CN105555795A - 新抗体纯化方法和由该方法得到的抗体、以及使用了阳离子交换基团的新抗体纯化法和由该方法得到的抗体 - Google Patents

新抗体纯化方法和由该方法得到的抗体、以及使用了阳离子交换基团的新抗体纯化法和由该方法得到的抗体 Download PDF

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Abstract

本发明(第一方式)是一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，其特征在于，使用具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体的载体1与具有阳离子交换基团的载体2制成连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱；本发明(第二方式)是具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于具有pKa为4.0以上的含有羧基的配体的阳离子交换基团的载体，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。

Description

新抗体纯化方法和由该方法得到的抗体、以及使用了阳离子交换基团的新抗体纯化法和由该方法得到的抗体
技术领域
本发明(第一方式)是将具有用于特异性纯化靶分子(例如，抗体或源自抗体的物质。以下有时将它们总称为抗体等)的亲和配体的载体和具有阳离子交换基团的载体作为整体来使用而对抗体等进行纯化的方法，本发明涉及在一个色谱步骤中实施亲和色谱纯化和阳离子交换色谱纯化的新抗体纯化方法及由该方法得到的抗体。
另外，本发明(第二方式)是使用了阳离子交换基团(以下也称为具有阳离子交换基团的载体、阳离子交换载体)的抗体等(抗体或源自抗体的物质)的新纯化法，本发明涉及pH4.0以下的抗体等的纯化方法及由该方法得到的抗体，但作为以羧基为配体的阳离子交换载体的使用pH，通常不会选择pH4.0以下。
背景技术
作为以抗体为主药的抗体医药品的主要成分的单克隆抗体，主要使用哺乳类培养细胞等以重组蛋白质的形式在培养液中表达，通过多步色谱、膜工序纯化至高纯度，然后进行制剂。抗体医药品为免疫球蛋白G及其类似物，一般而言除了称为抗体的分子以外，还含有由作为免疫球蛋白分子的恒定区的Fc区与其它功能性蛋白质或肽融合而成的Fc融合蛋白质(含有Fc的分子)。而且还包含Fab、scFv、以及双抗体(diabody)等低分子化抗体。另外，这些抗体医药品还包含以微生物为宿主，在其培养上清液中分泌表达的医药品、在菌体内或菌体外壁和菌体细胞膜之间蓄积表达、纯化、制剂化的医药品。
该培养、纯化、制剂化的工序中所形成或残留的凝聚体(二聚体以上的多聚体)成为副作用的主要原因，因此，降低其含量成为抗体医药品生产的重要课题。在此，所谓单体，例如在抗体的情况下，将四聚体结构的抗体定义为1个分子单位，所述四聚体结构的抗体具有下述构成：由作为恒定区的Fc区和可变区构成的重链(H链)2分子以及由可变区域构成的轻链(L链)2分子构成。该单位分子的多聚体形成凝聚体，成为抗体医药品的副作用的主要原因。
在培养、纯化、制剂化的工序中通过使用复杂的管理方法及添加剂来尝试了对抑制凝聚体的生成及其除去进行控制。特别是在纯化工序中，除了抑制凝聚体的生成以外，将其除去也很重要。因此，在纯化工序中，要求开发一种简便且有效的凝聚体除去技术。
抗体医药品的纯化工序中，利用特定单元操作的组合进行的纯化方法的模板化(平台化)不断发展，在其初期纯化工序(回收工序)中，广泛利用将作为配体的蛋白质A固定化于水不溶性载体而成的抗体亲和分离基质(蛋白质A载体)。一般而言，使用在中性条件下使抗体吸附于蛋白质A载体，并在酸性条件下洗脱抗体的方法，但通常通过3步色谱纯化而使其高纯度化，在蛋白质A色谱工序的后段，可以通过离子交换色谱、疏水性相互作用色谱等的组合来除去凝聚体等杂质(非专利文献1、非专利文献2、非专利文献3、专利文献5)。
亲和配体具有与特定分子特异性结合的功能，将该配体固定化于水不溶性载体而形成的亲和分离基质(也称为亲和色谱载体、亲和载体)用于从含有生物体成分、重组体的微生物和哺乳类培养细胞中有效地分离纯化有用物质。作为实际工业上利用的抗体亲和配体，例如可以举出：由蛋白质A、蛋白G、蛋白L等源自微生物或使它们重组表达而得到的功能性修饰体(类似物)构成的肽性或蛋白质性配体、骆驼单链抗体(ラクダー一本鎖)或抗体的Fc受体等重组蛋白质性配体、及噻唑衍生物等化学合成性配体，可以用于抗体医药品等的纯化。抗体医药品相对于化学药品显示更低的毒性且显示更高的特异性，因此，作为理想的医药品，其需求不断增高。
对于利用亲和载体的分离纯化而言，其课题在于抗体的凝聚体、源自宿主的杂质、抗体的分解物等(以下称为凝聚体等)的除去。
例如，作为亲和载体的一个例子，在蛋白质A色谱工序中，通常进行酸性洗脱，但是由于各种抗体的洗脱pH不同需要时间进行工艺设计，另外洗脱pH越低，形成凝聚体的风险越高，因此，对蛋白质A配体进行了施加蛋白质工程学修饰的尝试，使得需要pH3左右的较低pH洗脱的抗体也能够在pH3.5～4左右洗脱(专利文献1)。
另外，蛋白质A色谱工序后凝聚体含量较多的情况下，在后段的杂质除去工序中会导致目标单体(monomer)的收率降低，因此，除了尝试抑制蛋白质A色谱工序中的凝聚体形成以外，还进一步尝试了除去该色谱工序中的凝聚体。
另外，在蛋白质A色谱工序的使用中对降低凝聚体等杂质进行了尝试。即，提出了一种洗脱时的pH或离子强度的优化、以及划分洗脱峰的前半部分和后半部分等的方法。具体而言，是利用由于作为蛋白质A载体的特性，多聚体化而成的抗体分子以比未多聚体化的抗体分子有更高的概率与蛋白质A配体接触，因此，解离常数稍微变低，且基于微调疏水性的分离机制的方法(专利文献2、专利文献3、专利文献4)。但是，这些方法难以进行严密的控制，而且分离性能较低，无法作为通常的分离方法使用，需要在后段工序中进行杂质除去。
蛋白质A色谱所代表的亲和色谱在酸性pH下实施洗脱，但后段的离子交换色谱、疏水性相互作用色谱等通常在pH5以上的pH下进行处理，因此需要调节pH、离子强度。
另一方面，阳离子交换载体通常在比其配体的pKa更高的pH下使用。另外，对于使用阳离子交换载体进行纯化的靶蛋白质，在比蛋白质的等电点(pI)更低的pH下进行吸附洗脱。例如，在pI为8的抗体的纯化中，以pKa为2左右的磺酸基、pKa为3～5左右的羧基作为配体的阳离子交换载体使用pH5～6的缓冲液实施吸附洗脱而进行纯化。缓冲液的pH可以设定为配体的pKa与靶蛋白质的pI之间，但使用pH越低于pI，蛋白质的正电荷越多，洗脱离子强度需要设定得越高，存在回收率降低的倾向。在洗脱液的离子强度较高时，存在必须在后段的工艺构建中降低离子强度等的限制。另外，在使用pH接近或低于阳离子交换配体的pKa的情况下，配体的负电荷会质子化，导致结合容量降低，通常不选择该情况。因此，在使用阳离子交换载体的抗体的纯化中，可以对pKa2～5的阳离子交换载体使用pH5～6的缓冲液。
在亲和色谱工序之后使用阴离子交换色谱工序、疏水性相互作用色谱工序的情况下(专利文献8)、在阳离子交换色谱工序之后进行阴离子交换色谱工序的情况下(专利文献7)或在阳离子交换色谱工序中回收多种目标物质的情况下(专利文献6)，均同样地需要对pH、离子强度进行调整。
对于如上所述对抗体等进行亲和色谱纯化、并在后段的工艺中进行高度纯化而言，需要调整酸性pH洗脱液的pH、离子强度，连续的初期色谱在提高效率上受到限制。而且，在进行未采用亲和色谱纯化方法的离子交换色谱工序和疏水性电荷诱导色谱工序时，需要独立地进行各个工序，无法连续地纯化抗体等，在希望提高效率方面存在限制(专利文献9)。
另外，抗体亲和分离基质对抗体显示出较高的特异性而能够高纯度化，但是，即使严格地设定使用方法，单体(monomer)与凝聚体等的分离性能也较低，因此作为凝聚体等的除去工序而言存在限制。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4391830号公报
专利文献2：WO2008/085988
专利文献3：日本特表2010-507583号公报
专利文献4：WO2010/019493
专利文献5：WO2010/141039
专利文献6：日本特开平05-202098号公报
专利文献7：日本特开平06-228200号公报
专利文献8：日本特表2010-510963号公报
专利文献9：日本特表2008-535913号公报
非专利文献
非专利文献1：HoberS.等著、“J.Chromatogr.B”、2007年、848卷、40-47页
非专利文献2：LowD.等著、“J.Chromatogr.B”、2007年、848卷、48-63页
非专利文献3：RoqueA.C.A.等著、“J.Chromatogr.A”、2007年、1160卷、44-55页
发明的内容
发明要解决的课题
本发明(第一方式)的目的在于提供一种新抗体纯化方法，该方法能够在抗体或含Fc分子或Fab、scFv等低分子化抗体等源自抗体的物质的纯化工序的第一色谱工序中使作为亲和纯化的主要目标的抗体自身高纯度化，而且可以提高单体的选择性分离特性，对于凝聚体等的除去而言，能够降低对后段的杂质除去工序的负荷或省略后段的杂质除去工序。
本发明(第二方式)的目的在于提供一种抗体纯化方法，该方法是在抗体等的纯化中，作为回收色谱工序在后段的工艺中对亲和色谱纯化物高纯度地进行纯化时需要的抗体纯化方法，该方法不需要调整酸性pH洗脱液的pH、离子强度而能提高效率。
解决课题的方法
本发明人对上述课题进行了深入研究，结果发现了如下新分离方法，该方法将具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体的载体和具有阳离子交换基团的载体两者填充于同一柱内或连结柱内，同时实施两种色谱，由此，能够兼具特异性吸附性能与优异的凝聚体等除去性能，从而完成了本发明(第一方式)。
另外，本发明者对上述课题进行了深入研究，结果发现了如下阳离子交换载体的新分离方法，该方法包括：在洗脱抗体亲和载体的酸性pH下进行抗体等对阳离子交换载体的吸附洗脱，得到抗体的降低了凝聚体等杂质的级分，从而完成了本发明(第二方式)。
即，本发明(第一方式)的主旨如下：
[1]一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法包括：使用载体1和载体2制成连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱，所述载体1具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团。
[2]一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法是使用了载体1和载体2的抗体或源自抗体的物质的纯化方法，所述载体1具有对所述抗体或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团，
该方法包括：使含有抗体或源自抗体的物质的液体通过一体型柱或混合型柱而将抗体或源自抗体的物质载样于柱中，所述一体型柱在填充有所述载体1的柱的下游侧直接连结了填充有所述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两者的混合物，
