CN101842121B - 分离和纯化靶蛋白使其不含朊蛋白(PrPsc)的方法 - Google Patents

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Abstract

一种通过层析法分离和纯化靶蛋白的方法，其中，该层析法旨在除去或贫化朊病毒(PrPsc)，该方法包括如下步骤：-使一种可能受PrPsc污染的、包括靶蛋白的样品与多元(multimodal)层析材料接触；-设定缓冲剂条件，使得该靶蛋白与该多元层析材料结合，而PrPsc不与该多元层析材料结合；-随后洗脱该靶蛋白。

Description

分离和纯化靶蛋白使其不含朊蛋白(PrPsc)的方法
技术领域
本发明涉及一种用于分离和纯化靶蛋白的方法，使该靶蛋白不含与疾病关联的蛋白形式PrPsc。
背景技术
近来，在血浆衍生药物的纯化方法中，使PrPsc失活并去除已经得到越来越多的关注。其原因显然是由于疯牛病等的爆发。即使在生物制药法的药物生产中使用重组细胞株，由于朊蛋白的出现，也认为是不完全安全的(Vorberg et al.，The Journal ofinfectious diseases 2004；189：431-9.Susceptibility of common fibroblast cell lines totransmissible spongiform encephalopathy agents)。在定义生物制药蛋白的纯化方法时，以可能除去朊蛋白的步骤来针对不同纯化步骤作出评估(Foster PR，et al；Distributionof a bovine spongiform encephalopathy-derived agent over ion-exchange chromatographyused in the preparation of concentrates of fibrinogen and factor VIII；Vox Sang.2004Feb；86(2)：92-9；Trejo SR，et al，Evaluation of virus and prion reduction in a newintravenous immunoglobulin manufacturing process.Vox Sang.2003 Apr；84(3)：176-87；Zeiler B，et al，Concentration and removal of prion proteins from biological solutions；Biotechnol Appl Biochem.2003 Apr，37(Pt 2)：173-82；Foster et al.Studies on the removalof abnormal prion protein by processes used in the manufacture of human blood plasmaproducts，Vox Sang.2000，78：86-95；Burnouf et al.，Transfus Clin Biol.2006 Nov；13(5)：320-8.Epub 2007 Jan 23，Current strategies to prevent transmission of prions by humanplasma derivatives)。 
业已证明层析树脂在纯化法中能够除去PrPsc(参考2-4，6-7)。然而，有报道指出，使用具有不同化学结构和取代基的层析树脂以及不同缓冲剂体系的方法中，发现稳定的PrPsc清除因子这一事实，支持了该感染性病原体在层析载体表面非特异性结合这一观点。虽然PrPsc的去除表现出是可再生的，但不完全理解其去除机理引起了很多问题，例如(a)如何确定层析载体结合TSE试剂的最大容量，(b)如何确保再循环 凝胶的有效消毒程序，以及(c)如何保证在生产循环中稳定地除去PrPsc(Thyer J，Prion-removal capacity of chromatographic and ethanol precipitation steps used in the productionof albumin and immunoglobulins；Vox Sang.2006Nov；91(4)：292-300)。 
WO-A-98/0041披露了通过离子交换层析法从其他蛋白例如血红蛋白中除去朊病毒。离子交换层析介质的制备揭示了用(g-环氧丙氧丙基)三甲氧基硅烷和二甲醇胺衍生化硅胶以获得(均匀的)季铵基团的表面。 
WO-A-03/105911披露了通过常规离子交换层析法进行人体血浆清洁的方法，该离子交换层析法采用盐梯度液进行洗脱。 
WO-A-94/08686披露了，在液体层析柱中利用单一分离介质进行连续式不同标记的层析分离法。 
D.B.Brimacombe等人在Biochem.J.(1999)342，605-613中披露了通过两个连续层析步骤进行的recPrP的纯化。第一步是在S-琼脂糖(S-Sepharose)上进行阳离子交换层析(150-650 NaCl-梯度)。将所需要的洗脱液合并，进行第二个层析步骤(充填锌的螯合琼脂糖；0-100mM咪唑梯度液)。 
