TR201807044T4 - Prion proteini (PrPSC) içermeyen bir hedef proteinin izole edilmesi ve saflaştırılması için bir işlem. - Google Patents

Abstract

Prionları (PrPSC) uzaklaştıran veya tüketen kromatografi ile bir hedef proteinin izole edilmesi ve saflaştırılması için bir işlem şu aşamaları içerir: -potansiyel olarak PrPSC bulaşmış olan, bir hedef protein içeren bir numunenin bir çok-modlu kromatografi malzemesiyle temas ettirilmesi; -tampon koşullarının hedef proteinin çok-modlu kromatografi malzemesine bağlanacağı ve PrPSC'nin çok-modlu kromatografi malzemesine bağlanmayacağı şekilde ayarlanması; -ardından hedef proteinin taşınması.

Description

Tarifnameye göre "izole etme ve satlastirma" özellikle arzu edilen herhangi bir protein benzeri maddeyi en azindan zenginlestirmek için kullanilan islemler veya istenmeyen maddeleri tüketen islemler anlamina gelir. Tarifnameye göre, arzu edilen ürünün mümkün oldugu kadar saf elde edilmesi avantajlidir. ilgili protein anlainina gelir. Hedef protein ayrica arzu edildigi takdirde bir sabit protein karisimi, ör., bir takim halinde çalistiginda bir biyolojik etkiye sahip olan farkli faktörlerin bir karisimi olabilir.

Bulusun Detayli Açiklamasi Sürpriz bir sekilde, bir tekli kromatografî reçinesinin kromatografi kosullari altinda PrPSC'nin jele baglanmasini en aza indirebildigi ve dolayisiyla baglandigi ürün için mükemmel azaltma degerleri sagladigi bulunmustur. Reçine piyasadan temin edilebilir ve örnegin WO-A-2004/0243l8'de açiklanmaktadir. PrPSC'ye yönelik bu etkiye sahip oldugu gösterilmis olan reçine çok-modlu (veya karisik modlu veya hidrofobik yüklü indüksiyon) reçine olarak adlandirilmaktadir. Örnegin sadece bir prensibe göre çalisan iyon degistiriciler ve hidrofobik etkilesim kromatografisi reçineleri gibi standart kromatografi ortamlarinin aksine, çok-modlu reçineler iyonik etkilesimler ve hidrofobik etkilesimlerin bir kombinasyonuna göre çalisir. Bu tip bir reçinenin bir örnegi piyasadan GE Healthcare sirketinden temin edilebilen Capto® MMC'dir. Çok-modlu kromatografi reçinesi asagida açiklanmaktadir. Çesitli biyolojik maddelerin ayristirilmasi ve izole edilmesinde kullanim için etkili bir adsorban olan bir tekli çok-modlu kromatografi reçinesi açiklanmaktadir. Bu tarifnamedeki çok-modlu kromatografi reçinesi, örnegin, kolon kromatografisi gibi hazirlamali tekniklerde ve biyo-çipler gibi analitik aygitlarda kullanilabilir. Burada açiklanan mevcut çok-modlu kromatografi reçinesinin bir avantaji, bilinen teknikteki inaddeler için gerekli olan maliyetli ve çogunlukla zararli temizleme islemlerinin ortadan kaldirilmasiyla birlikte, immünoglobülinler gibi biyolojik maddeler için yüksek seçiciligi ve özgünlügüdür. Bir ikinci avantaj, bu tarifnamedeki çok-modlu kromatografi reçinesinin fizyolojik pH ve iyonik kuvvette biyolojik numunelerle kullanim için hemen hemen ideal uygunlukta olmasi, böylece bilinen teknikte gereken pH ayarlamasi ve liyotropik tuzlarin eklenmesi ihtiyacini ortadan kaldirrnasidir. Üçüncü avantaj, hazirlanmalarinda kullanilan tepkime maddelerinin düsük maliyeti isiginda, özel bilinen teknik adsorbanlarinin kullanimina kiyasla mevcut substratlarin önemli ekonomik kazançlar sunmaya yönelik yüksek kapasiteleri olarak görülebilir.

Karisik Mod Ligand Bu tarifnainedeki tekli çok-modlu kromatografi reçinesi bir kükürt atomu içeren bir baglayici grup araciligiyla bir negatif yüklü 2-(benzoilamino) bütanoik asit ligandi baglanan bir kati destek içerir. Bahsedilen tekli çok-modlu kromatografi reçinesi hedef proteinle hidrofobik ve iyonik etkilesimlerin bir kombinasyonu araciligiyla etkilesime girebilir. Bahsedilen hidrofobik etkilesimler negatif yüklü 2-(benzoilamino) bütanoik asit ligandindaki benzoilamino grubu ve/veya baglayici grup araciligiyla gerçeklesebilir.

Kati destek fizyolojik iyonik kuvvet ve pH'de iininünoglobülinler gibi biyolojik maddelerin adsorbe edilmesi için ideal olarak uygundur.

Burada kullanilan "sübstitüe edilmis" terimi, 2-(benzoilamin0) bütanoik asit grubuna bir sülfat, sülfonat, fosfat veya fosfonat grubunun dogrudan veya dolayli olarak baglanmasini belirtmektedir. Dolayli baglanma bir C1_6 düz veya dallanmis alkilen grubu olan bir aralayici grup araciligiyla gerçeklesebilir. 2-(benzoilamino) bütanoik asit grubu kati destege bir merkapto, eter veya amino içeren grup içeren bir baglayici grupla baglanir. Asagida açiklanan yapisal hususlara bagli olarak, baglayici grubun hidrofobik olmasi, böylece bir biyolojik maddenin baglanmasinin hem elektrostatik ve hem de hidrofobik etkilesimler araciligiyla gerçeklestigi bir pH'de kati destege hidrofobik Özellik kazandirmasi tercih edilir. Hidrofobik parçalara, sinirlayici olmaksizin, düz veya dallanmis CH, alkilen gruplair, CM alkenilen gruplari ve C2_(, alkinilen gruplari dahildir. Özellikle yararli parçalar etilen ve propilendir. Diger hidrofobik parçalar, örnegin, fenetilen olusturacak sekilde yukarida açiklanan bir aromatik grup içerir. Yukaridaki parçalar dolayisiyla en az bir merkapto, eter veya amino parçasiyla kesilir veya kapatilir. 2-(benzoilamino) bütanoik asit grubunun bir kükürt atomu içerrnedigi düzenlemelerde, baglayici grup tercihen bir merkapto parçasi içerir. Bu açidan, baglayici grup çok-modlu kromatografi reçinesine hidrofobik ve tiofilik özellikler kazandirir.

