CN1926146A - 抗体纯化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在溶液中从一种或多种污染物分离抗体的方法，该方法包括用包含支持物的层析树脂接触所述溶液，在所述支持物上已经固定了多式配体，其中多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统。在一个实施方式中，所述芳香族或杂芳香族实体的成环原子在C、S或O之间选择，和所述阳离子交换基团是弱阳离子交换剂。本发明可以用作单步骤过程，或作为在蛋白A柱上俘获之后的精炼步骤。

Description

抗体纯化
技术领域
本发明涉及抗体的纯化方法。更具体地，本方法有利地用作亲和层析之后的步骤来除去亲和树脂产生的污染物。本发明还包括试剂盒，用于从抗体与来自亲和层析树脂的残基之间形成的污染复合物中纯化抗体。
背景
免疫系统由许多相互依赖的细胞类型组成，它们集体地保护躯体对抗细菌、寄生虫、真菌、病毒感染和对抗肿瘤细胞的生长。免疫系统的卫士是它们宿主的血流中不断地漫游的巨噬细胞。当受到感染或免疫的攻击时，巨噬细胞通过吞入标记了称为抗原的外来分子的侵入物来进行响应。这个由辅助T细胞介导的事件建立了引起B细胞刺激的复杂的反应链。这些B细胞随后产生称为抗体的蛋白，其与外来侵入物结合。在抗体和抗原之间的结合事件标记了外来侵入物以通过吞噬作用或补体系统的活化来进行破坏。存在着许多不同种类的抗体或免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它们的不同不仅在于生理学作用，还在于它们的结构。从结构的角度来看，IgG抗体是已经广泛研究了的特别种类的免疫球蛋白，可能是由于它们在成熟免疫反应中起到的显著作用。
当今在人类和兽医学的诊断、保健和治疗领域的大量不同应用中利用了免疫球蛋白所拥有的生物学活性。实际上，在近几年中，单克隆抗体和重组抗体构建体已经成为当前在临床试验中进行研究的和接受FDA批准作为治疗剂和诊断剂的最大的一类蛋白。作为对表达系统和产生策略的补充，设计了纯化方案来以简单和低成本的方式获得高纯度抗体。
分离免疫球蛋白的传统方法基于包含免疫球蛋白的蛋白级分的选择性可逆沉淀，而将其他的蛋白质组群留在溶液中。典型的沉淀试剂是乙醇、聚乙二醇、易溶盐例如硫酸铵和磷酸钾和辛酸。一般地，这些沉淀方法得出非常不纯的产物而同时是费时和费力的。此外，向原料中添加沉淀试剂使得难以将上清液用于其他目的并且产生了处理难题，当论及免疫球蛋白的大规模纯化时这是特别相关的。
分离免疫球蛋白的可选择的方法是层析，其包括紧密相关的分离方法的家族。将层析与大多数其他物理和化学的分离方法区分开来的特征是使两种互不混合的相接触，其中一个相是固定的，另一个是移动的。引入移动相的样品混合物在被移动相携带通过系统时，在固定相和移动相之前经历了一系列的相互作用。相互作用利用了样品中的成分的物理或化学性质的差异。在移动相运动通过含有固定相的柱的影响下，这些差异决定了单个组分的移动速度。分离的成分按照与固定相的相互作用升高的顺序出现。阻滞最小的成分首先洗脱，最强烈滞留的材料最后洗脱。当样品成分从柱上洗脱时，当一种成分被阻滞到足以防止与邻近的溶解物的区域重叠时，得到了分离。对于每种特定的分离目的不断地进行着努力来设计最佳的固定相。这种固定相通常包括支持基质或基础基质，在其上连接了包含功能基团即结合基团的配体。根据所利用的相互作用的原理，对每一种层析都给出了参考。
因而，离子交换层析常被用于免疫球蛋白的分离。在阴离子交换层析中，免疫球蛋白的带负电的氨基酸侧链将与层析基质的带正电的配体相互作用。另一方面在阳离子交换层析中，免疫球蛋白的带正电的氨基酸侧链将与层析基质的带负电的配体相互作用。
疏水性相互作用层析(HIC)也是用于免疫球蛋白分离的广泛描述的方法。然而，疏水性基质需要向原料中添加易溶盐来使免疫球蛋白有效地结合。通过以连续的或阶梯式的梯度来降低易溶盐浓度，从基质上释放结合的抗体。如果目的是高纯度产品，建议的是将疏水性层析与进一步的步骤结合。因而，这种步骤的缺点是必需向原料中添加易溶盐，因为这产生了一些难题并且因而提高了大规模使用的成本。对于除了细胞培养上清液以外的其他原料，例如，乳清、血浆和蛋黄，向原料添加易溶盐在许多情况下阻碍了大规模应用，因为盐会妨碍耗尽了免疫球蛋白的原料的任何经济上可行的用途。在大规模应用中的另外的难题是数千升废料的处理。
蛋白A和蛋白G亲和层析是用于分离和纯化免疫球蛋白、特别是分离单克隆抗体的流行和普遍的方法，主要是由于易于使用和所获得的高纯度。与离子交换、疏水性相互作用、羟磷灰石和/或凝胶过滤步骤，特别是基于蛋白A的方法组合使用，已经成为许多生物药公司选择的抗体纯化方法，参见，例如WO 8400773和US 5,151,350。然而，不论它们的普遍运用和许多益处，公知的是，基于蛋白A的层析树脂由于配体的肽键而呈现了一定程度的碱敏感性。此外，当使用基于蛋白A的树脂来从细胞培养基纯化抗体时，其中蛋白酶的存在可能引起蛋白A配体或其肽片段的漏出。由于大多数漏出的蛋白A仍将倾向于与抗体形成复合物，来自亲和柱的洗脱液因而可能包含被蛋白A-抗体复合物以及蛋白A污染的抗体。
在WO 03/041859(Boehringer Ingelheim Pha rma KG)中已经出现了降低亲和层析基质的配体漏出的尝试，其中建议用至少一种表面活性剂来预先处理，例如，蛋白A基质来减少配体漏出。可以用例如5-15倍床体积的表面活性剂来处理亲和基质。接触时间对于该过程的有效性是决定性的。例如，在室温下，至少16h的接触时间是减少漏出所需的。在更高的温度下，接触时间可以更短。
在US 4,983,722(Miles Inc.)中提供了对于配体漏出难题的可选择方法，其中通过将抗体-蛋白A混合物暴露于阴离子交换材料以吸附两种成分，然后在提高离子强度的条件下次序地洗脱抗体和蛋白A，来从混合物中选择性地分离蛋白A。示例性的阴离子交换剂是二乙氨基乙基(DEAE)Trisacryl M或DEAE SepharoseTM。
