CN1925898B - 纯化抗体的工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在液体中从一种或多种混杂物纯化抗体的工艺，该工艺包括使所述液体与包含支持物的第一层析树脂接触，所述支持物上已经固定了多式配体，来将所述抗体吸附到所述树脂上，其中每个多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统；添加洗脱液以从所述树脂释放抗体；用第二层析树脂接触如此获得的洗出液。在一个实施方式中，所述芳香族或杂芳香环实体的成环原子选自由C、S或O构成的组，和所述阳离子交换基团是弱阳离子交换剂。

Description

纯化抗体的工艺
技术领域
本发明涉及纯化抗体，例如单克隆抗体的工艺。更具体地，本发明涉及俘获抗体的方法；使用至少两个层析步骤纯化抗体的工艺；使用本发明的方法纯化抗体的试剂盒；和层析柱。
背景
免疫系统由许多相互依赖的细胞类型组成，它们集体地保护躯体对抗细菌、寄生虫、真菌、病毒感染和对抗肿瘤细胞的生长。免疫系统的卫士是它们宿主的血流中不断地漫游的巨噬细胞。当受到感染或免疫的攻击时，巨噬细胞通过吞入标记了称为抗原的外来分子的侵入物来进行响应。这个由辅助T细胞介导的事件建立了引起B细胞刺激的复杂的反应链。这些B细胞随后产生称为抗体的蛋白，其与外来侵入物结合。在抗体和抗原之间的结合事件标记了外来侵入物以通过吞噬作用或补体系统的活化来进行破坏。存在着许多不同种类的抗体或免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们的不同不仅在于生理学作用，还在于它们的结构。从结构的角度来看，IgG抗体是已经广泛研究了的特别种类的免疫球蛋白，可能是由于它们在成熟免疫反应中起到的显著作用。
当今在人类和兽医学的诊断、保健和治疗领域的大量不同应用中利用了免疫球蛋白拥有的生物学活性。实际上，在近几年中，单克隆抗体和重组抗体构建体已经成为当前在临床试验中进行研究的和接受FDA批准作为治疗剂和诊断剂的最大一类蛋白。作为对表达系统和产生策略的补充，设计了纯化方案来以简单和低成本的方式获得高纯度抗体。
分离免疫球蛋白的传统方法基于包含免疫球蛋白的蛋白级分的选择性可逆沉淀，而将其他的蛋白质组群留在溶液中。典型的沉淀试剂是乙醇、聚乙二醇、易溶盐例如硫酸铵和磷酸钾和辛酸。一般地，这些沉淀方法得出非常不纯的产物而同时是费时和费力的。此外，向原料中添加沉淀试剂使得难以将上清液用于其他目的并且产生了处理难题，当论及免疫球蛋白的大规模纯化时这是特别相关的。
分离免疫球蛋白的可选择的方法是层析，其包括紧密相关的分离方法的家族。将层析与大多数其他物理和化学的分离方法区分开来的特征是使两种互不混合的相接触，其中一个相是固定的，另一个是移动的。引入移动相的样品混合物在被移动相携带通过系统时，在固定相和移动相之前经历了一系列的相互作用。相互作用利用了样品中的成分的物理或化学性质的差异。在移动相运动通过含有固定相的柱的影响下，这些差异决定了单个组分的移动速度。分离的成分按照与固定相的相互作用升高的顺序出现。阻滞最小的成分首先洗脱，最强烈滞留的材料最后洗脱。当样品成分从柱上洗脱时，当一种成分被阻滞到足以防止与邻近的溶解物的区域重叠时，得到了分离。对于每种特定的分离目的不断地进行着努力来设计最佳的固定相。这种固定相通常包含支持基质或基础基质，在其上连接了包含功能基团即结合基团的配体。根据所利用的相互作用的原理，对每一种层析都给出了参考。工业上的层析工艺常常包括超过一个的步骤，从俘获步骤开始，其是从粗的或澄清的进料初步纯化目标分子；随后是中间纯化步骤和最终的精炼步骤。离子交换层析常被用于免疫球蛋白的分离。在阴离子交换层析中，免疫球蛋白的带负电的氨基酸侧链将与层析基质的带正电的配体相互作用。另一方面在阳离子交换层析中，免疫球蛋白的带正电的氨基酸侧链将与层析基质的带负电的配体相互作用。
疏水性相互作用层析(HIC)也是用于免疫球蛋白分离的广泛描述的方法。然而，疏水性基质需要向原料中添加易溶盐来使免疫球蛋白有效地结合。通过以连续的或阶梯式的梯度来降低易溶盐浓度，从基质上释放结合的抗体。如果目的是高纯度产品，建议的是将疏水性层析与进一步的步骤结合。这种步骤的缺点是必需向原料中添加易溶盐，因为这产生了一些难题并且因而提高了大规模使用的成本。对于除了细胞培养上清液以外的其他原料，例如，乳清、血浆和蛋黄，向原料添加易溶盐在许多情况下阻碍了大规模应用，因为盐会妨碍耗尽了免疫球蛋白的原料的任何经济上可行的用途。在大规模应用中的另外的难题是数千升废料的处理。
蛋白A和蛋白G亲和层析是用于分离和纯化免疫球蛋白、特别是分离单克隆抗体的流行和普遍的方法，主要是由于易于使用和所获得的高纯度。与离子交换、疏水性相互作用、羟磷灰石和/或凝胶过滤步骤，特别是基于蛋白A的方法组合使用，已经成为许多生物药公司选择的抗体俘获方法，参见，例如WO8400773和US5,151,350。
已经建议了将蛋白A层析与疏水性相互作用层析(HIC)组合。US5,429,746(SmithKline Beecham Corp.)涉及应用疏水性相互作用层析作为抗体纯化中的一个步骤。其中公开了可以在采用例如蛋白A的亲和层析之后如何使用HIC，任选的具有中间的阳离子交换层析步骤。通过弱阳离子交换剂(CM SepharoseTM FF)说明了阳离子交换层析，其被调节到pH5.5用于吸附，用40mM柠檬酸盐、100mM氯化钠pH6的洗脱缓冲液来洗脱。将混合物施加到HIC柱，随后是亲合性和/或阳离子交换层析，则可能含有混杂物，例如免疫球蛋白聚集物、错误折叠的碎片、宿主细胞蛋白和来自亲和层析步骤的残余材料。在这种工艺中，抗体首先吸附到蛋白A层析支持物上并被洗脱，然后吸附到阳离子交换层析支持物并从上选择性地洗脱；最后吸附到HIC支持物并被洗脱。
作为对基于蛋白的亲和柱的替代，已经提出了将纯化学的树脂，例如多式树脂用于抗体纯化，其中不同的但共同作用的位点与目标相互作用。一个商业上可获得的实例是MBI Hypercel