Baglayici grubun hidrofobikligi hidroksil, bir halojenür veya nitro gibi polar sübstitüentler eklenmesiyle; bir merkapto parçasinin bilinen usullerle oksitlenmesiyle; baglayici gruba eter veya amino parçalari eklenmesiyle; veya bunlarin kombinasyonlariyla kolayca uygun hale getirilebilir.

Bir baska tercih edilen düzenlemede, baglayici grubun kendisi örnegin hidroksi-etil- selüloz, nisasta, amiloz veya agaroz gibi bir polisakkarid içerir. Bu baglamda tercih edilen bir polisakkarid dekstrandir. Dolayisiyla, kati destek asagida açiklanan bir baglayici grupla türetilebilen bir polisakkaridle modifiye edilebilir.

Herhangi bir belirli teoriyle kendilerini sinirlamak istememelerine ragmen, bulus sahipleri, bu tarifnamedeki çok-modlu kromatografi reçinesinin çok-modlu kromatograti reçinesi ve bir biyolojik madde arasindaki "karisik etkilesim modlari" araciligiyla görev yaptigina inanmaktadir. Yukarida bahsedilen 2-(benzoi1amin0) bütanoik asit grubunun pK degeri 4'ten düsüktür ve dolayisiyla yukarida açiklanan kullanim pH araliklari içinde negatif` yüklüdür. Bir immünoglobülin gibi bir biyolojik madde çok-modlu kromatografi reçinesiyle yaklasik pH 4 ila pH 6 arasinda temas ettirilir, bu aralik içinde biyolojik madde bir net pozitif veya nötr yüke sahiptir. Bu pH araliginda, biyolojik madde çok-modlu kromatografi reçinesine 2-(benzoilamin0) bütanoik asit gruplari ile bir veya daha fazla tipte etkilesim araciligiyla baglanir.

Etkilesimlere coulomb çekimleri ve hafif hidrofobik etkilesiinler dahildir. pH yaklasik 8'in üzerine çiktiginda, biyolojik madde bir net negatif yük kazanir, böylece negatif yüklü çok-modlu kromatografi reçinesi ve negatif yüklü biyolojik madde arasinda elektrostatik itme olusturur. Sonuç olarak, biyolojik madde elektrostatik itmeyle çok- modlu kromatografi reçinesinden serbest birakilir ve daha sonra izole edilebilir. Bu itici iyonik kuvvetlerin yukarida belirtilen zayif çekme kuvvetlerinden daha büyük olduguna inanilmaktadir. Çok-modlu kromatografî reçinesi Bu tarifname, bir kükürt atomu içeren bir baglayici grup araciligiyla negatif yüklü 2- (benzoilamino) bütanoik asit ligandi baglanan bir kati destek içermektedir. Özellikle iki farkli format kapsanmaktadir. Bir formatta, kati destek kromatografi ortamlari için tipik olarak kullanilan formda, yani bir tane veya tanecik formundadir. Bu taneler veya tanecikler 2-(benzoilamin0) bütanoik asit ligandi ile türetilir. Taneler veya tanecikler kolonu doldurmak için kullanilabilen bir kromatografi ortami olusturur. Bir baska formatta, kati destek bir pul, yani karisik mod ligandin kovalent olarak veya bir baska sekilde baglanabildigi genel olarak düzlemsel bir yüzeye sahip olan bir kati destek formundadir. Bir tespit aygitinin bir prob arayüzüne geçecek sekilde uyarlanan pullar Taneler ve Tanecikler Bu bulusun ögretilerine göre, çok-modlu kromatografi reçinesi ilk olarak bir organik malzeme içerebilen bir kati destek içerir. Örnek organik malzemelere polisakkaridler, örnegin selüloz, nisasta, agar, agaroz ve dekstrantir. Sübstitüe edilmis veya sübstitüe edilmemis poliakrilamidler, polimetakrilamidler, poliakrilatlar, polimetakrilatlar, polivinil hidrofilik polimerler, polistiren, polisülfon ve kopolimerler veya stiren ve divinilbenzen dahil hidrofilik sentetik polimerler kapsanmaktadir. Alternatif olarak, kati destek malzemesi olarak inorganik malzemeler kullanilabilir. Bu tip inorganik malzemelere, sinirlayiei olmaksizin, gözenekli inineral malzemeler, örnegin silis; hidrojel içeren silis, Zirkonya, titanya, alümina; ve diger seramik malzemeler dahildir. malzemelerin karisimlari veya iki malzemenin kopolimerizasyonu veya birbirine geçmis agiyla olusturulan kompozit malzemelerin kullanilmasi da mümkündür.

Kati destek çapi yaklasik 0.1 mm ila yaklasik 1,000 mm olan taneler veya düzensiz tanecikler formunda olabilir. Alternatif olarak, kati destek mikron veya birkaç milimetre boyutlarinda deliklerin nüfuz ettigi lifler, membranlar veya sünger benzeri malzemeler seklinde sekillendirilebilir.