P.R.Foster等人Vox Sanguinis 2000；78：86-95披露了通过许多步骤进行的血浆产物的制造中朊蛋白的去除法。此方法包括在不同的层析凝胶、不同的柱中进行的4次离子交换层析(步骤2、11、13和15)以及一次亲和层析(琼脂糖-FF上固定的肝素；步骤12)。 
T.Burnouf等人在Tranfusion Clinique et Biologique 13(2006)320-328中发表了有关在血浆衍生的凝血因子的不同层析步骤中去除TSE试剂的程度。该文献的关注点在于生产FVIII(DEAE-Toyopearl 650M)、vWF(DEAE-Toyopearl 650M)、纤维蛋白原(DEAE-Toyopearl 650M)、凝血酶原复合物/FIX(DEAE-纤维素)、PCC(DEAE-琼脂糖)、FIX(DEAE-琼脂糖或肝素-琼脂糖)以及凝血酶(S-琼脂糖)的各种(主要的)离子交换层析步骤。分别考察了所有这些体系。 
J.Thyer等人在Vox Sanguinis(2006)91，292-300中报道了在DEAE-琼脂糖、CM-琼脂糖、以及强阴离子交换介质(Macro-Prep High Q)层析柱中的PrP的减少(″Materialsand Methods″；Fig.1，page 294；Tablel 1)。披露了在另一个实验中依次使用一个DEAE-琼脂糖-柱(DEAE-Sepharose-column)以及一个CM-琼脂糖-(CM-Sepharose-)柱或 离子交换介质-柱(Macro-Prep-column)。 
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种层析法，该方法是在对可能被PrPsc污染的原料(例如源自生物学衍生的原料)的分级分离过程中除去PrPsc。该方法将避免现有技术的缺点。另一个目的在于设计一种方法，该方法将可靠地进行该纯化方法，并使层析载体再生。 
本发明的又一个目的在于提供使朊病毒贫化的蛋白成分。 
根据本发明，提供了一种通过层析法分离和纯化靶蛋白的方法，其中，该层析法去除或贫化朊病毒(PrPsc)，包括如下步骤： 
-使含有靶蛋白的、可能受PrPsc污染的样品与多元层析材料接触； 
-设定缓冲剂条件，使得该靶蛋白与该多元层析材料结合，而PrPsc则不与该多元层析材料结合； 
-随后洗脱该靶蛋白，并且 
-收集该靶蛋白。 
本发明方法提供了显著改进，这是因为层析树脂与PrPsc结合得不太强，使PrPsc在该靶蛋白被洗脱之前能够从该层析树脂上去除。 
根据本发明，“分离和纯化”，其意思具体是指至少富集所希望的任何蛋白类物质的方法，或贫化不想要的物质的方法。根据本发明，这将有利于得到所希望的尽可能纯的产品。 
术语“靶蛋白”意思是分离和/或纯化至无PrPsc的有价值的蛋白。如果希望的话，靶蛋白还可以是蛋白混合物，例如，当以其整体起作用时，它是具有生物学效应的不同因子的混合物。 
“朊病毒”是感染性似蛋白质的物质。 
具体实施方式
出人意料地发现，单一的层析树脂能够在层析条件下使PrPsc与凝胶的结合最小化，并因此能使结合于凝胶上的产品中PrPsc达到最优的贫化值。此树脂是可商购的， 并在例如WO-A-2004/024318中有过介绍。该文献在此引入作为参考。对PrPsc表现出此效应的树脂称为多元(或混合模式或疏水带电感应)树脂。与例如标准层析介质如离子交换剂和疏水相互作用层析树脂相反，该标准层析介质仅通过一种原理起作用，而多元树脂通过离子相互作用和疏水相互作用相结合而起作用。这类树脂的实例是从GE Healthcare商购的 
Figure GPA00001035017000041
MMC和 
Figure GPA00001035017000042
Adhere，或从PALL公司商购的MEP、HEA或PPA 
Figure GPA00001035017000043
这些多元树脂的配体可以进行不同的设计；以下是不同配体的实例： 
Figure GPA00001035017000044
2-(苯甲酰氨基)丁酸         N-苄基-2-羟基-N，N-二甲基乙基铵 
Figure GPA00001035017000045
3-({3-甲基-5-[(四氢呋喃-2-基甲基)氨基]苯基}氨基)苯甲酸 
多元层析材料的种类总结如下。 
本发明提供了固体基材，该基材是分离和分隔多种生物学物质的有效吸附剂。本发明的固体基材可以用于例如制备式技术设备，如柱层析，以及用于分析式装置，如生物芯片。在此描述的本发明固体基材的一个优点是它对生物学物质，如免疫球蛋白类的高选择性和特异性，以及避免了现有技术基材所需要的昂贵且通常有害的清洗工艺。第二个优点是本发明固体基材几乎是理想地适合在生理pH和离子强度下用于生物学样品，由此避免在现有技术中所规定的对pH的调节和易溶盐的添加。第三个优点可以认为是本发明基材的高容量，就用于制备它们的低成本而言，与使用特定的现有技术吸附剂相比，该基材表现出显著的经济收益。 
混合方式的配体
本发明的固体基材包括固体载体和与该固体载体连接的配体。该配体包括环状基团和连接基团，该环状基团可以是单环基团或多环基团，根据需要，该连接基团还可包括硫原子。通过混和式作用吸引被分析物的该配体被连接到固体载体上。 