接着，通过使洗脱液通过而对载样后的抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[3]根据[1]或[2]所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度梯度进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[4]根据[1]或[2]所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度逐级进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[5]根据[2]～[4]中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液。
[6]根据[2]～[4]中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更高的离子强度，且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液的清洗液。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是以蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似物作为配体的载体。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是以蛋白质A或其类似物作为配体的载体。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为Fab、scFv、双抗体、或含有抗原结合部位的分子。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载体2是以羧基为配体的载体。
[12]根据[11]所述的纯化方法，其中，所述羧基源自酸性氨基酸。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质的洗脱pH小于5.0。
[14]根据[1]～[13]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC为1mg/mL以上且100mg/mL以下。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2的离子交换容量为0.001mmol/mL以上且0.5mmol/mL以下。
[16]根据[1]～[15]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1的体积平均粒径为1μm以上且1000μm以下，所述载体2的体积平均粒径为1μm以上且1000μm以下。
[17]根据[1]～[16]中任一项所述的纯化方法，其中，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于载体2，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有pKa为4.0以上且含有羧基的配体。
[18]根据[1]～[17]中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC为1mg/mL以上且200mg/mL以下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有含有羧基的配体。
[19]根据[2]～[18]中任一项所述的纯化方法，其中，在填充有所述具有阳离子交换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[20]根据[2]～[19]中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述一体型柱的载体1与载体2的比例以体积标准计为1/20以上且20/1以下。
[21]根据[2]～[18]中任一项所述的纯化方法，其中，制作以混合状态具有所述具有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[22]根据[2]～[18]、[21]中任一项所述的纯化方法，其中，所述构成混合型柱的载体1与载体2的比例以体积标准计为1/20以上且20/1以下。
[23]根据[1]～[22]中任一项所述的纯化方法，其中，在吸附条件下，相对于载体1对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC，载体2对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC为1/10倍以上且10倍以下。
[24]一种抗体或源自抗体的物质，其是用[1]～[23]中任一项所述的纯化方法进行纯化而得到的。
本发明(第二方式)的主旨如下：
[1]一种具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括：将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于载体2中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有pKa为4.0以上且含有羧基的配体。
[2]根据[1]所述的使用方法，其中，所述含有羧基的配体源自酸性氨基酸。
[3]根据[1]或[2]所述的使用方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC为1mg/mL以上且200mg/mL以下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有含有羧基的配体。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载体2的离子交换容量为0.001mmol/mL以上且0.5mmol/mL以下。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载体2的体积平均粒径为1μm以上且1000μm以下。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的使用方法，其中，在填充有所述具有阳离子交换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[7]根据[1]～[5]中任一项所述的使用方法，其中，制作以混合状态具有所述具有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
[8]根据[6]或[7]所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液。
[9]根据[6]或[7]所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更高的离子强度，且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液的清洗液。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的使用方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含Fc分子、或者Fab、scFv、双抗体或含有抗原结合部位的分子。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度梯度进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[12]根据[1]～[10]中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度逐级进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
[13]一种抗体或源自抗体的物质，其是用[1]～[12]中任一项所述的使用方法进行纯化而得到的。
发明的效果
根据本发明(第一方式)，能够在作为抗体或含Fc分子或Fab、scFv等低分子化抗体等源自抗体的物质的纯化工序的第一工序的亲和色谱工序中，使作为亲和纯化的主要目标的抗体自身高纯度化，而且可以提高单体的选择性分离特性，能够减轻对后段的杂质除去工序的负荷。
根据本发明(第二方式)，在作为抗体等的纯化工序的第一工序的亲和色谱工序之后，能够直接用阳离子交换色谱处理其洗脱液，另外，能够在与亲和载体的酸性洗脱pH相同的pH下进行抗体等对阳离子交换载体的吸附洗脱，因此，能够通过亲和色谱纯化与阳离子交换色谱纯化整体处理来有效地构建工艺。另外，根据本发明(第二方式)，能够以较高的含量(纯度)得到纯化后的单体抗体。需要说明说的是，在以下的附图的简单说明中，第一方式参照图1～10、12～16，第二方式参照图1～16。
附图说明
图1是示出按照蛋白质A亲和色谱工序、病毒失活工序、及阳离子交换色谱工序的顺序进行的现有流程的图。
图2是示出本发明的一个例子的流程图，是示出了在同时进行蛋白质A亲和色谱工序及阳离子交换色谱工序之后进行病毒失活工序的流程的图。
图3是示出pH3.7、pH4.2、pH4.7时的具有各阳离子交换基团的载体的10％漏出DBC的图。
图4是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体A)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积比率(％)、右纵轴表示离子强度(mM))。
图5是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体B)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积比率(％)、右纵轴表示离子强度(mM))。
图6是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体C)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积比率(％)、右纵轴表示离子强度(mM))。
图7是示出使用了填充有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体D)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积比率(％)、右纵轴表示离子强度(mM))。
图8是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱、且抗体载样量为10mg时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
图9是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱、且抗体载样量为30mg时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