Yukarida açiklanan 2-(benzoilamin0) bütanoik asit grubu kati destek ve baglayici grup arasinda ve baglayici grup ve 2-(benzoilamin0) bütanoik asit grubu arasinda kovalent baglar olusturularak kati destek üzerine kiinyasal olarak sabitlenir. Tipik senaryolarda, kati destek önce kati destek üzerine baglayici grubun bir kismini veya tamamini olusturan reaktif gruplari ekleme görevi gören bir çift-fonksiyonlu tepkime maddesiyle islenir. Selüloz, bir hidrojel içeren kompozitler veya hidroksil gruplari saglayan diger malzemeler gibi bazi kati destekler için, hidroksil gruplarinin, örnegin, bir çift fonksiyonlu tepkime maddesiyle tepkimeden önce, bir hidroksit kaynagi ile protondan arindirilmasi çogunlukla avantajlidir. Çift fonksiyonlu tepkime maddesi hem kati destekle ve hem de 2-(benzoilamin0) bütanoik asit grubunu içeren tepkime maddeleriyle tepkimeye girebilir. Ayni veya farkli fonksiyonel gruplar içeren örnek çift fonksiyonlu tepkime maddelerine, sinirlayici olmaksizin, epiklorhidrin, epibromhidrin, dibromo- ve dikloropropanol, dibromobütan, etilen glikol diglisidileter, bütandiol diglisidileter, divinil sülfon, alilglisidileter ve alil broinür dahildir.

Fonksiyonel hale getirildikten sonra, kati destegin bir veya daha fazla çözücü ile yogun bir sekilde yikanmasiyla tepkimemis çift fonksiyonlu tepkime maddesi, tepkime yan ürünleri veya her ikisi uzaklastirilir. Bu açidan kullanilan tipik bir çözücü sudur. 2-(benzoilamino) bütanoik asit grubu daha sonra merkapto, hidroksil veya amino gruplari ile sübstitüe edilmis gruplar içeren tepkime maddeleri araciligiyla eklenir. Bu tip tepkime maddeleri yukarida açiklandigi gibi fonksiyonel hale getirilmis kati destek tarafindan saglanan fonksiyonel gruplarla tepkimeye girer.

Bir çift fonksiyonlu tepkime maddesinin bir 2-(benzoilamin0) bütanoik asit tepkime maddesi ile eslesmesi iyi bilinen kimyasal tekniklerle yönlendirilir. Örnegin, epoksitlerle fonksiyonel hale getirilmis kati destekler merkapto, hidroksi veya amino içeren tepkime maddeleriyle tepkimeye girerek bir substrati etilen içeren baglayici gruplarla donatabilir. Alil bromür ile modifiye edilmis kati destekler, örnegin, merkapto içeren tepkime maddeleriyle dogrudan tepkimeye girebilen alken gruplari saglar.

Alternatif olarak, alken gruplarinin ayrica bromlanmasiyla uygun sekilde reaktif brom türevleri saglanabilir.

Sabitlenmis 2-(benzoilamin0) bütanoik asit gruplarinin konsantrasyonu, kati destegi yapmak için kullanilan çift fonksiyonlu tepkime maddesinin konsantrasyonuna bagli olarak, kati destegin mililitresi basina bir mikromolün bir bölümü ve birkaç yüz mikroinol arasinda degisebilir.

Sabitlenmis grubun düsük konsantrasyonlari tipik olarak çok-modlu kromatografi reçinesinde düsük ayristirma kapasitesine neden olurken, yüksek konsantrasyonlar genel olarak artan kapasite saglar.

PSC'ye baglanmayan bir PrPSC uzaklastirma Yukarida açiklandigi gibi, baslica olarak Pr reçinesine sahip olmanin çesitli avantajlari vardir, bunlardan biri reçinenin ürünün tasinmasindan önce farkli tampon bilesimleriyle yogun bir sekilde yikanmasinin mümkün olmasidir, bu da farkli biyo-kimyasal bilesimlerdeki Pr nin çok düsük bir seviyeye kadar tüketilmesini veya bilesimlerden PrPSC'nin uzaklastirilmasini mümkün kilar. Örnegin, ürünün tasinmasindan önce daha az miktarda pirionun reçine veya hatta ürüne baglanabildigi hem iyonik ve hem de hidrofobik etkilesimi bozmak için sirasiyla yüksek ve düsük tuzlu tamponlar dahil, reçinenin farkli tiplerde yikama tamponlariyla yikanmasi mümkündür. Ürünün tasinmasindan önce bir optimum safligin elde edilmesi için yikama tamponlarina eklenebilen deterjanlar, alkoller ve amino asitler de örnekler arasindadir. PrPSC'nin reçineye baglandigi farkli tiplerdeki iyon degistirme reçineleri gibi "standart" kromatografi ortamlarinin diger tiplerinde benzer yikama asamalarinin gerçeklestirilmesi önemli ölçüde daha zordur. Ürüne kiyasla baglanma afinitesi önemli ölçüde daha yüksek oldugunda dahi, her zaman PrPSC'nin reçineden bir miktar ürünle birlikte tasinmasi riski olacaktir. Dolayisiyla, ürünün "çok-modlu" bir sekilde reçineye baglandigi, oysa PrPSC'nin reçineye nispeten düsük bir afiniteye sahip oldugu bir reçine kullanilmasinin, ürünün tasinmasindan önce uygun yikaina asamalarinin gerçeklestirilmesini mümkün kilma avantaji büyüktür.

Bulusa göre hedef protein Pr tasinmasindan sonra örnegin asagidaki yollarla tasinir: . iyonik kuvvetin arttirilmasi veya azaltilmasiyla tasima tamponunun iyonik kuvvetinin degistirilmesi, - tasima tamponuna alkoller - özellikle sulu çözelti içinde- örnegin mono- veya dihidroksialkanoller, ör. küçük alifatik alkoller, örnegin metanol, etanol, propanol eklenmesi ve/veya . pH'nin arttirilmasi veya azaltilmasiyla tasima tamponunun pH-degerinin degistirilmesi.