该配体包括环状基团，该环状基团可以是链接于该固体载体并且被硫酸根基团、 磺酸根基团、磷酸根基团或膦酸根基团取代的单环或多环基团。此单环或多环基团可以是芳香基团，如同在此所定义的，是仅含不饱和碳-碳键以给出芳香体系的环状烃。然而，原则上任何芳香基团都可用在本发明中，合适的芳香基团典型地包括一个、两个或三个芳香环。因此，例证性芳香基团是苯基以及它的取代衍生物，例如甲苯基和二甲苯基。二环芳香基团包括稠合的独立环，并且包括但不限于萘基。多环芳香基团包括蒽基和菲基，以及例如含有不同大小稠环的二氢亚萘基团。如果选择芳香基团，尽管不是必须的但优选与杂环基团或杂芳香基团稠合的基团，如以下所描述。 
“杂环”是含有至少一个杂原子的饱和的到部分饱和的环。相似地，“杂芳香基团”是芳香基团，其中至少一个碳原子被杂原子取代。在本发明中，杂原子优选是N、S、或O。还优选杂环基团或杂芳香基团是五元环或六元环，因为包括这些基团的试剂容易获得且商购价廉。 
当连接基团，如以下所定义的，不含有两极化合能力的硫原子时，则优选所述杂环基团或杂芳香基团是能赋予或有助于固体基材具有“亲硫”特性的基团，而因此是含有至少一个S原子的基团。 
使用含有二价硫原子的其他连接基团时，优选的杂环基团或杂芳香基团可以包括至少一个N原子、或S原子和N原子的组合。 
因此，典型的杂环基团或杂芳香基团包括噻唑啉、噻唑烷酮、咪唑、咪唑啉、噻唑、三唑类、四唑类、噻二唑、咪唑、吡啶、以及吗啉。在一个特别优选的实施方案中，合适的杂环基团或杂芳香基团是与芳香基团稠合的，如以上所述。在本文中，苯并咪唑和苯并噻唑是容易得到的候选物，从而得到较好的固体基材。 
如以上提及的，单环基团或多环基团是被硫酸根基团、磺酸根基团、磷酸根基团、或膦酸根基团取代的。这些基团在很宽的pH范围，如约2到约12内是足够酸性的以作为带电部分而存在。在本文中，固体载体理想地适于在生理离子浓度和pH条件下吸附生物学物质，例如免疫球蛋白类。 
如在此所用的术语“取代的”是指硫酸根基团、磺酸根基团、磷酸根基团、或膦酸根基团与单环基团或多环基团直接或间接相连接。间接连接可以通过间隔基团发生，该间隔基团是C1-6直链或支链的亚烷基基团。根据需要，该亚烷基基团可以用一个或多个二价部分隔断，该二价部分包括但不限制于-C(O)NH-、NHC(O)-、-O-、-5-、-5(O)-、-5(O)2-、-NH-、-C(O)O-、以及-OC(O)-。因此，间隔基团的具体例子包括-CH2-、-CH2CH2-、-CH2-O-CH2-以及-CH2C(O)NHCH2CH2-等。 
单环或多环基团通过连接基团链接于固体载体，该连接基团包括含有巯基、醚、或氨基的部分。由于以下描述的结构上的考虑，优选连接基团是疏水的，这样在通过静电相互作用和疏水相互作用而出现生物学物质结合的pH值条件下，可赋予固体载体疏水特性。疏水部分包括但不限制于直链和支链的C1-6亚烷基基团、C2-6亚烯基基团、以及C2-6亚炔基基团。特别有用的部分是亚乙基和亚丙基。其他疏水部分包括如以上所描述的芳香基团，以形成例如苯亚乙基。上述部分因此被至少一个巯基、醚、或氨基部分隔断或封端。在单环或多环基团不含有硫原子的实施方案中，连接基团优选含有巯基部分。在这方面，连接基团使固体基材具有疏水和亲硫特性。 
可以通过引入极性取代基例如羟基、卤素、或硝基；通过利用公知方法氧化巯基部分；通过将醚或氨基部分结合到连接基团中，或这些方法相结合，很容易按需要订制连接基团的疏水性。 
优选地，由含氨基的连接基团或那些含氧化巯基的部分所构成的固体基材还包括含有至少一个S原子的单环或多环基团。在这个方面，固体基材能够保留一定亲硫特性。 
在另一个优选的实施方案中，连接基团自身包括多糖，例如羟基-乙基-纤维素、淀粉、直链淀粉、或琼脂糖。本文中优选的多糖是葡聚糖。因此，固体载体是用多糖改性的，该多糖可以由以下所描述的连接基团衍生。 
本发明人认为本发明的固体基材是经由固体基材与生物学物质之间的“混合式”相互作用而操作的，而并非将它们限制于任何特别的理论。以上提及的单环和多环基团具有小于4的pK值，并且因此在以上描述的所用pH范围内是带负电的。生物学物质，例如免疫球蛋白，是在约pH 4和pH 6之间与固体基材接触，在此范围内，生物学物质带净正电荷或中性电荷。在这个pH范围内，生物学物质通过与单环或多环基团的一种或多种类型的相互作用结合于固体基材上。这些相互作用包括库伦吸引力以及温和的疏水缔合。当pH上升到大于约8时，生物学物质获得净负电荷，由此在带负电的固体基材和带负电的生物学物质之间产生静电斥力。随后，生物学物质通过静电斥力从固体基材上释放出来并可以由此分离出。这些离子斥力认为大于以上指出的较弱的吸引力。 
固体基材
本发明考虑了混合方式配体所连接的固体载体。具体考虑了两个不同的模式。在一个模式中，固体载体具有典型地用作层析介质的形式，即珠粒或颗粒。这些珠粒或颗粒由混合方式配体衍生出。球粒或颗粒形成可以用于填充柱的层析介质。在另一个模式中，固体载体为片状，即固体基材具有大致平坦的表面，混合式配体可以共价地或非共价地连接于该表面。适合与检测装置的探头界面衔接的载体片也称为“探针”。 
珠粒和颗粒
根据本发明的内容，固体基材首先包括固体载体，该固体载体可以包括有机材料。典型的有机材料是多糖类，例如纤维素、淀粉、琼脂、琼脂糖、以及葡聚糖。亲水合成聚合物也在考虑之列，包括取代的或未取代的聚丙烯酰胺类、聚甲基丙烯酰胺类、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯类、聚乙烯基亲水聚合物类、聚苯乙烯、聚砜、以及苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物。此外，无机材料可用作固体载体材料。这类无机材料包括但不限制于多孔无机材料，例如硅石，含有硅石、氧化锆、二氧化钛、氧化铝的水凝胶；以及其他陶瓷材料。还可能使用这些材料的混合物，或通过两种材料的共聚反应或通过它们的渗透网形成的复合材料(例如在US-A-5,268,097、US-A-5,234,991、和US-A-5,075,371中披露的那些材料)。 
