
本文还提供通过本文所述任一方法获得的分离蛋白质、药物作用剂和药物组合物。
从下列发明详述并结合所附权利要求可更全面地理解公开的纯化方法的这些和其他特征及优势。需要注意的是权利要求的范围由其中的记载而非由说明书中对所陈述特征和优点的具体讨论来界定。
在本发明的上下文中，除非另外指明，否则术语“包含”、“具有”、“包含”和“含有”应解释为开放性术语(即指“包括但不限于”)。另外，术语“包含”涵盖“由......组成”(举例而言，“包含”X的组合物可排他性地由X组成或可包含其他物质(例如X+Y))。
附图简述
在结合下列图阅读时，可最佳地理解公开的纯化方法的实施方案的下列详细描述。
图1展示用于配制实施例2至7中公开的纯化方法的缓冲液的方案示意图。
图2展示代表用于三种NH4Cl浓度的第二洗脱缓冲液的甜蜜点(sweet spots)的图形。
图3展示代表实施例5中15个运行中的每一个中HMW、产率、HCP和DNA的趋势分析图。
图4展示代表实施例8中50个运行中的每一个中HMW、LMW、HCP和DNA的趋势分析图。
图5展示用于纯化蛋白质的惯用过程的不同步骤示意图。BH：批量收获；EqB#1：第一平衡缓冲液；WB#1：第一洗涤缓冲液；ElB#1：第一洗脱缓冲液；EqB#2：第二平衡缓冲液；WB#2：第二洗涤缓冲液；ElB#2：第二洗脱缓冲液；EqB#3：第三平衡缓冲液；WB#3：第三洗涤缓冲液；层析1：第一层析步骤；层析2：第二层析步骤；层析3：第三层析步骤；pH adjust.：pH调节；conc.adjust.：浓度调节；conduct.adjust.：电导率调节；samp.：采样；stor.：储存；filt.：过滤；Nanofilt.：纳米过滤；TFF：切向流过滤。
图6展示本发明方法的不同步骤的示意图。BH：批量收获；EqB#1：第一平衡缓冲液；WB#1：第一洗涤缓冲液；ElB#1：第一洗脱缓冲液；ElB#2：第二洗脱缓冲液；层析1：第一层析步骤；层析2：第二层析步骤；层析3：第三层析步骤；samp.：采样；stor.：储存；Nanof.：纳米过滤；TFF：切向流过滤。
图7展示包含数次运行或循环的用于纯化蛋白质的惯用过程的不同步骤示意图。Clar.：澄清；EqB#1：第一平衡缓冲液；WB#1：第一洗涤缓冲液；ElB#1：第一洗脱缓冲液；EqB#2：第二平衡缓冲液；WB#2：第二洗涤缓冲液；ElB#2：第二洗脱缓冲液；EqB#3：第三平衡缓冲液；WB#3：第三洗涤缓冲液；层析1：第一层析步骤；层析2：第二层析步骤；层析3：第三层析步骤；Nanof.：纳米过滤；UF/DF：超滤/渗滤。
图8展示包含数次运行或循环的本发明方法的不同步骤示意图。Clar.：澄清；EqB#1：第一平衡缓冲液；WB#1：第一洗涤缓冲液；ElB#1：第一洗脱缓冲液；ElB#2：第二洗脱缓冲液；层析1：第一层析步骤；层析2：第二层析步骤；层析3：第三层析步骤；Nanof.：纳米过滤；UF/DF：超滤/渗滤。
图9展示包含数次运行或循环的纯化蛋白质的惯用过程中不同步骤的时间线示意图。表中的第一行展示时间(小时)。Clar.：澄清；层析1：第一层析步骤；层析2：第二层析步骤；层析3：第三层析步骤；低pH inact.：低pH灭活；Nanof.：纳米过滤；UF/DF：超滤/渗滤。圆代表过程完成时的时间。
图10展示包含数次运行或循环的本发明方法的不同步骤时间线的示意图。Clar.：澄清；层析1：第一层析步骤；层析2：第二层析步骤；层析3：第三层析步骤；Nanof.：纳米过滤；UF/DF：超滤/渗滤。圆代表过程完成时的时间。
图11展示包含数次运行或循环的纯化蛋白质的惯用过程中不同步骤的时间线示意图。表中的第一行展示时间(小时)。Clar.：澄清；层析1：第一层析步骤；层析2：第二层析步骤；层析3：第三层析步骤；低pH inact.：低pH灭活；Nanof.：纳米过滤；UF/DF：超滤/渗滤。示出了过程的生产力的估计值。
图12展示包含数次运行或循环的本发明方法的不同步骤时间线的示意图。Clar.：澄清；层析1：第一层析步骤；层析2：第二层析步骤；层析3：第三层析步骤；Nanof.：纳米过滤；UF/DF：超滤/渗滤。示出了过程的生产力的估计值。
发明详述
基于混合模式树脂(也称为多模式树脂)和层析膜吸附剂的可用性，发明人已研发了仅使用三个层析步骤的新纯化过程。换而言之，该方法仅包含三个涉及通过层析基质的步骤。
本发明是关于从溶液纯化蛋白质的方法，其包含以下步骤或由其组成：
(a)第一层析步骤，包含：
-使该溶液通过第一层析基质；
-使用第一洗脱缓冲液从第一层析基质洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
-使在步骤(a)结束时所获得的粗制蛋白质洗脱液通过第二层析基质；
-使用第二洗脱缓冲液从第二层析基质洗脱蛋白质洗脱物；和
(c)第三层析步骤，包含：
-使在步骤(b)结束时所获得的蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析基质；
-从第三层析基质的流过液回收纯化蛋白质；
其中所述缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
更具体而言，上述两个第一层析步骤中的每一个可包含以下步骤或由其组成：
-使平衡缓冲液通过层析基质；
-使溶液或粗制蛋白质洗脱液通过层析基质(如上所述)；
-使平衡缓冲液通过层析基质；
-任选地使洗涤缓冲液通过层析基质；
-任选地使平衡缓冲液通过层析基质；
-使用洗脱缓冲液从层析基质洗脱粗制蛋白质洗脱液或蛋白质洗脱物(如上所述)，
其中所述缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
本发明还关于从溶液纯化蛋白质的方法，其包含以下步骤或由其组成：
(a)第一层析步骤，包含：
-使一部分所述溶液通过第一层析基质；
-使用第一洗脱缓冲液从第一层析基质洗脱粗制蛋白质洗脱液；和
-任选地使卫生缓冲液通过第一层析基质；
(b)第二层析步骤，包含：
-使在步骤(a)结束时所获得的粗制蛋白质洗脱液通过第二层析基质，
-使用第二洗脱缓冲液从第二层析基质洗脱蛋白质洗脱物，和
-任选地使卫生缓冲液通过第二层析基质；
(c)第三层析步骤，包含：
-使在步骤(b)结束时所获得的蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析基质，
-从第三层析基质的流过液回收纯化蛋白质，和
-任选地使卫生缓冲液通过第三层析基质；
使用另一部分溶液连续重新开始步骤(a)、(b)和(c)直至使用所有溶液，并收集每一步骤(c)结束时所回收的纯化蛋白质；
其中平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
在本发明的上下文中，表达“层析基质”是指任种类的颗粒吸收剂介质、树脂或其他固相(例如膜)，其在纯化过程中用作吸收剂来分离待纯化分子和存在于混合物中的其他分子。基质，具体而言由树脂组成的基质可呈柱的形式，或呈膜吸附剂形式。
在本发明的上下文中，“膜吸附剂”指具有离子基团且包含附着的功能基团(例如亲和基团和离子交换基团)的丙烯酸聚合物的平片。树脂和膜之间的差异之一是流动分布：树脂通过扩散而膜通过对流。
在本发明方法的一个实施方案中，第一、第二和第三层析基质是层析柱。在本发明方法的另一实施方案中，第一、第二和第三层析基质是层析膜吸附剂。
因此，在一个实施方案中，本发明关于从溶液纯化蛋白质的方法，其包含以下步骤或由其组成：
(a)第一层析步骤，包含：
-使该溶液通过第一层析柱；
-使用第一洗脱缓冲液从第一层析柱洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
-使在步骤(a)结束时所获得的粗制蛋白质洗脱液通过第二层析柱；
-使用第二洗脱缓冲液从第二层析柱洗脱蛋白质洗脱物；和
(c)第三层析步骤，包含：
-使在步骤(b)结束时所获得的蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析柱；
-从第三层析柱的流过液回收纯化蛋白质；
其中所述缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
更具体而言，上述两个第一层析步骤中的每一种可包含以下步骤或由其组成：
-使平衡缓冲液通过层析柱；
-使溶液或粗制蛋白质洗脱液通过层析柱(如上所述)；
-使平衡缓冲液通过层析柱；
-任选地使洗涤缓冲液通过层析柱；
-任选地使平衡缓冲液通过层析柱；
-使用洗脱缓冲液从层析柱洗脱粗制蛋白质洗脱液或蛋白质洗脱物(如上所述)，
其中所述缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
本发明还关于从溶液纯化蛋白质的方法，其包含以下步骤或由其组成：
(a)第一层析步骤，包含：
-使一部分该溶液通过第一层析柱；
-使用第一洗脱缓冲液从第一层析柱洗脱粗制蛋白质洗脱液，和
-任选地使卫生缓冲液通过第一层析柱；
(b)第二层析步骤，包含：
-使在步骤(a)结束时所获得的粗制蛋白质洗脱液通过第二层析柱，
-使用第二洗脱缓冲液从第二层析柱洗脱的蛋白质洗脱物，和
-任选地使卫生缓冲液通过第二层析柱；
(c)第三层析步骤，包含：
-使在步骤(b)结束时所获得的蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析柱，
-从第三层析柱的流过液回收纯化的蛋白质，和
-任选地使卫生缓冲液通过第三层析柱；
使用另一部分溶液连续重新开始步骤(a)、(b)和(c)直至使用所有溶液，及
收集在每一步骤(c)结束时所回收的纯化的蛋白质；
其中所述平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
在另一实施方案中，本发明关于从溶液纯化蛋白质的方法，其包含以下步骤或由其组成：
(a)第一层析步骤，包含：
-使所述溶液通过第一层析膜吸附剂；
-使用第一洗脱缓冲液从第一层析膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
-使在步骤(a)结束时所获得的粗制蛋白质洗脱液通过第二层析膜吸附剂；
-使用第二洗脱缓冲液从第二层析膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；和
(c)第三层析步骤，包含：
-使在步骤(b)结束时所获得的蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析膜吸附剂；
-从第三层析膜吸附剂的流过液回收纯化蛋白质；
其中所述缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
更具体而言，上述两个第一层析步骤中的每一个可包含以下步骤或由其组成：
-使平衡缓冲液通过层析膜吸附剂；
-使溶液或粗制蛋白质洗脱液通过层析膜吸附剂(如上所述)；
-使平衡缓冲液通过层析膜吸附剂；
-任选地使洗涤缓冲液通过层析膜吸附剂；
-任选地使平衡缓冲液通过层析膜吸附剂；
-使用洗脱缓冲液从层析膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液或蛋白质洗脱物(如上所述)，
其中所述缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
本发明还关于从溶液纯化蛋白质的方法，其包含以下步骤或由其组成：
(a)第一层析步骤，包含：
-使一部分所述溶液通过第一层析膜吸附剂；
-使用第一洗脱缓冲液从第一层析膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液，和
-任选地使卫生缓冲液通过第一层析膜吸附剂；
(b)第二层析步骤，包含：
-使在步骤(a)结束时所获得的粗制蛋白质洗脱液通过第二层析膜吸附剂，
-使用第二洗脱缓冲液从第二层析膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物，和
-任选地使卫生缓冲液通过第二层析膜吸附剂；
(c)第三层析步骤，包含：
-使在步骤(b)结束时所获得的蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析膜吸附剂，
-从第三层析膜吸附剂的流过液回收纯化蛋白质，和
-任选地使卫生缓冲液通过第三层析膜吸附剂；
使用另一部分溶液连续重新开始步骤(a)、(b)和(c)直至使用所有溶液，和