Ayrica, açiklanan tasima tekniklerinin bir kombinasyonu da kullanilabilir. Ör., bulus iyonik kuvvet arttirilmasini ve etilen alkol miktari arttirilinasini kullanir.

Ainino asitlerin konsantrasyonunun arttirilmasi, "Hofmeister serisine" göre özel tuzlarla konsantrasyonlarin arttirilmasi gibi baska tasima kosullari da kullanilabilir.

Hedef proteinin tasinmasi hedef proteinin biyo-kimyasal özelligine baglidir. Örnegin, hedef proteinin ko-enzimi veya hedef proteinin üçüncül yapisina yönelik ayirt etme özelligi yüksek olan baska maddelerin, ör., hedef protein olarak yüksek heparin konsantrasyonuyla tasinan antitrombinin kullanilmasi da mümkündür.

Hedef proteini içeren protein fraksiyonunda prion proteni azaltma degeri, reçineye ilk olarak uygulanan miktardan hesaplandiginda, > 1 ila 4 lg(IO)'dur. Ilgili protein fraksiyonundaki prion analitik degeri bir Western blot analizinde prion tespit limitinin altindadir.

Mevcut bulusun bir düzenlemesinde, kroinatografi kosullari asagidaki asamalarin en az ikisini içerir: i) Bir çözücü ve/veya bir iyonik olmayan deterjan içeren bir yükleme ve denge tamponu kullanilmasi; ii) Bir çözücü ve/veya iyonik olmayan deterjan içermeyen bir yikama tamponu kullanilmasi; iii) Bir alkol ve/Veya bir amino asit içeren bir yikama tamponu kullanilmasi; iv) Yüksek bir tuz konsantrasyonu içeren bir yikama tamponu kullanilmasi; v) Düsük bir tuz konsantrasyonu içeren bir yikama tamponu kullanilmasi; vi) Bir alkol ve yüksek tuz konsantrasyonu kombinasyonu içeren bir tampon kullanilmasi.

Mevcut bulusun bir baska düzenlemesinde, kromatografi kosullari asagidaki asamalarin en az ikisini içerir: i) Bir çözücü ve/veya bir iyonik olmayan deterjan içeren bir yükleme ve bir denge tamponu kullanilmasi; ii) Bir çözücü ve bir iyonik olmayan deterjan içermeyen bir tampon olarak bir birinci yikama tamponu kullanilmasi; iii) Bir alkol ve bir amino asit içeren bir ikinci yikama tamponu kullanilmasi; iv) Yüksek tuz konsantrasyonu içeren bir üçüncü yikama tamponu kullanilmasi; v) Düsük tuz konsantrasyonu içeren bir dördüncü yikama tamponu kullanilmasi; vi) Bir alkol ve yüksek tuz konsantrasyonu kombinasyonu içeren bir tasima tampon kullanilmasi.

Bulusun yine bir baska düzenlemesinde, kullanilan tamponlar asagidaki sekildedir: i) Yükleme ve denge tamponu yaklasik %0.] ila yaklasik %10 (a/a) arasinda degisen bir konsantrasyonda tri-n-bütilfosfat ve/veya Triton x-lOO içerir; ii) Ikinci yikama tamponu yaklasik %5 ila yaklasik %30 (a/a) arasinda degisen etilen glikol ve 0.2 ila yaklasik 1.5 M lizin/arginin olmak üzere etilen glikol ve/veya lizin/arginin içerir; iii) Üçüncü yikama tamponu yaklasik 0.5 ila yaklasik 4 M, özellikle yaklasik 0.5 ila yaklasik 1.5 M arasinda degisen bir konsantrasyonda sodyum klorür içerir; iv) Dördüncü yikama tamponu yaklasik 0.01 ila yaklasik 0.2, özellikle 0.01 ila yaklasik 0.1 M arasinda degisen bir konsantrasyonda sodyum klorür içerir; v) Tasima tamponu yaklasik %25 ila yaklasik %75 (a/a), özellikle yaklasik %25 ila yaklasik %50 konsantrasyonda etilen glikol ve yaklasik 0.5 ila yaklasik 4 M NaCl olmak üzere etilen glikol ve/veya sodyum klorür içerir.

Mevcut bulusun bir baska düzenlemesinde, kromatografi kosullari asagidaki asamalarin en az ikisini içerir: i) Yükleme ve denge tamponu %03› - 5 (a/a) arasinda degisen bir konsantrasyonda tri-n-bütilfosfat ve/veya Triton x-lOO içerir; ii) %10-25 (a/a) arasinda EG ve 0.3-1.0M lizin/arginin olmak üzere etilen glikol ve/veya liZin/arginin içeren bir ikinci yikama tamponunun >10 kolon hacmiyle iii) 0.8-1 .5 M arasinda degisen bir konsantrasyonda sodyum klorür içeren bir üçüncü yikama tamponunun >10 kolon hacmiyle yikama; iv) 0.03-0.15M arasinda degisen bir konsantrasyonda sodyum klorür içeren bir dördüncü yikama tamponunun >10 kolon hacmiyle yikama; v) Tasima tamponu %35-65 (a/a) arasinda degisen konsantrasyonda EG ve 0.8-3.0 NaCl olmak üzere etilen glikol ve/veya sodyum klorür içerir.