固体载体可以是珠粒或无规则颗粒的形式，这些颗粒的直径为约0.1mm到约1,000mm。另外，可以将固体载体制成纤维、膜、或充满微米到几毫米大小的孔的渗透性海绵状材料。 
以上描述的单环或多环基团，在固体载体上，通过固体载体与连接基团之间以及连接基团与单环或多环基团之间形成共价键而化学固定。在典型的情况中，固体载体首先用二官能反应剂处理，该反应剂起到在固体载体上引入反应性基团的作用，该反应性基团形成部分或整个连接基团。对一些固体载体，例如纤维素、含有水凝胶的复合物、或其他存在羟基基团的材料，用氢氧化物源将羟基基团脱质子通常是有利的，例如在其与二官能反应剂反应之前进行。二官能反应剂既能与固体载体反应，又能与含有单环或多环基团的反应剂反应。含有相同或不同官能团的二官能反应剂的具体例子包括但不限于表氯醇、表溴醇、二溴丙醇和二氯丙醇、二溴丁烷、乙二醇二缩水甘油醚、丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜、烯丙基缩水甘油醚、以及烯丙基溴。 
一旦官能化，则用一种或多种溶剂彻底地洗涤固体载体以除去未反应的二官能反应剂、反应副产物、或它们二者。在这点上，所用的典型溶剂是水。 
然后，以含有用巯基、羟基、或氨基取代的单环或多环基团的反应剂来引入单环或多环基。这类反应剂与以上所描述的官能化固体载体所具有的官能团反应。 
二官能反应剂与单环或多环反应剂的具体匹配由众所周知的化学技术来指导。例如，用环氧化物官能化的固体载体，可以经过与含有巯基、羟基、或氨基的反应剂反应，来提供具有含亚乙基的连接基团的基材。又例如用烯丙基溴改性的其他固体载体存在能直接与含巯基的反应剂反应的烯烃基团。此外，这些烯烃基团可以进一步溴化以提供合适反应性的溴衍生物。 
固定的单环或多环基团的浓度为每毫升固体载体含几分之一微摩尔到几百微摩尔之间，这取决于制作固体载体的二官能反应剂的浓度。 
固定基团的低浓度一般导致固体基材的低分离容量，而高浓度通常使容量提高。 
如以上所描述，基本上不与PrPsc结合、能去除PrPsc的树脂有以下优点，其一是能在洗脱产物之前用不同的缓冲剂组合物彻底地洗涤树脂，这使之可能将甚至不同的生物化学组合物的PrPsc数目至少降低至非常低的水平或从该组合物中除去PrPsc。例如可以用不同类型的洗涤缓冲剂(包括相应的盐量很低的缓冲剂)洗涤树脂以阻止离子相应地进行疏水性相互作用，该相互作用中，在洗脱产物之前，可能有较小量的朊病毒结合于树脂或甚至结合于产物。洗涤剂、醇、和氨基酸也是可以在洗脱产物之前加入洗涤缓冲剂中以得到最佳纯度的实例。对于其他类型的“标准”层析介质，例如，对PrPsc可与之结合的不同类型的离子交换树脂来说，进行相似的洗涤步骤是明显较难的。即使结合亲和性比产物相对较高，在某种程度上总是存在将PrPsc连同产物一同从树脂上洗脱的风险。因此，使用产物可“多元地”与之结合，而PrPsc对其亲和性却相对较低的树脂，便具有很大的优势，这使之可能在洗脱产物之前使用适宜的洗涤步骤。 
根据本发明，在PrPsc洗脱之后再洗脱靶蛋白，例如通过下述措施： 
-增加或降低其离子浓度来修正洗脱缓冲剂中的离子浓度， 
-向洗脱缓冲剂-特别是水性溶液中-加入醇，例如一羟基或二羟基链烷醇，如甲醇、乙醇、丙醇之类的低级脂肪醇，和/或 
-通过增加或降低其pH值来修正该洗脱缓冲剂的pH值。 
还可以使用所述洗脱方法的组合。例如，本发明同时使用提高离子浓度和增加乙二醇量这两种方法。 
还可以使用其他洗脱条件，例如提高氨基酸浓度、使用根据“霍夫迈斯特系列”(hofmeister serie)的特定盐提高浓度。 
靶蛋白的洗脱取决于该靶蛋白的生物化学性质。例如可以使用靶蛋白的辅酶或对靶蛋白的三级结构具有高度识别力的其他物质来洗脱，例如当抗凝血酶作为靶蛋白时，用提高浓度的肝素来洗脱。 
包括靶蛋白的蛋白级份中的朊蛋白降低值，根据一开始施加于树脂上的量来计算，是＞1到4 lg(10)。所需要的蛋白级份中的朊病毒分析值，小于西式吸印杂交试验(Western blot assay)对朊病毒检测的极限值。 
在本发明的一个实施方案中，层析条件包括以下步骤中的至少两个： 
i)使用含有溶剂和/或非离子洗涤剂的加载和平衡缓冲剂； 
ii)使用没有溶剂和/或非离子洗涤剂的洗涤缓冲剂； 
iii)使用含有醇和/或氨基酸的洗涤缓冲剂； 
iv)使用含有高盐浓度的洗涤缓冲剂； 
v)使用含有低盐浓度的洗涤缓冲剂； 
vi)使用含有醇与高盐浓度相组合的缓冲剂。 
在本发明的另一个实施方案中，层析条件包括以下步骤中的至少两个： 
i)使用含有溶剂和非离子洗涤剂的加载和平衡缓冲剂； 
ii)使用第一洗涤缓冲剂，其是没有溶剂和非离子洗涤剂的缓冲剂； 
iii)使用含有醇和氨基酸的第二洗涤缓冲剂； 
iv)使用含有高盐浓度的第三洗涤缓冲剂； 
v)使用含有低盐浓度的第四洗涤缓冲剂； 
vi)使用含有醇与高盐浓度相组合的洗脱缓冲剂。 
在本发明的又一个实施方案中，所用的缓冲剂如下 