Figure 05806276X_0
(BioSepra)，是一种包含巯基-苯并咪唑-磺酸配体的吸附剂，声称提供了疏水性以及与抗体的离子相互作用。疏水性相互作用假定是归因于芳香环系统，而离子相互作用应当归因于SO3 -取代基，已知其是强阳离子交换剂。此外，MBI配体的芳香族系统的氮原子是在一定条件下可带电的，因而可以提供与带负电基团的离子相互作用。
US6,498,236(Upfront Chromatography)公开了一种从溶液，例如杂交瘤细胞培养上清液、动物血浆或血清分离或纯化免疫球蛋白的方法。提出了将该方法作为对使用蛋白A、蛋白G、合成肽和其他相对高分子量配体的替代，由于配体和免疫球蛋白的各自分子量之间的微小差异，以及由于它们相互结合的天然趋势，已经陈述了这些配体包含了一些缺点。根据US6,498,236，在它们的配体上存在的取代基的性质对于有效地结合免疫球蛋白是决定性的。更具体地，在所公开的方法中使用的固相基质由化学式M-SP1-X-A-SP2-ACID来描述，其中M代表基质主干，SP1代表间隔区，X代表O、S或NH，A代表单环或二环的任选的取代芳香族或芳香杂环部分，SP2代表任选的间隔区和ACID代表酸性基团。配体优选的来源于选自由苯并咪唑、苯并噻唑和苯并
Figure 05806276X_1
唑构成的组的化合物。
WO97/10887(Novo Nordisk A/S)涉及亲和性配体-基质的结合物，在蛋白质材料例如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素或类似物、衍生物和其片段的纯化中是有用的。发明WO97/10887是基于这种观点，疏水性配体的选择性可以通过提高疏水性成分的复杂度和空间几何结构来提高。这个观点引起了一组亲和性配体的发现，这个组限于具有杂芳香族实体的结构，其中至少一个成环原子是氮。
进一步的，在WO03/024588(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)中公开了合成多式阳离子交换媒介的方法。更具体地，将包含两个功能性，优选的同型半胱氨酸硫内酯(thiolactone)的支架衍生化并与固体基础基底矩阵反应。更具体地，两种功能性之一，优选的硫(sulphur)，用于与基质连接，第二种功能性是可以转化成离子基团的一种。因而，如此产生的多式媒介能够进行离子相互作用以及进一步的种类的相互作用，例如疏水性相互作用，取决于衍生化作用的性质。在实验部分，使用三种模型蛋白测试了生产的阳离子交换剂，即，细胞色素C(Cyt C)、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)。
本发明的简要说明
在一个方面，本发明提供了纯化抗体的耐用的工艺。这可以通过使包含所述抗体的液体接触包含支持物的第一层析树脂，所述支持物上已经固定了多式(multi-modal)配体，通过将抗体从树脂上释放来洗脱所述抗体，用第二层析树脂接触洗出液，如在附随的权利要求中详细地定义的。
在进一步的方面，本发明提供了从比现有技术的方法更小体积的进料纯化抗体。更具体地，本发明提供了从工艺进料中俘获抗体的方法，而不需要稀释工艺进料中的盐浓度。这可以通过如上所述的工艺实现，其中所述多式配体是耐盐性的配体，称为“高盐配体”。这样的第一步骤任选的继之以使用包含支持物的层析树脂的第二层析步骤，所述支持物上已经固定了包含阴离子交换基团的多式配体。
在特定的方面，本发明提供了一种工艺，其中第二层析步骤在非结合条件下进行。
根据以下的详细公开，本发明的其他方面和益处将更为明显。
附图的简要说明
附图1显示了在多式阳离子交换层析媒介上纯化含有IgG的进料的层析谱。
附图2显示了进料的分析性凝胶过滤层析谱，如以下的实施例3所解释的。在13ml处的峰是目标MAb，其余的峰是聚集物和/或宿主细胞蛋白。
附图3显示了从U1128042洗脱的集中级分9-16的分析性凝胶过滤层析谱，如实施例3所解释的。
附图4显示了根据本发明的工艺的步骤2的层析谱，更具体的是使用多式阴离子交换层析的精炼步骤，如以下的实施例4所解释的。
附图5显示了在柱238092上施加的流通物(级分3-10)的分析性凝胶过滤层析谱，如以下的实施例4所解释的。
定义
在本说明书中术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换地使用。
术语“洗脱液”按其在本领域中的常规含义使用，即，有适合的pH值和/或离子强度以从分离基质释放一种或多种化合物的缓冲液。
术语“亲和层析”是指基于以锁-匙识别的原则在目标生物分子和生物特性配体之间的特异性相互作用的层析。因而，目标和配体将构成亲和配对，例如抗原/抗体、酶/受体，等等。
术语“芳香族”基团是指根据Huckel′s由规则化学式(4n+2)定义的基团，其中n是正整数或零。
在此使用术语“层析树脂”来表示已经联结了称为配体的官能团的支持物。术语“基质”有时用来表示支持物。
术语“多式层析配体”是指能够提供与要结合的物质相互作用的至少两个不同的但共同起作用的位点的配体。这些位点之一提供了在配体和感兴趣的物质之间的吸引人的电荷-电荷相互作用类型。另一个位点一般提供了电子的受体-供体相互作用和/或疏水性和/或亲水性相互作用。电子供体-受体相互作用包括例如氢键、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、感生偶极等的相互作用。多式层析配体也称为“混合式”层析配体。在当前的应用中，其中配体是多式配体，在多式配体中的电荷-电荷相互作用基团是带负电的层析树脂表示为“多式阳离子交换树脂”，而其中配体是多式配体，在多式配体中电荷-电荷相互作用基团是带正电的层析树脂表示为“多式阴离子交换树脂”。
用语“电子供体-受体相互作用”是指，带有游离电子对的负电原子作为供体起作用，并结合缺少电子的原子，缺少电子的原子作为供体的电子对的接受体起作用。(参见例如，Karger et al.，AnIntroduction into Separation Science，John Wiley & Sons(1973)第42页。)术语“阳离子交换基团”在此是指带负电的或可带电的基团。