图10是示出使用填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱、且抗体载样量为40mg时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
图11是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱的正下方连结有具有阳离子交换基团的载体(SP-SepharoseFastFlow、阳离子交换载体A)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
图12是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱的正下方连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体A)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
图13是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱的正下方连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体B)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
图14是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱的正下方连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体C)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
图15是示出在填充了具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)的柱的正下方连结有具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体D)的柱时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
图16是示出将具有蛋白质A亲和配体的载体(蛋白质A载体)与具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体D)混合于同一柱中时的单体抗体(空白)和凝聚体抗体(斜线)的洗脱的图(横轴表示洗脱体积(mL)、左纵轴表示峰面积值、右纵轴表示离子强度(mM))。
具体实施方式
本发明(第一方式)的抗体等(抗体或源自抗体的物质)的新纯化方法的特征在于，将具有对抗体等的亲和配体的载体与具有阳离子交换基团的载体制成连结柱或混合柱，整体地对抗体等进行附和洗脱(在本发明(第一方式)中，连结柱、混合柱有时分别称为一体型柱、混合型柱，“吸附”有时指“载样”。)。
例如，本发明(第一方式)的纯化方法是使用了具有对上述抗体等的亲和配体的载体1和具有阳离子交换基团的载体2的抗体等的纯化方法，其特征在于，使含有抗体等的液体通过一体型柱或混合型柱而将抗体等载样于柱中，所述一体型柱在填充有上述载体1的柱的下游侧直接连结了填充有上述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两者的混合物，接着，使洗脱液通过而对载样后的抗体等进行洗脱。需要说明的是，在本发明(第一方式)中，具有亲和配体的载体1优选不含有阳离子交换基团，具有阳离子交换基团的载体2优选不含有亲和配体。
本发明(第二方式)的特征在于，在从亲和载体上洗脱靶分子(抗体等)的酸性洗脱pH下进行从阳离子交换载体上对抗体等的分离，或者，将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱，整体地对抗体等进行吸附和洗脱(在本发明中，连结柱、混合柱有时分别称为一体型柱、混合型柱，“吸附”有时指“载样”。)。即，本发明(第二方式)的具有阳离子交换基团的载体的使用方法的特征在于，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于具有阳离子交换基团的载体上，所述阳离子交换基团具有pKa4.0以上的含有羧基的配体，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。需要说明的是，在本发明(第二方式)中，具有亲和配体的载体1优选不含有阳离子交换基团，具有阳离子交换基团的载体2优选不含有亲和配体。上述第二方式的特征可以在第一方式中使用，也可以作为第一方式的构成要件。
本发明(第一方式、第二方式)可以通过操作将抗体亲和色谱纯化与阳离子交换色谱纯化制成整体的柱来实施。即，能够通过一个色谱工序(参照图2，本发明(第一方式、第二方式)的纯化流程)来实施两个色谱工序(参照图1，目前的流程)，可以节省工时，不使用各工序所需的溶液，能够提高生产效率。而且，还能够实现抗体单体的高含量(高纯度)。
以下，对本发明(第一方式、第二方式)中的阳离子交换载体和抗体亲和载体与阳离子交换载体的整体色谱化详细地进行说明。
具有亲和配体的载体(亲和载体)
本发明(第一方式、第二方式)中的“具有亲和配体的载体”(以下有时也称为具有亲和配体的载体1、亲和载体或亲和载体1)是指以如下所述物质作为配体固定于水不溶性载体所形成的载体，所述物质能基于以抗原与抗体的结合为代表的特异性分子间亲和力而从某个分子集合中选择性地捕捉(结合)目标(目的)分子。
可以用于本发明(第一方式、第二方式)的亲和配体只要具有能与作为靶分子的抗体等特异性结合的特征即可，没有特别限定，优选为肽性配体、蛋白质性配体、或化学合成性配体(合成化合物)。从对靶分子的特异性的观点考虑，更优选为肽性配体或蛋白质性配体，其中，对抗体等的亲和配体特别优选为蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L、蛋白质H、蛋白质D、蛋白质Arp、蛋白质FcγR、抗体结合性合成肽配体及它们的类似物。在第一和第二方式中，特别在第一方式中，作为上述亲和配体，更优选为蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似物，最优选为蛋白质A或其类似物。
在第一方式、第二方式中，上述亲和配体只要具有靶分子结合结构域(单体肽或蛋白质、单结构域)即可，没有特别限制，优选2个以上的结构域连结而成的多聚体肽或蛋白质(多结构域)，更优选2～10个，更优选2～8个，进一步优选2～6个结构域连结而成的多聚体蛋白质。这些多聚体蛋白质也可以是作为单一靶分子结合结构域的连结体的同源二聚体、同源三聚体等均聚物，如果靶分子相同，则也可以是作为多种靶分子结合结构域的连结体的异源二聚体、异源三聚体等杂聚物。
作为连结本发明(第一方式、第二方式)的上述亲和配体的靶分子结合结构域的方法，优选使多聚体蛋白质的三维立体结构稳定的方法，例如可以举出：经由结构域序列的末端氨基酸的连结方法、不经由结构域序列的氨基酸残基而进行连结的方法、或用1个或多个结构域序列以外的氨基酸残基进行连结的方法，并不限定于这些方法。
作为本发明(第一方式、第二方式)的上述抗体亲和配体，可以优选使用将多聚体蛋白质作为1个构成成分且与功能不同的其它蛋白质融合而成的融合蛋白质。作为融合蛋白质，可以举出：融合了白蛋白、GST(谷胱甘肽S-转移酶)的蛋白质、融合了DNA适体等核酸、抗生素等药物、PEG(聚乙二醇)等高分子的蛋白质等，但并不限定于这些蛋白质。
在第一方式中，亲和载体1对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC通常优选为1mg/mL以上且100mg/mL以下，更优选为10mg/mL以上，进一步优选为15mg/mL以上，更进一步优选为20mg/mL以上，特别优选为30mg/mL以上。
上述10％DBC例如可以通过下式求出。
DBC10％＝(V10％-Vd)C0/Vc(式中，V10％为IgG漏出10％时的溶液体积、Vd为管路内体积(例如，包括从注射至柱入口的管路内体积和从柱出口至检测器的管路内体积)、C0为载样液的抗体浓度(mg/mL)、Vc为柱体积)。在测定DBC10％时，优选在给定的流速、即给定的保留时间(例如1分钟～10分钟，优选3～6分钟)下进行。
在第一方式、第二方式中，上述亲和载体的体积平均粒径为例如1μm以上且1000μm以下，优选为5μm以上且500μm以下，更优选为10μm以上且200μm以下，进一步优选为150μm以下，更进一步优选为120μm以下，特别优选为100μm以下。
具有阳离子交换基团的载体(阳离子交换载体)
本发明(第一方式、第二方式)中的“具有阳离子交换基团的载体”(以下，也称为具有阳离子交换基团的载体2、阳离子交换载体或阳离子交换载体2)只要将如下所述阳离子交换基团固定于水不溶性载体上即可，所述阳离子交换基团能够在将作为靶分子的抗体等从抗体亲和配体中洗脱(溶出)的条件下作为阳离子交换基团发挥作用而捕捉靶分子，同时能够通过钠离子、钾离子等抗衡离子按照该靶分子的单体(monomer)、凝聚体的顺序离子强度依赖性地洗脱(溶出)。在从亲和配体中洗脱靶分子的pH的酸性pH范围内，为了以80％以上的回收率回收靶分子，作为阳离子交换基团，优选利用以弱酸性基团的羧基作为配体的阳离子交换基团(含有羧基的配体)。另外，上述含有羧基的配体可以源自酸性氨基酸，更优选源自谷氨酸。通常，从亲和载体中的洗脱使用pH4.0以下的酸性pH，因此，为了在该pH下得到较高的回收率，作为本发明(第一方式、第二方式)的阳离子交换配体的含有羧基的配体的pKa为4.0以上。上述含有羧基的配体的pKa优选为4.05以上且6.5以下，更优选为4.10以上且6.45以下。pKa较低时，存在抗体收率降低的隐患。
对于第一方式而言，在其优选的方式中，优选阳离子交换基团为羧基、磺酸基等。其中，优选为羧基，更优选为pKa为4.0以上的羧基。另外，上述羧基可以源自酸性氨基酸，更优选源自谷氨酸。另外，在从亲和配体中洗脱靶分子的pH范围中，优选避免形成局部酸性环境，优选为弱酸性基团。例如，在使用以蛋白质A作为亲和配体的载体时，作为阳离子交换基团，优选利用以羧基为配体的阳离子交换基团。
在第一方式中，上述阳离子交换基团的pKa优选为3.5以上且6.5以下，更优选为4.0以上且6.0以下，进一步优选为4.1以上且5.5以下。pKa较低时，存在抗体收率降低的隐患。
在本发明(第一方式、第二方式)中，在将具有阳离子交换基团的载体和亲和载体用于连结型柱或混合型柱的情况下，阳离子交换基团的pKa与洗脱pH优选满足阳离子交换基团pKa≥洗脱pH的关系，更优选满足阳离子交换基团pKa＞洗脱pH的关系。
以往在单独使用具有阳离子交换基团的载体时，在阳离子交换基团pKa＜洗脱pH的条件下进行，而本发明中发现了用于组合使用具有阳离子交换基团的载体和亲和载体的优选条件。可以认为，只要满足上述关系，则在洗脱时相对于靶蛋白质(抗体等)的电荷带有较多正电，能够相对地抑制阳离子交换基团的配体从负电转变为正电，因此能够回收进一步带有正电荷的凝聚抗体等，使抗体单体的纯化变得容易。