i)加载和平衡缓冲剂含有磷酸三(正)丁酯和/或曲拉通X-100(Triton x-100)，其浓度范围是约0.1到约10％(w/w)； 
ii)第二洗涤缓冲剂含有乙二醇和/或赖氨酸/精氨酸，其范围是约5到约30％(w/w)的乙二醇和0.2到约1.5M的赖氨酸/精氨酸； 
iii)第三洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度范围是从约0.5到约4M，特别是从约0.5到约1.5M； 
iv)第四洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度范围是从约0.01到约0.2，具体是0.01到约0.1M； 
v)含有乙二醇和/或氯化钠的洗脱缓冲剂，其浓度范围是从约25到约75％(w/w)、 具体是从约25到约50％的乙二醇和从约0.5到约4MNaCl。 
在本发明的另一个实施方案中，层析条件包括以下步骤中的至少两个： 
i)加载和平衡缓冲剂含有磷酸三(正)丁酯和/或曲拉通X-100(Triton x-100)，其浓度范围是从0.3到5％(w/w)； 
ii)用＞10柱容积的含有乙二醇和/或赖氨酸/精氨酸的第二洗涤缓冲剂洗涤，其浓度范围是10-25％(w/w)的EG和0.3-1.0M的赖氨酸/精氨酸； 
iii)用＞10柱容积的含有氯化钠的第三洗涤缓冲剂洗涤，其浓度是从0.8-1.5M； 
iv)用＞10柱容积的含有氯化钠的第四洗涤缓冲剂洗涤，其浓度是从0.03-0.15M； 
v)洗脱缓冲剂含有乙二醇和/或氯化钠，其浓度是35-65％(w/w)的EG和0.8-3.0的NaCl。 
在本发明的另一个实施方案中，所用的缓冲剂如下 
i)加载和平衡缓冲剂含有磷酸三(正)丁酯和/或曲拉通X-100(Triton x-100)，其浓度范围是从0.8到1.2％(w/w)； 
ii)用＞20柱容积的含有乙二醇和/或赖氨酸/精氨酸的第二洗涤缓冲剂洗涤，其浓度范围是18-22％(w/w)的EG和0.4-0.6M的赖氨酸/精氨酸； 
iii)用＞20柱容积的含有氯化钠的第三洗涤缓冲剂洗涤，其浓度范围是从0.8-1.2M； 
iv)用＞20柱容积的含有氯化钠的第四洗涤缓冲剂洗涤，其浓度范围是从0.08-0.12M； 
v)洗脱缓冲剂含有乙二醇和/或氯化钠，其浓度范围是45-55％(w/w)的EG和1.3-1.7的NaCl。 
使用不同类型的洗涤缓冲剂的优点在于，这提高了可以除去由于不同的相互作用而结合于树脂或靶蛋白的不同类型朊病毒的可能性。还通过增加相应洗涤缓冲剂的量(即1柱容积等于树脂的体积)，可以提高在所用缓冲剂上“作用迟缓的”任何残留朊病毒的安全性。 
多元层析材料可以包括下述成分： 
i)带正电的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体； 
ii)带负电的2-(苯甲酰氨基)丁酸配体； 
iii)苯基丙基配体； 
iv)N-己基配体； 
v)4-巯基-乙基-吡啶配体； 
vi)3-[{3-甲基-5-((四氢呋喃-2-基甲基)氨基)-苯基}氨基]苯甲酸配体。 
本发明的主题还包括从可能含有感染性蛋白的原料中分离出的、其朊蛋白贫化的蛋白成份。该成份含有根据本发明方法可得的药用蛋白。 
本发明具体要求保护的蛋白级份包括血浆蛋白、肽类激素、生长因子、细胞因子以及多克隆免疫球蛋白；血浆蛋白质选自人或动物血凝因子，包括血纤维蛋白原、凝血第一因子、凝血第二因子、凝血酶原复合物、FX、FXa、FIX、FIXa、FVII、FVIIa、FXI、FXIa、FXII、FXIIa、FXIII以及FXIIIa；温韦伯氏因子(von Willebrandt factor)；转运蛋白，包括白蛋白、转铁蛋白、血浆铜蓝蛋白、结合珠蛋白、血红蛋白以及血液结合素；蛋白酶抑制剂，包括β-抗凝血酶、α-抗凝血酶、α2-巨球蛋白、C1-抑制剂、组织因子通道抑制剂(TFPI)、肝素辅因子II、蛋白C抑制剂(PAI-3)、蛋白C和蛋白S；α-1酯酶抑制蛋白；α-1抗胰蛋白酶；抗血管紧张蛋白，包括潜伏性抗凝血酶；高糖基化蛋白，包括α-1-酸糖蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、间-α-胰蛋白酶抑制剂、α-2-HS糖蛋白和C-反应性蛋白；以及其他蛋白，包括富组氨酸糖蛋白、甘露聚糖结合凝集素(mannmman binding lectin)、C4-结合蛋白质、纤维结合蛋白、GC-球蛋白、血浆酶原、血液因子，例如红细胞生成素、干扰素、肿瘤因子、tPA、γCSF。 
通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。 
实施例
实施例1 
柱和树脂
用Capto MMC树脂(GE Healthcare Cat.No.17-5317-10，lot No.308581)填充的Tricorn柱(GE Healthcare，Sweden，横截面面积0.2cm2，直径0.5cm)，9cm床高，柱容积：1.8ml。 
起始材料
将从HEK 293细胞的蛋白衍生的、并经捕获柱步骤浓缩的重组体混合物用作起始材料(批次：BPP 047 SP洗脱液，117μg蛋白/ml)。 
缓冲剂组合物＊
缓冲剂1(添加S/D的平衡缓冲剂)
0.3M NaCl，0.01M CaCl2(2xH2O)，0.01M L-组氨酸，1％w/w曲拉通X-100，0.3％w/w TNBP，pH：7.0±0.1，导电率：29±3mS/cm2，在+25℃。 