收集在每一步骤(c)结束时所回收的纯化蛋白质；
其中所述平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
如上文所示，上述本发明方法仅包含三个层析步骤。尽管本发明的方法仅包含三个层析步骤，但其允许获得适用于药物目的且尤其适于至施用人的纯化蛋白质。
除在纯化过程中不存在人为操作(且由此减小完成所述纯化过程所需的总时间)外，所公开的方法还减小用于纯化的缓冲液和树脂的量。此外，主要缓冲液包含相同组份(即Bis Tris、NaCl、乙酸、水和任选地NH4Cl)，其大大促进了缓冲制备。除允许纯化各种mAb外，公开的纯化方法还简化mAb纯化，改进总产率，并减少原材料、储存设施、物质成本和过程时间。
与上述惯用蛋白质纯化方法相比，本文公开的方法使用以下4种或5种缓冲液：平衡缓冲液、洗涤缓冲液、两种洗脱缓冲液和任选地卫生缓冲液。公开的方法中所使用的4种主要缓冲液使用相同化合物基质从母液制得，其大大促进了缓冲液制备。
如本文中所使用，“本发明的缓冲液”指包含Bis Tris的缓冲液。Bis Tris是本领域的技术人员熟知的化合物，其IUPAC名称为2-[双(2-羟乙基)氨基]-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇，且其CAS编号为6976-37-0。这些本发明的缓冲液可对应平衡缓冲液、洗涤缓冲液和/或洗脱缓冲液。
更具体而言，这些本发明的缓冲液可包含不同浓度的相同化学物质(其中的一种是Bis Tris)或由其组成。在一具体实施方案中，缓冲液包含Bis Tris、乙酸和水或由其组成。在更具体的实施方案中，缓冲液包含Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl或由其组成。换而言之，这些缓冲液包含不同浓度的Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl或由其组成。
洗脱缓冲液可例如包含15mM-25mM(例如20mM)Bis Tris和15mM-25mM(例如20mM)NaCl或由其组成，其使用乙酸调节至pH介于3到4之间(例如3.7)。该洗脱缓冲液尤其适于与亲和层析基质、具体而言亲和层析柱或膜吸附剂(例如蛋白质A基质、具体而言蛋白质A柱或蛋白质A膜吸附剂)一起使用。
洗脱缓冲液还可包含15mM-25mM(例如20mM)Bis Tris、40mM-50mM(例如45mM)NaCl和20mM-30mM(例如25mM)NH4Cl或由其组成，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间(例如7.25)。该洗脱缓冲液尤其用于与多模式树脂层析基质、具体而言多模式树脂层析柱(例如Capto MMC)一起使用。
洗脱缓冲液亦可包含15mM-25mM(例如20mM)Bis Tris、50mM-150mM(例如80mM)NaCl及20mM-30mM(例如25mM)NH4Cl或由其组成，且使用乙酸调节至pH介于6与7之间(例如6.2)。这种洗脱缓冲液尤其用于与阳离子交换层析基质、具体而言阳离子交换膜吸附剂一起使用。
平衡缓冲液可包含15mM-25mM(例如20mM)Bis Tris和15mM-25mM(例如20mM)NaCl或由其组成，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间(例如7.4)。
洗涤缓冲液可包含15mM-25mM(例如20mM)Bis Tris和0.9M-1.1M(例如1M)NaCl或由其组成，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间(例如7.4)。
更具体而言，一种用于所公开的方法中的平衡缓冲液含有20mM Bis Tris和20mMNaCl，且使用2mM乙酸调节至pH 7.4。一种用于所公开的方法中的洗涤缓冲液含有20mM BisTris和1M NaCl，且使用2mM乙酸调节至pH7.4。用于所公开的方法中的第一洗脱缓冲液含有20mM Bis Tris和20mM NaCl，且使用275mM乙酸调节至pH 3.7。用于公开的方法中的第二洗脱缓冲液含有20mM Bis Tris、45mM NaCl和25mM NH4Cl且使用5mM乙酸调节至pH7.25(尤其用于与多模式树脂层析柱一起使用)，或含有20mM Bis Tris、80mM NaCl和25mM NH4Cl且使用5mM乙酸调节至pH 6.2(尤其用于与阳离子交换膜吸附剂一起使用)。
上述缓冲配制物的优点包含mAb产物能够通过具有较大兼容性的用于所公开的方法中的三种层析基质、具体而言三种层析柱或三种层析膜吸附剂，同时最小化不期望的相互作用，限制pH及电导率降低，并促进与传统纯化方法相比增加的产率。除使用数量减少的缓冲液外，所公开的方法的另一方面是使用Bis-Tris缓冲液。使用这种缓冲液避免在三个层析步骤之间调节pH且由此使得能够在闭合系统中自收获至最后纯化步骤运行该方法。
任选地用于本发明的上下文中的卫生缓冲液可包含0.05N至0.15N(例如0.1N)NaOH或由其组成。这种卫生缓冲液尤其适于与下列一起使用：亲和层析基质，具体而言亲和层析柱例如蛋白质A柱，或亲和层析膜吸附剂例如Sartobind蛋白质A膜吸附剂，多模式树脂或阳离子交换层析基质，具体而言多模式树脂层析柱，例如Capto MMC，或阳离子交换层析膜吸附剂，例如Sartobind S膜吸附剂，和/或阴离子交换层析基质，具体而言阴离子交换层析柱，例如BioPro Q75，或阴离子交换层析膜吸附剂，例如Sartobind Q膜吸附剂。
本文所用的术语“多肽”或“蛋白质”指：
1)具有天然蛋白序列的分子，即a)通过天然存在和具体而言非重组细胞产生的蛋白质，或b)通过基因改造或重组细胞产生的蛋白质，或
2)因一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代和/或因至少一种翻译后修饰(例如糖基化)而与天然蛋白的序列有所不同的分子。
在上文段落1)中所提及的分子可称为天然蛋白。
在上文段落2)中所提及的分子是非天然蛋白。
在某些方面中，待纯化蛋白是抗体。
本文所用的术语“抗体”指完整抗体或与完整抗体竞争特异性结合的其结合片段。结合片段包括但不限于F(ab)、F(ab')、F(ab')2、Fv和单链抗体。术语“重链”包括具有足够可变区序列以赋予抗原特异性的任一免疫球蛋白多肽。
本文所用的术语“重链”涵盖全长重链及其片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端处，且CH3结构域位于羧基末端处。
本文所用的术语“轻链”涵盖全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。如同重链，轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端处。本文所用的术语“轻链”包括具有足够可变区序列以赋予抗原特异性的任一免疫球蛋白多肽。
天然存在的抗体结构单元通常包含四聚体。每一这样的四聚体通常由多肽链的两个相同对构成，每一对具有一个全长轻链(通常具有约25kDa的分子量)和一个全长重链(通常具有约50-70kDa的分子量)。每一轻链和重链的氨基末端部分通常包括通常负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。每一链的羧基末端部分通常界定负责效应器功能的恒定区。人轻链通常分类为κ及λ轻链。重链通常分类为μ、δ、γ、α或ε，且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有数种亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1及IgM2。类似地，IgA也相似地分为亚类，包括但不限于IgA1及IgA2。在全长轻链和重链内，可变区和恒定区通常由约12个或更多个氨基酸的“J”区连结，其中重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。
每一轻链/重链对的可变区通常形成抗原结合位点。可变区通常展现由三个超变区(也称为互补决定区或CDR)连结的相对保守框架区(FR)的相同通用结构。来自每一对的两条链的CDR通常通过框架区对准，这使得能够结合至特定表位。轻链和重链可变区二者从N末端至C末端通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。通常根据以下文献的定义来将氨基酸分配至每一结构域：Kabat等，1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242。双特异性或双功能抗体通常是具有两个不同重链/轻链对和两个不同结合位点的人工杂合抗体。
F(ab)片段包含一个轻链和一个重链的CH1和可变区。F(ab)分子的重链不能与另一重链分子形成二硫键。F(ab')片段含有一条轻链和一条在CH1和CH2结构域间含有多个恒定区的重链，从而可在两条重链间形成链间二硫键以形成F(ab')2分子。Fv区包含来自重链和轻链二者的可变区，但无恒定区。单链抗体是Fv分子，其中重链和轻链可变区由柔性接头连接以形成单一多肽链，该单一多肽链形成抗原结合区。在某些实施方案中，除“多特异性”或“多功能”抗体外的双价抗体应理解为包含具有相同抗原特异性的结合位点。
可通过所公开的方法纯化的单克隆抗体(mAb)可通过各种技术产生，包括惯用单克隆抗体方法，例如本领域熟知的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交程序是优选，但原则上可采用其他用于产生单克隆抗体的技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。单克隆抗体可对应例如鼠类、嵌合、人源化或全人抗体。
在一个具体的实施方案中，通过本发明方法纯化的抗体选自下组的单克隆抗体：特异性结合至人β-淀粉样蛋白的原纤维体形式的抗体(例如人源化抗体)、特异性结合至细菌表面多糖聚-N-乙酰基葡糖胺(PNAG)的抗体(例如全人抗体)、特异性结合至癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)的抗体和特异性结合至CD38跨膜糖蛋白的抗体(例如人源化抗体)。
可通过本发明方法纯化的抗体的非限制性实例还包含：帕尼单抗(panitumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、阿巴伏单抗(abagovomab)、阿昔单抗(abciximab)、阿克苏单抗(actoxumab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿德木单抗(adecatumumab)、阿非莫单抗(afelimomab)、阿夫土珠单抗(afutuzumab)、阿拉珠单抗(alacizumab)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿里罗单抗(alirocumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿玛西单抗(amatuximab)、阿纳莫单抗(anatumomab)、阿普珠单抗(apolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、托珠单抗(tocilizumab)、巴息紫单抗(basilizimab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比西单抗(biciromab)、卡那单抗(canakinumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、达珠单抗(daclizumab)、登苏单抗(densumab)、艾库珠单抗(eculizumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依法珠单抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、埃达珠单抗(etaracizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、那他珠单抗(natalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗、帕妥珠单抗(pertuzumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、杜匹鲁单抗(dupilumab)、撒里路单抗(sarilumab)或夫苏木单抗(fresolimumab)。
