JP5797404B2 - プリオンタンパク質（ＰｒＰｓｃ）を含まない目的タンパク質の単離および精製の方法 - Google Patents

Description

本発明は、疾病に関連するタンパク質型ＰｒＰ^scを含まない目的タンパク質を単離および精製する方法に関する。

近年、血漿に由来する薬剤の精製法においてＰｒＰ^scの不活性化や除去に焦点を当てることは、より多くの注目を集めてきている。その理由が狂牛病などの発生であることは明らかである。生物医薬品生産用の組換え細胞株の使用でさえ、プリオンタンパク質の発生に関して、完全に安全とはみなされていない（Vorberg et al., The Journal of infectious diseases 2004; 189:431-9. Susceptibility of common fibroblast cell lines to transmissible spongiform encephalopathy agents）。生物医薬品として意図されたタンパク質の精製過程を決定する作業においては、プリオンタンパク質除去工程の候補として様々な精製工程が評価され得る（Foster PR, et al; Distribution of a bovine spongiform encephalopathy-derived agent over ion-exchange chromatography used in the preparation of concentrates of fibrinogen and factor VIII; Vox Sang. 2004 Feb; 86(2):92-9; Trejo SR, et al., Evaluation of virus and prion reduction in a new intravenous immunoglobulin manufacturing process. Vox Sang. 2003 Apr; 84(3): 176-87; Zeiler B, et al, Concentration and removal of prion proteins from biological solutions; Biotechnol Appl Biochem. 2003 Apr, 37(Pt 2):173-82; Foster et al. Studies on the removal of abnormal prion protein by processes used in the manufacture of human blood plasma products, Vox Sang. 2000, 78:86-95; Burnouf et al., Transfus Clin Biol. 2006 Nov; 13(5):320-8. Epub 2007 Jan 23, Current strategies to prevent transmission of prions by human plasma derivatives.）。

クロマトグラフィー樹脂が、精製過程におけるＰｒＰ^scの除去に寄与し得ることが知られている（参照文献２〜４、６〜７）。しかし、様々な化学構造および置換を有するクロマトグラフィー樹脂を用いる過程や様々なバッファーの系において一貫してＰｒＰ^sc浄化因子（ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ）が見つかっていることは、感染性因子のクロマトグラフィー担体表面上への非特異的結合が発生していることを裏付けるものである、と言われている。ＰｒＰ^scの除去は、再現可能であるようであるが、その除去機構が完全にはわかっていないため、例えば、いかにして（ａ）ＴＳＥ因子に結合するクロマトグラフィー担体の最大容量を決定するか、（ｂ）再生利用ゲルの効率的な殺菌消毒手順を確保するか、（ｃ）生産サイクルを通じて、一貫したＰｒＰ^sc除去可能量を保証するか、などの課題がある（Thyer J, Prion-removal capacity of chromatographic and ethanol precipitation steps used in the production of albumin and immunoglobulins; Vox Sang. 2006 Nov; 91(4):292-300）。

国際公開第９８／００４１号は、イオン交換クロマトグラフィーによる、例えばヘモグロビンといった他のタンパク質からプリオンを除去することを開示している。このイオン交換クロマトグラフィー媒体の調製は、第四級アンモニウム基の（均一な）表面を得るための、（ｇ‐グリシドキシプロピル）トリメトキシシランおよびジメタノールアミンで誘導体化されたシリカゲルを顕示する。

国際公開第０３／１０５９１１号は、溶出に塩勾配を利用したイオン交換クロマトグラフィーを用いた従来の手段によるヒト血漿の清浄方法を開示している。

国際公開第９４／０８６８６号は、単一分離媒体を用いる液体クロマトグラフィーカラムにおいて、連続方式で、相異なるクロマトグラフィー分離方法（different notes of chromatography）を実行するための方法を開示している。

D. B. Brimacombe et al. in Biochem. J. (1999) 342,605-613は、連続した２つのクロマトグラフィー工程によるｒｅｃＰｒＰの精製を開示している。第１の工程は、Ｓ−セファロース上で行われる陽イオン交換クロマトグラフィー（１５０〜６５０ ＮａＣｌ勾配）である。溜められた所期の溶出物は、第２のクロマトグラフィー工程（亜鉛荷電キレートセファロース；０〜１００ｍＭのイミダゾール勾配）に供される。

P. R. Foster et al. Vox Sanguinis 2000; 78:86-95は、血漿製品の製造における、多くの工程によるプリオンタンパク質の除去を開示している。この方法は、異なるクロマトグラフィーゲルを用いて、異なるカラムで行われる、４回のイオン交換クロマトグラフィー（工程２、１１、１３および１５）ならびに１回のアフィニティークロマトグラフィー（セファロース−ＦＦにヘパリンを固定；工程１２）からなる。

T. Burnouf et al.は、様々な血漿由来凝固因子のクロマトグラフィー工程におけるＴＳＥ因子除去の度合を、Tranfusion Clinique et Biologique 13 (2006) 320-328に発表している。その論文は、ＦＶＩＩＩ（ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍ）、ｖＷＦ（ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍ）、フィブリノゲン（ＤＥＡＥ−トヨパール ６５０Ｍ）、プロトロンビン複合体／ＦＩＸ（ＤＥＡＥ−セルロース）、ＰＣＣ（ＤＥＡＥ−セファロース）、ＦＩＸ（ＤＥＡＥ−セファロースまたはヘパリン−セファロース）およびトロンビン（Ｓ−セファロース）の生産に用いられる様々な種類の（大抵は）イオン交換クロマトグラフィー工程に、焦点を当てている。これらの系すべてを、個別に調べている。

J. Thyer et al.は、Vox Sanguinis (2006)91, 292-300の中で、ＤＥＡＥ−セファロース、ＣＭ−セファロースおよびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｈｉｇｈ Ｑ クロマトグラフィーカラムを通したＰｒＰの低減を報告している（「材料と方法」；図１、２９４頁；表ｌ）。別の実験では、ＤＥＡＥ−セファロース−カラム１種、およびＣＭ−セファロース−カラムまたはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ−カラム１種を連続して使用したことを開示している。

本発明の目的のひとつは、例えば、生物に由来する供給源など、ＰｒＰ^scが混入している可能性のある供給源の分画過程の際、ＰｒＰ^scを除去するクロマトグラフィーの方法を提供することである。その方法は、従来技術の欠点を回避するはずである。他の目的は、精製過程を、信頼性があるものとし且つクロマトグラフィー担体の再生を可能とすると考えられる方法を設計することである。