缓冲剂2(无S/D的平衡缓冲剂)
0.3M NaCl，0.01M CaCl2(2xH2O)，0.01M L-组氨酸，0.02％(w/w)吐温80，pH：6.5±0.1，导电率：31±3mS/cm2，在+25℃。 
缓冲剂3(洗涤1：赖氨酸&乙二醇(＝EG))
0.3M NaCl，0.01M CaCl(2xH2O)，0.01M L-组氨酸。 
0.02％(w/w)吐温80，0.5M一氯化L-赖氨酸，20％(w/w)乙二醇(＝EG)pH：6.5±0.1，导电率：37±3mS/cm2，在+25℃。 
缓冲剂4(洗涤2：高盐洗涤)
1.0M NaCl，0.05M CaCl2(2xH2O)，0.05M L-组氨酸，0.02％(w/w)吐温80，pH：6.5±0.1，导电率：89±5mS/c m2，在+25℃。 
缓冲剂5(洗涤3：低盐洗涤)
0.1M NaCl，0.01M CaCl2(2xH2O)，0.01M L-组氨酸，0.02％(w/w)吐温80，pH：6.5±0.1，导电率：13±3mS/cm2，在+25℃。 
缓冲剂6(洗脱缓冲剂)
1.5M NaCl，0.02M CaCl2(2xH2O)，0.02M L-组氨酸，0.02％(w/w)吐温80 
50％(w/w)乙二醇(EG)，pH：6.5±0.1(加入EG之前调节pH)导电率：39±3mS/cm2，在+25℃，在加入EG之后测量。 
缓冲剂7(再生缓冲剂) 
1M氢氧化钠 
用于pH调节：
1M HCl 
＊加入1kg而不是1L水作为最终体积来配制该缓冲剂。这样对最终的摩尔浓度稍有影响，因为这些添加将使最终的体积稍微增加。 
层析条件：
表1：归纳出所用缓冲剂的大致用量，用ml/min和cm/hour表示流速。也示出了每个缓冲剂步骤所需时间以及蛋白溶液与凝胶的接触时间。 
Figure GPA00001035017000131
将MMC树脂填充到Tricorn柱中，床高约9cm。监测层析步骤的导电率并置于280nm光波下。相对于1ml树脂蛋白加样约3mg。 
首先，用含有S/D化学品的平衡缓冲剂适当地平衡该柱，直到得到稳定的基线。以每kg加14g S/D原料的比例在起始材料中加入S/D化学品以获得与平衡缓冲剂相同的浓度，在蛋白溶液加到柱中之前将其搅拌至少10min。收集流出的缓冲剂各级份并分析其总蛋白(以及PrPsc掺合实验中的朊病毒)。在附录2中可以看到在280nm测量吸光度所得的层析分布型。 
-直流洗出液(缓冲剂1+蛋白) 
-缓冲剂1(高非离子洗涤缓冲剂；0.3M NaCl，0.01M CaCl2，0.01M L-组氨酸，1％w/w曲拉通X-100，0.3％w/w TNBP，pH：7.0) 
-缓冲剂2(低非离子洗涤缓冲剂，0.3MNaCl，0.01M CaCl2，0.01M L-组氨酸，0.02％(w/w)吐温80，pH：6.5) 
-缓冲剂3(氨基酸/醇缓冲剂；0.3M NaCl，0.01M CaCl2，0.01M L-组氨酸，0.02％(w/w)吐温80，0.5M一氯化L-赖氨酸，20％(w/w)乙二醇pH 6.5) 
-缓冲剂4(高盐缓冲剂，1.0M NaCl，0.05M CaCl2，0.05M L-组氨酸，0.02％(w/w)吐温80，pH：6.5) 
-缓冲剂5(低盐缓冲剂，0.1M NaCl，0.01M CaCl2，0.01M L-组氨酸，0.02％(w/w)吐温80，pH：6.5) 
-缓冲剂6(高盐/高醇缓冲剂；1.5M NaCl，0.02M CaCl2，0.02M L-组氨酸，0.02％ w/w吐温80，50％w/w乙二醇，pH：6.5) 
-缓冲剂7(再生缓冲剂；2M NaCl) 
用20柱容积的1MNaOH再生该柱并储存在20％(v/v)乙醇中以再次使用。 
结果 
表2(在无朊病毒的试验中总蛋白的检测) 
  样品   样品体积(ml)   总蛋白ug/ml   总蛋白mg   总蛋白％
  起始材料(加载的样品)   47   117   5.5   100
  直流洗出液(缓冲剂1)   40   na   na   na
  缓冲剂2   20   na   na   na
  缓冲剂3   40   17.9   0.7   13％
  缓冲剂4   20   10.7   0.2   4％
  缓冲剂5   10   13.6   0.1   2％
  缓冲剂6   9   150   1.4   25％
  缓冲剂7   18   na   na   na
na＝由于缓冲剂的干扰，没有用总蛋白分析法进行分析 
实施例2(朊病毒掺料实验) 
为了确定实例1中所描述的层析程序对朊蛋白的去除值，进行朊病毒掺料实验。使用与实例1中相同的柱、树脂、缓冲剂以及起始材料。 
朊蛋白感染性起始材料
在此实验中使用羊瘙痒病毒(scrapie)适应性仓鼠的263K毒株的微粒子/胞浆成分。 
约54g的含有117ug/ml蛋白的蛋白起始材料(与实例1中相同；批次：BPP 047 SP洗脱液)在25℃的水浴中融化，并温热至24.0℃(指标：20-25℃)。然后称重51.12g(指标：50±2g)的起始材料并用2.6ml(指标：2.5±0.2ml)微粒子/胞浆成分掺料至5.1％的最终浓度。被掺料的起始材料的pH调节至6.994(指标：7.0±0.1)。然后取出6ml等分样品，在≤-60℃等分并储存(起始材料-SSM掺合的样品)。 