在某些方面中，待纯化蛋白是酶。
可通过本发明方法纯化的酶的非限制性实例包括酸性α-葡糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素N-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸转移酶、α-N-乙酰基半乳糖胺酶(α-半乳糖苷酶B)、酸性脂肪酶、溶酶体酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷酯酶、β-葡糖苷酶、半乳糖神经酰胺酶、α-半乳糖苷酶A、酸性β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、神经胺酸酶、己糖胺酶A或己糖胺酶B。
可通过本发明方法纯化的蛋白质的其他非限制性实例包括人红细胞生成素、肿瘤坏死因子(例如TNF-α、TNF-β或TNF-K)、干扰素α或干扰素β。
含有待纯化蛋白的溶液可为培养基，优选为澄清的培养基。含有待纯化蛋白的溶液是例如在灌注生物反应器或补料分批生物反应器中获得的培养基。
灌注生物反应器或补料分批生物反应器的实例公开于美国临时专利申请案第61/775,060号(其全部内容以提述方式并入本文)中。
术语“澄清的培养基”意指基本上不含(例如至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％不含)哺乳动物、细菌或酵母细胞的从哺乳动物、细菌或酵母细胞培养物获得的液体培养基。
本文所用的短语“回收蛋白质”指在使用公开的纯化方法之后收集蛋白质。可使用各种标准蛋白质层析技术来实现所公开的纯化方法，所述层析技术例如但不限于亲和层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析、凝胶过滤层析和多模式树脂层析。
在所公开的方法的某些实施方案中，第一层析基质是蛋白质A基质。在所公开的方法的特定实施方案中，第一层析基质是蛋白质A柱。在所公开的方法的其他特定实施方案中，第一层析基质是蛋白质A膜吸附剂。蛋白质A基质、具体而言蛋白质A柱或蛋白质A膜吸附剂经由树脂配体与蛋白质间的亲和力发挥作用，从而允许高效去除杂质。在所公开的方法中使用蛋白质A基质、具体而言使用蛋白质A柱或蛋白质A膜吸附剂的另一优点在于mAb针对蛋白质A具有通用亲和力。在所公开的方法的一个实施方案中，蛋白质A柱是MabSelectSure树脂(GE Healthcare)。在所公开的方法的另一实施方案中，蛋白质A柱是AbsoluteHigh Cap(Novasep)。在所公开的方法的一个实施方案中，蛋白质A膜吸附剂是Sartobind蛋白质A膜吸附剂(Sartorius)。
在所公开的方法的其他实施方案中，第二层析基质是多模式(混合模式)树脂或阳离子交换层析基质。在所公开的方法的特定实施方案中，第二层析基质是多模式(混合模式)树脂层析柱。多模式树脂与感兴趣蛋白质经由若干使用mAb：离子、疏水性及氢键相互作用的机制来发生相互作用。更具体而言，在多模式树脂层析柱中，mAb：离子相互作用是mAb：阳离子相互作用，与发生于经典阴离子交换层析(AEX)柱中的mAb：阴离子相互作用相反。
在所公开的方法的一个具体实施方案中，多模式树脂是Capto MMC树脂(GEHealthcare)。Capto MMC是具有高度交联琼脂糖基底基质的多模式阳离子交换剂。CaptoMMC的特性汇总于下文中(参见GE Healthcare Life Sciences，数据文件：11-0035-45AA)。
Figure BDA0004079316320000181
在所公开的方法的其他特定实施方案中，第二层析基质是阳离子交换膜吸附剂。
在所公开的方法的一个其他具体实施方案中，阳离子交换膜吸附剂是SartobindS膜吸附剂(Sartorius)。在所公开的方法的另一具体实施方案中，阳离子交换膜吸附剂是NatriPur HD-C膜吸附剂(Natrix)。
在所公开的方法的其他实施方案中，第三层析基质是阴离子交换层析基质。在所公开的方法的特定实施方案中，第三层析基质是阴离子交换层析柱。在所公开的方法的其他特定实施方案中，第三层析基质是阴离子交换膜吸附剂。共价交联至阴离子交换基质、具体而言阴离子交换树脂的惰性聚合支持物的带正电荷的有机部分与感兴趣的蛋白质经由mAb：阴离子相互作用来发生相互作用。在所公开的方法的一个实施方案中，阴离子交换层析柱是BioPro Q75(YMC)。BioPro Q75的特性汇总于下文中(参见YMC-BioPro Q75及S75数据表)。
Figure BDA0004079316320000191
在所公开的方法的另一实施方案中，阴离子交换膜吸附剂是Sartobind Q膜吸附剂(Sartorius)。在所公开的方法的另一实施方案中，阴离子交换膜吸附剂是SartobindSTIC膜吸附剂(Sartorius)。在所公开的方法的另一实施方案中，阴离子交换膜吸附剂是HD-Q膜吸附剂(Natrix)。
在一个实施方案中，本发明方法并不包括在第一层析步骤结束时和/或在第二层析步骤结束时调节粗制蛋白质洗脱液和/或蛋白质洗脱物的pH。
在一个特定的实施方案中，使在第一层析步骤结束时所获得的粗制蛋白质洗脱液直接通过第二层析基质、具体而言第二层析柱或膜吸附剂。更具体而言，然后并不在两个步骤之间实施处理(例如pH调节、缓冲液交换或稀释)。在该方法中，多模式树脂层析柱可例如对应于Capto MMC柱。在这样的方法中，阳离子交换膜吸附剂可例如对应于Sartobind S膜吸附剂。另外，在一个特定的实施方案中，使在第二层析步骤结束时所获得的蛋白质洗脱物直接通过第三层析基质、具体而言第三层析柱或膜吸附剂。更具体而言，然后在两个步骤之间不实施处理(例如pH调节、缓冲液交换或稀释)。在这样的方法中，多模式树脂层析柱可例如对应于Capto MMC柱和/或阴离子交换层析柱可例如对应于BioPro Q75柱。此方法的具体实例公开于实施例4中。在这样的方法中，阳离子交换膜吸附剂可例如对应于Sartobind S膜吸附剂和/或阴离子交换层析膜吸附剂可例如对应于Sartobind Q膜吸附剂。该方法的具体实例公开于实施例8中。
在这样的方法中，完全不存在需要人工干预并打开纯化系统的步骤间处理(例如在灭活容器中稀释、后失活过滤(post inactivity filtration)和在蛋白质A汇集容器中调节pH)。
本发明方法中使用的层析基质可为较小的生物负荷层析基质(例如γ辐照的层析基质)。较小的生物负荷层析基质的实例公开于美国临时专利申请案61/928,906中，其全部内容以提述并入本文。
本发明方法可由此在包括第一、第二和第三层析基质的MCCS中实施。
术语“多柱层析系统”或“MCCS”指总共具有两个或更多个互连或切换的层析柱和/或层析膜的系统。多柱层析系统的非限制性实例是含有总共两个或更多个互连或切换的层析柱和/或层析膜的周期性逆流层析系统(PCCS)。多柱层析系统的其他实施例公开于本文中且为本领域已知。
存在于MCCS中的层析柱和/或层析膜可通过切换机制(例如柱切换机制)彼此连接或移动。MCCS还可包括一个或多个(例如两个、三个、四个或五个)泵(例如自动化泵，例如自动化蠕动泵)。可通过检测待纯化蛋白的水平(通过对应于通过MCCS的流体(例如MCCS中一个或多个层析柱和/或层析膜的输入物和/或洗脱物)中的特定蛋白质的水平的UV吸光度来检测)、液体(例如缓冲液)的特定体积或已经过的特定时间来触发柱切换事件。柱切换通常指如下机制：使MCCS中的至少两个不同层析柱和/或层析膜(例如存在于MCCS中的两个或更多个不同层析柱和/或层析膜)在至少过程中的一部分时间期间在实质上相同时间通过不同步骤(例如平衡、装载、洗脱或洗涤)。
存在于MCCS中的层析柱和/或层析膜可具有本文所描述的任一例示性形状、大小、体积(床体积)和/或单元操作中的一种或多种。
存在于MCCS中的层析柱和/或层析膜可含有本文所述或本领域已知任一例示性树脂中的一种或多种。举例而言，包含于一种或多种存在于MCCS中的层析柱和/或层析膜中的树脂可为利用捕获机制(例如蛋白质A结合捕获机制、蛋白质G结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、基质结合捕获机制、辅因子结合捕获机制、适配体结合捕获机制和/或标签结合捕获机制)的树脂。包含于MCCS的一种或多种层析柱和/或层析膜中的树脂可为阳离子交换树脂、阴离子交换树脂、分子筛树脂或疏水性相互作用树脂或其任何组合。本领域已知可用于纯化蛋白质的树脂的其他实例且可包含于存在于MCCS中的一种或多种层析柱和/或层析膜中。存在于MCCS中的层析柱和/或层析膜可含有相同和/或不同的树脂(例如本文所阐述或本领域已知用于重组蛋白纯化的任何树脂)。
存在于MCCS中的层析柱和/或层析树脂可实施一个或多个单元操作(例如捕获蛋白质、纯化蛋白质、精制蛋白质、灭活病毒、调节含有蛋白质的流体的离子浓度和/或pH或过滤含有蛋白质的流体)。在非限制性实例中，MCCS可实施从流体(例如液体培养基)捕获蛋白质和使存在于含有重组治疗性蛋白的流体中的病毒灭活的单元操作。MCCS可实施本文所阐述或本领域已知的两个或更多个单元操作的任何组合。
MCCS可配备下列：一个或多个(例如二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)UV监测器、一个或多个(例如二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)阀门、一个或多个(例如二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)pH计和/或一个或多个(例如二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)电导率计。MCCS还可配备利用软件(例如基于Unicorn的软件，GE Healthcare,Piscataway,NJ)的操作系统，所述软件用于在应该发生柱切换时进行感应(例如基于UV吸光度、液体体积或逝去时间)及实现(触发)柱切换事件。在MCCS包括一个或多个UV检测器的实例中，可任选地将UV检测器置于MCCS中的一个或多个(例如二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)层析柱和/或层析膜的入口处和/或MCCS中的一个或多个层析柱和/或层析膜的出口处。
MCCS可进一步包括一个或多个(例如二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个、十五个、十六个、十七个、十八个、十九个、二十个、二十一个、二十二个、二十三个或二十四个)在线缓冲液调节储存器和/或缓冲液储存器。在其他实例中，MCCS可包括一个或多个(例如二个、三个、四个、五个或六个)断流箱(break tank)，其可容纳无法容易地进入MCCS中的一个或多个层析柱和/或层析膜的流体。本文所述的系统可含有一个或多个断流箱。本文所述系统的其他实例并不包括断流箱。
MCCS可包括入口，流体(例如实质上不含细胞的液体培养基)可穿过该入口进入所述MCCS中。入口可具有本领域已知用于这些目的的任何结构。其可包括例如允许插入流体导管的螺纹(threading)、肋材(ribbing)或密封件，从而在将流体导管插入至入口中之后，流体会经由入口进入MCCS且流体并不从入口显著渗出。可用于本系统中的非限制性入口为那些本领域的技术人员已知且会理解的。本文所提供系统的一些实例还包括与MCCS入口流体连接的生物反应器。本文所述或本领域已知的任一示例性生物反应器可用于本发明系统中。
MCCS可包括出口，蛋白质可穿过该出口离开系统。出口可包括例如容许插入流体导管的螺纹、肋材或密封件或经设计以含有或储存蛋白质的小瓶。出口可含有能用于将无菌小瓶或其他此类储存容器密封于出口之上的表面以使蛋白质直接流入无菌小瓶或储存容器中。可用于本发明系统中的非限制性出口为那些本领域的技术人员已知并会理解的。
