KR101593766B1

KR101593766B1 - 혼합식 크로마토그래피에 의한 최적화된 항체 포획 방법

Info

Publication number: KR101593766B1
Application number: KR1020137011351A
Authority: KR
Inventors: 로베르토 팔켄스테인; 토르스텐 렘; 마르쿠스 스트라세르; 히데나리 야마다
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2016-02-15
Also published as: RU2013123899A; KR20130067306A; US9422329B2; CN103201288A; US20170015702A1; MX2013004627A; MX342235B; JP2014502259A; CA2815282A1; EP2635600B1; US20200165297A1; CA2815282C; US10377794B2; BR112013007237A2; RU2591523C2; CN103201288B; EP2635600A1; WO2012059495A1; JP5947802B2; US20130217866A1

Abstract

본원에는, 특히 생성물 관련(응집체 및 단편) 및 공정 관련 불순물(숙주 세포 단백질, 배지 성분)이 효과적으로 제거되어 종래의 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 필적하는 순도를 갖는 제제를 제공할 수 있는, 스트림라인 CST 및/또는 캅토 MMC를 사용하여 정화된 세포 배양물 상등액으로부터 직접 포획된 항체를 정제하는 방법이 기술되어 있다.

Description

혼합식 크로마토그래피에 의한 최적화된 항체 포획 방법{OPTIMIZED METHOD FOR ANTIBODY CAPTURING BY MIXED MODE CHROMATOGRAPHY}

본원에는, 특히 생성물 관련(응집체 및 단편) 및 공정 관련 불순물(숙주 세포 단백질, DNA, 배지 성분)이 효과적으로 제거되어 종래의 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 필적하는 순도를 갖는 제제를 제공할 수 있는, 스트림라인(Streamline) CST 및/또는 캅토(Capto) MMC를 사용하여, 정화된 세포 배양물 상등액으로부터 직접 포획된 항체를 정제하는 방법이 기술되어 있다.

단백질 A 크로마토그래피는 우수한 전체 수율 및 순도를 제공하는 그의 높은 선택성으로 인해 산업적 단클론성 항체 정제 공정에 첫번째 포획 단계로서 통상적으로 사용된다. 그러나, 상기 친화성 크로마토그래피의 주 단점은 그의 높은 비용으로, 이것은 특히 고용량으로 필요한 치료 항체의 경우에 및/또는 만성적 투여의 경우에 상품 요인의 상당한 경비를 차지할 수 있다. 또한, 친화성 매트릭스로부터의 용출된 단백질 A 리간드는 그의 잠재적 면역원성으로 인해 추가의 크로마토그래피 단계에 의해 제거되어야 한다.

이온성 및 소수성 작용기를 나타내는 다중모드(multimodal) 수지 상에서의 혼합식 크로마토그래피는 종래의 친화성 접근방법에 유용한 대안을 제공할 수 있다. 소수성 성분의 내염성(salt tolerability)으로 인해, 대부분의 경우에서 매트릭스 상의 정화된 세포 배양물 상등액의 직접 부하는 단클론성 항체의 효과적인 포획을 제공할 수 있다. 그러나, 수지의 다중모드 성질로 인해, 리간드와 특정 단클론성 항체와의 상이한 유형의 상호작용이 가능하여, 종래의 이온-교환 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피와 상이한 독특한 세척 및 용출 조건을 필요로 한다.

WO 2010/080062 호에는, 단일 중합체 상 시스템을 사용하는 분리 방법이 보고되어 있다. 곤충 세포주에서 발현된 폴리펩티드의 생성을 위한 제조 방법이 WO 2008/073620 호에 보고되어 있다.

다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질이 직접 조 세포 배양물 배양 상등액을 사용하는 컬럼 크로마토그래피 정제 방법에 제 1 단계로 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본원에 기술된 한 양태는 하기 단계를 포함하는, 항-IGF-1R 항체의 제조 방법이다:

(a) 조 포유동물 세포 배양물 배양 상등액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계; 및

(b) 에틸렌 글리콜 및 무기 염을 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하여 항-IGF-1R 항체를 회수함으로써 항-IGF-1R 항체를 생성하는 단계.

한 태양에서, 상기 방법은 단계 (a) 전에 하기의 추가 단계 (a-1)을 포함한다:

(a-1) 무기 염을 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계.

한 태양에서, 상기 방법은 단계 (a) 다음에 및 단계 (b) 전에 하기의 추가 단계 (a-b)를 포함한다:

(a-b) 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하여 항-IGF-1R 항체가 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수되지 않는 단계.