Bulusun bir baska düzenlemesinde, kullanilan tamponlar asagidaki sekildedir: i) Yükleme ve denge tamponu %0.8 - 1.2 (a/a) arasinda degisen bir konsantrasyonda tri-n-bütilfosfat ve/Veya Triton x-lOO içerir; ii) %18-22 (a/a) arasinda EG ve 0.4-O.6 M lizin/arginin olmak üzere etilen glikol ve/veya lizin/arginin içeren bir ikinci yikama tamponunun >20 kolon hacmiyle iii) 0.8-l.2 M arasinda degisen bir konsantrasyonda sodyum klorür içeren bir üçüncü yikama tamponunun >20 kolon haciniyle yikama; iv) 0.08-0.12M arasinda degisen bir konsantrasyonda sodyum klorür içeren bir dördüncü yikama tamponunun >20 kolon hacmiyle yikama; v) Tasima tamponu %45-55 (a/a) arasinda degisen konsantrasyonda EG ve l.3-l.7 NaCl olmak üzere etilen glikol ve/veya sodyum klorür içerir.

Farkli tiplerde yikama tainponlari uygulanmasinin avantaji, bunun farkli tiplerde olan ve reçineye veya hedef proteine farkli etkilesimlerle baglanan prionlarin uzaklastirilabilmesi olasiligini arttirmasidir. Ayrica, ilgili yikama tamponlarinin miktarinin arttirilmasiyla (yani, bir kolon hacmi reçine hacmine esittir), uygulanan tampon üzerindeki "yavas etki eden" her türlü kanal prionlarin güvenligi arttirilabilir.

Bulusa göre, çok-modlu kromatografi reçinesi bir negatif yüklü 2-(benzoilamino) bütanoik asit ligandi içerir.

Ayrica, Potansiyel olarak enfeksiyöz protein içeren kaynaklardan bulusa göre olan islemle elde edilen prion proteini tüketilmis bir hedef protein fraksiyonu açiklanmaktadir. Özellikle bulusa göre olan isleme göre izole edilen ve saflastirilan hedef protein asagidakilerden olusan gruptan seçilir: plazma proteinleri, peptid hormonlari, büyüme faktörleri, sitokinler ve poliklonal immünoglobülin proteinleri, insan ve hayvan kan pihtilastirici faktörlerinden seçilen plazma proteinleri, örnegin fibrinojen, protrombin, trombin, protrombin kompleksi, FX, FXa, FIX, FIXa, FVII, FVIIa, FXI, FXIa, FXII, FXIIa, FXIII ve FXHIa, von Willebrand faktörü, tasima proteinleri, örnegin albümin, transferin, seruloplazmin, haptoglobin, hemoglobülin ve hemopeksin, proteaz inhibitörleri, örnegin ß-antitrombin, (x-antitrombin, aZ-makroglobülin, Cl-inhibitörü, doku faktörü yolu inhibitörü (TFPI), heparin kofaktör II, protein C inhibitörü (PAI-3), Protein C ve Protein S, (1-1 esteraz inhibitörü proteinler, a-l anti-tripsin, antianjiyojenik proteinler, örnegin gizli-antitrombin, yüksek oranda glikosillenmis proteinler, örnegin a-l-asit glikoprotein, antikimotripsin, inter-(x-tripsin inhibitörü, a-Z-HS glikoprotein ve C-reaktif protein ve diger proteinler, örnegin histidin bakiinindan zengin glikoprotein, inannan baglayici lektin, C4-baglayici protein, fibronektin, GC-globülin, plazminojen, kan faktörleri, örnegin eritropoietin, interferon, tümör faktörleri, tPA, yCSF. ÖRNEKLER Kolon ve Reçine Tricom kolonu (GE Healthcare, Isveç, kesit alani: 0.2 cm2, çap 0.5 cm) Capto MMC 9 cm yatak yüksekligi, Kolon hacmi: 1.8 ml.

Baslangiç malzemesi HEK 293 hücrelerinden rekombinant olarak türetilmis ve bir yakalama kolunu asamasiyla yogunlastirilmis, proteinlerin bir karisimi baslangiç malzemesi olarak kullanilmistir (parti no: BPP .

Tampon bilesimleri* Tampon 1 (S/D eklenmis dengeleme tamponu) Tampon 2 (S/D içermeyen dengeleme tamponu) Tampon 3 (Yikama 1; Lizin ve Etilen glikol (=EG)) pH: 6.5 ± 0.1, Iletkenlik: +25° C'de 37 ± 3 mS/cmz.

Tampon 4 (Yikama 2; Yüksek Tuzlu Yikama) pH: 6.5 ± 0.1, Iletkenlik: +25° C'de 89 ± 5 mS/cmz.

Tampon 5 (Yikama 3; Düsük Tuzlu Yikama) pH: 6.5 ± 0.1, Iletkenlik: +25° C'de 13 ± 3 mS/cmz.

Tampon 6 (Tasima tamponu) Iletkenlik: +25o C'de 39 ± 3 mS/cmz, EG eklendikten sonra ölçülür.

Tampon 7 (Yenileme tamponu) 1 M Sodyum Hidroksit pH ayarlama için: 1 M HCl *Tamponlar bir nihai hacim olarak 1 L yerine, 1 kg su eklenerek hazirlanmistir. Bu nihai molariteler üzerinde küçük bir etkiye sahiptir, çünkü katki maddeleri nihai hacmi biraz arttirir.

Kromatografi kosullari: Tablo 1: Uygulanan yaklasik tampon miktarlarinin özeti, akis hizlari hem ml/dak ve hem de cm/saat olarak ifade edilmektedir. Her bir tampon asamasi için gereken süre ve protein çözeltisi için jelle temas süresi de gösterilmektedir.

Capto MMC çalismasi Kolon hacmi = (m1) Blok 1,8 No. ml Akis Akis Süre Temas süresi CV ml/dak cm/h (dak) (dak) Düsük tuzlu yikama Tasima tamponu, 1.5 M MMC reçinesi, yatak yüksekligi yaklasik 9 cm olan bir Tricorn kolonuna doldurulmus.