本文所提供系统的一些实例还包括泵系统。泵系统可包括一个或多个下列部分：一个或多个(例如二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)泵(例如本文所阐述或本领域已知的任何泵)、一个或多个(例如二个、三个、四个或五个)过滤器(例如本文所阐述或本领域已知的任何过滤器)、一个或多个(例如二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个)UV检测器和一个或多个(例如二个、三个、四个或五个)断流箱。
本文所述系统的一些实例进一步包括连接至泵和MCCS入口间的流体导管的另一流体导管，其中所述另一流体导管的一端流体连接至生物反应器且另一端流体连接至泵与入口间的流体导管。该另一流体导管可包括过滤器，其能够从自生物反应器(例如ATF细胞滞留系统)中去除的液体培养基中去除细胞。在一些实例中，该特定流体导管可包括一个或多个(例如二个、三个或四个)泵(例如本文所阐述或本领域已知的任一泵)和/或一个或多个(例如二个、三个或四个)断流箱(例如本文所阐述的任一示例性断流箱)，其中这些泵和/或断流箱与存在于流体导管中的流体流体连接。
本文所述的系统可任选地包括布置于最终层析柱或层析膜与出口间的流体导管。本文所述的系统可进一步包括与布置于最终层析柱或层析膜与出口间的流体导管流体连接的一个或多个过滤器，从而过滤器可从存在于布置于MCCS中的最终层析柱或层析膜与出口间的流体导管中的流体去除例如沉淀材料、颗粒物质或细菌。
可以连续模式运行本发明方法。换而言之，本发明方法可为从溶液纯化蛋白质的连续方法。
术语“连续方法”或“呈连续模式的方法”指连续供给流体通过系统的至少一部分的方法。
术语“流体”在本文中指任何液体，例如含有待纯化蛋白的溶液、缓冲液或用于病毒灭活的低或酸性pH溶液。
在优选的实施方案中，向第一、第二和第三基质连续供给流体。
术语“整合过程”指使用协作发挥作用以达成特定结果(例如从液体培养基生成纯化蛋白质)的结构元件实施的过程。
整合过程的实例揭示于美国临时专利申请案第61/775,060号(其全部内容提述并入本文中)中。
本发明方法的规模放大还可包括使用柱切换和/或增加每一层析柱的柱床体积。
此外，本发明方法可在闭合系统中从方法的第一步运行至最后一步。具体而言，层析步骤和任选地过滤步骤(例如纳米过滤步骤和/或超滤和渗滤步骤)可在闭合系统中运行。在本发明方法的一个具体实施方案中，使包含蛋白质的溶液逐份通过三种层析基质、具体而言三种层析柱或膜吸附剂，每次通过一部分溶液对应于一个运行。然后收集并汇集在每一运行结束时回收的蛋白质。该方法的具体实例公开于实施例5、6和8中。在这样的方法中，将层析步骤的柱或膜吸附剂使用若干次，并任选地使用例如如上文所定义的卫生缓冲液实施卫生化，由此允许减小树脂或膜吸附剂装置和所需缓冲液的量。举例而言，可连续实施3至50个运行(例如3至30个运行、5至25个运行、10至20个运行或15个运行)的序列。更具体而言，可以连续模式实施3、4、5、6、7或8个运行，随后对3个柱或膜吸附剂实施卫生化(例如使用卫生缓冲液)。这可重复例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。
本文公开的方法可用于回收纯化蛋白质。如本文所使用，“纯化”指允许有效体外、离体或体内使用蛋白质的纯度。对于将用于体外、离体或体内应用中的蛋白质而言，其应实质上不含污染物、其他蛋白质和/或可干扰该蛋白质在这些应用中的使用或至少不期望与感兴趣蛋白质包括在一起的化学物质。这些应用包括制备治疗组合物、以治疗组合物施用蛋白质及本文公开的其他方法。优选地，如本文所提及的“纯化”蛋白是如下蛋白质：可通过任何方法(即，通过自天然来源直接纯化、以重组方式或以合成方式)产生，且已从其他蛋白质组份纯化从而该蛋白质占给定组合物中总蛋白质的至少约80％重量/重量和更优选地占给定组合物中总蛋白质的至少约85％和更优选地至少约90％和更优选地至少约91％和更优选地至少约92％和更优选地至少约93％和更优选地至少约94％和更优选地至少约95％和更优选地至少约96％和更优选地至少约97％和更优选地至少约98％和更优选地至少约99％重量/重量。
如本文中使用，“粗制蛋白”指下列蛋白质：可通过任何方法(即通过从天然来源直接纯化、以重组方式或以合成方式)产生，且已从其他蛋白质组份纯化从而该蛋白质占给定组合物中总蛋白质的小于约80％重量/重量。
在一个特定的实施方案中，根据本发明从溶液纯化蛋白质的方法包括：
(a)第一层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；
(ii)使溶液通过蛋白质A柱；
(iii)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；
(iv)使洗涤缓冲液通过蛋白质A柱；
(v)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从蛋白质A柱洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过多模式树脂层析柱；
(ii)使来自步骤(a)的粗制蛋白质洗脱液通过多模式树脂层析柱；
(iii)使平衡缓冲液通过多模式树脂层析柱；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从多模式树脂层析柱洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换层析柱；
(ii)使来自步骤(b)的蛋白质洗脱物以流过模式通过阴离子交换层析柱；和
(iii)从阴离子交换层析柱的流过液回收纯化蛋白质，
其中平衡缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，洗涤缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和0.9M-1.1M NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，第一洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于3到4之间且第二洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris、40mM-50mMNaCl和20mM-30mM NH4Cl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间。
在另一实施方案中，根据本发明从溶液纯化蛋白质的方法包括：
(a)第一层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；
(ii)使一部分溶液通过蛋白质A柱；
(iii)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；
(iv)使洗涤缓冲液通过蛋白质A柱；
(v)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从蛋白质A柱洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过多模式树脂层析柱；
(ii)使来自步骤(a)的粗制蛋白质洗脱液通过多模式树脂层析柱；
(iii)使平衡缓冲液通过多模式树脂层析柱；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从多模式树脂层析柱洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换层析柱；
(ii)使来自步骤(b)的蛋白质洗脱物以流过模式通过阴离子交换层析柱；和
(iii)从阴离子交换层析柱的流过液回收纯化蛋白质，
(d)使用另一部分溶液连续重新开始步骤a)、b)和c)直至使用所有溶液，和
(e)收集在每一第三层析步骤结束时回收的纯化蛋白质；
其中平衡缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，洗涤缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和0.9M-1.1M NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，第一洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于3到4之间且第二洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris、40mM-50mMNaCl和20mM-30mM NH4Cl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间。
在另一特定实施方案中，根据本发明从溶液纯化蛋白质的方法包括：
(a)第一层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(ii)使所述溶液通过蛋白质A膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(iv)使洗涤缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(v)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从蛋白质A膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过阳离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(a)的粗制蛋白质洗脱液通过阳离子交换膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过阳离子交换膜吸附剂；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从阳离子交换膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(b)的蛋白质洗脱物以流过模式通过阴离子交换膜吸附剂；和
(iii)从阴离子交换膜吸附剂的流过液回收纯化蛋白质，
其中平衡缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，洗涤缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和0.9M-1.1M NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，第一洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于3到4之间且第二洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris、50mM-150mMNaCl和20mM-30mM NH4Cl，其使用乙酸调节至pH介于6到7之间。
在另一实施方案中，根据本发明从溶液纯化蛋白质的方法包括：
(a)第一层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(ii)使一部分所述溶液通过蛋白质A膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(iv)使洗涤缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(v)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从蛋白质A膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；
b)第二层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过阳离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(a)的粗制蛋白质洗脱液通过阳离子交换膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过阳离子交换膜吸附剂；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从阳离子交换膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包括：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(b)的蛋白质洗脱物以流过模式通过阴离子交换膜吸附剂；和