한 태양에서, 단계 (a-b)는 하기의 두 단계 (a-b1) 및 (a-b2)를 포함한다:

(a-b1) 무기 염을 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계;

(a-b2) 변성제를 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하여 항-IGF-1R 항체가 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수되지 않는 단계.

한 태양에서, 변성제는 구아니디늄 하이드로클로라이드 및 우레아로부터 선택된다.

한 태양에서, 무기 염은 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화암모늄으로부터 선택된다.

한 태양에서, 단계 (b)에서의 완충 용액은 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스(Tris), 1050 내지 1350 mM 염화나트륨 및 약 20%(w/v) 에틸렌 글리콜을 포함한다.

한 태양에서, 단계 (a-1)에서의 완충 용액은 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스 및 80 내지 120 mM 염화나트륨을 포함한다. 한 태양에서, 단계 (a-b1)에서의 완충 용액은 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스 및 80 내지 120 mM 염화나트륨을 포함한다. 한 태양에서, 단계 (a-b2)에서의 완충 용액은 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 110 내지 140 mM 트리스, 80 내지 120 mM 염화나트륨 및 30 내지 40 mM 아르기닌을 포함한다.

한 태양에서, 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질은, 카복실산, 에터, 티오에터 및 방향족 작용기를 함유하는 다중모드 약 양이온 교환 리간드가 공유 결합되는 가교결합된 아가로스를 포함한다.

도 1은 실시예 1의 단계 (b)에서 수득된 항-IGF-1R 항체 크로마토그래피 용출액의 분석용 크기 배제 크로마토그램이다.
도 2는 실시예 3에서 나타낸 조건에 따라 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해 수득된 항-IGF-1R 항체의 용출 크로마토그램이다.
도 3은 단계 (b)에서 수득된 항-IGF-1R 항체 크로마토그래피 용출액(A), 및 단계 (a-b2)에서 수득된 용출액(B)의 분석용 크기 배제 크로마토그램이다.
도 4는 항-IL13R 항체를 포함하는 조 배양 상등액을 적용한 용출 크로마토그램이다.
도 5는 항-IL13R 항체를 포함하는 예비-컨디셔닝된(pre-conditioned) 배양 상등액을 적용한 용출 크로마토그램이다.

본원에는 용출 및 세척에 최적화된 조건을 포함하는 스트림라인(Streamline) CST 및/또는 캅토(Capto) MMC를 사용하여, 정화된 세포 배양물 상등액으로부터 포획된 단클론성 항체를 정제하는 방법이 기술되어 있다. 특히 생성물 관련(응집체 및 단편) 및 공정 관련 불순물(숙주 세포 단백질, 배지 성분)이 효과적으로 제거되어, 종래의 친화성 크로마토그래피에 필적하는 순도를 갖는 제제를 제공할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 바와 같은 방법에 의해, 종래의 단백질 A 친화성 크로마토그래피가 대체될 수 있다.

한 태양에서, 상기 방법은 단백질 A 친화성 크로마토그래피 단계를 포함하지 않는다.

일반적인 크로마토그래피 방법 및 그의 사용법은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E.(ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z.(ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands (1998); Chromatography Today, Poole, C.F., and Poole, S.K., Elsevier Science Publishing Company, New York (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); or Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M., et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York (1987)]을 참조한다.

용어 "적용하는"은 용액이 크로마토그래피 물질과 접촉하게 되는 정제 방법의 부분 단계를 의미한다. 이것은 (a) 용액이 크로마토그래피 물질이 함유된 크로마토그래피 장치에 첨가되거나, 또는 (b) 크로마토그래피 물질이 용액에 첨가되는 것을 의미한다. (a)의 경우, 용액은 장치를 통과하여 크로마토그래피 물질과 용액에 함유된 물질 사이의 상호작용을 가능하게 한다. 예를 들면, pH, 전도도, 염 농도, 온도 및/또는 유량과 같은 조건에 따라서, 용액의 일부 물질은 크로마토그래피 물질에 결합될 수 있고 다른 물질은 크로마토그래피 물질로부터 회수될 수 있다. 용액에 잔류하거나 또는 크로마토그래피 물질로부터 회수되는 물질은 관류(flow-through)에서 찾을 수 있다. "관류"는 컬럼을 세척하기 위해 또는 크로마토그래피 물질에 결합된 물질의 용출을 유발하기 위해 사용되는, 적용된 용액 또는 완충 용액일 수 있는, 장치 통과후 수득되는 용액을 의미한다. 한 태양에서, 상기 장치는 컬럼 또는 카세트이다. (b)의 경우, 크로마토그래피 물질은, 예를 들면, 고체로서, 예를 들면, 정제될 해당 물질을 함유하는 용액에 첨가되어, 크로마토그래피 물질과 용액중 물질 사이의 상호작용을 가능하게 할 수 있다. 상호작용 후에, 크로마토그래피 물질은, 예를 들면, 여과에 의해 제거되며, 크로마토그래피 물질에 결합된 물질은 또한 그와 함께 용액으로부터 제거되는 반면, 크로마토그래피 물질에 결합되지 않은 물질은 용액중에 잔류한다.