さらに本発明の他の目的は、プリオンが削減されたタンパク質の画分を提供することである。

本発明によれば、プリオン（ＰｒＰ^sc）を除去または削減するクロマトグラフィーによる、目的タンパク質の単離および精製の方法であって、
ＰｒＰ^scが混入している可能性のある、目的タンパク質を含む試料と、マルチモーダルクロマトグラフィー材料（multimodal chromatographic material）とを接触させる工程と、
前記目的タンパク質が前記マルチモーダルクロマトグラフィー材料に結合する一方で、前記ＰｒＰ^scが前記マルチモーダルクロマトグラフィー材料に結合しないよう、バッファー条件を設定する工程と、
続いて、前記目的タンパク質を溶出させる工程と、
前記目的タンパク質を回収する工程と
を含む方法が提供される。

前記クロマトグラフィー樹脂は、より弱くＰｒＰ^scと結合し、目的タンパク質を溶出させる前にクロマトグラフィー樹脂からＰｒＰ^scを除去することができる。そのため、本発明の方法は大幅な改善をもたらす。

本発明において、「単離および精製」は、特に、所望するタンパク質様の物質を少なくとも濃縮するために用いられる方法、または不要な物質を削減する方法を意味する。本発明においては、できるだけ純粋な所望の生産物を生じることが有利であろう。

「目的タンパク質」という語は、ＰｒＰ^scを含まないように単離および／または精製されるべき、所期のタンパク質を意味する。目的タンパク質は、もし望まれるならば、タンパク質の静止混合物（still mixture）、例えば、集合して作用すると生物学的な効果をもつ種々の因子の混合物でもあり得る。

「プリオン」は、感染性のタンパク質性物質である。

驚くべきことに、単一のクロマトグラフィー樹脂が、クロマトグラフィー条件下において、ＰｒＰ^scのゲルへの結合を最小限におさえることができ、それに結合する産物に対する優れた減少値（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅｓ）を実現することが見出された。このような樹脂は、市販されており、例えば、国際公開第２００４／０２４３１８号に記述されている。その開示は、参照により本明細書に取り込まれる。ＰｒＰ^sc対してこの効果を有することを示している樹脂は、マルチモーダル（multimodal）(または混合モード、または疎水性荷電誘導（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｃｈａｒｇｅｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ））樹脂と呼ばれる。例えばイオン交換体および疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂のような、ひとつの原理のみで働く標準的なクロマトグラフィー媒体とは反対に、マルチモーダル樹脂は、イオン相互作用および疎水性作用の組み合わせを介して働く。例えば、そのような樹脂として、市販されている、ＧＥヘルスケア社のＣａｐｔｏ（登録商標）ＭＭＣおよびＣａｐｔｏ（登録商標）Ａｄｈｅｒｅ、または、ＰＡＬＬ社のＭＥＰ、ＨＥＡもしくはＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（登録商標）樹脂が挙げられる。これらマルチモーダル樹脂のリガンドは、異なった方法で設計することができ、多種にわたるリガンドの例は、次に挙げる通りである。

次に、マルチモーダルクロマトグラフィー材料の種類についてまとめる。

本発明は、様々な生体物質の分離および単離に使用する効果的な吸着体である固体基質を提供する。本発明の固体基質は、例えば、カラムクロマトグラフィー等の調製技術およびバイオチップ等の分析装置に使用し得る。本明細書に記載される本固体基質の利点のひとつは、免疫グロブリン等の生体物質に対するその高い選択性と特異性であり、それと共に、従来技術の基質において必要とされた、コストがかかり、しばしば弊害をもたらす洗浄過程を、回避させることである。第２の利点は、本発明の固体基質は、生理的なｐＨおよびイオン強度における生体試料との使用にほぼ理想的に適しているので、ｐＨ調節や従来技術で処方されるようなリオトロフィック塩の添加の必要性を取り除くことである。第３の利点としては、本基質の容量が大きいことが考えられ、それらを調製するために使用する試薬のコストが低いことを考慮にいれると、従来の特別な吸着体の使用に比べ、かなりの経済的な利得を提示するものである。

混合モードリガンド
本発明の固体基質は、固体担体と、該固体担体に取り付けられているリガンドとを含む。リガンドは、単環式基または多環式基であり得る環式基と、硫黄原子を含んでもよい連結基とを含む。分析物を混合モードの作用で引きつけるリガンドが、固体担体に取り付けられている。

リガンドは環式基を含む。該環式基は固体担体につながっており、また、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基またはホスホン酸基で置換される単環式基または多環式基であり得る。単環式基または多環式基は、ここに定義されるように、不飽和の炭素−炭素結合のみを含んで芳香族系を与える環状炭化水素である芳香族基であり得る。原則として、いかなる芳香族基を本発明に用いてもよいが、好適な芳香族基は、典型的に、１つ、２つ、または３つの芳香族環を含む。従って、芳香族基の例としては、フェニル基ならびに、トリル基およびキシリル基といったその置換誘導体が挙げられる。二環式芳香族基の範囲には、縮合した個々の環が含まれ、例としてナフチル基が挙げられるがこれに限定されない。多環式芳香族基は、アントラセニル基およびフェナントレニル基, ならびにアセナフチル基のような縮合した異なるサイズの環を含む基を含む。芳香族基が選択される場合、必須ではないが、下に述べるように、ヘテロ環式またはヘテロ芳香族基に縮合している基であることが好ましい。

「ヘテロ環」は、少なくとも１つのヘテロ原子を含む飽和ないし部分飽和の環である。同様に、「ヘテロ芳香族基」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子で置換された芳香族基である。本発明において、ヘテロ原子は、好ましくは、Ｎ、Ｓ、またはＯである。また、ヘテロ環式またはヘテロ芳香族基は五員環または六員環であることが、これらの基を含む試薬が容易かつ低廉に商業的供給源から入手できる点から好ましい。

連結基が、下に定義されるように、両価性硫黄原子を含まない場合、ヘテロ環式基またはヘテロ芳香族基は、固体基質に「硫黄親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）」性質を確立するもしくは寄与するものであること、すなわち、少なくとも１つのＳ原子を含むものであることが好ましい。