(iii)从阴离子交换膜吸附剂的流过液回收纯化蛋白质，
(d)使用另一部分溶液连续重新开始步骤a)、b)和c)直至使用所有溶液，和
(e)收集在每一第三层析步骤结束时回收的纯化蛋白质；
其中平衡缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，洗涤缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和0.9M-1.1M NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，第一洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于3到4之间且第二洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris、50mM-150mMNaCl和20mM-30mM NH4Cl，其使用乙酸调节至pH介于6到7之间。
从溶液纯化蛋白质的方法可包括至少一个过滤步骤，例如纳米过滤步骤、超滤步骤和/或渗滤步骤。过滤步骤可在层析步骤之前和/或之后实施。在纯化重组蛋白以用于药物目的时，在层析步骤后通常进行过滤步骤。因此，本发明方法可进一步在步骤(c)之后包括纳米过滤步骤。可另外在纳米过滤步骤之后实施超滤及渗滤步骤。如本文中所使用，“超滤”或“UF”指基于颗粒大小和UF膜中孔的大小使用半渗透膜以物理方式且选择性地从溶液去除颗粒和/或离子的过滤技术。如本文中所使用，“纳米过滤”指经由用于去除例如病毒颗粒的纳米过滤器过滤溶液。如本文中所使用，“渗滤”指使用超滤膜自溶液完全去除、置换盐或溶剂或降低盐或溶剂浓度的技术。
本发明方法还可进一步包括至少一个病毒灭活步骤。该至少一个病毒灭活步骤可在本发明方法的任一阶段中实施，例如在步骤(a)之前、在步骤(a)之后、在步骤(b)之后、在步骤(c)之后、在纳米过滤步骤之后和/或在超滤及渗滤步骤之后。这一病毒灭活步骤可通常是低或酸性pH灭活步骤。如本文中所使用，“低或酸性pH灭活”指使用酸性pH使病毒、具体而言包膜病毒变性的病毒灭活技术。通常，通过将回收蛋白在约3.0-5.0(例如约3.5-约4.5、约3.5-约4.25、约3.5-约4.0，例如4.0)的pH温育至少30分钟的时段(例如1小时-21天的时段、约2小时-21天的时段或约4小时-21天的时段)来实施低或酸性pH灭活步骤。举例而言，通过将回收蛋白在pH 4于例如6h-21天期间温育来实施低或酸性pH灭活步骤。
本发明方法还可在步骤(a)前包括提供含有待纯化蛋白且实质上不含细胞的液体培养基的步骤，其中将该液体培养基供给至第一层析基质中。
举例而言，从溶液纯化蛋白质的本发明方法可包括：
(pre-a)提供含有待纯化蛋白且实质上不含细胞的液体培养基的步骤，
(a)第一层析步骤，包括：
-使步骤(pre-a)的液体培养基通过第一层析基质；
-使用第一洗脱缓冲液从第一层析基质洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包括：
-使在步骤(a)结束时所获得的粗制蛋白质洗脱液通过第二层析基质；
-使用第二洗脱缓冲液从第二层析基质洗脱蛋白质洗脱物；和
(c)第三层析步骤，包括：
-使在步骤(b)结束时获得的蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析基质；
-从第三层析基质的流过液回收纯化蛋白质；
其中缓冲液中的每一种都包含Bis Tris。
最后，可将纯化蛋白质配制成适于储存的组合物和/或配制成适于施用至动物和/或人的药物组合物。
所公开的方法的多个优点之一是其允许获得良好产率的高纯蛋白。使用本发明方法回收的纯化蛋白质可例如展现至少95％、96％、97％、98％、99％、99.2％、99.5％或99.9％的纯度。更具体地，所公开的方法的多个优点之一是其允许获得含有减小量的污染DNA、高分子量(HMW)物质(其对应蛋白质聚集物)和/或宿主细胞蛋白(HCP)的高纯蛋白溶液。包含使用本发明方法回收的纯化蛋白质的溶液可例如展现小于0.4ppb、小于0.3ppb、小于0.2ppb或小于0.1ppb的污染DNA量。包含使用本发明方法回收的纯化蛋白质的溶液可例如展现小于0.9％、小于0.8％、小于0.7％、小于0.6％、小于0.5％或小于0.4％的HMW物质浓度。包含使用本发明方法回收的纯化蛋白质的溶液可例如展现小于23ppm、小于22ppm、小于21ppm、小于20ppm、小于19ppm或小于18ppm的HCP浓度。此外，本发明方法能够允许回收产率为至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的纯化蛋白质。
本发明的另一方面是关于制备适用于本发明方法的缓冲液的方法。实际上，所有这些缓冲液可非常容易且快速地从单一母液开始制得。
制备缓冲液的这种方法可包括下列步骤或由其组成：
i)产生最终浓度为15mM-25mM(例如20mM)Bis Tris和15mM-25mM(例如20mM)NaCl的溶液(例如100L溶液)；
ii)使用乙酸将溶液的pH值调节至7-8(例如7.4)；
iii)收集1/4溶液，由此获得平衡缓冲液；
iv)使用乙酸将来自步骤(iii)的剩余3/4溶液中的1/4的pH值调节至3-4(例如3.7)，由此获得洗脱缓冲液；
v)收集来自步骤(iii)的剩余2/4溶液中的1/4，添加NaCl以获得40mM-50mM(例如45mM)的最终NaCl浓度，另外添加NH4Cl以获得20mM-30mM(例如25mM)的最终NH4Cl浓度，且使用乙酸将pH值调节至7-8(例如7.25)，由此获得另一洗脱缓冲液；
vi)向来自步骤(iii)的剩余1/4溶液中添加NaCl并添加NaCl以获得0.9M-1.1M(例如1M)的最终NaCl浓度，由此获得洗涤缓冲液。
该方法例示性示于图1中。
制备缓冲液的另一方法可包括下列步骤或由其组成：
i)产生最终浓度为15mM-25mM(例如20mM)Bis Tris和15mM-25mM(例如20mM)NaCl的溶液(例如100L溶液)；
ii)使用乙酸将溶液的pH值调节至介于7到8之间(例如7.4)；
iii)收集1/4的溶液，由此获得平衡缓冲液；
iv)使用乙酸将来自步骤(iii)的剩余3/4溶液中的1/4的pH值调节至3-4(例如3.7)，由此获得洗脱缓冲液；
v)收集来自步骤(iii)的剩余2/4溶液中的1/4，添加NaCl以获得70mM-90mM(例如80mM)的最终NaCl浓度，另外添加NH4Cl以获得20mM-30mM(例如25mM)的最终NH4Cl浓度，且使用乙酸将pH值调节至6-7(例如6.2)，由此获得另一洗脱缓冲液；
vi)向来自步骤(iii)的剩余1/4溶液中添加NaCl并添加NaCl以获得0.9M-1.1M(例如1M)的最终NaCl浓度，由此获得洗涤缓冲液。
制备缓冲液的上述方法还可对应本发明方法在实施三个层析步骤之前的最初始步骤。
本发明进一步关于包含以下部分或由其组成的试剂盒：
(a)多模式树脂或阳离子交换层析基质、亲和层析基质(例如蛋白质A基质)和/或阴离子交换层析基质；和
(b)至少一种本发明缓冲液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl或由其组成)，和/或用于制备至少一种本发明缓冲液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl或由其组成)的说明。
在一个实施方案中，试剂盒包含以下部分或由其组成：
(a)多模式树脂层析柱、亲和层析柱(例如蛋白质A柱)和/或阴离子交换层析柱；和
(b)至少一种本发明缓冲液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl或由其组成)，和/或用于制备至少一种本发明缓冲液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl或由其组成)的说明。
在另一实施方案中，试剂盒包含以下部分或由其组成：
(a)阳离子交换膜吸附剂、亲和层析膜吸附剂(例如蛋白质A膜吸附剂)和/或阴离子交换层析膜吸附剂；和
(b)至少一种本发明缓冲液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl或由其组成)，和/或用于制备至少一种本发明缓冲液(例如包含Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl或由其组成)的说明。
实施例
下列实施例是用于阐述所公开的方法的具体实施方案及其各种用途。其仅出于阐述目的而陈述，而不应解释为以任何方式限制本发明范围。
实施例1：纯化缓冲液的优化
Bis Tris缓冲液可有利地用作用于多模式树脂层析柱的缓冲液。
使通过蛋白质A层析柱后获得的粗制蛋白质洗脱液通过Capto MMC多模式树脂层析柱。
该树脂即使在低pH下也能够固定mAb，如层析步骤后于蛋白质A柱上获得的那些。然而，该树脂还需要盐以获得良好洗脱。然而，过高盐浓度对mAb稳定性有害，这是由于其增加了洗脱样品中高分子量(HMW)物质的水平，且还对固定于培养基上的杂质有效，从而降低mAb的纯度。
为避免这些缺点，发明人进行实验设计(DOE)以减小步骤(a)洗脱缓冲液中的盐浓度和pH。
为此，发明人引入新种类的盐，氯化铵，其带来与NaCl相同的电导率但在相互作用方面强于Na+。
DOE参数
应用中心复合表面设计(CCF)以使用MODDE 9软件(UMETRICS)优化洗脱条件。CCF设计由完全析因设计和三个中心点构成(在所有17个实验中)。洗脱pH在7.2-7.8间变化，且以同样的方式NaCl浓度在0mM-100mM变化且NH4Cl浓度在0mM-50mM变化。
因子和反应汇总于下文中。
Figure BDA0004079316320000311
缩写：
Quant.：定量；Control.：控制；Transf.：转变；Prec.：精确度；MLR：多元线性回归；Orthog.：正交；PLS：偏最小二乘；Unit Var.：单位变异数；HCP：宿主细胞蛋白；HMW：高分子量物质
DOE实验
17个实验汇总于下表中。
Figure BDA0004079316320000321
DOE结果
在运行期间，4次实验似乎在产物回收率方面不一致。N1和N2运行因条件而无洗脱，且在N5和N11运行期间，必须在10个柱体积(CV)后停止洗脱。由此将这些实验从分析排除。
将所有实验提交至SEC-HPLC和HCP分析。
结果汇总于下表中。
Figure BDA0004079316320000322
Figure BDA0004079316320000331
在MODDE 9.0预测工具中，发明人通过固定下列反应来测定甜蜜点(其指含有应用条件的空间)：
-产率：95％至100％
-HCP：20ppM-30ppm
-HMW：0.4％至0.8％
三种NH4Cl浓度(0mM、25mM和50mM)的甜蜜点示于图2中。
黑色空间是含有下列所符合的第一准则的空间：产率90％-100％。浅灰色空间是含有产率和HCP率(20ppm-30ppm)的空间。深灰色空间是甜蜜点，其是含有以下所符合的3个准则的空间：产率、HCP率和HMW率(0.4％至0.8％)。
发明人由此使用该附图说明证明，使用的NaCl越多，则增加的HMW和产率越多。另外，pH增加越多，则HCP率越重要。因此，发明人证明为获得高产率和良好纯度，必须在低pH和低NaCl浓度实施洗脱。
发明人证明可使用NH4Cl来降低NaCl浓度。最适当NH4Cl浓度为25mM，从而得到产率大于95％、HCP率约为30ppm且HMW率为0.6％的甜蜜点。
发明人由此证明用于第二层析步骤的最佳洗脱缓冲液为20mM Bis Tris、45mMNaCl、25mM NH4Cl且使用乙酸补足至pH为7.25。
实施例2：第三层析步骤的优化
首先设计纯化过程，其中使用Sartobind STIC膜作为第三步(因其盐耐受性质)以在两个第一层析步骤后精制杂质并去除病毒。
然而，在连续过程中，实施每一步骤多次。丢弃式膜(例如Sartobind STIC膜)不能再利用。发明人由此设计了使得能够精制杂质、去除病毒和再利用的替代性第三层析步骤，其由此可用于连续过程中。