在第一方式、第二方式中，上述阳离子交换载体的体积平均粒径为例如1μm以上且1000μm以下，优选为5μm以上且500μm以下，更优选为10μm以上且200μm以下，进一步优选为150μm以下，更进一步优选为120μm以下，特别优选为100μm以下。
在第一方式、第二方式中，上述阳离子交换载体的离子交换容量优选为0.001mmol/mL以上且0.5mmol/mL以下。
在第一方式、第二方式中，上述含有具有包含羧基的配体的阳离子交换基团的载体(上述阳离子交换载体2)对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC优选为1mg/mL以上且200mg/mL以下，更优选为10mg/mL以上，进一步优选为15mg/mL以上，更进一步优选为20mg/mL以上，特别优选为30mg/mL以上。需要说明的是，上述10％DBC例如可以通过下式来求出。
DBC10％＝(V10％-Vd)C0/Vc(式中，V10％为IgG漏出10％时的溶液体积、Vd为管路内体积(例如，包括从注射至柱入口的管路内体积和从柱出口至检测器的管路内体积)、C0为载样液的抗体浓度(mg/mL)、Vc为柱体积)。在测定DBC10％时，优选在给定的流速、即给定的保留时间(例如1分钟～10分钟，优选3～6分钟)、给定pH(例如3～5，特别是4)下进行。
水不溶性载体(载体)
可以用于本发明(第一方式、第二方式)的“水不溶性载体”为不溶于水的基材，只要能够将抗体亲和配体与阳离子交换基团固定化即可，没有特别限制，例如可以举出：玻璃珠、硅胶等无机载体，由交联聚乙烯醇、交联聚丙烯酸酯、交联聚丙烯酰胺、交联聚苯乙烯等合成高分子、结晶性纤维素、交联纤维素、交联琼脂糖、交联葡聚糖等多糖类构成的有机载体，以及由它们的组合得到的有机-有机、有机-无机等复合载体等。作为市售品，可以例示出：作为多孔质纤维素凝胶的GCL2000、将烯丙基葡聚糖与亚甲基双丙烯酰胺以共价键交联而成的SephacrylS-1000、作为丙烯酸酯类载体的TOYOPEARL、作为琼脂糖类交联载体的SepharoseCL4B、RapidRunAgaroseBeads、及作为纤维素类交联载体的Cellufine等。
另外，用于本发明(第一方式、第二方式)的水不溶性载体从每单位时间的处理容量的观点考虑，希望其表面积较大，优选为具有多个适当大小的细孔的多孔质。作为载体的形态，可以为珠状、整体柱状、纤维状、膜状(包含中空纤维)等的任一种，可选择任意的形态。为了使配置在水不溶性载体上的抗体亲和配体与阳离子交换基发挥协同作用，其物理距离接近，能得到一定的保留时间，这样可以有效地发挥该分离基质的功能，从该方面考虑，优选多孔质珠。在将阳离子交换基团在固定化有抗体亲和配体的载体上进行固定化的情况下，从抗体亲和配体导入的难易度的方面考虑，优选由多糖类构成的、或者用单糖或多糖类进行了修饰的载体。具体而言，优选琼脂糖或纤维素载体，但并不特别限定于此。
在第一方式中，作为将亲和配体固定于水不溶性载体、分离基质的方法，可以使用一般的方法。例如抗体亲和配体的氨基可以经由导入在载体上的甲酰基与载体结合，抗体亲和配体的氨基也可以经由载体上的被活化的羧基与载体结合。
另外，这些水不溶性载体可以在抗体亲和配体导入之前进行活化以使配体能与载体共价键合，也可以使用市售的活化载体，也可以自行进行活化。
在第一方式中，作为通过活化导入水不溶性载体的官能团，只要是能与抗体亲和配体形成共价键的官能团即可，没有特别限定，例如可以举出环氧基(环氧氯丙烷)、溴化氰、N,N-二琥珀酰亚胺基碳酸盐(DSC)等活化的羟基、醛基或活化羧基(例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯、羰基二咪唑(CDI)活化酯)等反应性官能团(“活化基团”)等(HermansonG.T.等著、“ImmobilizedAffinityLigandTechniques，AcademicPress”、1992年、美国专利第5,874,165号、美国专利第3,932,557号、美国专利第4,772,653号、美国专利第4,210,723号、美国专利第5,250,6123号、欧州专利公开第1352957号、WO2004/074471)。其中包含将亲和配体直接共价键合于载体的官能团和使用直链、支链、或环状连接基团(linker)或间隔基团(spacer)的官能团。需要说明的是，在将导入了抗体亲和配体的载体活化时，优选不与抗体亲和配体直接发生反应的活化方法。
在第一方式中，在亲和配体内，将蛋白质性配体固定化于载体的方法可以使用使蛋白质的官能团的一部分与载体的官能团的一部分发生反应的方法，能够用于该反应的蛋白质侧的主要官能团(活性基团)可以举出：N末端氨基酸和赖氨酸(Lys)侧链的氨基、或者半胱氨酸(Cys)侧链的硫醇基、或者C末端氨基酸及谷氨酸(Glu)侧链及天冬氨酸(Asp)侧链的羧基等，但并不限定于这些官能团。
在第一方式中，作为控制配体的取向性并将蛋白质性抗体亲和配体固定化于水不溶性载体的方法，提出了一种利用在C末端具有半胱氨酸的蛋白A的方法(美国专利第6,399,750号、LjungquistC.等著，“Eur.J.Biochem.”，1989年，186卷，557-561页)。
作为利用连接基团的固定化技术，除了确保载体和配体的距离、排除立体位阻而谋求高性能化的方法以外，还可以举出：在连接基团或间隔基团中赋予、形成官能团(例如带电胺)的方法等。一直在对通过在抗体亲和配体固定化时配体有效地聚集于连接基团或间隔基团部分，从而提高固定化收率来提高分离性能进行研究。例如可以举出：向利用作为连接臂的一部分的经NHS活化的羧酸进行衍生物化而成的琼脂糖载体上固定化蛋白质性配体的固定化技术(美国专利第5,260,373号、日本特开2010-133733、日本特开2010-133734)。
另外，也提出了一种除连接基团或间隔基团以外，在载体上利用缔合性基团使抗体亲和配体聚集于载体，然后，缔合性基团和抗体亲和配体之间不形成共价键而在水不溶性载体上将抗体亲和配体分别固定化的方法(日本特开2011-256176)。
在第一方式、第二方式中，作为将阳离子交换基团固定化或导入水不溶性载体的方法，通常可以利用阳离子交换基团的制作中所使用的方法。例如：作为向糖骨架导入羧甲基的方法，有在碱性条件下使一氯乙酸进行反应的方法；作为导入硫酸基的方法，有在碱条件下使硫酸进行反应的方法；但并不限定于这些方法。也可以通过在向水不溶性载体导入与氨基反应的活性基团之后经由氨基酸的氨基将氨基酸固定化来导入羧基。另外，阳离子交换基团可以直接地固定化于水不溶性载体，也可以经由间隔基团、连接基团等进行固定化，所述阳离子交换基团可以使高碘酸钠与水不溶性载体上存在或导入的二醇基反应而使载体活化来导入醛基，添加在同一分子内具有氨基和阳离子交换基团的分子，在亚胺形成后进行还原处理，由此通过还原氨基化法使载体上的醛基和氨基共价键合而导入阳离子交换基团。另外，只要能在将靶分子从亲和载体上洗脱(溶出)的酸性pH条件下作为阳离子交换基团而发挥作用，阳离子交换基团、间隔基团、连接基团还可以含有具有其它功能的官能团，对其分子形状也没有特别限制。从配体溶出时的毒性的观点考虑，氨基酸的羧基导入方法也优选以抗体纯化用分离基质的材料的方式进行。
本发明(第一方式、第二方式)的特征在于，在从亲和载体上进行靶分子的洗脱的酸性洗脱pH下进行从阳离子交换载体上的抗体等的分离，或者使用亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱，整体地进行抗体等的吸附和洗脱。
作为抗体医药品的纯化平台工艺中所利用的第一色谱和第二色谱的代表例子，可以使用例如蛋白质A色谱和阳离子色谱的组合。
在第一方式、第二方式中，第一色谱的蛋白质A色谱的单体与凝聚体的分离性能较低，分离的稳定性也不足，因此，通常选择将作为靶分子的抗体或含Fc分子的变性或凝聚抑制在最小限度、且同时可得到较高回收率的洗脱条件，而凝聚体等的除去由后段工艺来承担。
在第一方式、第二方式中，在选择阳离子交换色谱作为第二色谱的情况下，一般而言以吸附洗脱模式进行凝聚体、其它杂质的除去，但需要将来自蛋白质A载体(以下也称为蛋白质A载体)的洗脱液调整为适于阳离子交换色谱吸附的pH和离子强度。因此，在蛋白质A色谱工序的条件设定之后需要对阳离子交换色谱工序的条件进行设定。因此，存在多种限制因素，而不能说可以进行有效地进行凝聚体等的分离。
另一方面，在使用本发明(第一方式、第二方式)的方法时，使用亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱，整体地进行抗体等的吸附和洗脱，由此能够将两个工序的色谱操作缩短为一个工序，可以期待所使用的缓冲液的种类和使用量的减少、以及操作时间的缩短。
另外，对于本发明(第一方式、第二方式)的新抗体纯化法而言，通过在从亲和配体上洗脱靶分子的狭窄的pH范围内对离子强度等进行设定，能够得到单体含量较高的洗脱级分。特别是在单克隆抗体的纯化中，该洗脱pH大幅偏离靶分子的等电点，因此，每个抗体的洗脱离子强度的幅度没有较大的差异，可期待能够在狭窄的范围内设定各种靶分子的使用条件。进而，在使用修饰蛋白质A配体作为亲和配体的情况下，除了能够进一步狭窄地设定洗脱pH范围以外，还可以通过使用碱CIP(cleaninginplace；原位清洗)进行有效的清洗，因此，从构建稳定的工艺的观点考虑，优选利用修饰蛋白A。
在第一方式、第二方式中，未使用亲和载体而将其它色谱载体用作连结柱或混合柱时，例如，在将离子交换载体与疏水色谱载体连结或混合使用的情况下，即使靶分子为单克隆抗体，除了由于疏水性和等电点的差异等而使各种靶分子的使用条件的设定不同以外，特异性也较低，作为回收工序，可以认为其难以平台化。
在第一方式、第二方式中，亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱在吸附时可以通过抗体亲和配体而发挥较高的特异性，而且通过在亲和配体的洗脱条件范围内设定离子强度，可以容易地设定其使用条件，从该观点考虑，比未使用亲和载体1的其它载体的组合更优异。
虽然公开了在蛋白质A色谱柱中经过吸附/洗脱的抗体全部被阳离子交换色谱柱捕捉之后用pH5.0-9.0的缓冲液进行洗脱，由此取消蛋白质A色谱与阳离子交换色谱之间的收集槽(holdingtank)的方法，但是在使用比从亲和载体中洗脱的pH更高的pH作为从阳离子交换载体中洗脱的pH方面与本发明(第二方式)存在区别。另外，本发明(第一方式、第二方式)可以将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱，作为整体的柱而使用，从以单一的洗脱操作进行洗脱的过程中能够分级靶物质的观点、以及该洗脱pH小于5.0或为4.0以下、直接以亲和载体的洗脱pH进行阳离子交换载体的洗脱的观点考虑，是本质上不同的技述领域(WO2011/017514)。
更具体而言，关于本发明(第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱的使用方法，在中性附近下吸附抗体等靶分子时，优选添加一定浓度以上的阳离子交换基团的抗衡离子来使用，在该条件下，阳离子交换基团的功能不发挥作用，另外，即使发挥作用，也可以通过更高离子强度的清洗来清洗除去源自该阳离子交换基团的非特异性吸附物。另一方面，离子强度不阻碍抗体亲和配体的吸附，能够以较高的特异性吸附目标物质，此外，通过使用高离子强度的清洗液，可有效地清洗除去非特异性地吸附于基材、连接基团、间隔基团、配体及靶分子的分子。