Kromatografi asamasi iletkenlik için ve 280 nm'de izlenmistir. Protein yükü 1 m1 reçineye bagli yaklasik 3 mg'dir. Önce, kolon uygun sekilde stabil bir baslangiç çizgisi elde edilene kadar S/D kimyasallari içeren dengeleme tamponuyla dengelenmistir. Baslangiç malzemesine kg basina 14 g S/D stogu oraninda S/D kimyasallari eklenmesiyle denge tamponuyla ayni konsantrasyon elde edilmis, protein çözeltisi kolona uygulanmadan önce en az dakika süreyle karistirilmistir. Asagidaki tamponlarin fraksiyonlari toplanmis ve toplam protein (ve PrPSC katma deneylerinde prionlar) için analiz edilmistir. 280 nm'deki absorbansla ölçülen kromatografi profili ek 2'de görülebilir: Devridaim (Tampon 1 + proteinler) Tampon 1 (Yüksek iyonik olmayan deterjan tainponu; 0.3 M NaCl, 0.01 M CaClz, Tampon 2 (Düsük iyonik olmayan deterjan tamponu; 0.3 M NaCl, 0.01 M CaClz, Tampon 3 (Amino asit/ Alkol Tamponu; 03 M NaCl, 001 M CaClg, 0.01 M L- Histidin, %002 (a/a) Tween 80, 0.5 M L-Lizin monoklorür, %20 (a/a) Etilen glikol, pH 6.5) Tampon 4 (Yüksek tuz tamponu; 1.0 M NaCl, 0.05 M CaClz, 0.05 M L-Histidin, Tampon 5 (Düsük tuz tamponu; 0.1 M NaCl, 0.01 M CaClz, 0.01 M L-Histidin, Tampon 6 (Yüksek tuz / Yüksek Alkol Tamponu) 1.5 M NaCl, 0.02 M CaClz, Tampon 7 (Yenileme tamponu; 2 M NaCl) Kolon 20 kolon hacminde 1 M NaOH ile yenilenmis ve daha sonra kullanilmak üzere Sonuçlar Tablo 2 (Prion içermeyen deneyde toplam protein tespiti) Numune Toplam Toplam Toplam Numune hacmi Protein Protein Protein numunesi) Devridaim (Tampon 1) 40 yok yok yok Tampon 2 20 yok yok yok Numune Toplam Toplam Toplam Numune hacmi Protein Protein Protein Tampon 4 20 10.7 0.2 %4 Tampon 5 10 13.6 0.1 %2 Tampon 6 9 150 1.4 %25 Tampon 7 18 yok yok yok yok = tamponun toplam protein analiz usulünü engellemesinden dolayi analiz edilineinistir Örnek 2 (prion katma deneyi) Örnek 1'de açiklanan kromatografi usulünün prion proteini uzaklastirma özelligini belirleyebilmek için, bir prion katma deneyi gerçeklestirilmistir. Örnek 1'deki ile ayni kolon, reçine, tamponlar ve baslangiç malzemesi kullanilmistir.

Prion proteini enfektivitesi baslangiç malzemesi Bu deneyde hamstere uyarlanmis scrapie 263K susunun bir mikrozomal/sitosolik fraksiyonu kullanilmistir. 117 11ng protein içeren yaklasik 54 g protein baslangiç malzemesi (örnek I'dekiyle ayni; parti no: BPP 25°C'deki bir su banyosunda eritilmis ve baslangiç malzemesi tartilmis ve %5.1 nihai konsantrasyona kadar 2.6 ml (hedef: 2.5 ± 0.2 ml) mikrozomal/sitosolik fraksiyon eklenmistir. Ekleme yapilmis baslangiç malzemesinin pH'sinin 6.994 (hedef: 7.0 ± 0.1) oldugu kontrol edilmistir. Daha sonra 6 ml'lik bir bölüm çikarilmis, bölümlere ayrilmis ve S -60°C'de saklanmistir (ekleme yapilmis baslangiç malzemesi numunesi - SSM). kisim, agirliga göre tayin) ve 36 dakika karistirilmistir. Daha sonra 0.665 g S/D tepkime maddesi hemen kalan 47.72 g ekleme yapilmis baslangiç inalzemesine eklenmis (hedef oran: ekleme yapilmis baslangiç malzemesi kg'si basina 14 g S/D-tepkime maddesi) ve 31 dakika karistirilmistir. Baslangiç malzemesinin sicakliginin baslangiçta 24.5°C oldugu ve karistirma fazinin sonunda 23.7°C oldugu (hedef aralik: 18-25°C) kontrol edilmistir.

Kromatografi asamasi Capto MMC reçinesi (CV = 1.0 ml, yatak yüksekligi = 9 cm) ile doldurulmus bir GE Healthcare Tricom 1.8 ml kolonu 1.0 ml/dak akis hizinda 8.3 CV Tampon 1 (S/D içeren Dengeleme tamponu) ile dengelenmistir (hedef: 1.0 ml/dak'ta 5 CV). Daha sonra 1.0 ml/dak akis hizi uygulanarak kolona 47.29 g S/D islenmis ekleme yapilmis baslangiç malzemesi yüklenmistir (hedef: 1.0 ml/dak'ta 45 ± 2 g). Yüklemenin ardindan kolon 0.8 ml/dak akis hizinda ile yikanmistir (hedef: 1.0 ml/dak'ta 10 CV). UV sinyali yükselmeye basladiginda devridaim toplanmaya baslanmis ve absorbans düsmeye baslayana kadar devam edilmistir. Devridaim fraksiyonunun agirligi belirlenmis (gerçek agirlik: 48.23 g), 16 ml'lik bir bölüm çikarilmis, bölümlere ayrilmis ve S -60°C'de saklanmistir (devridaim numunesi-FT). Yikama fraksiyonu 1 Tampon 2 ile yikama sirasinda toplanmistir. Bu fraksiyonun gerçek agirliginin 12.75 g oldugu belirlenmis ve 12 ml'lik bir bölüm çikarilmis ve S -60°C'de saklanmistir (yikama 1 numunesi-Wl ).