용어 "결합-및-용출 방식"은 정제될 해당 물질을 함유하는 용액이 크로마토그래피 물질에 적용되어, 해당 물질이 크로마토그래피 물질에 결합하는 크로마토그래피 단계의 작업 방식을 의미한다. 따라서, 해당 물질은 크로마토그래피 물질 상에 유지되는 반면, 해당되지 않는 물질은 관류 또는 상등액과 함께 제거된다. 해당 물질은 그 다음에 제 2 단계에서 용출 용액에 의해 크로마토그래피 물질로부터 회수된다. 한 태양에서, 본원에 기술된 바와 같은 방법은 결합-및-용출 방식으로 수행된다.

용어 "완충 용액"은 산성 또는 알칼리성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 pH의 변화가 용해된 완충 물질에 의해 균등하게 되는 용액을 의미한다. 상기 성질을 갖는 임의의 완충 물질이 사용될 수 있다. 일반적으로, 약학적으로 허용되는 완충 물질을 사용한다. 한 태양에서, 완충 용액은 인산 및/또는 그의 염으로 이루어진 포스페이트 완충 용액, 또는 아세트산 및 그의 염으로 이루어진 아세테이트 완충 용액, 또는 시트르산 및/또는 그의 염으로 이루어진 시트레이트 완충 용액, 또는 모폴린 완충 용액, 또는 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 완충 용액, 또는 히스티딘 완충 용액, 또는 글리신 완충 용액, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스) 완충 용액으로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 완충 용액은 트리스 완충 용액, 또는 시트레이트 완충 용액, 또는 히스티딘 완충 용액으로부터 선택된다. 완충 용액은, 예를 들면, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 염화암모늄 또는 황산암모늄과 같은 무기 염을 포함할 수 있다.

본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "연속 용출" 및 "연속 용출 방법"은 용출, 즉, 크로마토그래피로부터 결합 화합물의 회수를 야기하는 용액의 전도도가 연속적으로 변화, 즉, 상승 또는 저하되는, 즉, 농도가 각각 용출 야기 물질 농도의 2% 또는 1%의 변화보다 크지 않은 일련의 소 단계들에 의해 변화되는 방법을 의미한다. 상기 "연속 용출"에서, 하나 이상의 조건, 예를 들면, pH, 이온 강도, 염 농도 및/또는 크로마토그래피의 흐름은 선형으로 또는 지수적으로 또는 점근적으로(asympotically) 변화될 수 있다. 한 태양에서, 변화는 선형적이다.

용어 "단계 용출"은, 예를 들면, 용출, 즉, 크로마토그래피 물질로부터 결합 물질의 회수를 야기하는 물질의 농도가 한번에, 즉, 한 값/수준에서 다음 값/수준으로 직접적으로 상승 또는 저하되는 방법을 의미한다. 상기 "단계 용출"에서는, 하나 이상의 조건, 예를 들면, pH, 이온 강도, 염 농도 및/또는 크로마토그래피의 흐름이 첫 번째 값, 예를 들면, 출발 값에서 두 번째 값, 예를 들면, 최종 값으로 모두 한번에 변화될 수 있다. 따라서, 조건들은 선형적 변화와 대조적으로, 점증적으로, 즉 단계적으로 변화된다.