２価の硫黄原子を含む他の連結基を使用する場合、好ましいヘテロ環式基またはヘテロ芳香族基は、少なくとも１つのＮ原子を含んでもよく、または、ＳおよびＮ原子の組み合わせを含んでもよい。

従って、ヘテロ環式基またはヘテロ芳香族基の例としては、チアゾリン、チアゾリドン、イミダゾール、イミダゾリン、チアゾール、トリアゾール、テトラゾール、チアジアゾール、イミダゾール、ピリジンおよびモルホリンが挙げられる。特に好ましい一実施形態において、好適なヘテロ環式またはヘテロ芳香族基は、前述のように、芳香族基と縮合している。この点において、ベンゾイミダゾールとベンゾチアゾールは、容易に入手可能な候補であり、優れた固体基質を生み出す。

前記のように、単環式基または多環式基は、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基、またはホスホン酸基で置換されている。これらの基は、十分に酸性であり、例えば、ｐＨ約２からｐＨ約１２といった広いｐＨの範囲内で、帯電した部分として存在する。そのため、固体担体は、生理学的イオン強度およびｐＨにおいて、免疫グロブリンのような生体物質を吸収するのに理想的に適している。

本明細書で使われる「置換」という語は、単環式基または多環式基に、硫酸基、スルホン酸基、リン酸基またはホスホン酸基が直接的もしくは間接的に付加することを指す。間接的な付加は、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖または分岐アルキレン基であるスぺーサー基を介して起こり得る。アルキレン基は、１つ以上の二価の部分、例えば、特に限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｏ−、−５−、−５（Ｏ）−、−５（Ｏ）₂−、−ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および−ＯＣ（Ｏ）−が間に入ってもよい。つまり、スぺーサー基の例として、−ＣＨ₂−、−ＣＨ₂ＣＨ₂−、−ＣＨ₂−Ｏ−ＣＨ₂−、および−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）ＮＨＣＨ₂ＣＨ₂−が挙げられる。

単環式基または多環式基は、メルカプト含有部分、エーテル含有部分、またはアミノ含有部分を含む連結基によって、固体担体に繋がれている。後述の構造的な考慮事項に従って、連結基は静電気的および疎水性の相互作用の両方を通して生体物質の結合が起こるｐＨにおいて、固体担体に疎水的な性質を与えるよう、疎水性であることが好ましい。疎水性部としては、直鎖または分岐のＣ１〜Ｃ６のアルキレン基、Ｃ２〜Ｃ６のアルケニレン基およびＣ２の〜Ｃ６アルキニレン基が挙げられるが、これらに限定されない。特に有用な部分はエチレンとプロピレンである。疎水性部分としては他に、前述のように芳香族基が挙げられ、例えばフェニルエチレン（ｐｈｅｎｅｔｈｙｌｅｎｅ）を形成する。従って、先述の部分は、その間にメルカプト部分、エーテル部分、もしくはアミノ部分の少なくとも１つが入っている（interrupt）か、または、メルカプト部分、エーテル部分、もしくはアミノ部分の少なくとも１つによりキャップ（cap）されている。単環式基または多環式基が、硫黄原子を含まない実施形態では、連結基は、好ましくは、メルカプト部分を含む。これに関連して、連結基は、疎水性および硫黄親和性の性質を固体基質に与える。好ましいメルカプト含有連結基のひとつを、構造式に表す。

連結基の疎水性は、ヒドロキシル、ハロゲン化物もしくはニトロといった極性置換体を導入すること、公知の方法によりメルカプト部分を酸化すること、エーテル部分もしくはアミノ部分を連結基に導入すること、またはこれらの組み合わせにより、容易に調整することができる。このような、容易に利用可能なメルカプト含有連結基の１つを、構造式に示す。

アミノ含有連結基の例を、構造式に示す。
アミノ含有連結基からなる固体基質、または、酸化されたメルカプト部分からなる固体基質は、少なくともひとつのＳ原子を含む単環式基または多環式基も含むことが好ましい。この場合、固体基質は、幾分かの硫黄親和性な性質を保持することができる。

他の好ましい一実施形態において、連結基、それ自体が、ヒドロキシエチルセルロース、デンプン、アミロースまたはアガロースのような多糖類を含む。ここで好ましい多糖類は、デキストランである。よって、固体担体は、後述のように、連結基で誘導体化され得る多糖類で修飾される。

いかなる特定の理論に縛られるものではないが、本発明者らは、本発明の固体基質が、固体基質と生体物質の間の相互作用の「混合モード」を通して機能すると考える。前記の単環式および多環式基は、４未満のｐＫ値を有し、従って、前述のような使用のｐＨ範囲内では、負に帯電している。免疫グロブリンのような生体物質は、生体物質が全体として正または中性の電荷をもつ、約４から６のｐＨの間で、固体基質と接触する。このｐＨ範囲において、生体物質は、単または多環式基との一種以上の相互作用を介して、固体基質と結合する。相互作用は、クーロン引力および弱い疎水性会合を含む。ｐＨが、約８を超えて上がる場合、生体物質は、全体として、負に帯電し、これによって、負に帯電した固体基質と負に帯電した生体物質との間で、静電反発力が生まれる。従って、生体物質は、静電反発力によって、固体基質から引き離され、その後に単離され得る。これらの反発イオン力は、上記の弱い引力よりも強いと考えられている。

固体基質
本発明は、混合モードリガンドが取り付けられた固体担体を意図する。特に、二つの異なるフォーマットを意図する。１つのフォーマットでは、固体担体が、クロマトグラフィー媒体に用いられる典型的な形、すなわち、ビーズまたは粒子の形である。これらのビーズまたは粒子は、混合モードリガンドで誘導体化される。ビーズまたは粒子は、カラムに充填可能なクロマトグラフィー担体を形成する。もうひとつのフォーマットでは、固体担体は、チップの形をとる。すなわち、混合モードリガンドが共有結合またはその他の結合で取り付けられる、一般的に平面の表面を有する固体担体の形をとる。検出装置のプローブのインターフェイスに適応するチップも「プローブ（ｐｒｏｂｅｓ）」と呼ばれる。