将1.955g的曲拉通X-100与0.582g的TnBP混合(指标比例：按重量计10份+3份)并搅拌36min。然后将0.665g的S/D反应剂立即加入剩余的47.72g掺料起始材料(指标比例：每kg掺料起始材料加14g S/D反应剂)并搅拌31min。将起始材料 的温度在开始时校正至24.5℃，而在搅拌期结束时校正至23.7℃(指标范围：18-25℃)。 
层析步骤
将用Capto MMC树脂填充的GE Healthcare Tricorn 1.8ml柱(CV＝1.0ml，床高＝9cm)用8.3CV的缓冲剂1(具有S/D的平衡缓冲剂)进行平衡，流速是1.0ml/min(指标：在1.0ml/min为5CV)。然后将47.29g S/D经掺料处理的起始材料加样至该柱，使用1.0ml/min的流速(指标：在1.0ml/min为45±2g)。加样之后，用10.0CV的缓冲剂2(无S/D的平衡缓冲剂)冲洗该柱，流速为0.8ml/min(指标：在1.0ml/min为10CV)。当UV信号开始上升时开始收集直流洗出液并持续进行，直到吸光度开始下降。测定直流洗出液的重量(实际重量：48.23g)，取出16ml等分部分，在≤-60℃等分并储存(直流洗出液样品-FT)。在用缓冲剂2冲洗过程中收集洗涤级分1。测定这部分的实际重量为12.75g，取出12ml等分样并在≤-60℃储存(样品洗涤1-W1)。 
然后用22.2CV的缓冲剂3洗涤柱(赖氨酸&乙二醇洗涤)，流速为0.6ml/min(指标：在0.6ml/min为20CV)。用缓冲剂3洗涤过程中，收集洗涤级分2并测定这部分的实际重量为40.35g。取出16ml等分部分，并在≤-60℃储存(样品洗涤2-W2)。 
用10.0CV的缓冲剂4(高盐洗涤)洗涤柱的过程中，流速为0.9ml/min(指标：在1.0ml/min为10CV)，收集洗涤级分3。测定其实际重量为18.48g，然后取出16ml等分样品，在≤-60℃等分并储存(样品洗涤3-W3)。 
用5.0CV的缓冲剂5(低盐洗涤)洗涤柱的过程中，流速为1.0ml/min(指标：在1ml/min为5CV)，收集洗涤级分4。测定这部分的实际重量为12.22g。取出11.5ml等分样品并在≤-60℃储存(样品洗涤4-W4)。 
然后用8.3CV的缓冲剂6(洗脱缓冲剂)洗脱产物，使用0.2ml/min的流速(指标：在0.2ml/min为7CV)。在用缓冲剂6冲洗柱的整个过程中进行洗脱液的收集。测定该洗脱级分的实际重量为13.54g，取出12.5ml等分样品，并在≤-60℃储存(样品洗脱液-E)。 
用9.4CV的缓冲剂7(再生缓冲剂)进行柱的再生过程中，流速为0.6ml/min(指标：在0.6ml/min为20CV)，收集再生级分4。测定17.97ml体积的该级分的重量，取出ml等分试样并在≤-60℃储存(样品再生-Reg)。 
表3(朊病毒掺料实验结果) 
  样品   样品体积(ml)   PrPSC含量Log10   PrPSC含量％
  起始材料(样品-SSM)   54   4.67   100
  直流洗出液，缓冲剂1(样品-FT)   48   4.68   102
  缓冲剂2(样品-W1)   13   3.61   9.5
  缓冲剂3(样品-W2)   40   2.61   0.9
  缓冲剂4(样品-W3)   18   ＜1.27   ＜0.04
  缓冲剂5(样品-W4)   12   ＜1.09   ＜0.03
  缓冲剂6(样品-E)   14   ＜1.13   ＜0.03
  缓冲剂7(样品-Reg)   18   ＜1.26   ＜0.04
讨论 
从表3和附录1(图1-5)可以看出，对于缓冲剂4-7洗脱出的级分，可以看到优异的朊蛋白去除值。因此，在这些级分中洗脱的蛋白产物，在PrPSc去除方面具有非常好的安全系数。还非常重要的是，加样的朊蛋白的质量平衡显示，除了直流洗出液和早期的洗涤缓冲剂，在其他级分中没有发现任何PrPSc。据我们所知，这在现有技术中没有出现过。在已公开的用作朊蛋白去除步骤的层析树脂的实例中，即使得到了相对可接受的朊蛋白降低值，在处理产品级分之前和之后，一般都可以在几个级分中发现朊蛋白，表现出有交叉污染的风险。 
分析说明 
根据Bradford进行的总蛋白测定
根据Bradford的蛋白测定是基于观察考马斯亮蓝G-250(Coomassie Brilliant BlueG-250)酸性溶液的吸光度最大值，当发生与蛋白的结合时，该最大值是从465nm移至595nm。疏水的和离子的相互作用，都会使阴离子形式的染料稳定，产生可见的颜色变化。该测定法之所以实用，是因为染料-白蛋白复合物溶液在10倍浓度的范围内其消光系数都是恒定值。见Bradford，MM.进一步公开的资料，分析生物化学72：248-254，1976刊载的文献：利用蛋白-染料结合的原理对微克含量蛋白进行迅速和灵敏的定量分析。 
用于PrPSc检测的西式吸印杂交试验(Western Blot Assay) 
西式吸印杂交试验是蛋白酶K抗羊瘙痒病毒缔合的朊蛋白(PrPSc)的半定量测定。 
按照DC Lee等人(Journal of Virological Methods 2000；84：77-89)描述的方式进行西式吸印杂交试验。 

Claims (15)