US 5,429,746(SmithKline Beecham Corp.)涉及应用疏水性相互作用层析作为抗体纯化中的一个步骤。它公开了可以在采用例如蛋白A的亲和层析之后使用HIC，任选的具有中间的阳离子交换层析步骤。用弱的阳离子交换剂(CM SepharoseTM FF)例示了阳离子交换层析，其被调整到pH 5.5进行吸附，用40mM柠檬酸盐、100mM氯化钠，pH 6的洗脱缓冲液进行洗脱。施加到HIC柱，随后进行亲和和/或阳离子交换层析的混合物则可能含有污染物例如免疫球蛋白聚集物、错误折叠的碎片、宿主细胞蛋白和来自亲和层析步骤的残余材料。在这种过程中，抗体首先吸附到蛋白A层析支持物并被洗脱；然后吸附到阳离子交换层析支持物并从其上选择性地洗脱；最终吸附到HIC支持物并洗脱。
还已经建议陶瓷的羟磷灰石对于免疫球蛋白精炼也是有用的。更具体地，已经报道了(Chromatography，tech note 2849；S.G.Franklin，Bio-Rad Laboratories，Inc.，2000 Alfred Nobel Drive，Hercules，CA94547USA)，可以在CHT陶瓷羟磷灰石(Bio-Rad)上从未分级培养基中的IgG1-蛋白A复合物中分辨出IgG1。更具体地，羟磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)是磷酸钙的一种形式，其已经显示了具有独特的分离性质。然而，已知基于羟磷灰石的基质也包括某些缺点。例如，由于Ca漏出，它们在酸性pH值下是不稳定的，并且它们对螯合剂例如EDTA敏感。此外，已经显示了，难以使用基于羟磷灰石的基质来开发和规模化耐用和可重现的纯化方法，因为例如在大的柱中难以包装羟磷灰石和难以维持性能。最后，存在着由金属离子污染和钙离子的交换引起树脂性质改变的风险，这种改变是管理机构非常关切的。
为了避免稳定性难题和从基于蛋白的亲和柱的漏出，已经提出了具有不同选择性的纯化学的树脂。例如，已经提出了将多式(multi-modal)层析用于抗体纯化，其中两种或多种不同的但共同作用的位点与目标相互作用。更具体地，陈述了一种包含巯基苯并咪唑磺酸配体的吸附剂MBI Hypercel(BioSepra)来提供与单克隆和多克隆抗体的疏水性以及离子相互作用。疏水性相互作用假定是归因于芳香环系统，而离子相互作用应当归因于SO3 -取代基，已知其是强阳离子交换剂。此外，MBI配体的芳香族系统的氮原子是在一定条件下可带电的，因而可以提供与带负电基团的离子相互作用。已经公开了MBIHypercel作为对基于蛋白A的树脂的替代物来俘获和纯化治疗性和诊断性抗体。
US 6,498,236(Upfront Chromatography)公开了一种从溶液，例如杂交瘤细胞培养上清液、动物血浆或血清分离或纯化免疫球蛋白的方法。提出了将该方法作为对使用蛋白A、蛋白G、合成肽和其他相对高分子量配体的替代，由于配体和免疫球蛋白的各自分子量之间的微小差异，以及由于它们相互结合的天然趋势，已经陈述了这些配体包含了一些缺点。根据US 6,498,236，对于配体是否将与免疫球蛋白有效地结合，配体上存在哪一种取代基，例如苯环，是决定性的。更具体地，在所公开的方法中使用的固相基质由化学式M-SP1-X-A-SP2-ACID来描述，其中M代表基质主干，SP1代表间隔区，X代表O、S或NH，A代表单环或二环的任选的取代芳香族或芳香杂环部分，SP2代表任选的间隔区和ACID代表酸性基团。配体优选的来源于选自由苯并咪唑、苯并噻唑和苯并唑构成的组的化合物。
WO97/10887(Novo Nordisk A/S)涉及亲和性配体-基质的结合物，在蛋白质材料例如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素或类似物、衍生物和其片段的纯化中是有用的。发明WO97/10887是基于这种观点，疏水性配体的选择性可以通过提高疏水性成分的复杂度和空间几何结构来提高。这个观点引起了一组亲和性配体的发现，这个组限于具有芳香杂环实体的结构，其中至少一个成环原子是氮。在WO 97/10887中公开的配体，是由计算机模拟技术和/或对模拟配体库的筛选来设计的，提出了用于替代蛋白A和蛋白G，蛋白A和蛋白G都是用于从发酵液俘获免疫球蛋白的公知的配体。
进一步的，在WO 03/024588(Amersham Biosciences AB)中公开了合成多式阳离子交换媒介的方法。更具体地，将包含两个功能性，优选的同型半胱氨酸硫内酯(thiolactone)的支架衍生化并与固体基础基质反应。更具体地，两种功能性之一，优选的硫(sulphur)，用于与基质连接，第二种功能性是可以转化成离子基团的一种。因而，如此产生的多式媒介能够进行离子相互作用以及进一步的种类的相互作用，例如疏水性相互作用，取决于衍生化作用的性质。在实验部分，使用三种模型蛋白测试了生产的阳离子交换剂，即，细胞色素C(CytC)、牛血清白蛋白(BSA)和免疫球蛋白G(IgG)。
发明的简要说明
在一个方面，本发明提供了纯化抗体的耐用的方法。在本发明的特定的方面，提供了一种方法用于从亲和层析柱，例如蛋白A柱的洗出物中除去漏出物。这可以如附随的权利要求中所定义的来实现。
因而，在本发明的特定的方面，提供了用于纯化高纯度单克隆或多克隆抗体的、作为基于蛋白A的亲和层析的补充的有用方法。
在本发明的进一步的方面，提供了这样一种方法，其为当前使用的精炼方法提供了不同的选择性。
根据以下的详细公开，本发明的其他方面和益处将更为明显。
附图的简要说明
附图1显示了对照实验的结果，如在以下的实验部分公开的，MAb-蛋白A混合物运动通过毛细管而不是柱，以确保延迟容积(delayvolume)是正确的。
附图2显示了第二对照实验的结果，如在以下的实验部分公开的，其中蛋白A溶液在参考基质(SepharoseTM FF，Amersham Biosciences)上运动。
附图3显示了第三对照实验的结果，如在以下的实验部分公开的，其中将蛋白A溶液施加到多式树脂上。
附图4显示了以结合模式分离MAb和MAb-蛋白A聚集物，如在以下的实验部分公开的。
附图5显示了以结合模式分离MAb和MAb-蛋白A聚集物，通过使用优化的洗脱方案进行优化，如在以下的实验部分公开的。
附图6显示了通过凝胶过滤分析附图5的峰，如以下的实验部分描述的。
附图7显示了以“流通模式”分离纯的MAb和MAb-蛋白A聚集物，即，MAbs流过柱时没有被吸附，如以下所描述的。
附图8显示了通过凝胶过滤分析附图7的峰，如以下的实验部分描述的。
附图9显示了以流通模式分离纯的MAb和MAb-蛋白A聚集物，但使用了比附图7中显著更大的样品体积，如在以下的实验部分描述的。