在液相色谱的上下文中术语“俘获步骤”是指分离工艺的起始步骤。最通常地，俘获步骤包括澄清、浓缩、稳定化和针对可溶混杂物进行重要的纯化。在俘获步骤之后，可以接着进行中间纯化，其进一步降低混杂物的剩余量，例如宿主细胞蛋白、DNA、病毒、内毒素、营养物、细胞培养基的成分，例如防沫剂和抗生素，和与生产相关的混杂物，例如聚集物、错误折叠的种类和聚集物。
在液相色谱的上下文中术语“精炼步骤”是指最后的纯化步骤，在其中除去痕量杂质留下活性的、安全的产物。在精炼步骤中除去的混杂物常常是目标分子或怀疑的漏出产物的构象体(conformer)。
术语“Fc结合蛋白”是指能够与抗体的可结晶部分(Fc)结合的蛋白，包括，例如蛋白A和蛋白G，或其维持了所述结合性质的任何片段或融合蛋白。
发明的详细说明
本发明涉及从液体中俘获一种或多种抗体的方法，该方法包括使所述液体接触包含支持物的层析树脂，所述支持物上已经固定了多式配体，来将抗体吸附到所述树脂上，其中每个多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统，在所述系统中成环原子选自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子构成的组。
在本发明的有益的实施方式中，所述成环原子选自由碳(C)和硫(S)原子构成的组。在特定的实施方式中，所述成环原子是碳(C)原子。本方法可以对发酵液使用，所述发酵液优选的已经通过例如过滤进行了澄清以除去细胞碎片等等。最通常地，在俘获方式中，不存在之前的层析。为了获得更高纯度的产品，本方法优选的继之以进一步的纯化，例如，通过层析、膜滤或任何其他的常规纯化方法。因而，在一个实施方式中，所述多式层析俘获步骤继之以一个或进一步的纯化步骤。
在一个方面，本发明涉及从液体纯化一种或多种抗体的工艺，该工艺包括使所述液体与包含支持物的第一层析树脂接触，所述支持物上已经固定了多式配体，来将所述抗体吸附到所述树脂上，其中每个多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统；添加洗脱液以从所述树脂释放抗体；用第二层析树脂接触如此获得的洗出液。
因而，在第一步骤中，这是俘获步骤，在结合条件下使包含抗体的液体接触多式层析树脂，容许吸附抗体和任选的一种或多种混杂物。在低于期望的抗体的等电点的pH值下，有利地缓冲接触了第一树脂的液体。在吸附步骤之后，称为洗脱液的另一种液体将与树脂接触来解吸附，即，释放所述抗体。洗脱液通常是缓冲液，例如磷酸盐缓冲液。在一个实施方式中，洗脱是通过增加pH值的逐步洗脱。然而，理解的是，本领域的技术人员可以容易地修改条件以获得吸附和洗脱，例如通过另外调整pH值和/或盐浓度，即，溶液的传导性。在有益的实施方式中，本工艺的第一步骤是通过重力或泵送使液体和/或洗脱液通过装填的层析柱。如果需要，在本工艺的层析步骤之间可以应用一个或多个洗涤步骤。应用于第一步骤的液体有利地是进料流，即，细胞培养液或发酵肉汤，其已经任选的经受了预处理，例如过滤、通过调节pH值和/或传导性来整理，等等。因而，第一层析俘获步骤将除去宿主细胞残余物，例如细胞碎片和蛋白、DNA、内毒素，等等。直接对工艺进料使用本工艺的益处是，与常规树脂相比，在此使用的特异性多式配体能够在更高的盐浓度下吸附抗体，因而这大大降低了或甚至消除了稀释工艺进料的需要，如公知的，工艺进料是有相对高传导性的。处理体积的减少将改善处理效率，并避免了对非常大和昂贵的设备的投资。在特定的实施方式中，本工艺作为膨胀床工艺来运行。
用于本工艺的多式层析树脂可以由本领域的技术人员容易地制备。简言之，所述树脂包含多式配体，所述多式配体直接地或通过间隔区与有机或无机支持物联结，支持物有时指基础基质。支持物可以是粒子，例如基本上球形的粒子、整料、过滤器、膜、表面、毛细管，等等的形式。在一个实施方式中，所述支持物是从天然的多聚体，例如交联的碳水化物材料，例如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、konjac、角叉菜胶、gellan、藻酸盐等等制备的。为了获得高的吸附能力，所述支持物优选的是多孔的，然后配体与外表面以及孔洞表面结合。这种天然的多聚体支持物可以根据标准方法容易地制备，例如反相悬浮凝胶化(S Hjertén：Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)。做为选择，所述支持物是从合成聚合物，例如交联的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等等制备的。这种合成聚合物可以根据标准方法容易地生产，参见例如″Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization″(R Arshady：Chimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。多孔的天然或合成聚合物支持物也可以从商业的来源获得，例如Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden。对于用多式配体纯化抗体有用的树脂的特定实例是用于膨胀床吸附的树脂，即，含有高密度填料，优选的不锈钢填料的多聚体支持物。