Daha sonra kolon 0.6 ml/dak akis hizinda 22.2 CV Tampon 3 (Lizin ve Etilen glikol yikamasi) ile yikanmistir (hedef: 0.6 ml/dak'ta 20 CV). Tampon 3 ile yikama sirasinda, yikama fraksiyonu 2 toplanmis ve bu fraksiyonun gerçek agirliginin 40.35 g oldugu belirlenmistir. 16 ml'lik bir bölüm çikarilmis ve S -60°C'de saklanmistir (yikama 2 numunesi-W2). 0.9 ml/dak akis hizinda 10.0 CV Tampon 4 ile yikama sirasinda (Yüksek Tuzlu Yikama) (hedef: 1.0 ml/dak'ta 10 CV), yikama fraksiyonu 3 toplanmistir. Gerçek agirligin 18.48 g oldugu belirlenmis, daha sonra 16 ml'lik bir bölüm çikarilmis, bölümlere ayrilmis ve S -60°C'de saklanmistir (yikama 3 numunesi-W3). 1.0 ml/dak akis hizinda (hedef: lml/dak'ta 5 CV), yikama fraksiyonu 4 toplanmistir. Bu fraksiyonun gerçek agirligi 12.22 g olarak belirlenmistir. 11.5 ml'lik bir bölüm çikarilmis ve S -60°C'de saklanmistir (yikama 4 numunesi-W4).

Daha sonra ürün 0.2 ml/dak akis hizi uygulanarak ile tasinmistir (hedef: 0.2 ml/dak'ta 7 CV). Kolonun Tampon 6 ile yikanmasinin tamami boyunca tasinan ürün toplanmistir. Tasinan ürün fraksiyonunun gerçek agirliginin 13.54 g oldugu belirlenmis, 12.5 ml'lik bir bölüm çikarilmis ve S -60°C'de saklanmistir (tasinan ürün numunesi-E). 0.6 ml/dak akis hizinda ile yenileme sirasinda (hedef: 0.6 ml/dak'ta 20 CV), yenileme fraksiyonu toplanmistir. Gerçek agirligin 17.97 ml oldugu belirlenmis, 16 ml'lik bir bölüm çikarilmis ve S -60°C'de saklanmistir (yenileme numunesi-Reg).

Tablo 3 (Prion katma deneyinin sonucu) Numune Numune hacmi PrP lçerigi PrP lçerigi (ml) Logio % Devridaim, Tampon l (numune - 48 4.

Tampon 2 (numune -Wl). 13 3.61 9.5 Tampon 4 (numune -W3) 18 Tampon 6 (numune -E) 14 Tampon 7 (numune -Reg) 18 <1 .26 <0.04 Açiklama Tablo 3 ve ek 1'de (Sekil 1-5) görülebildigi gibi, Tampon 4-7 fraksiyonlari için mükemmel prion proteini uzaklastirma degerleri görülebilir. Dolayisiyla, bu fraksiyonlar içinde tasinan protein ürünleri PrPSC uzaklastirma açisindan çok iyi güvenlik marjlarina sahip olacaktir. Uygulanan prion proteini kütle dengesinin devridaim ve ilk yikama tamponu disindaki fraksiyonlarda hiç PrPS'C bulunmadigini göstermesi de çok önemlidir. Bildigimiz kadariyla, bilinen teknikte bu önceden gösterilmemistir. Prion proteini uzaklastirma asamasi olarak kromatografi reçinelerinin yayinlanmis örneklerinde, nispeten makul prion proteini azaltma degerleri elde edilmesine ragmen, prion proteinlerinin normal olarak ürün fraksiyonundan önce ve sonra incelenen çesitli fraksiyonlarda bulunabilmesi, çapraz katisiklik riski oldugunu göstermektedir.

Analizin açiklamasi Bradford'a göre toplam proteinin belirlenmesi Bradford'a göre protein tayini proteine baglanma gerçeklestiginde bir asidik Coomassie Parlak Mavisi G-250 çözeltisi için absorbans maksimumunun 465 nm'den 595 nin'ye kaydiginin gözlemlenmesine dayanir. Hem hidrofobik ve hem de iyonik etkilesimler boyanin anyonik formunu stabilize ederek görünen bir renk degisimine neden olur. Bir boya-albümin kompleksi çözeltisinin sönüm katsayisi 10 katlik bir konsantrasyon araligi boyunca sabit oldugundan, bu analiz yararlidir. Ek bilgi için bkz., ayrica Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248- 254. 1976.

PrPSC Tespiti için Western Blot Analizi Western blot analizi proteinaz K dirençli Scrapie ile iliskili prion proteininin (PrPSC) bir yari-nicel tespitidir. açiklandigi gibi gerçeklestirilmistir.

Claims (2)

ISTEMLER

1. Prionlari (PrPSC) uzaklastiran veya tüketen kromatografiyle bir hedef proteinin izole edilmesi ve saflastirilmasi için bir islem olup, bahsedilen islem asagidaki asamalari içerir: - potansiyel olarak PrPSC bulasmis olan, bir hedef protein içeren bir numunenin bir tekli çok-modlu kromatografi reçinesiyle temas ettirilmesi, burada bahsedilen tekli çok-modlu kromatografi reçinesi bir baglayici grup araciligiyla bir negatif yüklü 2-(benzoilamino) bütanoik asit ligandinin baglandigi bir kati destek içerir, burada baglayici grup bir kükürt atomu içerir ve burada tekli çok-modlu kromatografi reçinesi bahsedilen hedef proteinle hidrofobik ve iyonik etkilesiinlerin bir kombinasyonu araciligiyla etkilesime girebilir, burada bahsedilen hidrofobik etkilesimler negatif yüklü 2-(benzilamino) bütanoik asit ligandindaki benzilamino grubu ve/veya baglayici grup araciligiyla gerçeklesebilir; tampon kosullarinin hedef proteinin tekli çok-modlu kromatografi reçinesine baglanacagi ve PrPSC'nin tekli çok-modlu kromatografi reçinesine baglanmayacagi sekilde ayarlanmasi; ve - ardindan bahsedilen tekli çok-modlu kromatografi reçinesinden hedef proteinin tasinmasi.