ビーズおよび粒子
本発明の教示によれば、固体基質は、まず、有機材料を含んでもよい固体担体を含む。有機材料の例として、セルロース、デンプン、寒天、アガロースおよびデキストランのような多糖類が挙げられる。置換もしくは非置換のポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリレート、ポリメタアクリレート、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホン、ならびにスチレンとジビニルベンゼンとの共重合体を含む親水性合成ポリマーが意図される。あるいは、無機材料を固体担体材料として用いてもよい。そのような無機材料として、シリカのような多孔性の無機材料;ハイドロゲル含有シリカ、ジルコニア、チタニア、アルミナ；およびその他のセラミック材料が挙げられるが、これらに限定されない。これら材料の混合物、または二種の材料の共重合もしくは相互侵入網によって形成された複合材料を用いることも可能である。それらは例えば、米国特許第５，２６８，０９７号、米国特許第５，２３４，９９１号、および米国特許第５，０７５，３７１号に開示されている。

固体担体は、直径約０．１ｍｍから約１０００ｍｍのビーズまたは不規則形状粒子の形であってよい。あるいは、固体担体は、繊維、膜、または、ミクロンから数ミリメートル大の細孔が通っているスポンジ状材料に成形され得る。

前述の単環式基または多環式基は、固体担体と連結基との間、および、連結基と単環式基または多環式基との間に、共有結合を形成することによって、固体担体上に化学的に固定される。典型的な状況では、固体担体をまず、連結基の一部または全体を形成する反応基を固体担体に導入する役割をする二官能基試薬（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅａｇｅｎｔ）で処理する。セルロース、ハイドロゲルを含む複合体、またはヒドロキシル基を提示するその他の材料など、いくつかの固体担体に対しては、例えば二官能基試薬との反応の前に、水酸化物供給源でヒドロキシル基を脱プロトン化することが有利である場合が多い。二官能基試薬は、固体担体及び単環式基または多環式基を含む試薬の両方と反応することができる。官能基群が同じまたは異なっているものを包含する二官能基試薬の例としては、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジブロモプロパノール、ジクロロプロパノール、ジブロモブタン、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ブタンジオールジグリシジルエーテル、ジビニルスルホン、アリルグリシジルエーテルおよび臭化アリルが挙げられるが、これらに限定されない。

いったん官能化すると、次に、固体担体を１つ以上溶媒で何度も洗浄し、未反応の二官能基試薬、反応副産物またはその両方を除去する。これに関して用いられる典型的な溶媒は、水である。

次いで、単環式基または多環式基を、メルカプト、ヒドロキシルまたはアミノ基で置換した基を含む試薬によって導入する。そのような試薬は、前述のように官能化された固体担体によって提示される官能基と反応する。

二官能基試薬と単環式基または複環式基試薬との特定の組み合わせは、周知の化学的性質によって導かれる。例えば、エポキシドで官能化された固体担体は、メルカプト、ヒドロキシまたはアミノ含有試薬と反応し、エチレン含有連結基を基質に与える。アリル臭化物で修飾された他の固体担体は、例えば、メルカプト含有試薬と直接反応し得るアルケン基を提示する。あるいは、アルケン基はさらに臭素化され、好適な反応性を有する臭化誘導体を与える。

固定される単環式基または多環式基の濃度は、固体担体の作製に用いる二官能基試薬の濃度に応じて、固体担体ミリリットルあたり、数分の1マイクロモルと数百マイクロモルの間で変えることができる。

典型的には、固定された基の濃度が低ければ、固体基質の分離能は低くなり、反対に濃度が高ければ、一般的に分離能は高くなる。

上述のように、ＰｒＰ^scに大部分結合しないＰｒＰ^sc除去樹脂を有することには、いくつかの利点がある。そのひとつは、産物を溶出させる前に、異なるバッファー組成物を用いて樹脂を何度も洗浄することが可能であり、それにより、様々な生化学的組成のＰｒＰ^scの数を、少なくともかなり低いレベルまで減じること、または、組成物からＰｒＰ^scを除去することが可能になる。例えば、高濃度塩バッファー、場合により、低濃度塩バッファーなどの異なる種類の洗浄バッファーで、産物を溶出させる前に、樹脂を洗浄し、少量のプリオンが樹脂または産物にも結合し得るイオン相互作用、場合により、疎水性相互作用を妨げることが可能である。界面活性剤、アルコールおよびアミノ酸もまた、最適な純度を得るために、産物を溶出させる前に洗浄バッファーに添加し得るものの例である。例えば、ＰｒＰ^scが結合する様々な種類のイオン交換樹脂などの、他の種類の「標準的な」クロマトグラフィー媒体に、同様な洗浄工程を行うことは、非常に難しい。結合親和性が、産物と比べて非常に高い場合でさえ、ＰｒＰ^scがある程度、樹脂から産物と共に溶出される危険性が常にある。従って、ＰｒＰ^scが比較的低い親和性を有する一方で、産物が「マルチモーダル」に結合する樹脂を用いることは、大変有利であり、これにより、産物を溶出させる前に、適切な洗浄工程を適用することが可能となる。

本発明によると、ＰｒＰ^scを溶出させた後に、例えば、下記によって、目的タンパク質を溶出させる。
‐ イオン強度を増加または減少させることにより溶出バッファーのイオン強度を変える工程、
‐溶出バッファー（特に、水性溶液であるもの）に、モノヒドロキシアルカノールもしくはジヒドロキシアルカノール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノールのような低級脂肪族アルコール）のようなアルコールを加える工程、および／または、
‐ ｐＨを増加または減少させることにより溶出バッファーのｐＨ値を変える工程。

また、上述の溶出技術を複数組み合わせて用いることもできる。例えば、本発明においては、イオン強度を上げ、かつエチレングリコール量を増加させる。

また、他の溶出条件も用いることができる。例えば、アミノ酸の濃度を増加させたり、「ホフマイスターシリーズ」に従って特定の塩の濃度を増加させる。

目的タンパク質の溶出は、該目的タンパク質の生化学的性質に依存する。例えば、目的タンパク質の補酵素、または、目的タンパク質の三次構造を高度に認識する他の物質を使用することが可能である。目的タンパク質の例として、ヘパリンの濃度を上げることで溶出されるアンチトロンビンが挙げられる。