如上所述，在本工艺中利用的层析树脂的多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统。在可选择的实施方式中，用于第一步骤的树脂是多式的，包含两种不同种类的配体，即阳离子交换基团和芳香族或杂芳香族环系统，优选的为基本上相当的数量。能够与目标分子进行疏水性相互作用的芳香环系统可以包含一个或两个环状结构，由一个或多个原子或例如由萘基基团来分隔。进一步的，所述环状系统任选的被例如烷氧基团，例如甲氧基取代。在一个实施方式中，所述芳香族或杂芳香族环系统不含有任何氮原子，但限于碳原子、硫原子和/或氧原子作为所述环状结构的构成原子。因而，在这个实施方式中，第一步骤接触使用包含芳香族或杂芳香族环系统的多式阳离子交换剂，所述环状系统在成环位置中没有氮。因而，在一个实施方式中，所述芳香族或杂芳香族实体的成环原子选自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子构成的组。在有益的实施方式中，所述芳香族或杂芳香族实体的成环原子选自由碳(C)和硫(S)构成的组。在特定的实施方式中，所述芳香族或杂芳香族实体的成环原子是碳(C)原子。
在一个实施方式中，用于本工艺的第一步骤的树脂描述如下：
Sup-间隔区-X-阳离子交换基团-间隔区-芳香族或杂芳香族的环，其中Sup是支持物，间隔区是任选的；X是连结原子例如O、S或N。适合的间隔区和产生这种间隔区的联结化学作用是本领域中公知的。因此，这个实施方式不同于以上讨论的US6,498,236，在US6,498,236中作为阳离子交换基团的酸性基团是对芳香族实体的取代。因而，在本实施方式中使用的树脂可以预计容许不同的和在空间上更为扩展的种类的与目标化合物的键，因为当前的结构容许在芳香族和阳离子官能团之间的进一步的距离。
阳离子交换基团优选的是弱的阳离子交换剂，即，可以在某些pH值下质子化的基团。与弱阳离子交换剂相反，强阳离子交换基团包含在所有pH值下都保持带电的基团。因而，在一个实施方式中，多式配体包含羧基，例如一个或两个羧基。
然而，本领域技术人员将理解的是，如上所述的多式配体可以还有提供进一步的相互作用，例如氢键作用。除了以上讨论的基团之外，在本工艺中使用的多式层析配体也可以包含一个或多个磺酰基基团、胺或羰基基团，其分别可以或可以不促进与混杂物和抗体的相互作用。
例如，与以上讨论的载体连结来制备本工艺中使用的多式层析树脂的配体可以按以上讨论的WO03/024588(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)中所描述的来合成，其中包含弱阳离子官能团的多式配体从高半胱氨酸硫内酯开始合成。对于多式配体合成的进一步的参考文献，参见例如WO02/059059(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。配体可以通过称为间隔区的适合的距离元件与载体连结。对于对此有用的连结方法的综述，参见例如Immobilized AffinityLigand Techniques，Hermanson et al，Greg T.Hermanson，A.KrishnaMallia and Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。如本领域中公知的，诸如配体密度或取代水平、支持物的孔隙大小等的参数可以变化，以提供具有期望的性质的层析树脂。
本工艺的第二步骤包括用第二层析树脂接触从第一步骤获得的洗出液。在一个实施方式中，第二层析步骤选自由离子交换层析；疏水性相互作用层析(HIC)；固定的金属亲和层析(IMAC)；和亲和层析构成的组。所有所述方法和它们的使用是本领域技术人员公知的，可以方便地使用商业上可获得的层析树脂。关于支持物和配体的固定的以上讨论的原则也适用于这个步骤。在一个实施方式中，第二步骤是精炼步骤，以除去细微的混杂物，产生高纯度产品。在可选择的实施方式中，第二步骤是中间步骤，在这种情况下，根据本发明的工艺还包括随后的精炼步骤。在有益的实施方式中，第二步骤是离子交换层析步骤，优选的是阴离子交换层析步骤。阴离子交换树脂可以呈现任何带正电的配体，例如Q基团。
在特定的实施方式中，本工艺的第二步骤包括用多式阴离子交换树脂接触从第一步骤获得的洗出液。更具体地，多式阴离子交换树脂包含阴离子交换基团以及一种或多种能提供与目标抗体的合作性相互作用的进一步的基团。所述多式阴离子交换树脂包含第一基团，其能够与目标化合物的带负电的位点相互作用，和第二基团，其能够产生至少一种相互作用，所述相互作用不同于与所述目标化合物的电荷-电荷相互作用。关于这一点，理解的是，分离基质的基团的相互作用的不同方式针对相同的目标化合物，即，每个目标化合物理想地被两种或多种相互作用的方式吸附。本领域技术人员理解的是，这种功能基团可以在相同的配体上出现，在这种情况下，每个配体是多式的，或在不同的配体上出现，在这种情况下分离基质的总体是多式的。在一个实施方式中，所述多式阴离子交换树脂的阴离子交换基团是强的离子交换剂。在可选择的实施方式中，所述多式阴离子交换树脂的阴离子交换基团是弱的离子交换剂。在特定的实施方式中，所述多式阴离子交换树脂包含芳香族基团。在另一个实施方式中，所述配体选自由N-苯甲基-N-甲基乙醇胺、N，N-二甲基苯甲基胺、2-氨基苯并咪唑和thiomicamine构成的组。根据以上关于支持物和固定的讨论，用于本方法的多式阴离子交换树脂可以由本领域的技术人员容易地制备。已经公开了多式阴离子交换基团，参见例如US6,702,943(AmershamBiosciences)，通过引用将其包括在此。在最佳的实施方式中，本工艺的第二步骤是在非结合条件下在多式阴离子交换树脂上进行的阴离子交换步骤。因而，在这个实施方式中，将第一步骤产生的洗出液在非结合条件下施加到第二层析树脂上，容许吸附混杂物而抗体从流通物中回收。
本工艺对于回收任何单克隆或多克隆抗体是有用的，例如来源于哺乳动物宿主，例如小鼠、啮齿动物、灵长类和人类的抗体，或来源于培养的细胞例如杂交瘤的抗体。在一个实施方式中，所述回收的抗体是人类或人源化抗体。所述抗体可以是任何类型的抗体，即，选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM构成的组。在一个实施方式中，要纯化的抗体是能够与蛋白A结合的抗体，或含Fc的抗体片段或融合蛋白。在特定的实施方式中，回收的抗体是免疫球蛋白G(IgG)。在本文中，要理解的是，术语“抗体”还包括抗体片段和任何包含抗体或抗体片段的融合蛋白。因而，本发明还包括纯化上述抗体以及包含这种抗体的融合蛋白的任何一种的片段。根据本发明分离的抗体作为药物是有用的，例如包含为特定个体设计的活性成分的个人化药物。根据本发明分离的抗体在研究中和在诊断领域中也是有用的。