附图10显示了附图9的峰的凝胶过滤分析结果，如以下的实验部分描述的。
定义
在本说明书中术语“抗体”和“免疫球蛋白”可互换地使用。
术语“洗脱液”按其在本领域中的常规含义使用，即，有适合的pH值和/或离子强度以从分离基质释放一种或多种化合物的缓冲液。
术语“亲和层析”是指基于以锁-匙识别的原则在目标生物分子和生物特性配体之间的特异性相互作用的层析。因而，目标和配体将构成亲和配对，例如抗原/抗体、酶/受体，等等。
在此使用术语“层析树脂”来表示已经联结了称为配体的官能团的载体。
术语“多式层析配体”是指能够提供与要结合的物质相互作用的至少两个不同的但共同起作用的位点的配体。这些位点之一提供了在配体和感兴趣的物质之间的吸引人的电荷-电荷相互作用类型。另一个位点一般提供了电子受体-供体相互作用和/或疏水性和/或亲水性相互作用。电子供体-受体相互作用包括例如氢键、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、感生偶极等的相互作用。多式层析配体也称为“混合式”层析配体。
用语“电子供体-受体相互作用”是指，带有游离电子对的负电原子作为供体起作用，并结合缺少电子的原子，缺少电子的原子作为供体的电子对的接受体起作用。(参见例如，Karger et al.，AnIntroduction into Separation Science，John Wiley & Sons(1973)第42页)术语“阳离子交换基团”在此是指带负电的或可带电的基团。
在液相色谱的上下文中术语“俘获步骤”是指分离过程的起始步骤。最通常地，俘获步骤包括澄清、浓缩、稳定化和针对可溶污染物进行重要的纯化。在俘获步骤之后，可以接着进行中间的纯化，除去大部分重要的混杂物，包括DNA、病毒和内毒素。
在液相色谱的上下文中术语“精炼步骤”是指最后的纯化步骤，在其中除去痕量染污物和混杂物留下活性的、安全的产物。在精炼步骤中除去的污染物常常是目标分子或怀疑的漏出产物的构象体(comformer)。
术语“Fc结合蛋白”是指能够与抗体的可结晶部分(Fc)结合的蛋白，包括，例如蛋白A和蛋白G，或其维持了所述结合性质的任何片段或融合蛋白。
发明的详细说明
在一个方面，本发明涉及在溶液中从一种或多种污染物分离抗体的方法，该方法包括用包含支持物的层析树脂接触所述溶液，在所述支持物上已经固定了多式配体，其中多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统，以将抗体和/或污染物吸附在所述树脂上。
在有益的实施方式中，污染物被吸附到所述多式配体上，而基本上纯的抗体级分作为流通物，即不被吸附地，或以结合形式通过随后的选择性洗脱来回收。在此，术语“基本上纯的”理解为意思是基本上所有的污染物都被除去了。最有利地，至少约80％，例如至少约95％，即在95-100％之间，例如至少约98％，即在98-100％之间，和优选的至少约99％，即在99-100％之间的污染物在所述多式层析树脂上被除去。然而，本领域技术人员将理解的是，可能的纯度将取决于施加到层析树脂上的溶液中的抗体浓度以及使用的其他条件。
在本方法的特定实施方式中，施加到多式层析树脂上的溶液是来自于亲和层析树脂的含有抗体的洗出液。在有益的实施方式中，所述亲和层析树脂的配体包含Fc结合蛋白，例如蛋白A，例如天然的或重组的蛋白A。这种亲和树脂是商业上可获得的，例如来自AmershamBiosciences的MabSelectTM。因而，在这个实施方式中，要除去的污染物可能包含释放的蛋白A；蛋白A和抗体之间形成的复合物，例如蛋白A-MAb复合物，该复合物可能包含每个蛋白A分子的多个抗体，例如2-4个抗体与一个蛋白A分子复合；和释放的蛋白A或抗体的聚集物。
在有益的实施方式中，使用常规的液相色谱，即，通过使溶液通过层析柱来进行本方法。为了回收吸附的物质，通过使缓冲液通过所述柱来进行洗脱。如果需要，可以在任何这样的通过之前或之间应用一次或多次洗涤步骤。本领域的技术人员将理解的是，取决于在任何之前的步骤，例如亲和层析中使用的具体条件，产生的洗出液可能需要通过适合的添加或调整来进行整理。注意到即使对于实际的理由这是优选的，如果要纯化来自蛋白A柱的洗出液，本方法不必在亲和层析之后直接进行，或甚至在相同的设备中进行。
在本方法的一个实施方式中，以流通模式将包含期望的抗体的溶液施加到多式层析柱上，在这种情况下大多数抗体将直接通过而污染物被吸附。本领域的技术人员可以容易地修改条件以获得流通，例如，通过调整pH值，这将取决于例如要纯化的抗体的电荷和电荷分布。因而，这个实施方式实质上不同于US 6,498,236，在US 6,498,236中已经特异性地选择了配体来有效地结合免疫球蛋白，如以上所讨论的。此外，在所述US 6,498,236中公开的方法没有被建议作为蛋白A层析的补充，即，除去蛋白A柱的漏出物(leakage)，这是本发明的一个有益的实施方式。在本发明和US 6,498,236的教导之间的进一步的差异是配体的性质，将在以下呈现。
在可选择的实施方式中，在结合条件下将包含期望的抗体的溶液施加到多式层析柱上，在这种情况下抗体以及污染物将被吸附到多式层析树脂上。再一次，本领域的技术人员可以容易地修改条件以获得期望的结合，例如通过调整pH值和/或盐浓度，即，溶液的传导性。
用于本方法的多式层析树脂可以由本领域的技术人员容易地制备。简言之，所述树脂包含多式配体，所述多式配体直接地或通过间隔区与有机或无机支持物联结，支持物有时指基础基质。支持物可以是粒子，例如基本上球形的粒子、整料、过滤器、膜、表面、毛细管，等等的形式。在一个实施方式中，所述支持物是从天然的多聚体，例如交联的碳水化物材料，例如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、konjac、角叉菜胶、gellan、藻酸盐等等制备的。为了获得高的吸附能力，所述支持物优选的是多孔的，然后配体与外表面以及孔洞表面结合。这种天然的多聚体支持物可以根据标准方法容易地制备，例如反相悬浮凝胶化(SHjertén：Biochim Biophys Acta 79(2)，393-398(1964)。做为选择，所述支持物是从合成聚合物，例如交联的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等等制备的。这种合成聚合物可以根据标准方法容易地生产，参见例如“Styrene basedpolymer supports developed by suspension polymerization”(R Arshady：Chimica e L′Industria 70(9)，70-75(1988))。多孔的天然或合成聚合物支持物也可以从商业的来源获得，例如AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden。