はじめに樹脂に加えた量から計算した、目的タンパク質を含むタンパク質画分のプリオンタンパク質除去値（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）は、１ｌｇ（１０）より大きく４ｌｇ（１０）以下である。所期のタンパク質画分のプリオンタンパク質分析値（ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｖａｌｕｅ）は、プリオンのウェスタンブロットアッセイの検出限界を下回っている。

本発明の一実施形態において、クロマトグラフィー条件は、次の工程の少なくとも２つを含む：
ｉ）溶媒および／または非イオン性界面活性剤を含有する添加平衡バッファーを使用する工程、
ｉｉ）溶媒および／または非イオン性界面活性剤を含有しない洗浄バッファーを使用する工程、
ｉｉｉ）アルコールおよび／またはアミノ酸を含有する洗浄バッファーを使用する工程、
ｉｖ）高塩濃度の洗浄バッファーを使用する工程、
ｖ）低塩濃度の洗浄バッファーを使用する工程、
ｖｉ）アルコールと高塩濃度との組み合わせを含むバッファーを使用する工程。

本発明のさらなる一実施形態において、クロマトグラフィー条件は、次の工程のうち少なくとも二つを含む:
ｉ）溶媒および／または非イオン性界面活性剤を含有する添加平衡バッファーを使用する工程、
ｉｉ）溶媒および非イオン性界面活性剤を含有しないバッファーである第一の洗浄バッファーを使用する工程、
ｉｉｉ）アルコールおよびアミノ酸を含有する第二の洗浄バッファーを使用する工程、
ｉｖ）高塩濃度の第三の洗浄バッファーを使用する工程、
ｖ）低塩濃度の第四の洗浄バッファーを使用する工程、
ｖｉ）アルコールと高塩濃度との組み合わせを含む溶出バッファーを使用する工程。

さらに、他の本発明の他の一実施形態において、用いられるバッファーは、次の通りである：
ｉ）添加平衡バッファーは、リン酸トリ−ｎ−ブチルおよび／またはトリトンＸ−１００を約０．１〜１０％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で含む；
ｉｉ）第二の洗浄バッファーは、エチレングリコールおよび／またはリシン／アルギニンを含み、ここでエチレングリコールは、約５〜約３０％（ｗ／ｗ）の範囲であり、リシン／アルギニンは、０．２〜約１．５Ｍの範囲である；
ｉｉｉ）第三の洗浄バッファーは、塩化ナトリウムを、約０．５〜約４Ｍ、特に約０．５〜約１．５Ｍの濃度範囲で含む；
ｉｖ）第四の洗浄バッファーは、塩化ナトリウムを約０．０１〜約０．２Ｍ、特に０．０１〜約０．１Ｍの濃度範囲で含む；
ｖ）溶出バッファーは、エチレングリコールおよび／または塩化ナトリウムを含み、エチレングリコールを、約２５〜約７５％（ｗ／ｗ）、特に、約２５から約５０％の濃度の範囲で、ＮａＣｌは、約０．５〜約４Ｍの濃度で含む。

本発明のさらなる一実施形態において、クロマトグラフィー条件は、次の工程のうち少なくとも二つを含む。
ｉ）添加平衡バッファーは、リン酸トリブチルおよび／またはトリトンＸ−１００を０．３〜５％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で含む；
ｉｉ）エチレングリコールを１０〜２５％（ｗ／ｗ）の範囲で、および／またはリシン／アルギニンを０．３〜１．０Ｍの範囲で含む、カラム容量の１０倍より多い第二の洗浄バッファーで洗浄する工程；
ｉｉｉ）塩化ナトリウムを０．８〜１．５Ｍの濃度範囲で含む、カラム容量の１０倍より多い第三の洗浄バッファーで洗浄する工程；
ｉｖ）塩化ナトリウムを０．０３〜０．１５Ｍの濃度の範囲で含む、カラム容量の１０倍より多い第四の洗浄バッファーで洗浄する工程；
ｖ）溶出バッファーは、エチレングリコールおよび／または塩化ナトリウムを含み、ここでＥＧは３５〜６５％（ｗ／ｗ）の濃度の範囲で、またＮａＣｌは０．８〜３．０の濃度の範囲で含まれる。

本発明の他の一実施形態において、用いられるバッファーは、次の通りである：
ｉ）添加平衡バッファーは、リン酸トリブチルおよび／またはトリトンＸ−１００を０．８〜１．２％（ｗ／ｗ）の濃度の範囲で含む；
ｉｉ）エチレングリコールを１８〜２２％（ｗ／ｗ）で、および／またはリシン／アルギニンを０．４〜０．６Ｍを含む、カラム容量の２０倍より多い洗浄バッファーで洗浄する工程；
ｉｉｉ）塩化ナトリウムを０．８〜１．２Ｍの濃度範囲で含む、カラム容量の２０倍より多い第三の洗浄バッファーで洗浄する工程；
ｉｖ）塩化ナトリウムを０．０８〜０．１２Ｍの濃度の範囲で含む、カラム容量の２０倍より多い第四の洗浄バッファーで洗浄する工程；
ｖ）溶出バッファーは、エチレングリコールおよび／または塩化ナトリウムを含み、ここでＥＧは４５〜５５％（ｗ／ｗ）の濃度の範囲で、またＮａＣｌは１．３〜１．７の濃度の範囲で含まれる。

異なった種類の洗浄バッファーを適用することの利点は、それによって、異なった種類のプリオンや、樹脂または目的タンパク質に異なる相互作用で結合しているプリオンを除去できる可能性が上がることである。また、各バッファーの量（すなわち、１カラム容量は、樹脂の容量に等しい）を増やすことによって、加えたバッファーに対して「ゆっくりと作用する（ｓｌｏｗａｃｔｉｎｇ）」いくらかの残存プリオンに対する安全性が増加し得る。

マルチモーダルクロマトグラフィー材料は、
ｉ）正に帯電したＮ−ベンジル−Ｎ−メチル エタノールアミンリガンド、
ｉｉ）負に帯電した２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンド、
ｉｉｉ）フェニルプロピルリガンド、
ｉｖ）Ｎ−ヘキシルリガンド、
ｖ）４−メルカプト−エチル−ピリジンリガンド、
ｖｉ）３−［｛３−メチル−５−（（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）アミノ）−フェニル｝アミノ］安息香酸リガンド、
を含み得る。