作为精制步骤测试以下三种介质：
-Sartobind STIC(Sartorius)
-Sartobind Q(Sartorius)，和
-BioPro Q75(YMC)，一种AEX树脂。
首先，发明人在Capto MMC洗脱(100mM NaCl、20mM Bis Tris，pH 8.0)后测试了这些树脂以评估第三步即使在使用100mM NaCl条件下去除杂质的能力。在单一运行中评估Sartobind STIC和Q膜。在下列三种运行中评估BioPro Q75：100mM、50mM和25mM NaCl浓度。结果示于下表中。
Sartobind STIC Sartobind Q BioPro Q75
条件(mM NaCl) 100 100 100/50/25
大小(mL) 0.08 0.08 2.5
HMW(％) 1.6 1.8 1.8/1.7/1.7
HCP(ppm) 9 6 20/15/14
DNA(ppb) 2.8 0.01 0.1
这些结果由此展示Sartobind STIC膜因其盐耐受性质而给出良好杂质去除。然而，在运行期间将压力从1巴增加至3巴的过程中展示该膜不能用于再利用技术中，其尤其由于压力在1M NaCl洗涤后和在0.1N NaOH卫生化之后并不降低。使用Sartobind Q膜在杂质方面获得了最佳结果。然而，因再利用和可用性问题，发明人认为此膜并不适宜。
最后，BioPro Q75树脂给出关于杂质去除的中间结果。另外，在运行期间观察到并无压力。最后，因经典树脂技术而完成再利用。
发明人由此显示，阴离子交换层析柱在精制步骤中是膜的良好替代方式以通过连续过程实施蛋白质纯化。
实施例3：纯化缓冲液的配制
本文所述的三步纯化方法利用4种缓冲液：平衡缓冲液、洗涤缓冲液和两种洗脱缓冲液，其都由同一母液制得。方案示意图展示于图1中且如下所述：将等量20mM Bis Tris和等量20mM NaCl用注射用水(WFI)配制成100L作为母液，且随后使用乙酸将溶液pH调节至7.4。然后收集25L所得溶液并储存作为平衡缓冲液。然后取出25L母液并添加等量1M NaCl。该所得25L溶液是洗涤缓冲液。然后使用乙酸将25L母液的pH调节至3.7。该所得25L溶液是第一洗脱缓冲液。然后使用乙酸将剩余25L母液的pH调节至7.25，且添加等量45mM NaCl和等量25mM NH4Cl，从而得到另一洗脱缓冲液。
实施例4：小规模连续多步骤过程
利用本发明方法小批纯化特异性结合至CD38跨膜糖蛋白的人源化单克隆抗体(抗CD38 mAb)。
材料和方法
材料
-第一步：60mL Absolute High Cap树脂，在定制有Fast Flow管道的XK50/20柱中
-第二步：100mL Capto MMC树脂，在定制有Fast Flow管道的XK50/20柱中
-第三步：50mL BioPro Q75树脂，在定制有Fast Flow管道的XK50/20柱中
-Akta Purifier管道，其使用PEEK调节(tuning)(内径1.0mm)进行改造
第一步细节
使用Absolute High Cap树脂(参考号AbSHC 35P1-A-V-00200)填充XK50/20柱。最终体积为60mL。HETP为13538N/m且不对称度为1.2。
在该步骤中使用以下三种缓冲液：
-平衡缓冲液，使用20mM Bis Tris、2mM NaCl制得且使用乙酸补足至pH 7.4
-洗涤缓冲液，使用20mM Bis Tris、1M NaCl制得且使用乙酸补足至pH7.4
-洗脱缓冲液，使用20mM Bis Tris、20mM NaCl制得且使用乙酸补足至pH 3.7。
根据柱大小，将用于平衡、洗涤、装载和洗脱步骤的流速设置为24mL/min(滞留时间：2.5min)。
第二步细节
使用Capto MMC树脂(参考号17-5317-02)填充XK50/20柱。最终体积为100mL。HETP为5686N/m且不对称度为1.3。
在该步骤中使用以下两种缓冲液：
-平衡缓冲液，使用40mM Bis Tris、20mM NaCl制得且使用乙酸补足至pH 7.4
-洗脱缓冲液，使用20mM Bis Tris、45mM NaCl、25mM NH4Cl制得且使用乙酸补足至pH 7.25。
根据柱大小，将用于平衡、装载和洗脱步骤的流速设置为24mL/min(滞留时间：4.8min)。
第三步细节
使用BioPro Q75树脂(参考号QAA0S75)填充XK50/20柱。最终体积为50mL。HETP为4875N/m且不对称度为1.6。
在该步骤中使用以下一种缓冲液：
-平衡缓冲液，使用40mM Bis Tris、20mM NaCl制得且使用乙酸补足至pH 7.4。
根据柱大小，将用于平衡和洗脱步骤的流速设置为24mL/min(滞留时间：2.1min)。
结果
将2.325g批量收获物(以1.71g/L的浓度)加载于Absolute High Cap树脂上。纯化2,325g的总持续时间为2h10 min。回收2.125g，意味着产率为91％。在技术上，在并无反压时成功实现纯化，即使以连续的配置使用柱。
使用该3步骤过程获得的最终产物的杂质去除汇总于下表中并与使用PCT/EP2012/059528中所述的2步骤过程获得进行比较。
批量收获物 3步骤过程最终产物 2步骤过程最终产物
产率(％) 91 92
HMW(％) 8.7 0.4 0.9
HCP(ppm) <![CDATA[2.2×10<sup>5</sup>]]> 18 23
DNA(ppb) <![CDATA[3×10<sup>6</sup>]]> <0.1 0.4
发明人由此展示新的连续多步过程与PCT/EP2012/059528中所述应用于同一产物上的2步骤过程同等有效。
实施小规模研究以评估在每一步骤后所获得的杂质率。发明人展示，每一步骤可有效去除杂质，如下表中所汇总。
HMW(％) HCP(ppm) DNA(ppb)
批量收获物 8.7 <![CDATA[2.2×10<sup>5</sup>]]> <![CDATA[3×10<sup>6</sup>]]>
Absolute HC 1.0 <![CDATA[1×10<sup>3</sup>]]> <![CDATA[2×10<sup>4</sup>]]>
Capto MMC 0.4 40 10
BioPro Q75 0.4 18 <0.1
该实施例由此展示，由发明人设计的连续过程与分批过程同等有效。
实施例5：全尺寸连续多步过程
应用上述方法以大规模纯化特异性结合至CD38跨膜糖蛋白的人源化单克隆抗体(抗CD38 mAb)。
材料和方法
材料
-第一步：50mL动态结合容量(DBC)为50mg/mL的Absolute High Cap树脂
-第二步：100mL DBC为35mg/mL的Capto MMC树脂
-第三步：50mL DBC为170mg/mL的BioPro Q75树脂
-来自GE的周期性逆流系统(专用Akta纯化器)，其包含上述3个在线柱且允许监测所有柱。
方法
连续实施15个运行的序列。更具体而言，以连续模式实施5个运行，随后使用0.1NNaOH对3个柱实施卫生化，然后开始新序列。
结果
序列允许在小于500min内纯化10g抗CD38 mAb。
装载29.5g批量收获物并回收28g纯化mAb。本发明的连续多步骤过程由此允许达到95％的平均产率。在25h内获得这28g纯化的mAb。
此外，最终产物的分析结果与使用PCT/EP2012/059528中所述2步骤过程获得的最终产物的分析结果相当。这些分析结果汇总于下表中。
Figure BDA0004079316320000371
Figure BDA0004079316320000381
在单独分析每一步骤时情况也是如此，如下表中所示。
HMW(％) HCP(ppm) DNA(ppb)
批量收获物 8.7 <![CDATA[2.2×10<sup>5</sup>]]> <![CDATA[3×10<sup>6</sup>]]>
Absolute HC 1.0 800 <![CDATA[2×10<sup>4</sup>]]>
Capto MMC 0.2 40 10
BioPro Q75 0.2 5 <0.1
另外，如图3所示，趋势并未展示每一运行间的任何显著差异。
实施例6：呈连续模式的分批纯化
使用实施例5中所述的过程以全尺寸连续分批形式纯化抗CD38 mAb。
在本实施例中，在69h期间连续纯化43L浓度为1.66g/L的mAb。更具体而言，实施45个运行，在每一运行中装载960mL澄清产物。由此仅使用70L缓冲液即可回收19.5L浓度为3.42g/L的纯化mAb，其代表93％的产率。
下表汇总该纯化方法和PCT/EP2012/059528中所述的2步骤纯化过程相比的特征。
2步过程 连续多步骤过程
步骤数 2 3
运行数 1+1 45
持续时间(h) 72 69
使用的系统 Akta过程 周期性逆流系统
缓冲液体积(L) 99.2 69.7
柱类型 BPG140 XK50/20
树脂体积(L) 7.5 0.2
因此，本发明的连续多步骤过程允许将所用缓冲液的体积减小33％并将所用树脂的体积减小97％。
实施例7：不同单克隆抗体的纯化
除人源化抗CD38抗体外，使用上述连续多步骤过程来纯化其他抗体，即特异性结合至细菌表面多糖聚-N-乙酰基葡糖胺(PNAG)的全人抗体、特异性结合至癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)的单克隆抗体和结合至人β-淀粉样蛋白的原纤维体形式的人源化13C3 mAb，如国际公开案第WO2009/065054号中所述。
下表展示在纯化这三种抗体时获得的总产率和纯度。
抗体 <![CDATA[总产率(％)<sup>1</sup>]]> 纯度(％)
人源化13C3 mAb 86 96
抗PNAG mAb 89 96
抗CD38mAb 93 99
抗CEACAM5 mAb 92 96
1总产率对应纳米过滤、超滤和渗滤步骤前的产率。
总之，使用4种不同抗体证实，连续多步过程方法允许获得良好产率的纯化抗体和极佳的纯度，纯化抗体具有适于施用至人的质量。
实施例8：膜吸附剂连续多步骤过程
应用本发明方法使用丢弃式膜吸附剂大规模纯化特异性结合至CD38的人源化单克隆抗体(抗CD38 mAb)。
材料和方法
材料
-第一步：4种Sartobind蛋白质A膜吸附剂(Sartorius)，各2mL
-第二步：2种Sartobind S”纳米”膜吸附剂(Sartorius)，各3mL
-第三步：1种Sartobind Q”纳米”膜吸附剂(Sartorisu)，3mL
所用缓冲液与描述于实施例4中的那些相同，只是第二步骤的洗脱缓冲液使用20mM Bis Tris、80mM NaCl、25mM NH4Cl制得且使用乙酸补足至pH6.2。
方法
经由50个运行(各30mg)在3个上述步骤中以连续模式实施过程以纯化1.5g抗体。
简而言之，使用平衡缓冲液平衡蛋白质A膜吸附剂，然后装载。装载后，将膜吸附剂再次平衡，然后使用第一洗脱缓冲液洗脱。将蛋白质A膜吸附剂的洗脱物直接加载于阳离子交换膜吸附剂上。尽管使用平衡缓冲液平衡阳离子交换膜，但在下一装载前使用卫生缓冲液对蛋白质A膜吸附剂实施卫生化。使用第二洗脱缓冲液洗脱阳离子交换膜吸附剂并将洗脱物直接加载于阴离子交换膜吸附剂上。
结果
可在750min(每一运行15min)内纯化1.5g抗体。回收率约为80％。
分析结果汇总于下表中。
膜连续多步骤过程
HMW(％) 1.8
LMW(％) 0.6
HCP(ppm) 10
DNA(ppb) 0.9
因此，与使用再利用树脂的过程相比，使用丢弃式膜吸附剂的本发明的连续多步骤过程允许在内部规格之内内且无需另外优化过程和缓冲液即获得满意杂质去除率。
此外，如图4所示，趋势中并未展示出每一运行间有任何显著差异。因此，发明人惊讶地证明，丢弃式膜吸附剂实际上是稳定的并可再利用于50个运行中且并无任何性能降低。
在本发明方法中使用膜吸附剂而非柱的主要优点汇总如下：
-在同等规模下，可以柱10倍的流速使用膜吸附剂，由此显著减小过程的持续时间。举例而言，以1mL/min的流速来使用5mL经树脂填充的柱，而以最小10mL/min的流速来使用相应5mL膜吸附剂。因此，在使用经树脂填充的3根柱于2h 30min内实施本发明的3层析步骤过程时，其可使用膜吸附剂在15min内完成。
-即使再利用，膜吸附剂还是丢弃式装置，其可由此在一批后弃除且无需长期储存。由此无需对其进行测试以确保长期稳定性。
-使用膜吸附剂的本发明方法因避免柱成本、柱填充和柱储存而较为便宜。