通常，使重组单克隆抗体表达的培养上清液由于具有接近于人等的体液的离子强度，因此，即使直接供于本发明(第一方式、第二方式)的连结柱或混合柱也可保持较高的特异性，此外，还可通过更高离子强度的清洗液进一步减少杂质。优选在从亲和载体上洗脱含有靶分子的组合物之前通过离子强度较低的缓冲液，使得离子交换基团的功能能够发挥，然后与从亲和配体中的低pH洗脱联动地进行阳离子交换基团的依赖离子强度的洗脱。
在本发明(第一方式、第二方式)中，在将填充有亲和载体的柱A与填充有阳离子交换载体的柱B进行连结时，优选在上述柱A的正下方连接上述柱B，连结部分优选在中途未设置分支阀而以直管进行连接，但是作为流路，只要能够直接连结，也可以在中途加入分支阀。
本发明(第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱可以通过亲和配体和阳离子交换基的比率来调节其功能。在亲和载体在中性条件下的靶物质的结合容量大于从亲和载体酸性洗脱的pH下的阳离子交换载体的结合容量时，存在酸性洗脱时即使在低离子强度下靶物质也可以从柱中洗脱的倾向，在亲和载体的结合容量接近或低于阳离子交换载体的结合容量时，为了使低离子强度下从亲和载体洗脱的抗体全部转移到阳离子交换载体上且得到更高的回收率，需要将洗脱离子强度设定得较高。在任一种情况下均可以通过对离子强度和/或pH的调节来控制回收率和其单体比率。
在第一方式、第二方式中，亲和载体的结合容量(例如10％DBC)与阳离子交换载体的结合容量(例如10％DBC)的比率没有特别限制，相对于吸附条件下的亲和载体对IgG的保留时间为6分钟时的结合容量，阳离子交换载体对IgG的保留时间为6分钟时的结合容量优选为10倍以下，更优选为5倍以下。另外，下限优选为1/10倍以上，更优选为1/5倍以上。上述结合容量的比率例如可以是从亲和载体、阳离子交换载体各自的10％DBC值而求得的比率。
在第一方式、第二方式中，构成上述一体型柱或上述混合型柱的亲和载体与阳离子交换载体的比例(亲和载体/阳离子交换载体)以体积标准计优选为1/20以上且20/1以下，更优选为1/5以上且5/1以下。
通过本发明(第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱而纯化的靶分子是抗体等(免疫球蛋白G及其类似物)，一般而言除称为抗体的分子以外，还包括将免疫球蛋白分子的恒定区即Fc区和其它的功能性蛋白质或肽融合而成的Fc融合蛋白质(含Fc分子)、及低分子化抗体，可以用作抗体医药品的原料。具体而言，抗体等优选含有免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含Fc分子、以及Fab、scFv、及双抗体等低分子化抗体。
以下，举例示出靶分子为免疫球蛋白G的情况对本发明(第一方式、第二方式)的以亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱为整体进行抗体等的吸附和洗脱的使用方法进行详细的说明，但本发明(第一方式、第二方式)并不限定于此。
本发明(第一方式、第二方式)中的优选使用方法为如下方法：例如，(1)在填充有阳离子交换载体的柱之前连结填充有亲和载体的柱，制作成一体型柱，在中性pH条件(例如pH6以上且9以下)下将含有抗体等的溶液载样于一体型柱中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体等进行洗脱的方法；(2)制作以混合状态一起具有上述阳离子交换载体和亲和载体的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗体等的溶液进行载样，并使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体等进行洗脱的方法等。
在第一方式、第二方式中，使用了亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱的靶分子(抗体)纯化除了基本上由吸附工序、清洗工序、离子强度调节工序、洗脱工序等四个工序构成以外，还可以包括其后的再生工序和/或CIP工序、再平衡化工序等用于再利用的工序。
在第一方式、第二方式中，吸附工序中欧可以使用普通的亲和柱色谱纯化方法。即，在其一例中，将含有抗体等(例如，免疫球蛋白G)的蛋白质溶液的pH调节至中性附近，然后使该溶液通过本发明(第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换基团(阳离子交换载体)的连结柱或混合柱，使抗体等(例如，免疫球蛋白G)特异性地吸附于填充有亲和载体的柱或亲和载体中。例如，在以蛋白质A载体作为亲和载体的情况下，其载样pH优选为6以上，更优选为6.3以上且9以下，进一步优选为6.5以上且8.5以下。在利用哺乳类培养细胞生产的免疫球蛋白G的纯化中，不需要特别调节离子强度，此外，还可以预先提高离子强度而进一步抑制非特异吸附。在吸附工序中使给定浓度的含有抗体或源自抗体的物质的溶液吸附于载体，作为含有抗体或源自抗体的物质的溶液的溶剂，可以使用例如PBS(约10mM磷酸、约150mMNaCl等)。另外，在吸附工序之前可以进行平衡化工序，作为平衡化溶液的溶剂，可以使用例如PBS(约10mM磷酸、约150mMNaCl等)。
在第一方式、第二方式中，在清洗工序中，适量通过在亲和配体发挥作用的条件范围内的缓冲液来清洗柱内部。即，pH的优选范围也可以为与上述载样时相同的范围(中性附近的pH)，例如优选为6以上。此时，作为靶分子的抗体等(例如，免疫球蛋白G)吸附于亲和载体。这时，通过在中性附近的pH下对离子强度、组合物进行优化，有时能够有效地除去杂质。在载样、清洗时，优选阳离子交换载体不发挥作用的条件，即，优选利用中性附近的pH且具有一定以上高离子强度的清洗液，通过该过程，能够清洗两种分离基质和/或通过免疫球蛋白G而非特异性地残留于柱的杂质。
在第一方式、第二方式中，在对含有抗体等的溶液进行载样并开始下述洗脱之前进行清洗工序，清洗工序的次数例如至少为1次以上，优选为2次以上。清洗工序的优选例子例如可以列举以下的例子，但并不限定于以下例子。
(1)用平衡化溶液对上述一体型柱或混合型柱进行平衡化，对上述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并优选在该载样之后且洗脱之前通过清洗液(第2清洗液)，所述清洗液(第2清洗液)的离子强度低于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液且pH高于洗脱液，(2)用平衡化溶液对上述一体型柱或混合型柱进行平衡化，对上述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并优选在该载样之后且洗脱之前通过清洗液(第1清洗液)，所述清洗液(第1清洗液)的离子强度接近或高于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液且pH高于洗脱液，接下来再通过清洗液(第2清洗液)，所述清洗液(第2清洗液)的离子强度低于平衡化溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液且pH高于洗脱液。上述(1)和(2)的方法是将普通的蛋白质A色谱中使用的清洗方法适用于一体型柱或混合型柱的方法，可以冲洗非特异性地吸附于蛋白质A载体的杂质，也能够冲洗吸附于阳离子交换载体的杂质。另外，上述(1)优选对例如纯化纯度较高的抗体进行，而上述(2)优选对例如培养上清液进行。上述(1)和(2)中使用的第2清洗液为例如10mMTris/HClpH7等溶液，上述(2)中使用的第1清洗液为例如10mMTris1MNaClpH7、10mMTrispH7等溶液。需要说明的是，也可以在上述(1)和(2)之前用与平衡化溶液相同离子强度和pH的溶液(例如，PBS)进行预清洗。
在第一方式、第二方式中，在离子强度调节工序中，用中性附近且离子强度较低的缓冲液置换柱，为在洗脱时基于阳离子交换载体的离子强度依赖性洗脱功能的发挥而准备。离子强度更优选低于洗脱液的离子强度。
在第一方式、第二方式中，在洗脱工序中，通过酸性pH、离子强度的组合，在从亲和配体洗脱时，阳离子交换分离模式发挥作用，能够将单体含量较高的级分回收于低离子强度洗脱级分中。洗脱液的pH可以应用抗体等(例如，免疫球蛋白G)从亲和配体洗脱的pH。该pH以由亲和载体和抗体等(例如、免疫球蛋白G)的种类而确定的分离条件为中心来确定，因此，不需要特别的条件设定，从抑制凝聚体等的生成的观点考虑，优选为比能够从亲和载体上进行洗脱的范围更高的pH。在第一方式、第二方式中，抗体等的洗脱pH为4.0以下，优选为3.95以下，更优选为3.9以下，进一步优选为3.8以下。需要说明的是，洗脱pH为例如3.0以上，优选为3.2以上，更优选为3.5以上。
在第一方式的其它方式中，抗体等的洗脱pH优选小于5.0，更优选为4.5以下，进一步优选为4.0以下。需要说明的是，洗脱pH为例如3.0以上，优选为3.2以上，更优选为3.5以上。
在第一方式、第二方式中，亲和载体为蛋白质A载体的情况的洗脱液pH设定为例如pH为小于5.0且2以上、4.0以下且2以上之间。其中，从避免靶分子的酸变性的目的考虑，更优选为pH3.0以上，特别优选为pH3.5以上。洗脱液pH的上限值优选与上述相同。
在第一方式、第二方式中，使用碱耐性型的修饰型蛋白质A载体的情况下，通常其洗脱pH以3.5～4.0之间为中心进行设定，但并不限定于此。另外，洗脱离子强度不仅依赖于亲和配体与阳离子交换载体的比率，还也依赖于每单位体积的抗体等(例如，免疫球蛋白G)的载样量，可以通过梯度实验、逐步洗脱实验容易地设定优化点。
本发明(第二方式)的阳离子交换载体的洗脱条件或本发明(第一方式)的洗脱条件可以应用盐浓度梯度洗脱、逐步洗脱，为了简化操作，优选设定为能实现通过逐步洗脱进行抗体的回收并实现高单体含量的条件，但梯度洗脱更容易进行条件设定。
在第一方式、第二方式中，例如，可以在酸性pH下以离子强度梯度进行抗体等的洗脱，也可以在酸性pH下以离子强度逐级进行抗体等的洗脱。需要说明的是，在即使进行清洗工序的离子强度与酸性pH的组合，凝聚体也残留于柱而不会混入洗脱级分的情况下，可以省略离子强度调节工序。
在第一方式、第二方式中，在开始洗脱时，优选使洗脱液的pH恒定，并连续或阶段性地增大洗脱液的离子强度。洗脱液只要是通常使用的即可，例如可以为乙酸、柠檬酸等。洗脱液的pH优选为3以上且4.0以下，更优选为3.1以上且3.95以下，进一步优选为3.2以上且3.90以下。特别是在第一方式中，洗脱液的pH优选为3以上且5以下，更优选为3.1～4.5，进一步优选为3.2～4.0。在第一方式、第二方式中，离子强度优选在0.1mM以上且2000mM以下，更优选在0.5mM以上且1000mM以下，进一步优选在1mM以上且500mM以下的范围内连续或阶段性地增大。
使用本发明(第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱进行纯化的抗体等(例如，免疫球蛋白G)显示出比基于单一分离模式的抗体亲和分离基质更高的单体选择性，其洗脱液中的单体含量较高。