1.一种通过层析法分离和纯化靶蛋白的方法，其中该层析法旨在除去或贫化朊病毒PrPSc，包括如下步骤：
-使可能受PrPsc污染的、含有靶蛋白的样品与多元层析材料接触；
-设定缓冲剂条件，使得该靶蛋白与该多元层析材料相结合，而PrPsc则不与该多元层析材料结合；
-随后洗脱该靶蛋白；
所述的多元层析材料含有
i)带正电的N-苄基-N-甲基乙醇胺配体；
ii)带负电的2-(苯甲酰氨基)丁酸配体；
iii)苯基丙基配体；
iv)N-己基配体；
v)4-巯基-乙基-吡啶配体；
vi)3-[{3-甲基-5-((四氢呋喃-2-基-甲基)氨基)-苯基}氨基]苯甲酸配体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，按以下步骤洗脱朊病毒后，再洗脱该靶蛋白：
-增加或降低其离子浓度来修正该洗脱缓冲剂中的离子浓度，
-向该洗脱缓冲剂中，加入醇，和/或
-增加或降低其pH值来修正该洗脱缓冲剂的pH值。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的醇为一羟基或二羟基的链烷醇，或低级脂肪醇。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述的低级脂肪醇为甲醇、乙醇、丙醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，根据最初施加于该多元层析材料上的加样量计算，含有该靶蛋白的蛋白级份中，朊蛋白去除值是>1到4（log10）。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，层析条件包括以下步骤中的至少两个：
i)使用含有溶剂和/或非离子洗涤剂的加载和平衡缓冲剂；
ii)使用没有溶剂和/或非离子洗涤剂的洗涤缓冲剂；
iii)使用含有醇和/或氨基酸的洗涤缓冲剂；
iv)使用含有高盐浓度的洗涤缓冲剂；
v)使用含有低盐浓度的洗涤缓冲剂；
vi)使用含有醇与高盐浓度相组合的缓冲剂。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，该层析条件包括以下步骤中的至少两个：
i)使用含有溶剂和/或非离子洗涤剂的加载和平衡缓冲剂；
ii)使用第一洗涤缓冲剂，该第一洗涤缓冲剂是没有溶剂和非离子洗涤剂的缓冲剂；
iii)使用含有醇和氨基酸的第二洗涤缓冲剂；
iv)使用含有高盐浓度的第三洗涤缓冲剂；
v)使用含有低盐浓度的第四洗涤缓冲剂；
vi)使用含有醇与高盐浓度相组合的洗脱缓冲剂。
8.根据权利要求6所述的方法，其中：
i)加载和平衡缓冲剂含有磷酸三(正)丁酯和/或曲拉通X-100（Triton x-100），其浓度是从0.1到10%（w/w）；
ii)该第二洗涤缓冲剂含有乙二醇和/或赖氨酸/精氨酸，其含量范围是从5到30%（w/w）的乙二醇和从0.2到1.5M的赖氨酸/精氨酸；
iii)该第三洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度是从0.5到4M；
iv)该第四洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度是从0.01到0.2；
v)该洗脱缓冲剂含有乙二醇和氯化钠，其浓度是从25到75%(w/w)的乙二醇，和从0.5到4M NaCl。
9.根据权利要求8所述的方法，其中：该第三洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度是从0.5到1.5M。
10.根据权利要求8所述的方法，其中：该第四洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度是从0.01到0.1M。
11.根据权利要求8所述的方法，其中：该洗脱缓冲剂含有乙二醇和氯化钠，其浓度是从25到50%(w/w)的乙二醇，和从0.5到4M NaCl。
12.根据权利要求7所述的方法，其中：
i)加载和平衡缓冲剂含有磷酸三(正)丁酯和/或曲拉通X-100（Triton x-100），其浓度是从0.1到10%（w/w）；
ii)该第二洗涤缓冲剂含有乙二醇和赖氨酸/精氨酸，其含量范围是从5到30%（w/w）的乙二醇和从0.2到1.5M的赖氨酸/精氨酸；
iii)该第三洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度是从0.5到4M；
iv)该第四洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度是从0.01到0.2；
v)该洗脱缓冲剂含有乙二醇和氯化钠，其浓度是从25到75%(w/w)的乙二醇，和从0.5到4M NaCl。
13.根据权利要求12所述的方法，其中：该第三洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度是从0.5到1.5M。
14.根据权利要求12所述的方法，其中：该第四洗涤缓冲剂含有氯化钠，其浓度是从0.01到0.1M。
15.根据权利要求12所述的方法，其中：该洗脱缓冲剂含有乙二醇和氯化钠，其浓度是从25到50%(w/w)的乙二醇，和从0.5到4M NaCl。
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