如以上讨论的，在此讨论的多式阳离子交换树脂的多式配体通常包含阳离子交换基团，即带负电的或可带电的基团，和至少一个芳香族或杂芳香族环系统。然而，本领域的技术人员容易理解的是，通过将至少两种不同种类的配体附着到支持物可以制备等效的树脂，其中一种配体包含阳离子交换基团，而另一种包含芳香族或杂芳香族环系统。因而，在此讨论的功能性可以通过单个连结基团、或通过不同的连结基团来与支持物连结。因而，在一个实施方式中，本发明涉及从液体中俘获一种或多种抗体的工艺，该工艺包括使所述液体接触层析树脂来将抗体吸附在配体上，所述树脂是多式的，并包含已经固定了配体的支持物，其中所述树脂包含在相同或不同配体上呈现的阳离子交换基团和芳香族或杂芳香族环系统，在所述系统中成环原子选自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子构成的组。在另一个实施方式中，本发明涉及从液体纯化一种或多种抗体的工艺，该工艺包括使所述液体与第一层析树脂接触以将所述抗体吸附到配体上，所述树脂是多式的，并包含已经固定了配体的支持物，其中所述树脂包含在相同或不同配体上呈现的阳离子交换基团和芳香族或杂芳香族环系统，添加洗脱液以从所述树脂释放抗体；用第二层析树脂接触如此获得的洗出液。以上所讨论的也同样很好地适用于多式阴离子交换树脂，在该实施方式中第二层析步骤在多式阴离子交换树脂上进行。
在第二个方面，本发明是试剂盒，在独立的区室中包含多式层析树脂；第二层析树脂；至少两种不同的缓冲液；和描述如何纯化抗体的书面说明，其中多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统。在一个实施方式中，所述芳香族或杂芳香族实体的成环原子选自由碳(C)、硫(S)和氧(O)构成的组。在可选择的实施方式中，在不同的配体上呈现不同的基团，而是层析树脂仍包含约相等比例的每种基团，并且基本上所有的基团对于与目标相互作用是有效的。本试剂盒可以用于任一上述描述的工艺用来纯化抗体。在有益的实施方式中，所述树脂存在于由任何常规材料制成的柱中，所述常规材料例如，生物相容的塑料，例如聚丙烯，或玻璃。所述柱可以是适合于抗体的实验室规模或大规模纯化的大小。在特定的实施方式中，所述柱装备有luer衔接器、tubing连接器和domednuts。在有益的实施方式中，所述多式层析树脂存在于层析柱中，其是一次性的(disposable)种类。通过在使用后丢弃树脂，消除了在不同工艺之间交叉污染的风险。
最后，本发明包括一次性的层析柱用于纯化抗体，该柱包含多式层析树脂，所述多式层析树脂包含在相同或不同配体上的阳离子交换基团和芳香族和/或杂芳香族环系统。在一个实施方式中，所述一次性的层析柱包含多式层析树脂，其中每个配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统。在一次性的柱的特定实施方式中，所述多式配体的芳香族或杂芳香族实体的成环原子选自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子构成的组。本发明的一次性的层析柱可以填有用于常规液相色谱的树脂，或具有适合于膨胀床吸附的形式的树脂，膨胀床吸附是一种在运作期间树脂被液化的方法。在最后提及的情况中，带有配体的支持物具有某些常规的高密度填料，例如钢或玻璃。
附图的详细说明
附图1显示了在多式阳离子交换层析媒介(U1128042)上纯化含有IgG的进料的层析谱，如以下的实施例3所解释的。收集级分9到16并集中，用于通过凝胶过滤进行分析。测定回收率为＞95％。280nm处的UV吸收表示为实线，传导性表示为短划线，pH值表示为点线。
附图2显示了对进料的分析性凝胶过滤层析谱(柱U1128042上的起始材料)，如以下的实施例3所解释的。在0ml注射样品，IgG峰在13ml出现。在13ml处的峰是目标MAb，其余的峰是聚集物和/或宿主细胞蛋白。
附图3显示了从U1128042洗脱的集中级分9-16的分析性凝胶过滤层析谱，如实施例3所解释的。在13ml处的峰是目标MAb，其余的峰是洗脱的样品中的聚集物和/或宿主细胞蛋白。
附图4显示了根据本发明的工艺的步骤2的层析谱，更具体的是使用多式阴离子交换层析的精炼步骤，如以下的实施例4所解释的。在调整pH值到6后将来自第一纯化步骤(实例3)的洗出物的集中的级分(9-16)施加到柱上。通过分析性凝胶过滤估计的来自流通物、在集中的级分3-10中的IgG纯度是非常高的(参见附图5)。使用pH值6，预计IgG在流通物中停止。然而，层析谱的形状表明，某些蛋白与柱结合。这也通过在这个层析操作之后计算回收率而确认了，回收率是80％。在用运动缓冲液洗涤开始时所见的额外的峰，可能是离开所述柱的松散结合的蛋白。
附图5显示了在柱238092上施加的流通物(级分3-10)的分析性凝胶过滤层析谱，如以下的实施例4所解释的。在13处的峰是IgG，在10处的峰是聚集物。通过这种分析方法实际上不能检测出污染宿主细胞蛋白。标度与附图2和3不相同，而是更为放大的。
实验部分
当前的实施例仅为了说明性的目的提供，无论如何不能解释为限制由附随的权利要求定义的本发明的范围。以下和本说明书中其他地方提供的所有参考文献通过引用合并在此。
实施例1：多式阳离子交换树脂(第一步骤)的制备
以下给出的基质的体积是指澄清床(settled bed)体积。按克给出的基质重量是指抽吸(水泵)干重。要理解的是，这些基质仍是水溶的材料。以下所指的搅动是通过悬浮的、电机驱动的的搅拌器进行，因为提示了使用磁棒搅拌器会损坏珠子。功能性的分析，和珠子上烯丙基化、环氧化作用的程度或离子交换基团的取代程度的确定，参考本领域技术人员公知的常规方法。通过对凝胶的另外的元素分析，特别是分析硫原子，最终补足以下的方法。
表1：多式配体原型的化学结构