在使用基于单一分离模式的亲和载体的情况下，也可通过洗脱pH和离子强度等的优化来稍微提高单体含量，但其效果较差，且其效果的显现伴有更大的回收率的降低。通过使用本发明(第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱，能够通过单一色谱操作有效地实现单体含量的提高，所述单体含量的提高可以通过特异性较高的亲和纯化及主要通过阳离子交换色谱来实现，因此，能够降低对后段工艺的负荷，可以有助于工艺整体的收率提高和单体含量的提高。即，通过使用本发明(第一方式、第二方式)的亲和载体与阳离子交换载体的连结柱或混合柱的新抗体纯化法，能够有助于抗体医药品的制造工艺的生产率提高和高纯度化。
本申请要求基于在2013年9月17日申请的日本专利申请第2013-192378号和2013年9月17日申请的日本专利申请第2013-192379号的优先权。以参考的方式将在2013年9月17日申请的日本专利申请第2013-192378号和2013年9月17日申请的日本专利申请第2013-192379号的说明书的全部内容引用到本申请中。
实施例
以下，基于实施例对本发明(第一方式、第二方式)更详细地进行说明，但本发明(第一方式、第二方式)并不限定于这些实施例。
(阳离子交换载体的制备例)
羧基导入载体的制备(制备例1)
在反应容器中取以湿润体积计为4mL量的用冷水置换的LowdensityGlyoxal4RapidRun(ABT公司)作为4％琼脂糖珠，用冷却的1M谷氨酸(pH6)清洗5次，并在回收后使浆料的液量为7mL。在色谱槽内翻转搅拌2小时，然后追加投入1M的二甲基胺硼烷水溶液0.5mL，并在色谱槽内搅拌1小时30分钟。再在室温下翻转搅拌过夜。进行离心使载体沉降后，除去上清液使液面为6mL，并在其中直接加入20mg的硼氢化钠，在室温下进一步翻转搅拌2小时。用添加了水、0.1M柠檬酸、0.1M氢氧化钠、及0.5M的NaCl的PBS充分清洗，得到了用还原氨基化法经由谷氨酸的氨基向醛基导入了羧基的琼脂糖载体。本阳离子交换载体为Glyoxal-COOH。
(阳离子交换载体(含有羧基的配体)的pKa和离子交换容量的测定)
作为羧基导入阳离子交换载体，将CM-SepharoseFastFlow(GEHealthcare公司；阳离子交换载体A)、TOYOPEARLCM-650M(东曹株式会社；阳离子交换载体B)、FRACTOGELCOO(M)(Merck公司；阳离子交换载体C)、Glyoxal-COOH(制备例1；阳离子交换载体D)用1MKCl(pH2)进行置换，并用0.1MNaOH滴定来求得pKa和离子交换容量。将结果示于表1。
表1
(阳离子交换载体在酸性pH下的结合容量的测定)
作为羧基导入阳离子交换载体，将CM-SepharoseFastFlow(GEHealthcare公司)、TOYOPEARLCM-650M(东曹株式会社)、FractogelCOO(M)(Merck公司)、Glyoxal-COOH(制备例1)填充于Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)，将制备为0.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(人免疫球蛋白G)：日本制药)作为载样液，在以下的色谱条件下测定结合容量。将载样液的pH调节为3.7、4.2、或4.7，测定各个结合容量，作为10％漏出的动态结合容量(10％DBC)。
阳离子交换载体的10％DBC测定所使用的色谱条件
柱：ID0.66cm×柱长(Height)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制)
流速：0.4mL/分(保留时间：6分钟)
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：0.5mg-IgG/mL(5mM柠檬酸：pH3.7、4.2、或4.7)
平衡化液：5mM柠檬酸(pH3.7、4.2、或4.7)
洗脱液：50mM柠檬酸、0.5M氯化钠(pH3.7)
CIP液：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠
中和·再平衡化液：5mM柠檬酸(pH3.7、4.2、或4.7)
将各载体的结合容量(10％DBC)示于图3。根据其结果，没有发现以羧基作为配体的各种阳离子交换载体的结合容量有很大差别。另外，没有发现表1的离子交换容量与结合容量之间相互关联。存在pKa越低，结合容量的pH依赖性越大的倾向。
(单体含量的测定)
将各色谱洗脱液供于凝胶过滤，对凝聚体和单体进行分级，根据其峰面积值的比较而求出单体含量。以下示出凝胶过滤的条件。
凝胶过滤色谱条件
柱：Superdex20010/300GL(ID1cm×柱长(Height)30cm)(GEHealthcare公司)
流速：0.5mL/分
检测波长：214nm
载样液：100μL/样品注射(Injection)(稀释至吸光度值不超过1的范围)
洗脱液：PBS(pH7.4)
(比较例1)
使用了阳离子交换载体在pH5缓冲液中进行的抗体分离
作为阳离子交换载体，将CM-SepharoseFastFlow(GEHealthcare公司)、TOYOPEARLCM-650M(东曹株式会社)、FractogelCOO(M)(Merck公司)、Glyoxal-COOH(制备例1)填充于Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中，以制备成0.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU：日本制药)作为载样液，在以下的色谱条件下进行了分离。在洗脱级分中添加精氨酸使得最终浓度为50-100mM，在pH5～6下用凝胶过滤色谱进行了单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
阳离子交换色谱条件
柱：ID0.66cm×柱长(Height)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制)
流速：0.4mL/分(保留时间：6分钟)，其中CIP以后为0.8mL/分
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：0.5mg-IgG/mL(10mM柠檬酸、pH5)
平衡化(5柱体积)：10mM柠檬酸、pH5
载样量(30mg)
清洗(5柱体积)：10mM柠檬酸、pH5
洗脱梯度(40柱体积)：A→B线性梯度
A液：10mM柠檬酸、pH5
B液：250mM柠檬酸、pH5
再生(4柱体积)：50mM柠檬酸、250mM氯化钠、pH5
CIP(4柱体积)：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠
中和·再平衡化(4柱体积)：10mM柠檬酸、pH5
级分：1柱体积
作为各载体的色谱的结果，将CIP级分为止的全部洗脱级分中的单体和凝聚体量的总和设为100，将单体和凝聚体的分离示于图4至7。其结果确认了如下情况：载样的抗体回收于洗脱级分中，且凝聚体的峰顶部与单体的峰顶部仅稍微错开，未明显分离。
(比较例2)
使用了蛋白质A载体的抗体的分离
作为蛋白质A载体，将MabSelectSuRe(GEHealthcare公司)填充于Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中，以制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU：日本制药)作为载样液，在以下的色谱条件下进行分离。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在pH5～6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
蛋白质A色谱条件
柱：ID0.66cm×柱长(Height)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制)
流速：0.4mL/分(保留时间：6分钟)，其中CIP以后为0.8mL/分
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、pH7.4)
平衡化(5柱体积)：PBS、pH7.4
载样量(10mg、30mg或40mg)
清洗(5柱体积)：PBS、pH7.4
清洗2(4柱体积)：10mMTris/HCl、pH7
洗脱梯度(40柱体积)：A→B线性梯度
A液：1mM柠檬酸、pH3.7
B液：250mM柠檬酸、pH3.7
再生(4柱体积)：50mM柠檬酸、250mM氯化钠、pH3.7
CIP(4柱体积)：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠
中和·再平衡化(4柱体积)：PBS、pH7.4
作为各色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图8至10。根据其结果，虽然载样的抗体回收到了洗脱级分中，但是凝聚体的峰顶部与单体峰一起在初期被洗脱，任一种载样量均为确认到凝聚体的分离。需要说明的是，该蛋白质A载体的结合容量(10％DBC)约为50.3mg/mL左右。
(比较例3)
将填充有蛋白质A载体的柱与填充有以磺丙基为配体的阳离子交换载体(SP-SepharoseFastFlow)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
在Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中分别填充作为蛋白质A载体的MabSelectSuRe(GEHealthcare公司)、作为阳离子交换载体的SP-SepharoseFastFlow(GEHealthcare公司)，将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。以制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU：日本制药)作为载样液，在以下的色谱条件下进行分离。需要说明的是，1柱体积是以1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在pH5～6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
连结柱色谱条件
柱：ID0.66cm×柱长(Height)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制)的连结体
流速：0.4mL/分(保留时间：6分钟)，其中CIP以后为0.8mL/分
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、pH7.4；10mM磷酸、150mMNaCl等)
平衡化(5柱体积)：PBS、pH7.4
载样量(40mg)
清洗(5柱体积)：PBS、pH7.4
清洗2(4柱体积)：10mMTris/HCl、pH7
洗脱梯度(40柱体积)：A→B线性梯度
A液：1mM柠檬酸、pH3.7
B液：250mM柠檬酸、pH3.7