2. Istem l'e göre islem olup, burada hedef protein prionun tasinmasindan sonra asagidaki yollarla tasinir: - iyonik kuvvetin arttirilmasi veya azaltilmasiyla tasima tamponunun iyonik kuvvetinin degistirilmesi, - tasima tamponuna alkoller - özellikle sulu çözelti içinde- örnegin mono- veya dihidroksialkanoller, ör. küçük alifatik alkoller, örnegin metanol, etanol, propanol eklenmesi ve/veya - pH'nin arttirilmasi veya azaltilmasiyla tasima tamponunun pH-degerinin degistirilmesi. Önceki istemlerden herhangi birine göre islem olup, burada hedef proteini içeren protein fraksiyonunda prion proteini uzaklastirma degeri, reçineye ilk olarak uygulanan miktardan hesaplandiginda, > 1 ila 4 lg( 10)'dur. Önceki istemlerden herhangi birine göre islem olup, burada ilgili protein fraksiyonundaki prion proteini analitik degeri Western blot analizinde prion tespit limitinin altindadir. Önceki istemlerden herhangi birine göre islem olup, burada kromatografi kosullari asagidaki asamalarin en az ikisini içerir: Bir çözücü ve/veya bir iyonik olmayan deterjan içeren bir yükleme ve denge tainponu kullanilmasi; Bir çözücü ve/veya iyonik olmayan deterjan içermeyen bir yikama tamponu kullanilmasi; Bir alkol ve/veya bir amino asit içeren bir yikama tamponu kullanilmasi; Yüksek bir tuz konsantrasyonu içeren bir yikama tamponu kullanilmasi; Düsük bir tuz konsantrasyonu içeren bir yikama tamponu kullanilmasi; Bir alkol ve yüksek tuz konsantrasyonu kombinasyonu içeren bir tampon kullanilmasi. Önceki istemlerden herhangi birine göre islem olup, burada kromatografi kosullari asagidaki asamalarin en az ikisini içerir: Bir çözücü ve/veya bir iyonik olinayan deterjan içeren bir yükleme ve bir denge tamponu kullanilmasi; Bir çözücü ve bir iyonik olmayan deterjan içermeyen bir tampon olarak bir birinci yikama tamponu kullanilmasi; Bir alkol ve bir amino asit içeren bir ikinci yikama tamponu kullanilmasi; Yüksek tuz konsantrasyonu içeren bir üçüncü yikama tamponu kullanilmasi; Düsük tuz konsantrasyonu içeren bir dördüncü yikama tamponu kullanilmasi; vi) Bir alkol ve yüksek tuz konsantrasyonu kombinasyonu içeren bir tasima tamponu kullanilmasi. Önceki istemlerden herhangi birine göre islem olup, burada: i) Yükleme ve denge tamponu yaklasik %01 ila yaklasik %10 (a/a) arasinda degisen bir konsantrasyonda tri-n-bütil fosfat ve/veya Triton x-100 içerir; ii) Ikinci yikama tamponu yaklasik %5 ila yaklasik %30 (a/a) arasinda degisen etilen glikol ve 0.2 ila yaklasik 1.5 M lizin/arginin olmak üzere etilen glikol ve/veya lizin/arginin içerir; iii) Üçüncü yikama tainponu yaklasik 0.5 ila yaklasik 4 M, özellikle yaklasik 0.5 ila yaklasik 1.5 M arasinda degisen bir konsantrasyonda sodyum klorür iv) Dördüncü yikama tamponu yaklasik 001 ila yaklasik 0.2, özellikle 0.01 ila yaklasik 01 M arasinda degisen bir konsantrasyonda sodyum klorür içerir; v) Tasima tamponu yaklasik %25 ila yaklasik %75 (a/a), özellikle yaklasik yaklasik 4 M NaCl olmak üzere etilen glikol ve/veya sodyum klorür içerir. Önceki istemlerden herhangi birine göre islem olup, burada hedef protein asagidakilerden olusan gruptan seçilir: plazma proteinleri, peptid hormonlari, büyüme faktörleri, sitokinler ve poliklonal immünoglobülin proteinleri, insan ve hayvan kan pihtilastirici faktörlerinden seçilen plazma proteinleri, örnegin fibrinojen, protrombin, trombin, protroinbin kompleksi, FX, FXa, FIX, FlXa, FVII, FVIIa, FXI, FXIa, FXII, FXIIa, FXIII ve FXIIIa, von Willebrand faktörü, tasima proteinleri, örnegin albümin, transferin, seruloplazmin, haptoglobin, hemoglobülin ve hemopeksin, proteaz inhibitörleri, örnegin ß-antitrombin, oc- antitrombin, 0t2-makroglobülin, Cl-inhibitörü, doku faktörü yolu inhibitörü (TFPI), heparin kofaktör Il, protein C inhibitörü (PAI-3), Protein C ve Protein S, (1-1 esteraz inhibitörü proteinler, (x-l anti-tripsin, antianjiyojenik proteinler, örnegin gizli-antitrombin, yüksek oranda glikosillenmis proteinler, örnegin (x-l- asit glikoprotein, antikimotripsin, inter-(x-tripsin inhibitörü, a-2-HS glikoprotein ve C-reaktif protein ve diger proteinler, örnegin histidin bakimindan zengin glikoprotein, mannan baglayici lektin, C4-baglay1ci protein, fibronektin, GC- globülin, plazminojen, kan faktörleri, örnegin eritropoietin, interferon, tümör faktörleri, tPA, yCSF.