对于用多式配体纯化抗体有用的支持物的特定实例是用于膨胀床吸附的支持物，即，含有高密度填料，优选的不锈钢填料的多聚体支持物。这种膨胀床吸附树脂对于在俘获步骤中俘获抗体，例如单克隆抗体也是有用的。
如上所述，在本方法中使用的层析树脂的多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统。能够与目标分子进行疏水性相互作用的芳香环系统可以包含一个或两个环状结构，由一个或多个原子或例如由萘基基团来分隔。进一步的，所述环状系统任选的被例如烷氧基团，例如甲氧基取代。在一个实施方式中，所述芳香族或杂芳香族环系统不含有任何氮原子，但限于碳原子、硫原子和氧原子作为所述环状结构的构成原子。因而，在有益的实施方式中，芳香族或芳香杂环实体的成环原子选自由C、S和O构成的组。
在一个实施方式中，用于本方法的树脂描述如下：Su-间隔区-X-阳离子交换基团-间隔区-芳香族或杂芳香族的环，其中Su是支持物，间隔区是任选的；X是连结原子例如O、S或N。适合的间隔区和产生这种间隔区的联结化学作用是本领域中公知的。因此，这个实施方式实质上不同于以上讨论的US 6,498,236，在US 6,498,236中作为阳离子交换基团的酸性基团是对芳香族实体的取代。因而，在本实施方式中使用的树脂可以预计容许不同的和在空间上更为扩展的种类的与目标化合物的键，因为当前的结构容许在芳香族和阳离子官能团之间的进一步的距离。不希望限于任何理论，可以假定的是，与声称已经对抗体吸附进行了优化的US 6,498,236相比，当前的基质提供了对于相对大的含抗体复合物的更为良好的吸附作用。
阳离子交换基团优选的是弱的阳离子交换剂，即，可以在某些pH值下质子化的基团。与弱阳离子交换剂相反，强阳离子交换基团包含在所有pH值下都保持带电的基团。因而，在一个实施方式中，多式配体包含羧基，例如一个或两个羧基。
然而，本领域技术人员将理解的是，如上所述的多式配体可以还有提供进一步的相互作用，例如氢键作用。除了以上讨论的基团之外，在本方法中使用的多式层析配体也可以包含一个或多个磺酰基基团、胺或羰基基团，其可以或可以不促进与污染物和抗体的相互作用。
例如，与以上讨论的载体连结来制备本方法中使用的多式层析树脂的配体可以按以上讨论的WO03/024588(Amersham Biosciences)中所描述的来合成，其中包含弱阳离子官能团的多式配体从高半胱氨酸硫内酯开始合成。对于多式配体合成的进一步的参考文献，参见例如WO 02/059059(Amersham Biosciences)。配体可以通过称为间隔区的适合的距离元件与载体连结。对于对此有用的连结方法的综述，参见例如Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson et al，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia and Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992。如本领域中公知的，诸如配体密度或取代水平、支持物的孔隙大小等的参数可以变化，以提供具有期望的性质的层析树脂。
本方法对于回收任何单克隆或多克隆抗体是有用的，例如来源于哺乳动物宿主，例如小鼠、啮齿动物、灵长类和人类的抗体，或来源于培养的细胞例如杂交瘤的抗体。在一个实施方式中，所述回收的抗体是人类或人源化抗体。所述抗体可以是任何类型的抗体，即，选自由IgA、IgD、IgE、IgG和IgM构成的组。
在一个实施方式中，要纯化的抗体是能够与蛋白A结合的抗体，或含Fc的抗体片段或融合蛋白。在特定的实施方式中，回收的抗体是免疫球蛋白G(IgG)。在本文中，要理解的是，术语“抗体”也包括抗体片段和任何包含抗体或抗体片段的融合蛋白。因而，本发明也包括纯化上述抗体以及包含这种抗体的融合蛋白的任何一种的片段。根据本发明分离的抗体作为药物是有用的，例如包含为特定个体设计的活性成分的个人化药物。根据本发明分离的抗体在研究中和在诊断领域中也是有用的。
在一个实施方式中，如上所述，本方法包括在蛋白A层析树脂上的第一俘获步骤和在多式层析树脂上的随后的精炼步骤。应用与蛋白A步骤的溶液可以是细胞培养液或发酵肉汤，其已经任选的经受了预处理，例如过滤、通过调节pH值和/或传导性来整理，等等。因而，俘获步骤将除去宿主细胞残余，例如细胞碎片和蛋白、DNA、内毒素等，而精炼步骤将主要除去为来自俘获步骤的残余物形式的污染物，例如蛋白A-抗体聚集物，如以上所讨论的。因此，本发明提供了比例如以上讨论的US 5,429,746(SmithKline Beecham Corp.)更简单的过程，US 5,429,746公开了基于蛋白A的层析之后的两种另外的步骤。另外，与建议作为基于蛋白A的层析的选择的较小的有机配体相比，本发明维持了关于选择性和容量的蛋白A的实际益处，而可以获得高纯度的抗体产物。
然而，要理解的是，使用在此描述的多式层析树脂来纯化抗体作为单个步骤可能是很好的，在这种情况下可以除去以上例举的所有污染物。在这种单步过程中使用的多式配体与以上讨论的多式MBITMHyperCel配体的不同在于，形成当前配体的芳香环系统的原子限于碳原子，或选自由碳原子、硫原子和氧原子构成的组，即，在环中不出现氮原子。因为这样的氮是可带电的，在某些条件下MBITM HyperCel配体的性质将实质上不同于当前配体的性质。此外，当前的多式配体仅包含弱阳离子交换基团，与MBITM HyperCel的在所有pH值下都是带电的强SO3 -相反。