再生(4柱体积)：50mM柠檬酸、250mM氯化钠、pH3.7
CIP(4柱体积)：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠
中和·再平衡化(4柱体积)：PBS、pH7.4
作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图11。这时，在将比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，比较例3中再生级分为止回收得到的单体为21.0％，另外，单体含量为94.1％。CIP级分为止回收得到的单体为22.9％，将填充有以磺丙基作为配体的阳离子交换载体的柱与填充有蛋白质A载体的柱连结使用时，能够离子强度洗脱的单体回收率较差。
(参考例1)
将填充有蛋白质A载体的柱与填充有以pKa小于4.0的羧基作为配体的阳离子交换载体A(CM-SepharoseFastFlow)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
在Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中分别填充作为蛋白质A载体的MabSelectSuRe(GEHealthcare公司)、作为阳离子交换载体A的CM-SepharoseFastFlow(GEHealthcare公司)，将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体A的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。以制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU：日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。需要说明的是，1柱体积是以1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在pH5～6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
连结柱色谱条件
柱：ID0.66cm×柱长(Height)7cm、2.4mL容量(Omnifit公司制)的连结体
流速：0.4mL/分(保留时间：6分钟)，其中CIP以后为0.8mL/分
多克隆抗体(IgG)：GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU(日本制药)
载样液：2.5mg-IgG/mL(PBS、pH7.4；10mM磷酸、150mMNaCl等)
平衡化(5柱体积)：PBS、pH7.4
载样量(40mg)
清洗(5柱体积)：PBS、pH7.4
清洗2(4柱体积)：10mMTris/HCl、pH7
洗脱梯度(40柱体积)：A→B线性梯度
A液：1mM柠檬酸、pH3.7
B液：250mM柠檬酸、pH3.7
再生(4柱体积)：50mM柠檬酸、250mM氯化钠、pH3.7
CIP(4柱体积)：0.1M氢氧化钠、1M氯化钠
中和·再平衡化(4柱体积)：PBS、pH7.4
作为色谱的结果，将CIP分级为止的各分级的单体和凝聚体的峰面积值示于图12。这时，在将比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，参考例1中再生级分为止回收得到的单体为21.2％，另外，单体含量为99.0％。CIP级分为止回收得到的单体为73.7％，单体含量为83.3％。在将填充有以pKa小于4.0的羧基作为配体的阳离子交换载体A的柱与填充有蛋白质A载体的柱连结使用时，能够离子强度洗脱的单体回收率较差。
(实施例1)
将填充有蛋白质A载体的柱与填充有以羧基作为配体的阳离子交换载体B(TOYOPEARLCM-650M)的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
在Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中分别填充作为蛋白质A载体的MabSelectSuRe(GEHealthcare公司)、作为阳离子交换载体B的TOYOPEARLCM-650M(东曹株式会社)，将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体B的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。以制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU：日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。需要说明的是，1柱体积是以1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在pH5～6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图13。这时，在将相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，实施例1中再生级分为止回收得到的单体为91.6％，另外，单体含量为96.7％。
对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的混合液中的单体含量、单体回收率80％为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9％，单体含量为93.5％。即使在单体回收率为80％的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为93.4％，实施例1的单体含量为97.1％，单体含量也得到了提高。
(实施例2)
将填充有蛋白质A载体的柱与填充有以羧基作为配体的阳离子交换载体C(FractogelCOO(M))的柱连结制成一体型柱，使用该一体型柱进行抗体的分离。
在Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中分别填充作为蛋白质A载体的MabSelectSuRe(GEHealthcare公司)、作为阳离子交换载体C的FractogelCOO(M)(Merck公司)，将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体C的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。以制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU：日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。需要说明的是，1柱体积是以1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在pH5～6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图14。这时，将与相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，实施例2中再生级分为止回收得到的单体为86.7％，另外，单体含量为99.2％。
对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的混合液中的单体含量、单体回收率80％为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9％，单体含量为93.5％。即使在单体回收率为80％的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为93.4％，实施例2的单体含量为99.2％，单体含量也得到了提高。
(实施例3)
使用将填充有蛋白质A载体的柱与填充有以羧基为配体的阳离子交换载体D(Glyoxal-COOH)的柱连结而成的柱进行抗体的分离。
在Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中分别填充作为蛋白质A载体的MabSelectSuRe(GEHealthcare公司)、作为阳离子交换载体D的Glyoxal-COOH，将两根柱按照填充有蛋白质A载体的柱、填充有阳离子交换载体D的柱的顺序进行连结，作为整体的柱实施色谱操作。以制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU：日本制药)作为载样液，在比较例3的色谱条件下进行分离。需要说明的是，1柱体积是以1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在pH5～6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图15。这时，在将相同载样量的比较例2的40mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，实施例3中再生级分为止回收得到的单体为102.0％，另外，单体含量为96.7％。回收率超过100％可以认为是凝胶过滤时注入量的误差，根据图15的单体与凝聚体的分离行为可以判断，不会对与比较例的单体含量的比较造成影响。
对于表2的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的混合液中的单体含量、单体回收率80％为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9％，单体含量为93.5％。即使在单体回收率为80％的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为93.4％，实施例3的单体含量为99.1％，单体含量也得到了提高。
(实施例4)
将蛋白质A载体与以羧基作为配体的阳离子交换载体D(Glyoxal-COOH)混合填充于一个柱内制成混合型柱，使用该混合型柱进行抗体的分离。
将作为蛋白质A载体的MabSelectSuRe(GEHealthcare公司)与作为阳离子交换载体D的Glyoxal-COOH分别以4︰1(体积比)进行混合而填充于Omnifit公司制的柱(ID0.66cm×柱长(Height)7cm)中，以制备成2.5mg/mL的人多克隆抗体(GAMMA-GLOBULIN-NICHIYAKU：日本制药)作为载样液，在比较例2的色谱条件下进行分离。抗体载样量为10mg。需要说明的是，1柱体积是以1根柱体积为2.4mL进行操作。在洗脱液中添加精氨酸使最终浓度为50-100mM，在pH5～6下用凝胶过滤色谱进行单体含量的测定。另外，根据其峰面积值分析求出各级分的单体量和凝聚体量。
作为色谱的结果，将CIP级分为止的各级分的单体和凝聚体的峰面积值示于图16。这时，在将相同载样量的比较例2的10mg抗体载样试验的洗脱级分中的单体量设为100的情况下，实施例4中再生级分为止回收得到的单体为103.0％，另外，单体含量为97.3％。回收率超过100％可以认为是凝胶过滤时的注入量的误差，根据图16的单体与凝聚体的分离行为可以判断，不会对与比较例的单体含量的比较造成影响。