本発明の主題はまた、感染性である可能性を有するタンパク質を含有する供給源から単離されたタンパク質の、プリオンタンパク質が削減された画分でもある。該画分は、本発明の方法によって得ることができる、薬剤的に適用可能なタンパク質を含有する。

特に、タンパク質画分は、血漿タンパク質、ペプチドホルモン、増殖因子、サイトカインおよびポリクローナル免疫グロブリンタンパク質、フィブリノゲン、プロトロンビン、トロンビン、プロトロンビン複合体、ＦＸ、ＦＸａ、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩａ、ＦＸＩ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩａ、ＦＸＩＩＩ、ＦＸＩＩＩａ、フォン・ヴィレブランド因子などのヒトおよび動物血液凝固因子から選択される血漿タンパク質、アルブミン、トランスフェリン、セルロプラスミン、ハプトグロビン、ヘモグロブリンおよびヘモペキシンなどの輸送タンパク質、β−アンチトロンビン、α−アンチトロンビン、α２−マクログロブリン、Ｃｌ阻害因子、組織因子経路阻害因子（ＴＦＰＩ）、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ阻害因子（ＰＡＩ−３）、プロテインＣおよびプロテインＳ、α−１エステラーゼ阻害因子タンパク質、α−１抗トリプシンなどのプロテアーゼ阻害剤、潜在性抗トロンビンなどの抗血管新生タンパク質、α−ｌ−酸性糖タンパク質、アンチキモトリプシン、インターαトリプシンインヒビター、α−２−ＨＳ糖タンパク質、Ｃ−反応性タンパク質などの高グリコシル化タンパク質、ならびに、ヒスチジン高含有糖タンパク質、マンナン結合レクチン、Ｃ４−結合タンパク質、フィブロネクチン、ＧＣグロブリン、プラスミノゲン、エリスロポエチンのような血液因子、インターフェロン、腫瘍因子、ｔＰＡ、γＣＳＦなどその他のタンパク質を含むことを求められる。

さらに、本発明を次の実施例により説明するが、これらに限定されない。

実施例１
カラムおよび樹脂
Ｔｒｉｃｏｒｎカラム（ＧＥヘルスケア社、スウェーデン、断面積：０．２ｃｍ²、直径：０．５ｃｍ）に、ＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号１７−５３１７−１０、ロット番号３０８５８１）を、９ｃｍのベッド高、カラム容量：１．８ｍｌで、充填する。

出発材料
ＨＥＫ２９３細胞由来組換えタンパク質の、キャプチャーカラム工程を経て濃縮された混合物を、出発材料として用いた。（バッチ番号：ＢＰＰ ０４７ ＳＰ ｅｌｕａｔｅ、１１７μｇのタンパク質／ｍｌ）。

バッファー組成＊
バッファー１（Ｓ／Ｄが添加された平衡バッファー）
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂（２×Ｈ₂Ｏ）、０．０１Ｍ Ｌ−ヒスチジン、１％ｗ／ｗ トリトンＸ−１００、０．３％ｗ／ｗ ＴＮＢＰ、ｐＨ：７．０±０．１、導電率：２９±３ｍＳ／ｃｍ²（＋２５℃）
バッファー２（Ｓ／Ｄ無し平衡バッファー）
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂（２×Ｈ₂Ｏ）、０．０１Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、ｐＨ：６．５±０．１、導電率：３１±３ｍＳ／ｃｍ²（＋２５℃）
バッファー３（洗浄１：リシンおよびエチレングリコール（＝ＥＧ））
０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂（２×Ｈ₂Ｏ）、０．０１Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、０．５Ｍ 一塩化（Ｌ−）リシン（Ｌ−Ｌｙｓｉｎ ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｉｄ）、２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（＝ＥＧ）、ｐＨ：６．５±０．１、導電率：３７±３ｍＳ／ｃｍ²（＋２５℃）
バッファー４（洗浄２：高濃度塩洗浄）
１．０Ｍ ＮａＣｌ、 ０．０５Ｍ ＣａＣｌ₂（２×Ｈ₂Ｏ）、０．０５Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、ｐＨ：６．５±０．１、導電率：８９±５ｍＳ／ｃｍ²（＋２５℃）
バッファー５（洗浄３：低濃度塩洗浄）
０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂（２×Ｈ₂Ｏ）、０．０１Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、ｐＨ：６．５±０．１、導電率：１３±３ｍＳ／ｃｍ²（＋２５℃）
バッファー６（溶出バッファー）
１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ ＣａＣｌ₂（２×Ｈ₂Ｏ）、０．０２Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（ＥＧ）、ｐＨ：６．５±０．１（ＥＧ添加前にｐＨを調整）、導電率（＋２５℃、ＥＧ添加後に測定）：３９±３ｍＳ／ｃｍ²
バッファー７（再生バッファー）
１Ｍ水酸化ナトリウム

ｐＨ調整用：
１Ｍ ＨＣｌ
＊バッファーは、最終体積１Ｌとしてではなく、加えた水１ｋｇに対して、調製された。添加物によって最終体積が少し増加することがあるので、この調製は最終モル濃度に小さい影響を及ぼすであろう。

クロマトグラフィー条件：
表１は適用されたバッファーの慨ねの量、ｍｌ／分およびｃｍ／時で表わされた流速の概要である。各バッファーの工程に要する時間、およびタンパク質溶液についてのゲルとの接触時間も示す。

ＭＭＣ樹脂を、Ｔｒｉｃｏｒｎカラムに約９ｃｍのベッド高で充てんした。クロマトグラフィー工程は、導電率について２８０ｎｍでモニターした。タンパク質添加は、樹脂１ｍｌに対して約３ｍｇであった。