在第二个方面，本发明是试剂盒，在独立的区室中包含多式层析树脂；至少两种不同的缓冲液；和描述如何纯化抗体的书面说明，其中多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统。在有益的实施方式中，所述说明给出了使用所述试剂盒来从蛋白A和抗体之间形成的复合物中分离抗体的细节。在一个实施方式中，芳香族或杂芳香族实体的成环原子在C、S或O之间选择。本试剂盒可以用于任一上述描述的方法用来纯化抗体。在有益的实施方式中，所述树脂存在于由任何常规材料制成的柱中，所述常规材料例如，生物相容的塑料，例如聚丙烯，或玻璃。所述柱可以是适合于抗体的实验室规模或大规模纯化的大小。在特定的实施方式中，所述柱装备有luer衔接器、tubing连接器和domed nuts。在一个实施方式中，所述柱是无菌的。在特定的实施方式中，所述柱是一次性的(disposable)。
最后，本发明的另一个方面是用于纯化抗体的系统，优选的从来源于细胞培养物的液体中的细胞成分和/或污染物中纯化。因而，在一个实施方式中，本发明是用于从液体中纯化抗体的系统，该系统包括填有树脂的第一层析柱，所述树脂的配体包含蛋白A或蛋白G；填有多式层析树脂的第二层析柱，所述多式层析树脂包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统；向第一柱添加样品或洗脱缓冲液的装置；将来自第一柱的洗脱液添加到第二柱的装置；泵送装置；和阀门。第一和第二层析柱的树脂可以是以上所讨论的。在有益的实施方式中，所述系统是自动化的。这种自动化系统可以由过程控制的标准工具来控制。
附图的详细说明
在以下的层析(附图1-6，7和9)中，彩色的标示如下：蓝色或红色线(XX)：A280nm；绿色线(YY)：荧光；褐色线(ZZ)：传导性(mS/cm)；灰色线(OO)：pH值。
附图1显示了对照实验1的结果，如在以下实施例2(a)中公开的。通过旁路注射2ml MAb-蛋白A混合物，收集0.5ml级分。附图1清楚地显示了A280曲线的相对大小和荧光发射是如何处于良好的拟合的。
附图2显示了对照实验2的结果，如在以下实施例2(a)中公开的。将2ml包含荧光标记的蛋白A的溶液注射到包含参考树脂SPSepharoseTM Fast Flow(FF)(Amersham Biosciences)的柱中。使用梯度洗脱，收集1ml的级分。再一次，在A280曲线和荧光发射之间观察到了良好的拟合。
附图3显示了对照实验3的结果，如在以下实施例2(a)中公开的。将蛋白A溶液注射到多式媒介原型U790 P73中，其在以下的实施例2，材料和方法中描述。使用梯度洗脱，收集1ml的级分。同样在这种情况下，在A280曲线和荧光发射之间观察到了良好的拟合。
附图4显示了以结合模式分离MAb和MAb-蛋白A聚集物，如在以下的实施例2(b)中公开的。再一次，使用多式媒介原型U790 P73。20倍柱容积(CV)的0-100％B的梯度用于洗脱。A缓冲液(平衡)在pH 5.0使用，B缓冲液在以下的实施例2，材料和方法中定义。
附图5显示了使用进一步优化的条件分离MAb和MAb-蛋白A聚集物，如以下的实施例2(b)中公开的。使用多式媒介原型U790 P73。使用0CV 0-77％B、30CV 77％B和77-100％B CV的优化的梯度。A缓冲液(平衡)在pH 4.5使用，B缓冲液在以下的实施例2，材料和方法中定义。
附图6显示了通过在SuperdexTM 200上凝胶过滤的峰分析结果，如以下的实施例2中描述的。分析的峰在附图5中示出。更具体地，附图6A显示了级分A9(来自主要UV峰的顶端)的凝胶过滤结果，而附图8B显示了级分C7(来自荧光峰的顶端)的凝胶过滤结果。在附图6A中，没有MAb-蛋白A聚集物是可检测的。在附图6B中，在MAb峰之前的层析谱中的两个峰，MAb-蛋白A聚集物是可检测的。这是好的指示，可以使用根据本发明的多式层析方法从MAbs中分离MAb-蛋白A聚集物。
附图7显示了以流通模式分离纯的MAb和MAb-蛋白A聚集物，如在以下的实施例2(c)中描述的。使用原型多式配体U790 P73。样品体积是6.5ml(4.4mg MAb/ml)。样品包含添加了未标记(蓝线)或荧光标记的(红线)蛋白A的MAb。使用97％B＝0.13M NaCl(平衡)。A缓冲液和B缓冲液是以下材料和方法中描述的。
附图8显示了通过在SuperdexTM 200上凝胶过滤的峰分析结果，如实施例2中描述的。分析的峰在附附图7中示出。样品体积是100μl，流速是0.5ml/min，缓冲液为以下的材料和方法中描述的。更具体地，附图8A说明了级分A7，来自用未标记的蛋白A进行的；流通峰的顶端；附图8B说明了级分B3，来自用未标记的蛋白A进行的；洗脱峰的顶端；附图8C说明了级分B3，来自用荧光标记的蛋白A进行的。红色曲线显示了UV，而绿色标绘显示了荧光。
附图9显示了以流通模式分离纯的MAb和MAb-蛋白A聚集物，如在以下的实施例2(c)中描述的。使用原型U790 P73。样品比用于获得以上附图7的实质上更大，即50ml MAb 4.2mg/ml(总共210mgMAb；添加荧光标记的蛋白A)。实验条件：97％B＝0.13M NaCl(平衡)。A缓冲液和B缓冲液如上所述，在材料和方法中。蓝线：UV(280nm)，褐色线：传导性，绿色标绘：荧光。
附图10显示了通过在SuperdexTM 200上凝胶过滤获得的附图9中出现的峰的分析结果，如实施例2中描述的：
流通级分：A2、A5、A8、A11、A15、B3、B6、B9和B11。
洗脱级分：C2。样品体积为100μl，而流速是0.5ml/min。
缓冲液在以下的材料和方法中描述。附图10A显示了附图9的选定级分的凝胶过滤的层析谱覆盖图，而附图10B显示了附图10A的放大。MAb-蛋白A聚集物在洗脱的峰中是可检测的，但在流通级分中不可检测。这些结果表明，基本上所有的MAb-蛋白A聚集物吸附到柱上，通过传导性的增加被再次洗脱。
实验部分
当前的实施例仅为了说明性的目的提供，无论如何不能解释为限制由附随的权利要求定义的本发明的范围。以下和本说明书中其他地方提供的所有参考文献通过引用合并在此。
实施例1：多式层析树脂
以下给出的基质的体积是指澄清床(settled bed)体积。按克给出的基质重量是指抽吸(水泵)干重。要理解的是，这些基质仍是水溶的材料。以下所指的搅动是通过悬浮的、电机驱动的的搅拌器进行，因为提示了使用磁棒搅拌器会损坏珠子。功能性的分析，和珠子上烯丙基化、环氧化作用的程度或离子交换基团的取代程度的确定，参考本领域技术人员公知的常规方法。通过对凝胶的另外的元素分析，特别是分析硫原子，最终补足以下的方法。