용어 "다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질"은 이온 교환 크로마토그래피에서 정지상으로 사용되는 공유적으로 결합된 하전된 치환체를 갖는 고정된 고분자량 매트릭스, 예를 들면, 화학적으로 가교결합된 아가로스를 의미한다. 전체 전하 중성을 위해, 비-공유 결합된 상대 이온이 그에 결합된다. "다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질"은 그의 비-공유 결합된 양이온성 상대 이온과 주위 용액의 유사하게 하전된 이온을 교환시키는 능력을 갖는다. "다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질"은 이온성 상호작용, 소수성 상호작용, 반-데르-발스(van-der-Waals) 상호작용, 및 주위 용액에 포함된 분자들과의 수소 결합의 생성을 가능하게 할 수 있는 공유 결합된 리간드를 포함한다.

당해 분야에 숙련된 자에게, 예를 들면, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 상기 아미노산 서열을 암호화하는 상응하는 핵산 서열로 전환시키는 절차 및 방법은 공지되어 있다. 그러므로, 핵산은 개개 뉴클레오티드로 이루어진 그의 핵산 서열, 및 유사하게 그에 의해 암호화된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 특징으로 한다.

본원에서 사용된 용어 "결합에 적합한 조건하에서" 및 그의 문자적 동의어는 해당 물질, 예를 들면, 항-IGF-1R 항체가 그와 접촉하게 될 때 정지상, 예를 들면, 이온 교환 물질에 결합하는 것을 의미한다. 이것은 반드시 해당 물질 100%가 결합되는 것을 의미하는 것은 아니지만, 기본적으로 해당 물질 100%가 결합된다, 즉, 해당 물질의 50% 이상이 결합되고, 바람직하게는 해당 물질의 75% 이상이 결합되고, 바람직하게는 해당 물질의 85% 이상이 결합되고, 보다 바람직하게는 해당 물질의 95% 이상이 정지상에 결합된다.

본원에서 용어 "항체"는 광의로 사용되며, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 다중특이성 항체(예를 들면, 이중특이성 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한, 항체 단편을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 다양한 항체 구조를 포함한다. 천연 항체는 다양한 구조를 갖는 분자이다. 예를 들면, 천연 IgG 항체는 여기서 다이설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 이루어진, 약 150,000 달톤의 4량체 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인(VH)에 이어, 3 또는 4개의 불변 도메인(CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4)을 갖는다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 도메인(VL)에 이어, 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 두 유형중 하나로 지정될 수 있다.

인간 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체(IGF-IR, EC 2.7.112, CD221 항원)는 막횡단 단백질 티로신 키나제 부류에 속한다(문헌 [LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16, 143-163 (1995); Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57, 1050-1063 (2000)]). IGF-IR은 고친화성 하에 IGF-I에 결합하며 생체내에서 상기 리간드에 대한 생리학적 반응을 개시한다. 그러나, IGF-IR은 또한 IGF-II에도 약간 낮은 친화성 하에 결합한다. IGF-IR 과발현은 세포의 신생물 전환을 촉진하며, IGF-IR이 세포의 악성 형질 전환에 수반된다는 증거가 존재하므로 암 치료를 위한 치료제의 개발에 유용한 목표이다(문헌 [Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57, 1050-1063 (2000)]). 예시적인 항 IGF-1R 항체, 그의 암호화 서열 및 제조 방법은 WO 2004/087756 호, WO 2007/045456 호 및 WO 2007/115814 호에 기술되어 있다.

예를 들면, 세포 배양 방법에 의해 제조된 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 정제를 위해, 일반적으로 상이한 크로마토그래피 단계들의 조합을 사용한다. 통상적으로, 단백질 A 친화성 크로마토그래피 다음에 1 또는 2개의 추가 분리 단계가 뒤따른다. 한 태양에서, 상기 추가의 크로마토그래피 단계는 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계이거나 또는 그 반대이다. 최종 정제 단계는 응집 면역글로불린, 잔류 HCP(숙주 세포 단백질), DNA(숙주 세포 핵산), 바이러스 또는 내독소와 같은 미량 불순물 및 오염물의 제거를 위한 소위 "마무리(polishing) 단계"이다. 한 태양에서, 최종 정제 단계는 관류 방식의 음이온 교환 크로마토그래피이다.

다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 컬럼 크로마토그래피 정제 방법에서 제 1 단계로서, 통상적으로 사용되는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 대신 조 세포 배양물 배양 상등액에 직접 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

본원에 기술된 바와 같은 방법의 경우, 조 배양 상등액의 예비-컨디셔닝이 필요하지 않다. 놀랍게도 이것은, 상이한 항체가 생성된 배양으로부터 수득된 배양 상등액의 경우 배양 상등액으로부터 항체를 직접 포획하기 위해 적어도 전도도의 감소가 필요하기 때문이다. 또한, 조 세포 배양 상등액으로부터 항-IGF-1R 항체의 포획은 거의 정량적이다. 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 폴리펩티드의 회수에 일반적으로 적용가능한 조건 및 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 대한 소수성 상호작용에 의한 결합을 위한 조건은 반대 방향으로 나타나기 때문에, 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 항체의 회수를 위한 새로운 조건이 필요하다.