はじめに、カラムを、安定したベースラインが得られるまで、Ｓ／Ｄ化学物質を含む平衡バッファーで、適切に平衡化した。出発材料に、１Ｋｇ当たり１４ｇの割合でストックのＳ／Ｄを加え、平衡バッファーと同じ濃度にした。タンパク質溶液をカラムにのせる前に、これを少なくとも１０分間攪拌した。下記のバッファーの画分を回収し、全タンパク質（およびＰｒＰ^sc打ち込み実験におけるプリオン）の分析をした。吸光度２８０ｎｍで測定したクロマトグラフィー分析結果は、付録２で見ることができる。
− フロースルー（バッファー１＋タンパク質）
− バッファー１（高濃度非イオン洗浄バッファー；０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂、０．０１Ｍ Ｌ−ヒスチジン、１％ｗ／ｗ トリトンＸ−１００、０．３％ｗ／ｗ ＴＮＢＰ、ｐＨ：７．０）
− バッファー２（低濃度非イオン性洗浄バッファー；０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣＩ₂、０．０１Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、ｐＨ：６．５）
− バッファー３（アミノ酸／アルコールバッファー；０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂、０．０１Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、０．５Ｍ 一塩化（Ｌ−）リシン、２０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール、ｐＨ：６．５）
− バッファー４（高濃度塩バッファー；１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．０５Ｍ ＣａＣｌ₂、０．０５Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、ｐＨ：６．５）
− バッファー５（低濃度塩バッファー；０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ ＣａＣｌ₂、０．０１Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、ｐＨ：６．５）
− バッファー６ （高濃度塩／高濃度アルコールバッファー）１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ ＣａＣｌ₂、０．０２Ｍ Ｌ−ヒスチジン、０．０２％（ｗ／ｗ）ツイーン８０、５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール（ＥＧ）、ｐＨ：６．５
− バッファー７（再生バッファー；２Ｍ ＮａＣｌ）

カラムを、２０カラム容量の１Ｍ ＮａＯＨで再生し、さらなる使用のために、２０％（ｖ／ｖ）エタノール中で保存した。

結果
表２はプリオン無しの実験における全タンパク質の検出を示す。

実施例２（プリオン打ち込み実験）
実施例１で述べたクロマトグラフィー手順のプリオンタンパク質除去の測定を可能にするために、プリオン打ち込み実験を行った。実施例１と同じカラム、樹脂、バッファーおよび出発材料を用いた。

プリオンタンパク質感染性出発材料
スクレイピーに感染させたハムスターの２６３Ｋ株のミクロソーム／細胞質画分を、この実験に用いた。

１１７μｇ／ｍｌのタンパク質を含む、約５４ｇのタンパク質出発材料（実施例１と同様、バッチ番号：ＢＰＰ ０４７ ＳＰ ｅｌｕａｔ）を、水槽中、２５℃で解凍し、温度２４．０℃（目安：２０〜２５℃）まで温めた。次に、５１．１２ｇ（目安：５０±２ｇ）の出発材料を計量し、２．６ｍｌ（目安：２．５±０．２ｍｌ）のミクロソーム／細胞質画分を打ち込み、最終濃度５．１％とした。打ち込み済出発材料のｐＨをチェックしたところ、６．９９４（目安：７．０±０．１）であった。次いで、６ｍｌの分量（ａｌｉｑｕｏｔ）を取り、分注して、−６０℃以下で保存した（打ち込み済出発材料試料−ＳＳＭ）。

１．９５５ｇのトリトンＸ−１００を、０．５８２ｇのＴｎＢＰ（目安となる割合：１０部＋３部、重量による測定）と混合し、３６分間攪拌した。直ちに、０．６６５ｇのＳ／Ｄ試薬を、残り４７．７２ｇの打ち込み済出発材料（目安となる割合：打ち込み済出発材料１Ｋｇあたり１４ｇのＳ／Ｄ試薬）に添加し、３１分間攪拌した。出発材料の温度をチェックしたところ、攪拌段階の開始時２４．５℃、および攪拌段階の終了時２３．７℃（目安となる範囲：１８〜２５℃）であった。

クロマトグラフィー工程
ＣａｐｔｏＭＭＣ樹脂を充てんしたＧＥヘルスケア社の１．８ｍｌＴｒｉｃｏｒｎカラム（ＣＶ＝１．０ｍｌ、ベッド高＝９ｃｍ）を、８．３ＣＶのバッファー１（Ｓ／Ｄを含む平衡バッファー）を用い流速１．０ｍｌ／分（目安：１．０ｍｌ／分で５ＣＶ）で平衡化した。次に、４７．２９ｇのＳ／Ｄで処理した打ち込み済出発材料を、１．０ｍｌ／分（目安：１．０ｍｌ／分で、４５±２ｇ）の流速をかけながら、カラムに充てんした。それに続いて、カラムを流速０．８ｍｌ／分で１０．０ＣＶのバッファー２（Ｓ／Ｄ無し平衡バッファー）（目安：１．０ｍｌ／分で１０ＣＶ）で洗い流した。フロースルーの回収は、ＵＶシグナルが上がり始めた時に開始し、吸光度が落ち始めるまで継続した。フロースルー画分の重量を測定し（実重量：４８．２３ｇ）、１６ｍｌの分量を取り、分注して、−６０℃以下で保存した（フロースルー試料−ＦＴ）。洗浄画分1を、バッファー２で流した際に、回収した。この画分の実重量を測定したところ、１２．７５ｇであった。また、１２ｍｌの分量を取り、分注して、−６０℃以下で保存した（洗浄１試料−Ｗ１）。

次いで、カラムを、２２．２ＣＶのバッファー３(リシンおよびエチレングリコール洗浄)を用い、流速０．６ｍｌ／分（目安：０．６ｍｌ／分で２０ＣＶ）で洗浄した。バッファー３での洗浄の際、洗浄画分２を回収した。この画分の実重量を測定したところ、４０．３５ｇであった。１６ｍｌの分量を取り、分注して、−６０℃以下で保存した（洗浄２試料−Ｗ２）。

カラムを、１０．０ＣＶのバッファー４（高濃度塩洗浄）を用い、流速０．９ｍｌ／分（目安：１．０ｍｌ／分で１０ＣＶ）で洗浄した際、洗浄画分３を回収した。実重量１８．４８ｇを測定し、１６ｍｌの分量を取り、分注して、−６０℃以下で保存した（洗浄３試料−Ｗ３）。

カラムを、５．０ＣＶのバッファー５（低濃度塩洗浄）を用い、流速１．０ｍｌ／分（目安：１ｍｌ／分で５ＣＶ）で洗浄した際、洗浄画分４を回収した。この画分の実重量を測定したところ、１２．２２ｇであった。１１．５ｍｌの分量を取り、−６０℃以下で保存した（洗浄４試料−Ｗ４）。