实施例9：GMP规模连续多步骤过程
应用上述方法以大规模纯化特异性结合至CD38跨膜糖蛋白的人源化单克隆抗体(抗CD38 mAb)。
材料和方法
材料
-第一步：6L动态结合容量(DBC)为35mg/mL的MabSelect Sure树脂
-第二步：6L DBC为35mg/mL的Capto MMC树脂
-第三步：6L DBC为170mg/mL的BioPro Q75树脂
-来自GE的2个AktaProcess(在所述3个柱之前)和来自Sartorius的一个Flexact(于第一步与第二步之间完成在低pH下灭活的步骤)，包含上述3个线上柱且允许监测所有柱。
方法
连续实施7次运行的序列。
结果
序列允许在小于16h内纯化1.3Kg抗CD38 mAb。
装载14.4Kg批量收获物且回收1.30Kg纯化mAb。本发明的连续多步骤过程由此允许实现90％的平均产率。在16h内获得1.3Kg纯化的那些mAb。
与之相比，使用2步骤过程的500L分批的纯化耗费3天并使用20L柱。
本发明的连续方式由此是一种允许节约时间和原材料(节约66％以上的树脂体积)的进化。
此外，最终产物的分析结果与使用PCT/EP2012/059528中所述2步骤过程获得的最终产物的分析结果相当。这些分析结果汇总于下表中。
Figure BDA0004079316320000411
综上所述，本发明包括但不限于以下项：
1.一种从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
-使所述溶液通过第一层析基质；
-使用第一洗脱缓冲液从所述第一层析基质洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
-使在步骤(a)结束时获得的所述粗制蛋白质洗脱液通过第二层析基质；
-使用第二洗脱缓冲液从所述第二层析基质洗脱的蛋白质洗脱物；和
(c)第三层析步骤，包含：
-使在步骤(b)结束时获得的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析基质；
-从所述第三层析基质的流过液回收纯化的蛋白质；
其中各所述缓冲液都包含Bis Tris。
2.项1的方法，其中使在步骤(a)结束时获得的所述粗制蛋白质洗脱液不经历如pH调节、缓冲液交换或稀释的任何处理而直接通过第二层析基质。
3.项1或2的方法，其中使在步骤(b)结束时获得的所述蛋白质洗脱物不经历如pH调节、缓冲液交换或稀释的任何处理而直接通过第三层析基质。
4.项1至3任一项的方法，其中在闭合系统中从第一步骤至最后步骤运行所述方法。
5.项1至4任一项的方法，其中所述两个第一层析步骤中的每一步包含：
-使平衡缓冲液通过所述层析基质；
-使所述溶液或粗制蛋白质洗脱液通过所述层析基质；
-使平衡缓冲液通过所述层析基质；
-任选地使洗涤缓冲液通过所述层析基质；
-任选地使平衡缓冲液通过所述层析基质；
-使用洗脱缓冲液从所述层析基质洗脱所述粗制蛋白质洗脱液或所述蛋白质洗脱物，
其中每种缓冲液都包含Bis Tris。
6.项1至5任一项的方法，其中每种缓冲液都由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
7.项1至6任一项的方法，其中所述方法包含步骤：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过第一层析基质；
(ii)使所述溶液通过所述第一层析基质；
(iii)使平衡缓冲液通过所述第一层析基质；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述第一层析基质；
(v)使平衡缓冲液通过所述第一层析基质；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述第一层析基质洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过第二层析基质；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述第二层析基质；
(iii)使平衡缓冲液通过所述第二层析基质；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述第二层析基质洗脱蛋白质洗脱物；和
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过第三层析基质；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述第三层析基质；
(iii)任选地使洗涤缓冲液通过所述第三层析基质；和
(iv)从所述第三层析基质的流过液回收纯化蛋白质。
8.项1至7任一项的方法，其中所述第一、第二和第三层析基质是层析柱。
9.项1至7任一项的方法，其中所述第一、第二和第三层析基质是层析膜吸附剂。
10.项1至9任一项的方法，其中所述第一层析基质是亲和层析基质。
11.项10的方法，其中所述亲和层析基质是蛋白质A基质。
12.项1至11任一项的方法，其中所述第二层析基质是多模式树脂层析基质或阳离子交换层析基质。
13.项1至12任一项的方法，其中所述第三层析基质是阴离子交换层析基质。
14.项1至13任一项的方法，其中所述蛋白质是单克隆抗体。
15.项14的方法，其中所述单克隆抗体选自下组：特异性结合至人β淀粉样蛋白的原纤维体形式的抗体、特异性结合至细菌表面多糖聚N乙酰基葡糖胺(PNAG)的抗体、特异性结合至癌胚抗原相关细胞粘附分子5(CEACAM5)的抗体和特异性结合至CD38跨膜糖蛋白的抗体。
16.项1至15任一项的方法，其进一步在步骤(c)之后包含纳米过滤步骤。
17.项16的方法，其进一步在纳米过滤步骤之后包含超滤和渗滤步骤。
18.项1至17任一项的方法，其中所述第一洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于3到4之间。
19.项1至8或10至18任一项的方法，其中所述第二洗脱缓冲液包含15mM-25mM BisTris、40mM-50mM NaCl和20mM-30mM NH4Cl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间。
20.项1至7或9至18任一项的方法，其中所述第二洗脱缓冲液包含15mM-25mM BisTris、50mM-150mM NaCl和20mM-30mM NH4Cl，其使用乙酸调节至pH介于6到7之间。
21.项5至20任一项的方法，其中所述平衡缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间。
22.项5至21任一项的方法，其中所述洗涤缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和0.9M-1.1M NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间。
23.项1至22任一项的方法，其中以至少95％的产率回收所述纯化蛋白质。
24.项1至23任一项的方法，其中所述回收的纯化蛋白展示至少99％的纯度。
25.项1至24任一项的方法，其进一步包含将所述回收的纯化蛋白质配制成药物组合物的步骤。
26.一种以连续模式从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；
(ii)使所述溶液通过所述蛋白质A柱；
(iii)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A柱；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述蛋白质A柱；
(v)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A柱；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述蛋白质A柱洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过多模式树脂层析柱；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述多模式树脂层析柱；
(iii)使平衡缓冲液通过所述多模式树脂层析柱；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述多模式树脂层析柱洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换层析柱；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述阴离子交换层析柱；和
(iii)从所述阴离子交换层析柱的流过液回收纯化蛋白质，
其中所述缓冲液中的每一种由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
27.一种以连续模式从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；
(ii)使一部分所述溶液通过所述蛋白质A柱；
(iii)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A柱；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述蛋白质A柱；
(v)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A柱；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述蛋白质A柱洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过多模式树脂层析柱；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述多模式树脂层析柱；
(iii)使平衡缓冲液通过所述多模式树脂层析柱；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述多模式树脂层析柱洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换层析柱；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述阴离子交换层析柱；和
(iii)从所述阴离子交换层析柱的流过液回收纯化蛋白质，
(d)使用另一部分所述溶液连续重新开始步骤a)、b)和c)直至使用所有所述溶液，和
(e)收集在每一第三层析步骤结束时回收的所述纯化蛋白质；
其中所述缓冲液中的每一种由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
28.一种以连续模式从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(ii)使所述溶液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(v)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述蛋白质A膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阳离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述阳离子交换膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过所述阳离子交换膜吸附剂；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述阳离子交换膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述阴离子交换膜吸附剂；和
(iii)从所述阴离子交换膜吸附剂的流过液回收纯化蛋白质，
其中所述缓冲液的每一种由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