表1：配体原型的化学结构
Figure A20058000626700181
实施例1(a)配体原型U1012054
在这个实施例中，描述了3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸是怎样与NHS活化的琼脂糖载体连结的。
硫丙酸琼脂糖的制备：向100ml烯丙基活化的(0.3mmol烯丙基/ml)SepharoseTM 6Fast Flow gel(Amersham Biosciences)、4g AcONa和100ml蒸馏水的搅拌的悬浮液中添加溴，直到获得持久的黄色。然后添加甲酸钠直到悬浮液完全地脱色。过滤反应混合物，用500ml蒸馏水湿润凝胶。然后将活化的凝胶直接转移到反应容器，用17.5ml硫丙酸(每个烯丙基6个同等物)和12g NaCl的水溶液(50ml蒸馏水)处理，在添加前其pH值用50％aq.NaOH调节到11.5。在搅动下在50℃进行反应18小时。过滤反应混合物和用500ml蒸馏水洗涤，产生具有0.29mmol CO2H基团/ml凝胶的取代程度的硫丙酸Sepharose凝胶。
用N-羟基琥珀酰亚胺活化凝胶：然后用300ml 1M NaCl、500ml 0.1M HCl、500ml 50％aq.丙酮、500ml丙酮连续地洗涤100ml所产生的硫丙酸Sepharose。洗涤之后将凝胶置于丙酮中沉淀，虹吸抽出上清液，借助20ml的丙酮将沉积的珠子转移到反应容器。然后添加80ml丙酮中15.2g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液，和80ml丙酮中二环己基碳二亚胺的另一种溶液。反应浆液在30℃搅动18小时。过滤之后，在整个工作日用150ml异丙醇慢慢地洗涤(重力流)凝胶10次。反应后用NH4OH估计NHS活化的程度约80％，相当于约0.23mmolNHS官能团/ml凝胶的活化。
配体与NHS活化的硫丙酸SePharose的连结：如WO 02/05959中描述的制备3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸(配体12)。制备565mg的3-氨基-4(丙基磺酰基)噻吩-2-羧酸(2.27mmol)在2ml蒸馏水、2ml 1M NaHCO3和2ml乙醇中的溶液的可溶混合物，小心添加50％含水NaOH调节到pH值8.5。
用20ml冰冷的1mM HCl溶液快速洗涤NHS-活化的硫丙酸Sepharose(10ml)。然后将凝胶转移到Erlenmeyer中，向其中添加thineyl丝氨酸溶液。将反应混合物置于摇床上(150rpm)在室温下18小时。
过滤反应混合物之后，用40ml蒸馏水、20ml乙醇、20ml 0.25Maq.乙醇胺、20ml蒸馏水、20ml1M aq.NaCl、和20ml蒸馏水连续地洗涤凝胶。
实施例1(b)-(d)
在以下的实施例1(b)-(d)中，使用D，L-高半胱氨酸硫内酯作为支架，如WO 03/024588中描述的制备原型配体U790P65、U790P71和U790P73。简言之，在通过高半胱氨酸硫内酯与酰基氯或酐反应形成酰胺键之后，用碱水解来实现硫内酯环的开放，将产生的化合物进一步与活化的SepharoseTM 6FF(Amersham Biosciences)连结。
实施例1(b)：配体原型U790P73
将30ml DCM中的苯甲酰氯(8.7ml，75mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，120ml)中的D，L-高半胱氨酸硫内酯(11.5g，75mmol)和二异丙胺(DIPEA)(26ml，150mmol)的溶液中。在室温下搅拌混合物过夜。在真空下蒸发溶剂，用乙酸乙酯(300ml)提取反应残余物。用aq.柠檬酸10％(w/w，200ml)、aq.K2CO3 10％(200ml)、水(200ml)洗涤有机相，用硫酸钠干燥。过滤之后，除去溶剂产生白色固体(13.8g，83％)。在0℃，向276mg(1.25mmol)这种白色固体中添加5N氢氧化钠溶液(5ml)，混合物在室温下进一步搅拌2小时。将从烯丙基化的SepharoseTM 6Fast Flow(250μmol/ml)开始根据公知过程获得的溴化的SepharoseTM 6Fast Flow(10ml)(Amersham Biosciences)与配体(如上所述)的碱性溶液混合，加热到50℃过夜。反应之后，过滤凝胶，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗涤。然后通过滴定酸根来测量凝胶的离子容量，得出约130μmol/ml凝胶。
实施例1(c)：配体原型U790P65
将4ml DCM中的3，4，5-三甲氧基-苯甲酰氯(2.37g，10.3mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，6ml)中的D，L-高半胱氨酸硫内酯(1.58g，10.3mmol)和二异丙胺(DIPEA)(3.58ml，20.6mmol)的溶液中。在室温下搅拌混合物过夜。在真空下蒸发溶剂，用乙酸乙酯(50ml)提取反应残余物。用aq.柠檬酸10％(w/w，30ml)、aq.K2CO3 10％(30ml)、水(30ml)洗涤有机相，用硫酸钠干燥。过滤之后，除去溶剂产生白色固体(2.21g，69％)。在0℃，向389mg(1.25mmol)这种白色固体中添加5N氢氧化钠溶液(5ml)，混合物在室温下进一步搅拌2小时。将从烯丙基化的SepharoseTM 6Fast Flow(250μmol/ml)开始根据公知过程获得的溴化的SepharoseTM 6FastFlow(10ml)(Amersham Biosciences)与配体(如上所述)的碱性溶液混合，加热到50℃过夜。反应之后，过滤凝胶，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗涤。测量凝胶的离子容量为59μmol/ml凝胶。
实施例1(d)：配体原型U790P71