次いで、産物を、８．３ＣＶのバッファー６（溶出バッファー）を用い、０．２ｍｌ／分（目安：０．２ｍｌ／分で７ＣＶ）の流速をかけて溶出させた。溶出物の回収は、バッファー６でカラムを洗う間全体を通して行われた。溶出画分の実重量を測定したところ、１３．５４ｇであった。１２．５ｍｌの分量を取り、−６０℃以下で保存した（溶出試料−Ｅ）。

９．４ＣＶのバッファー７(再生バッファー)を用い、流速０．６ｍｌ／分（目安：０．６ｍｌ／分で２０ＣＶ）でカラムを再生する際に、再生画分を回収した。１７．９７ｍｌの実重量を測定した。１６ｍｌの分量を取り、−６０℃以下で保存した（再生試料−Ｒｅｇ）。

考察
表３および付録１（図１〜５）からわかるように、バッファー４〜７画分では優れたプリオンタンパク質除去値が見られる。よって、これらの画分に溶出するタンパク質産物は、ＰｒＰ^sc除去に関して、非常に良好な安全マージンを有すると思われる。また、非常に重要なことに、ＰｒＰ^scが、フロースルーや初期の洗浄バッファー以外の画分中に全く見られないことが、加えたプリオンタンパク質の物質収支から示されている。我々の知る限りでは、このことはこれまで従来技術では示されていなかった。文献にみられるプリオンタンパク質除去工程としてのクロマトグラフィー樹脂の例において、たとえ、比較的許容可能なプリオンタンパク質除去値が達成されても、プリオンタンパク質は、普通、産物画分を処理する前後の数画分の中に見出すことができ、このことは、クロスオーバー混入の危険性を示唆している。

分析についての説明
ブラッドフォード法による全タンパク質の測定
ブラッドフォード法によるタンパク質測定は、クマシーブリリアントブルー Ｇ−２５０の酸性溶液に対する吸光度極大が、タンパク質への結合が起こった際に、４６５ｎｍから５９５ｎｍに変わるという観察に基づいている。疎水性相互作用およびイオン性相互作用の両方が、この染料の陰イオンの形を安定化し、目でわかる色の変化を引き起こす。このアッセイは、染料−アルブミン複合体溶液の吸光係数が、１０倍の濃度範囲にわたって一定であるため、有用である。さらに詳しい情報は、Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976.も参照のこと。

ＰｒＰ ^sc を検出するためのウェスタンブロットアッセイ
ウェスタンブロットアッセイは、プロテイナーゼＫ耐性スクレイピー関連プリオンタンパク質（ＰｒＰ^sc）を半定量的に測定するものである。ウェスタンブロットアッセイは、DC Lee et al., Journal of Virological Methods 2000;84:77-89に記述されている通りに行った。

Claims (6)

1. プリオン（ＰｒＰ^ｓｃ）を除去または削減するクロマトグラフィーによる、目的タンパク質の単離および精製の方法であって、
   ＰｒＰ^ｓｃが混入している可能性のある、目的タンパク質を含む試料と、マルチモーダルクロマトグラフィー材料とを接触させる工程と、
   前記目的タンパク質が前記マルチモーダルクロマトグラフィー材料に結合する一方で、前記ＰｒＰ^ｓｃが前記マルチモーダルクロマトグラフィー材料に結合しないよう、バッファー条件を設定する工程と、
   続いて、前記目的タンパク質を溶出させる工程と、
   を含み、
   前記マルチモーダルクロマトグラフィー材料が、負に帯電した２−（ベンゾイルアミノ）ブタン酸リガンドを含み、且つ、
   以下の工程を以下の順番で行うことを含む方法：
   ｉ）リン酸トリ−ｎ−ブチルおよび／またはトリトンＸ−１００を０．１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の濃度範囲で含有するｐＨ７．０±０．１の添加平衡バッファーを使用する工程、
   ｉｉ）溶媒および／または非イオン性界面活性剤を含有しないｐＨ６．５±０．１〜ｐＨ７．０±０．１の洗浄バッファーを使用する工程、
   ｉｉｉ）５％（ｗ／ｗ）〜３０％（ｗ／ｗ）の濃度範囲のエチレングリコールおよび／または０．２Ｍ〜１．５Ｍの濃度範囲のリシン／アルギニンを含有するｐＨ６．５±０．１〜ｐＨ７．０±０．１の洗浄バッファーを使用する工程。
2. プリオンを溶出させた後に、
   イオン強度を増加または減少させることにより溶出バッファーのイオン強度を変える工程、
   溶出バッファーにアルコールを加える工程、および／または、
   ｐＨを増加または減少させることにより溶出バッファーのｐＨ値を変える工程によって、前記目的タンパク質を溶出させる、請求項１に記載の方法。
3. はじめに樹脂に加えた量から計算した、前記目的タンパク質を含むタンパク質画分のプリオンタンパク質除去値が、１０^１より大きく１０^４以下である、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 所期のタンパク質画分のプリオンタンパク質分析値が、プリオンウェスタンブロットアッセイの検出限界を下回っている、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
5. クロマトグラフィー条件が、前記工程ｉｉｉ）に続いてさらに以下の工程を以下の順番で行うことを含む、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法：
   ｉｖ）塩化ナトリウムを０．５Ｍ〜４Ｍの濃度範囲で含有するｐＨ６．５±０．１〜ｐＨ７．０±０．１の第三の洗浄バッファーを使用する工程、
   ｖ）塩化ナトリウムを０．０１Ｍ〜０．２Ｍの濃度範囲で含有するｐＨ６．５±０．１〜ｐＨ７．０±０．１の第四の洗浄バッファーを使用する工程、
   ｖｉ）２５％（ｗ／ｗ）〜７５％（ｗ／ｗ）の濃度範囲のエチレングリコールと０．５Ｍ〜４Ｍの濃度範囲の塩化ナトリウムとを含むｐＨ６．５±０．１〜ｐＨ７．０±０．１の溶出バッファーを使用する工程。
6. 前記マルチモーダルクロマトグラフィー材料が、
   ｉ）正に帯電したＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンリガンド、
   ｉｉｉ）フェニルプロピルリガンド、
   ｉｖ）Ｎ−ヘキシルリガンド、
   ｖ）４−メルカプト−エチル−ピリジンリガンド、または
   ｖｉ）３−［｛３−メチル−５−（（テトラヒドロフラン−２−イルメチル）アミノ）
   −フェニル｝アミノ］安息香酸リガンド、を含む、
   請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。