Figure S05806276X20060906D000141
实施例1(a)：多式配体原型U1012054
在这个实施例中，描述了3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸是怎样与NHS活化的琼脂糖载体连结的。
硫丙酸 SepharoseTM的制备：向100ml烯丙基活化的(0.3mmol烯丙基/ml)SepharoseTM 6 Fast Flow凝胶(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)、4g AcONa和100ml蒸馏水的搅拌的悬浮液中添加溴，直到获得持久的黄色。然后添加甲酸钠直到悬浮液完全地脱色。过滤反应混合物，用500ml蒸馏水湿润凝胶。然后将活化的凝胶直接转移到反应容器，用17.5ml硫丙酸(每个烯丙基6同等物)和12g NaCl的水溶液(50ml蒸馏水)处理，在添加前其pH值用50％aq.NaOH调节到11.5。在搅动下在50℃进行反应18小时。过滤反应混合物和用500ml蒸馏水洗涤，产生具有0.29mmol CO2H基团/ml凝胶的取代程度的硫丙酸SepharoseTM凝胶。
用N-羟基琥珀酰亚胺活化凝胶：然后用300ml 1M NaCl、500ml 0.1MHCl、500ml 50％aq.丙酮、500ml丙酮连续地洗涤100ml所产生的硫丙酸SepharoseTM。洗涤之后将凝胶置于丙酮中沉积，虹吸抽出上清液，借助20ml的丙酮将沉积的珠子转移到反应容器。然后添加80ml丙酮中15.2g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液，和80ml丙酮中二环己基碳二亚胺的另一种溶液。将反应浆液在30℃下搅动18小时。过滤之后，在整个工作日用150ml异丙醇慢慢地洗涤(重力流)凝胶10次。反应后用NH4OH估计NHS活化的程度约80％，相当于约0.23mmol NHS官能团/ml凝胶的活化。
多式配体与NHS活化的硫丙酸SepharoseTM的连结：如WO02/05959中描述的制备3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸(配体12)。制备565mg的3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸(2.27mmol)在2ml蒸馏水、2ml1M NaHCO3和2ml乙醇中的溶液的可溶混合物，小心添加50％含水NaOH调节到pH值8.5。
用20ml冰冷的1mMHCl溶液快速洗涤NHS-活化的硫丙酸SepharoseTM(10ml)。然后将凝胶转移到Erlenmeyer中，向其中添加thineyl丝氨酸溶液。将反应混合物置于摇床上(150rpm)在室温下18小时。
过滤反应混合物之后，用40ml蒸馏水、20ml乙醇、20ml 0.25M aq.乙醇胺、20ml蒸馏水、20ml1M aq.NaCl、和20ml蒸馏水连续地洗涤凝胶。
实施例1(b)-(d)
在以下的实施例1(b)-(d)中，使用D，L-高半胱氨酸硫内酯作为支架，如WO03/024588中描述的制备多式配体原型U790P65、U790P71和U790P73。简言之，在通过高半胱氨酸硫内酯与酰基氯或酐反应形成酰胺键之后，用碱水解来实现硫内酯环的开放，将产生的化合物进一步与活化的SepharoseTM 6FF(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)连结。
实施例1(b)：多式配体原型U790P73：将30ml DCM中的苯甲酰氯(8.7ml，75mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，120ml)中的D，L-高半胱氨酸硫内酯(11.5g，75mmol)和二异丙胺(DIPEA)(26ml，150mmol)的溶液中。在室温下搅拌混合物过夜。在真空下蒸发溶剂，用乙酸乙酯(300ml)提取反应残余物。用aq.柠檬酸10％(w/w，200ml)、aq.K2CO310％(200ml)、水(200ml)洗涤有机相，用硫酸钠干燥。过滤之后，除去溶剂产生白色固体(13.8g，83％)。在0℃，向276mg(1.25mmol)这种白色固体中添加5N氢氧化钠溶液(5ml)，混合物在室温下进一步搅拌2小时。将从烯丙基化的SepharoseTM 6 Fast Flow(250μmol/ml)开始根据公知工艺获得的溴化的SepharoseTM 6 Fast Flow(10ml)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)与配体(如上所述)的碱性溶液混合，加热到50℃过夜。反应之后，过滤凝胶，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗涤。然后通过滴定酸根来测量凝胶的离子容量，得出约130μmol/ml凝胶。
实施例1(c)：多式配体原型U790P65：将4ml DCM中的3，4，5-三甲氧基-苯甲酰氯(2.37g，10.3mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，6ml)中的D，L-高半胱氨酸硫内酯(1.58g，10.3mmol)和二异丙胺(DIPEA)(3.58ml，20.6mmol)的溶液中。在室温下搅拌混合物过夜。在真空下蒸发溶剂，用乙酸乙酯(50ml)提取反应残余物。用aq.柠檬酸10％(w/w，30ml)、aq.K2CO3 10％(30ml)、水(30ml)洗涤有机相，用硫酸钠干燥。过滤之后，除去溶剂产生白色固体(2.21g，69％)。在0℃，向389mg(1.25mmol)这种白色固体中添加5N氢氧化钠溶液(5ml)，混合物在室温下进一步搅拌2小时。将从烯丙基化的SepharoseTM 6 Fast Flow(250μmol/ml)开始根据公知工艺获得的溴化的SepharoseTM 6 Fast Flow(10ml)(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)与配体(如上所述)的碱性溶液混合，加热到50℃过夜。反应之后，过滤凝胶，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗涤。测量凝胶的离子容量为59μmol/ml凝胶。