将4ml DCM中的苯基戊二酐(1.96g，10.3mmol)溶液在0℃滴加到二氯甲烷(DCM，6ml)中的D，L-高半胱氨酸硫内酯(1.58g，10.3mmol)和二异丙胺(DIPEA)(3.58ml，20.6mmol)的溶液中。在室温下搅拌混合物过夜。在真空下蒸发溶剂，用5N氢氧化钠溶液(10ml)直接处理反应残余物，在室温下进一步搅拌2小时。将从烯丙基化的SepharoseTM 6Fast Flow(250μmol/ml)开始根据公知过程获得的溴化的SepharoseTM 6Fast Flow(10ml)(Amersham Biosciences)与如上所述配体的1.4ml碱性溶液混合，加热到50℃过夜。反应之后，过滤凝胶，用水(2×150ml)、乙醇(2×150ml)、乙酸0.2M(2×150ml)和水(2×150ml)洗涤。然后测量凝胶的离子容量为110μmol/ml凝胶，相当于55μmol/ml凝胶的配体取代水平。
实施例2：抗体的分离
材料
层析系统             KTATM Explorer 100和UNICORN v.4.0软件
                     (Amersham Biosciences)
分光光度计           UltrospecTM 3000pro(Amersham Biosciences)
荧光分光光度计       SPEX Fluorolog-3来自JY Horiba(Edison，NJ，
                     USA)
乙酸                 Merck cat.no.1.00063，p.a.(Pro Analysi)
Na-琥珀酸盐          BDH，cat.No.30219
NaCl                Merck cat.no.1.06404，p.a.
Tris                 Merck cat.no.1.08382，p.a.
NaOH               Merck cat.no.1.06469，p.a.
MES                 SIGMA cat no.M3671
Na2CO3           Merck cat no.1.06392.1000，p.a.
水                  使用MilliQ水
Cy 5活性染料        Amersham Biosciences
SP SepharoseTM Fast Flow(对照)            Amersham Biosciences
SuperdexTM 20010/300(凝胶过滤)            Amersham Biosciences
对于在结合条件下分离纯的MAb和MAb-蛋白A聚集物，使用以下缓冲液：
A缓冲液(平衡)：100mM乙酸，20mM Na-琥珀酸盐，pH 4.5
               -5.0
B缓冲液：      100mM乙酸，20mM Na-琥珀酸盐，1.5M
              NaCl，pH 6.4
对于以流通模式分离纯的MAb和MAb-蛋白A聚集物，使用以下缓冲液：
A缓冲液：50mM MES，1M NaCl pH 7
B缓冲液：50mM MES，0.1M NaCl pH 7.0
对于凝胶过滤，使用以下条件：
50mM磷酸盐缓冲液，0.150M NaCl，pH 7.0
单克隆人源化IgG1抗体，pI9，(Genentech)在蛋白A媒介(MabSelect，Amersham Biosciences)上进行最初的纯化。
从Novozymes获得天然的蛋白A(Batch NDP 1023)。
方法
柱填充和测试：将凝胶浆液导入部分填有Milli Q水的HR5/5柱中。将顶端衔接头降低到接近凝胶表面而不压缩凝胶。然后以1.2ml/min装填凝胶直到床稳定。然后降低衔接头接触到凝胶表面。通过注射25μl2％丙酮来评估装填性能(即，塔板(plate)数和不对称性)。
蛋白A的荧光标记：200μl蛋白A溶液(～50mg/ml)用1000μl 0.1MNa2CO3 pH 9.3稀释。
将溶液转移到Cy5活性染料的小瓶。在室温下孵化30分钟，随后在PD10柱上脱盐，用100mM HAc，20mM Na-琥珀酸盐pH5.0平衡。然后用未标记的蛋白A将标记的蛋白A 1∶5稀释到～41mg/ml的终浓度。
样品制备：在分光光度计中在280nm测量MAb样品的三个复本。将吸光率的平均值用于浓度测定。根据
                   C＝A/(1×ε)
确定MAb浓度为4.4mg/ml，其中：
C＝IgG的浓度
A＝280nm的吸光率
1＝通路长度
ε＝MAb的摩尔消光系数，mg ml-1＝1.46。
以1∶1000(w/w)的比例向MAb样品中添加荧光标记的蛋白A溶液。
在流通方式中，通过添加NaCl调整离子强度(细节参见下文)。
用于蛋白A检测的荧光测量：通过使用荧光分光光度计(SPEXFluorolog-3)在收集的级分中进行相关的蛋白A浓度的测量。在630nm进行Cy5的激发，在670nm检测荧光发射。
凝胶过滤：为了测试MAb-蛋白A聚集，使用填有SuperdexTM 200(Amersham Biosciences)的预填充的柱进行凝胶过滤。分析来自原型的操作的选定级分。样品体积为100μl，流速为0.5ml/min。
平衡：2倍柱容积(CV)缓冲液(第一次使用)。
平衡：0.1CV缓冲液(操作之间)。
样品注射：100μl。等度洗脱：1.2CV缓冲液。
蛋白A浓度的分析：以200μl样品+800μl稀释剂的比例稀释样品(使用用于蛋白A分析的样品稀释剂)。混合之后，在水浴中煮沸试管10分钟，然后再一次混合。然后对样品进行蛋白A含量分析。
实施例2(a)：结合条件下的对照实验
将荧光标记的蛋白A与如上所述的MAb溶液混合。为了确保荧光标记不影响蛋白A的层析性质，和确保在KTATM Explorer(AmershamBiosciences)中设置正确的延迟值，如下进行了三个不同的对照实验：
对照实验1：通过旁路注射MAb-蛋白A混合物，收集0.5ml级分。比较收集的级分中的吸收曲线和荧光。如附图1所示，在正确的设置系统延迟体积之后，A280曲线的相对大小和荧光发射的是良好拟合的。
对照实验2：向SP SepharoseTM Fast Flow中注射2ml蛋白A溶液。梯度洗脱和级分收集(1ml/级分)。通过280nm的吸光率和通过测量收集的级分中的荧光来监视蛋白A的洗脱。同样在这种情况下，在A280曲线和荧光发射之间观察到了良好的拟合，参见附图2。