29.一种以连续模式从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(ii)使一部分所述溶液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(v)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述蛋白质A膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阳离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述阳离子交换膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过所述阳离子交换膜吸附剂；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述阳离子交换膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述阴离子交换膜吸附剂；和
(iii)从所述阴离子交换膜吸附剂的流过液回收纯化蛋白质，
(d)使用另一部分所述溶液连续重新开始步骤a)、b)和c)直至使用所有所述溶液，和
(e)收集在每一第三层析步骤结束时回收的所述纯化蛋白质；
其中所述缓冲液中的每一种由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
30.项26或27的方法，其中：
-所述平衡缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，
-所述洗涤缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和0.9M-1.1M NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，
-所述第一洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于3到4之间，且
-所述第二洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris、40mM-50mM NaCl和20mM-30mMNH4Cl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间。
31.项28或29的方法，其中：
-所述平衡缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，
-所述洗涤缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和0.9M-1.1M NaCl，其使用乙酸调节至pH介于7到8之间，
-所述第一洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris和15mM-25mM NaCl，其使用乙酸调节至pH介于3到4之间，且
-所述第二洗脱缓冲液包含15mM-25mM Bis Tris、50mM-150mM NaCl和20mM-30mMNH4Cl，其使用乙酸调节至pH介于6到7之间。
32.项26至31任一项的方法，其中在闭合系统中从所述第一步骤至所述最后步骤运行所述方法。

Claims (10)

1.一种从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
-使所述溶液通过第一层析基质；
-使用第一洗脱缓冲液从所述第一层析基质洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
-使在步骤(a)结束时获得的所述粗制蛋白质洗脱液通过第二层析基质；
-使用第二洗脱缓冲液从所述第二层析基质洗脱的蛋白质洗脱物；和
(c)第三层析步骤，包含：
-使在步骤(b)结束时获得的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析基质；
-从所述第三层析基质的流过液回收纯化的蛋白质；
其中各所述缓冲液都包含Bis Tris。
2.权利要求1的方法，其中使在步骤(a)结束时获得的所述粗制蛋白质洗脱液不经历如pH调节、缓冲液交换或稀释的任何处理而直接通过第二层析基质。
3.权利要求1或2的方法，其中使在步骤(b)结束时获得的所述蛋白质洗脱物不经历如pH调节、缓冲液交换或稀释的任何处理而直接通过第三层析基质。
4.权利要求1至3任一项的方法，其中在闭合系统中从第一步骤至最后步骤运行所述方法。
5.权利要求1至4任一项的方法，其中所述两个第一层析步骤中的每一步包含：
-使平衡缓冲液通过所述层析基质；
-使所述溶液或粗制蛋白质洗脱液通过所述层析基质；
-使平衡缓冲液通过所述层析基质；
-任选地使洗涤缓冲液通过所述层析基质；
-任选地使平衡缓冲液通过所述层析基质；
-使用洗脱缓冲液从所述层析基质洗脱所述粗制蛋白质洗脱液或所述蛋白质洗脱物，
其中每种缓冲液都包含Bis Tris。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中每种缓冲液都由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
7.一种以连续模式从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；
(ii)使所述溶液通过所述蛋白质A柱；
(iii)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A柱；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述蛋白质A柱；
(v)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A柱；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述蛋白质A柱洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过多模式树脂层析柱；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述多模式树脂层析柱；
(iii)使平衡缓冲液通过所述多模式树脂层析柱；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述多模式树脂层析柱洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换层析柱；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述阴离子交换层析柱；和
(iii)从所述阴离子交换层析柱的流过液回收纯化蛋白质，
其中所述缓冲液中的每一种由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
8.一种以连续模式从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A柱；
(ii)使一部分所述溶液通过所述蛋白质A柱；
(iii)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A柱；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述蛋白质A柱；
(v)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A柱；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述蛋白质A柱洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过多模式树脂层析柱；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述多模式树脂层析柱；
(iii)使平衡缓冲液通过所述多模式树脂层析柱；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述多模式树脂层析柱洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换层析柱；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述阴离子交换层析柱；和
(iii)从所述阴离子交换层析柱的流过液回收纯化蛋白质，
(d)使用另一部分所述溶液连续重新开始步骤a)、b)和c)直至使用所有所述溶液，和
(e)收集在每一第三层析步骤结束时回收的所述纯化蛋白质；
其中所述缓冲液中的每一种由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
9.一种以连续模式从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(ii)使所述溶液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(v)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述蛋白质A膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阳离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述阳离子交换膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过所述阳离子交换膜吸附剂；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述阳离子交换膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述阴离子交换膜吸附剂；和
(iii)从所述阴离子交换膜吸附剂的流过液回收纯化蛋白质，
其中所述缓冲液的每一种由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
10.一种以连续模式从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：
(a)第一层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过蛋白质A膜吸附剂；
(ii)使一部分所述溶液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(iv)使洗涤缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；
(v)使平衡缓冲液通过所述蛋白质A膜吸附剂；和
(vi)使用第一洗脱缓冲液从所述蛋白质A膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；
(b)第二层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阳离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(a)的所述粗制蛋白质洗脱液通过所述阳离子交换膜吸附剂；
(iii)使平衡缓冲液通过所述阳离子交换膜吸附剂；和
(iv)使用第二洗脱缓冲液从所述阳离子交换膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；
(c)第三层析步骤，包含：
(i)使平衡缓冲液通过阴离子交换膜吸附剂；
(ii)使来自步骤(b)的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过所述阴离子交换膜吸附剂；和
(iii)从所述阴离子交换膜吸附剂的流过液回收纯化蛋白质，
(d)使用另一部分所述溶液连续重新开始步骤a)、b)和c)直至使用所有所述溶液，和
(e)收集在每一第三层析步骤结束时回收的所述纯化蛋白质；
其中所述缓冲液中的每一种由Bis Tris、乙酸、NaCl、水和任选地NH4Cl组成。
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