实施例1(d)：多式配体原型U790P71
将4ml DCM中的苯基戊二酐(1.96g，10.3mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，6ml)中的D，L-高半胱氨酸硫内酯(1.58g，10.3mmol)和二异丙胺(DIPEA)(3.58ml，20.6mmol)的溶液中。在室温下搅拌混合物过夜。在真空下蒸发溶剂，用5N氢氧化钠溶液(10ml)直接处理反应残余物，在室温下进一步搅拌2小时。将从烯丙基化的SepharoseTM 6 Fast Flow(250μmol/ml)开始根据公知工艺获得的溴化的SepharoseTM 6 Fast Flow(10ml)(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)与如上所述的配体的1.4ml碱性溶液混合，加热到50℃过夜。反应之后，过滤凝胶，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗涤。然后测量凝胶的离子容量为110μmol/ml凝胶，相当于55μmol/ml凝胶的配体取代水平。
实施例2：多式阴离子交换树脂(第二步骤)的制备
一航的
基质的体积是指澄清床体积。
按克给出的基质重量是指抽吸干重。要理解的是，这些基质仍是水溶的材料。
大规模反应搅动是指悬浮的、电机驱动的搅拌器，因为提示了使用磁棒搅拌器会损坏珠子。小规模反应(最多20ml或g凝胶)在封闭的小瓶中进行，搅动是指使用摇床。
功能性的分析，和珠子上烯丙基化、环氧化作用的程度或离子交换基团的取代程度的确定，参看常规方法。
1.在基质上引入烯丙基团
在典型的工艺中，用烯丙基缩水甘油醚进行烯丙基化，但是注意到，在固相支持物上引入烯丙基团也可以使用烯丙基溴容易地实现。
用烯丙基缩水甘油醚活化SepharoseTM
将100g数量的SepharoseTM 6 FF抽吸干燥至80g，与0,4g NaBH4、12g Na2SO4和45ml50％NaOH水溶液混合。在50℃将混合物搅拌1小时。在添加100ml烯丙基缩水甘油醚之后，将悬浮物在50℃下强烈搅拌额外的20小时。过滤反应混合物之后，用500ml蒸馏水、500ml乙醇、200ml蒸馏水、200ml 0,2M乙酸和500ml蒸馏水连续地洗涤凝胶。滴定得出0.32mmol烯丙基/ml凝胶的取代程度。
2.配体连结到基质上
优选的在碱性条件下通过烯丙基的溴化和亲核取代来实现与基质的连结。
通过溴化来活化烯丙基SepharoseTM：
向100ml烯丙基活化的SepharoseTM 6 FF(0.32mmol烯丙基/ml排水的凝胶)、4g AcONa和100ml蒸馏水的搅拌的悬浮液中添加溴，直到获得持久的黄色。然后添加甲酸钠直到悬浮液完全地脱色。
过滤反应混合物，用500ml蒸馏水湿润凝胶。然后将活化的凝胶直接转移到反应容器，与合适的多式阴离子交换配体进一步反应。
2-氨基苯并咪唑-SepharoseTM
将如上所述获得的10g数量的溴活化的凝胶(0.32mmol烯丙基/ml排水的凝胶)转移到反应小瓶中，反应小瓶含有在水(6ml)和乙醇(3ml)中的、通过添加50％NaOH水溶液调节到pH12的2-氨基苯并咪唑(2g)的溶液。
在搅动下在55℃进行反应17小时。将反应混合物过滤之后，用3×10ml蒸馏水、3×10ml水性0.5HCl和最后的3×10ml蒸馏水连续地洗涤凝胶。获得的2-氨基苯并咪唑具有0.17mmol胺基/ml凝胶的取代程度。
Figure S05806276X20060906D000191
2-氨基苯并咪唑
实施例3：抗体俘获到多式阳离子交换剂
材料和方法
在层析柱中，将包含如以上的实施例1所描述制备的、与SepharoseTM 6 FF连结到40μmol/ml凝胶的取代水平的配体U790P73(N-(2-氧-四氢-噻吩-3-基)-苯甲酰胺)的原型树脂TricornTM 5/50装填到1ml的柱体积。
起始材料是根据标准方法制备的中国的仓鼠卵巢(CHO)细胞澄清的进料。该进料含有人源化IgG1，其是碱性的，表现出9.1的pI值和1.7的消光系数(ε)，浓度0.8g mAb/L。
通过添加浓缩的乙酸将进料的pH值调节到6，之后将25ml进料加载到多式阳离子交换柱上。50mM磷酸盐缓冲液pH6用作加载缓冲液，加载期间的流速是100cm/h。在14倍柱体积的洗涤期之后，通过pH梯级，使用25mM磷酸盐缓冲液，pH7.5来洗脱结合的蛋白。收集流通级分和来自洗涤的2ml级分和洗脱物。
分析性凝胶过滤
进行分析性凝胶过滤来获得对洗脱级分的纯度的估计。分析了起始材料以及层析操作的流通物和集中的洗出物。使用10mM磷酸盐缓冲液、0.14M NaCl，pH7.4作为运动缓冲液和0.5ml/min的流速，将50μl的样品施加到SuperdexTM 200 10/300 GL柱上。
分析集中的洗出液中的蛋白浓度用于测定回收率
在洗脱缓冲液中将来自洗出物的总库稀释五倍。在分光光度计中测量280nm的吸光率，将三份吸光率的平均值用于根据公式1来测定蛋白浓度。计算洗脱的蛋白的总量，并除以施加到柱上的IgG的总量来计算回收率。
公式1：
C＝A*稀释因数/(1×ε)
其中
C＝IgG的浓度(mg/ml)
A＝280nm的吸光率
1＝通路长度
(ε)＝MAb的摩尔消光系数(mg ml-1)
结果
使用pH6的结合缓冲液将IgG结合到柱上，可以使用pH7.5来洗脱。与起始材料的IgG纯度相比，来自洗出物的集中的级分(9-16)含有高纯度的IgG。在流通物中存在非常少的目标蛋白(＜5％)，回收率估计是＞95％。在多式阳离子交换剂上进行纯化的层析谱可见附图1，来自对起始材料(进料)、和来自俘获步骤的集中的洗出液的分析性凝胶过滤的层析谱在附图2和3中示出。