对于表3的各连结柱的评价结果，将再生级分为止的单体回收率、再生级分为止的混合液中的单体含量、单体回收率80％为止的洗脱液混合液中的单体含量与比较例2进行比较而示出。比较例2的再生级分为止的CIP级分为止回收得到的单体为99.9％，单体含量为96.5％。即使在单体回收率为80％的时刻进行比较，相对于比较例2的单体含量为97.1％，实施例4的单体含量为99.1％，单体含量也得到了提高。
表2
表3
以上，根据本发明(第一方式)，可以提供一种新分离模式和使用方法，能够有助于抗体医药品的制造工艺的生产率提高和高纯度化，所述新分离模式和使用方法在将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱而整体地进行抗体等的吸附和洗脱的抗体等的纯化方法中，能够实现80％以上的高回收率，或者即使未实现80％以上的回收率也能使单体(monomer)含量提高。
此外，根据本发明(第二方式)，在将pKa为4.0以上的阳离子交换载体用于亲和色谱洗脱的pH4.0以下的酸性溶液中进行依赖离子强度的洗脱时，抗体回收率为80％以上且能够提高单体含量。另外，根据本发明(第二方式)，不需要临时回收蛋白质A载体的洗脱液，将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱能够整体地进行抗体等的吸附和洗脱。
即，通过利用本发明(第二方式)的使用方法，在从亲和载体上进行靶分子的洗脱的酸性洗脱pH下从阳离子交换载体上进行抗体等的分离、或者将亲和载体与阳离子交换载体制成连结柱或混合柱而整体地进行抗体等的吸附和洗脱，由此，能够有助于抗体医药品的制造工艺的生产率提高和高纯度化。

Claims (37)

1.一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法包括：使用载体1和载体2制成连结柱或混合柱，整体地对抗体或源自抗体的物质进行吸附和洗脱，所述载体1具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团。
2.一种抗体或源自抗体的物质的纯化方法，该方法是使用了载体1和载体2的抗体或源自抗体的物质的纯化方法，所述载体1具有对抗体或源自抗体的物质的亲和配体，所述载体2具有阳离子交换基团，
该方法包括：使含有抗体或源自抗体的物质的液体通过一体型柱或混合型柱而将抗体或源自抗体的物质载样于柱中，所述一体型柱在填充有所述载体1的柱的下游侧直接连结了填充有所述载体2的柱，所述混合型柱填充有所述载体1和载体2两者的混合物，
接着，通过使洗脱液通过而对载样后的抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度梯度进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
4.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度逐级进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液。
6.根据权利要求2～4中任一项所述的纯化方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更高的离子强度，且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液的清洗液。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是以蛋白质A、蛋白质G、蛋白质L或它们的类似物作为配体的载体。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有亲和配体的载体1是以蛋白质A或其类似物作为配体的载体。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、或含Fc分子。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为Fab、scFv、双抗体、或含有抗原结合部位的分子。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的纯化方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载体2是以羧基为配体的载体。
12.根据权利要求11所述的纯化方法，其中，所述羧基源自酸性氨基酸。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的纯化方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质的洗脱pH小于5.0。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC为1mg/mL以上且100mg/mL以下。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2的离子交换容量为0.001mmol/mL以上且0.5mmol/mL以下。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体1的体积平均粒径为1μm以上且1000μm以下，所述载体2的体积平均粒径为1μm以上且1000μm以下。
17.根据权利要求1～16中任一项所述的纯化方法，其中，将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于载体2，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有pKa为4.0以上且含有羧基的配体。
18.根据权利要求1～17中任一项所述的纯化方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC为1mg/mL以上且200mg/mL以下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有含有羧基的配体。
19.根据权利要求2～18中任一项所述的纯化方法，其中，在填充有所述具有阳离子交换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
20.根据权利要求2～19中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述一体型柱的载体1与载体2的比例以体积标准计为1/20以上且20/1以下。
21.根据权利要求2～18中任一项所述的纯化方法，其中，制作以混合状态具有所述具有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
22.根据权利要求2～18、21中任一项所述的纯化方法，其中，构成所述混合型柱的载体1与载体2的比例以体积标准计为1/20以上且20/1以下。
23.根据权利要求1～22中任一项所述的纯化方法，其中，在吸附条件下，相对于载体1对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC，载体2对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC为1/10倍以上且10倍以下。
24.一种抗体或源自抗体的物质，其是用权利要求1～23中任一项所述的纯化方法进行纯化而得到的。
25.一种具有阳离子交换基团的载体的使用方法，该方法包括：将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于载体2中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有pKa为4.0以上且含有羧基的配体。
26.根据权利要求25所述的使用方法，其中，所述含有羧基的配体源自酸性氨基酸。
27.根据权利要求25或26所述的使用方法，其中，所述载体2对IgG的保留时间为6分钟时的10％DBC为1mg/mL以上且200mg/mL以下，所述载体2具有阳离子交换基团，该阳离子交换基团具有含有羧基的配体。
28.根据权利要求25～27中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载体2的离子交换容量为0.001mmol/mL以上且0.5mmol/mL以下。
29.根据权利要求25～28中任一项所述的使用方法，其中，所述具有阳离子交换基团的载体2的体积平均粒径为1μm以上且1000μm以下。
30.根据权利要求25～29中任一项所述的使用方法，其中，在填充有所述具有阳离子交换基团的载体2的柱之前连结填充有具有亲和配体的载体1的柱，制作一体型柱，在中性pH条件下将含有抗体或源自抗体的物质的溶液载样于所述一体型柱中，然后使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
31.根据权利要求25～29中任一项所述的使用方法，其中，制作以混合状态具有所述具有阳离子交换基团的载体2和具有亲和配体的载体1的混合型柱，在中性pH条件下对含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，并使用pH4.0以下的酸性缓冲液对抗体或源自抗体的物质进行洗脱。
32.根据权利要求30或31所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开始之前通入清洗液，所述清洗液的离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液，且pH高于洗脱液。
33.根据权利要求30或31所述的使用方法，其中，用平衡溶液对所述一体型柱或混合型柱进行平衡，并对所述含有抗体或源自抗体的物质的溶液进行载样，在该载样之后且洗脱开始之前，通入与平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液相比具有相同或更高的离子强度、且pH高于洗脱液的清洗液，接着再通入离子强度低于平衡溶液和含有抗体或源自抗体的物质的溶液、且pH高于洗脱液的清洗液。
34.根据权利要求25～33中任一项所述的使用方法，其中，所述抗体或源自抗体的物质为免疫球蛋白G、免疫球蛋白G衍生物、含Fc分子、或者Fab、scFv、双抗体或含有抗原结合部位的分子。
35.根据权利要求25～34中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度梯度进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
36.根据权利要求25～34中任一项所述的使用方法，其中，在酸性pH下、且以离子强度逐级进行所述抗体或源自抗体的物质的洗脱。
37.一种抗体或源自抗体的物质，其是用权利要求25～36中任一项所述的使用方法进行纯化而得到的。
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