对照实验3：如对照2，但向媒介原型U790 P73(参见以上的实施例1(b))中注射蛋白A溶液。使用多式媒介原型同样的，在A280曲线和荧光发射(附图3)之间观察到了良好拟合，在非标记和标记的蛋白A之间没有获得分离。
实施例2(b)：
以结合模式分离MAb和MAb-蛋白A
将2ml MAb-蛋白A混合物注射到不同的媒介原型中。如上进行梯度洗脱和级分收集。通过监视280nm的吸光率和洗脱物传导性以及通过测量收集的级分中的荧光，来跟踪MAb和MAb-蛋白A的洗脱。为每个原型计算吸光率曲线和荧光发射之间的滞留体积中的差异。结果在表2和附图4中示出。即使数据点的数目少并且变异相对高，可以断定，更高的洗脱传导性引起了UV和荧光峰(即，MAb和MAb-蛋白A聚集物之间)之间的更好的分离。在参考基质SP SepharoseTMFast Flow上没有获得分离。
表2：在吸收曲线和荧光发射之间的滞留体积(dRt)和洗脱传导性中的差异
  媒介   dRt(ml)   mS/cm
  SP Seph FFU2054U790P65U790P71U790P73   011,60,53,5   19,938,550,445,684,2
通过调整样品的pH值，其对分离有微小的影响，和梯度的优化，进一步优化了在原型U790 P73上获得的分离。在一个实验中(结果未显示)，通过使用较浅的梯度，即40CV而不是20，将dRt增加到6ml。通过分步洗脱获得了好得多的分离(附图5)。这样，荧光部分可以完全地从主峰分离。通过在SuperdexTM 200上凝胶过滤来分析层析谱中的不同级分(附图6)。可以在荧光峰，即，层析谱中MAb峰之前的两个峰，中检测到MAb-蛋白A聚集物，而不是在主UV峰中。这个结果表明，有可能通过使用多式配体从MAb中分离MAb-蛋白A聚集物。
实施例2(c)：
以流通模式分离MAb和MAb-蛋白A聚集物
运用添加未标记和荧光标记的蛋白A以流通模式进行两个实验(条件：97％B＝0.13M NaCl)。结果揭示层析谱几乎是相同的(附图7)。如上，通过在SuperdexTM 200上凝胶过滤来分析不同级分(附图8A-B)。MAb-蛋白A聚集物在洗脱的峰中是可检测的，但在流通物中不可检测。此外，可以在层析谱中两个微小的峰中检测到SuperdexTM级分的荧光发射，而不是在主UV峰中(附图8C)。因而，这些结果表明，有可能以流通模式从MAb中分离MAb-蛋白A聚集物。因而，大多数蛋白A-抗体聚集物被吸附，而约95％的MAbs直接穿过了柱。
为了进一步研究以流通模式分离MAb和MAb-蛋白A聚集物的方法的可能性，将50ml MAb-蛋白A混合物(总共210mg MAb)施加到1ml柱上(附图9)。98.4％的蛋白直接穿过了柱(根据mAU*ml)，通过提高传导性洗脱出了一个小的峰(1.6％)。通过在SuperdexTM 200上凝胶过滤和通过检测荧光发射来分析该级分。此外，如上所述准备了用于蛋白A分析的样品。
凝胶过滤的结果在附图10中示出。如上，MAb-蛋白A聚集物在洗脱的峰中是可检测的，但在流通级分中不可检测。这个结果表明，大多数MAb-蛋白A聚集物吸附到柱上，通过传导性的增加被再次洗脱。
荧光测量显示，在样品施加期间，荧光发射，即蛋白A含量在流通物中逐渐地增加。然而在洗脱峰中发现了90％的荧光。通过分析蛋白A浓度(表3)确认了这些观察结果。因而，当施加40mg MAb/ml吸附剂时除去了约99％的MAb-蛋白A聚集物，在最高的样品加载(210mg/ml)时除去了96％。
表3：流通物和洗脱峰中蛋白A浓度的分析结果
  样品   施加的量(mg/ml吸附剂)   ng SPA/ml   蛋白A浓度(％)
  起始材料级分A5级分A11级分B9集中级分A1-A14集中级分A1-B12集中级分A15-B12级分C2(洗脱的级分)   -4292，4201,6117,6210126到210210   119914,653,514615,848,784,310450   -1,24,512,21,34,17872

Claims (12)

1.在溶液中从一种或多种污染物分离抗体的方法，所述方法包括用包含支持物的层析树脂接触所述溶液，在所述支持物上已经固定了多式配体，其中多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统，以将抗体和/或污染物吸附在所述树脂上。
2.根据权利要求1的方法，其中所述芳香族或杂芳香族实体的成环原子在C、S或O之间选择。
3.权利要求1或2的方法，其中所述阳离子交换基团是弱阳离子交换剂。
4.根据以上权利要求的任一项的方法，其中施加到所述多式层析树脂上的溶液是来自亲和层析树脂的含有抗体的洗出液，所述亲和层析树脂优选的是其配体包含蛋白A的树脂。
5.根据权利要求4的方法，其中所述污染物包含在释放的亲合配体和抗体之间形成的复合物，和/或释放的亲合配体和/或抗体的聚集物。
6.根据以上权利要求的任一项的方法，其中所述污染物被吸附在所述多式层析树脂上。
7.根据以上权利要求的任一项的方法，其包括从所述层析树脂上洗脱抗体和/或污染物。
8.根据以上权利要求的任一项的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。
9.用于纯化抗体的试剂盒，所述试剂盒包含多式层析树脂；至少两种不同的缓冲液；和书面指导，其描述了如何从蛋白A和抗体之间形成的复合物、和/或蛋白A或抗体的聚集物分离抗体，其中多式配体包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统。
10.根据权利要求9的试剂盒，其中所述芳香族或杂芳香族实体的成环原子在C、S或O之间选择。
11.用于从液体中纯化抗体的系统，所述系统包括填有树脂的第一层析柱，所述树脂的配体包含蛋白A或蛋白G；填有多式层析树脂的第二层析柱，所述多式层析树脂包含至少一个阳离子交换基团和至少一个芳香族或杂芳香族环系统；向第一柱添加样品或洗脱缓冲液的装置；将来自第一柱的洗脱液添加到第二柱的装置；泵送装置；和阀门。
12.根据权利要求11的系统，其是自动化的。
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