更具体地，首先，在将进料的pH值调整到6之后，将CHO细胞澄清的进料加载到多式阳离子交换层析媒介(U1128042)上。50mM磷酸盐、20mM Na-琥珀酸盐，pH6用作结合缓冲液，使用pH梯级洗脱结合的蛋白。25mM磷酸盐缓冲液pH7.5用于洗脱。收集级分9到16并集中，用于通过凝胶过滤进行分析。测定回收率收为＞95％。在附图1中，280nm处的UV吸收表示为实线，传导性表示为短划线，pH值表示为点线。
对于进料的分析性凝胶过滤层析(柱U1128042上的起始材料)，样品体积是50μl，洗脱液为PBS缓冲液，pH7.4，流速0.5ml/min。在0ml注射样品，IgG峰在13ml出现。在附图2中，在10ml处的峰是IgG聚集物，其余的峰是宿主细胞蛋白。
从U1128042洗脱的集中级分9-16的分析性凝胶过滤层析谱在附图3中示出。在第一层析步骤之后，污染蛋白被很大程度地减少了。在0ml注射样品，在13ml处的峰是IgG，在10ml处的峰是IgG聚集物。在洗脱的样品中的另一个峰是宿主细胞蛋白。
实施例4：通过阴离子交换精炼
材料和方法
媒介(238092)包含以170μmol/ml凝胶的取代水平与SepharoseTM6FF连结的配体2-氨基苯并咪唑，将媒介填充到层析柱HR5/5中，到1ml的柱体积。
来自实施例2的集中的洗出液，级分9-16用作这个纯化步骤的起始材料。洗出液中的pH值通过添加10％乙酸调节到6。使用25mM磷酸盐pH6作为加载缓冲液将8ml调整了pH值的洗出液、相当于大约10mg IgG施加到柱238092上。选择缓冲条件、pH值和传导性，以成为对于IgG是非结合调节的。使用0.5ml/min的流速，在加样和洗涤期间收集1ml级分。
来自流通物的集中的级分(3-10)的IgG纯度通过分析性凝胶过滤进行分析。测定洗脱的蛋白的数量，计算回收率。在实施例2的材料和方法中描述了分析性凝胶过滤的方法和蛋白浓度的测定和回收率的计算。
结果
在俘获步骤中使用多式阳离子交换层析进行纯化的洗脱的IgG级分进一步通过阴离子交换层析来纯化。在这个精炼步骤中，使用非结合条件将IgG加载到柱上。通过分析性凝胶过滤估计在来自这个精炼步骤的流通物的集中的级分中IgG纯度是非常高的。虽然使用了非结合条件，一些IgG结合到柱上，计算的回收率为80％。
在多式阴离子交换剂上进行的纯化的层析谱在附图4中可见，对流通级分进行分析性凝胶过滤的层析谱在附图5中示出。
为了获得附图6，在调整pH值到6后将来自第一纯化步骤(实例3)的洗出物的集中的级分(9-16)施加到柱上。通过分析性凝胶过滤估计的来自流通物、在集中的级分3-10中的IgG纯度是非常高的(参见附图5)。使用pH值6，预计IgG在流通物中停止。然而，层析谱的形状表明，某些蛋白与柱结合。这也通过在这个层析操作之后计算回收率而确认了，回收率是80％。在用运动缓冲液洗涤开始时所见的额外的峰，可能是离开所述柱的松散结合的蛋白。
为了获得附图7，来自柱238092上的施加的流通物(级分3-10)的分析性凝胶过滤层析谱，在13处的峰是IgG，在10处的峰是聚集物。通过这种分析方法实际上不能检测出污染宿主细胞蛋白。标度与附图2和3不相同，而是更为放大的。

Claims (16)

1.从液体纯化一种或多种抗体的工艺，所述工艺包括使所述液体与包含支持物的第一层析树脂接触，所述支持物上已经固定了多式配体，来将所述抗体吸附到所述树脂上，其中每个多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统；添加洗脱液以从所述树脂释放抗体；和用第二层析树脂接触如此获得的洗出液。
2.根据权利要求1的工艺，其中与多式层析树脂接触的液体是细胞培养液或发酵肉汤。
3.根据权利要求1或2的工艺，其中所述多式配体的芳香族或杂芳香族环系统的成环原子选自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子构成的组。
4.根据权利要求1或2的工艺，其中所述多式配体的阳离子交换基团是弱阳离子交换剂。
5.根据权利要求1或2的工艺，其中所述第二层析步骤选自由离子交换层析；疏水性相互作用层析(HIC)；固定的金属亲和层析(IMAC)；和亲和层析构成的组。
6.根据权利要求5的工艺，其中所述第二层析步骤是离子交换层析。
7.根据权利要求1或2的工艺，其中所述第二层析步骤是阴离子交换层析。
8.根据权利要求1或2的工艺，其中所述第二层析步骤是多式阴离子交换层析。
9.根据权利要求1或2的工艺，其中从所述第二层析树脂的流通物中回收抗体。
10.根据权利要求1或2的工艺，其中抗体从第二层析树脂上洗脱。
11.根据权利要求1或2的工艺，其中所述抗体是单克隆抗体。
12.根据权利要求1或2的工艺，其中所述抗体是多克隆抗体。
13.从液体纯化一种或多种抗体的工艺，所述工艺包括使所述液体与第一层析树脂接触以将所述抗体吸附到配体上，所述树脂是多式的，并包含已经固定了配体的支持物，其中所述树脂包含在相同或不同配体上存在的阳离子交换基团和芳香族或杂芳香族环系统；添加洗脱液以从所述树脂释放抗体；和用第二层析树脂接触如此获得的洗出液。
14.用于在两步工艺中纯化一种或多种抗体的试剂盒，所述试剂盒在独立的区室中包含填有层析树脂的第一层析柱，所述树脂是多式的并包含已经固定了配体的支持物，其中在相同或不同的配体上存在阳离子交换基团和芳香族或杂芳香族环系统；填有层析树脂的第二层析柱；以及用于吸附和/或洗脱抗体的一种或多种缓冲液。
15.根据权利要求14的试剂盒，其中所述多式配体的芳香族或杂芳香族环系统的成环原子选自由碳(C)、硫(S)和氧(O)原子构成的组。
16.根据权利要求14或15的试剂盒，其中所述第一层析柱是无菌的柱。
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