또 다른 태양에서, 상기 방법은 단계 (a) 다음에 및 단계 (b) 전에 하기의 추가 단계 (a-b)를 포함한다:

다른 태양에서, 단계 (a-b)는 하기의 두 단계 (a-b1) 및 (a-b2)를 포함한다:

(a-b1) 무기 염을 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계; 및

또한, 한 태양에서, 변성제는 구아니디늄 하이드로클로라이드, 우레아 및 아르기닌으로부터 선택된다. 한 태양에서, 무기 염은 염화나트륨, 염화칼륨 및 염화암모늄으로부터 선택된다. 또한, 한 태양에서, 단계 (b)에서의 완충 용액은 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스, 1050 내지 1350 mM 염화나트륨 및 약 20%(w/v) 에틸렌 글리콜을 포함한다. 한 태양에서, 단계 (a-1)에서의 완충 용액은 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스 및 80 내지 120 mM 염화나트륨을 포함한다. 다른 태양에서, 단계 (a-b1)에서의 완충 용액은 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스 및 80 내지 120 mM 염화나트륨을 포함한다. 또 다른 태양에서, 단계 (a-b2)에서의 완충 용액은 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 110 내지 140 mM 트리스, 80 내지 120 mM 염화나트륨 및 30 내지 40 mM 아르기닌을 포함한다. 또 다른 태양에서, 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질은, 카복실산, 에터, 티오에터 및 방향족 작용기를 함유하는 다중모드 약 양이온 교환 리간드가 공유 결합되는 가교결합된 아가로스를 포함한다. 한 태양에서, 단계 (a-1)에서 완충 용액의 5개 컬럼 부피의 전체 부피가 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용된다. 또 다른 태양에서, 단계 (a-b1)에서 완충 용액의 5개 컬럼 부피의 전체 부피가 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용된다. 또한, 한 태양에서, 단계 (a-b2)에서 완충 용액의 10개 컬럼 부피의 전체 부피가 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용된다. 또한 한 태양에서, 단계 (b)에서 완충 용액의 10개 컬럼 부피의 전체 부피가 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용된다.

완충 용액의 개개 성분들은 하기의 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다:

하기 실시예 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 나타나 있다. 본 발명의 진의로부터 벗어나지 않고 나타낸 절차에 변형이 이루어질 수 있는 것으로 주지된다.

실시예

재료 및 방법

달리 언급하지 않는 한, 재료 제조사의 매뉴얼에 따라 상이한 방법들이 수행되었다.

재조합 DNA 기술:

문헌 [Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)]에 기술된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물 시약은 제조사의 지시에 따라 사용하였다.

단백질 측정:

단백질 농도는 아미노산 서열을 기준으로 산출된 몰흡광 계수를 이용하여, 320 nm의 기준 파장하에 280 nm에서 흡광도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.

크기-배제- HPLC :

ASI-100 HPLC 시스템(디오넥스(Dionex), 독일 이드슈타인) 상에서 토소 하스(Tosoh Haas) TSK 3000 SWXL 컬럼을 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 용출 피크는 280 nm에서 UV 다이오드 배열 검출기(디오넥스)로 모니터링하였다. 1 mg/ml로 농축된 샘플을 해리시킨 후에, 안정한 기준선이 달성될 때까지 컬럼을 200 mM 인산 이수소 칼륨 및 250 mM 염화칼륨으로 이루어진 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 분석 실험은 실온에서 0.5 ml/분의 유량을 이용하여 등용매 조건하에서 30 분에 걸쳐 수행하였다. 크로마토그램은 크로멜레온(Chromeleon)(디오넥스, 독일 이드슈타인)을 사용하여 수동으로 통합하였다.

역상 HPLC ( RP - HPLC ):

순도는 RP-HPLC로 분석한다. 분석은 아세토니트릴/수성 TFA 구배를 사용하여 포로쉘(Poroshell) 컬럼 상에서 수행한다. 용출 프로필은 215 nm에서 UV 흡광도로서 모니터링한다. 용출된 물질의 퍼센트는 용출 단백질의 총 피크 면적을 기준으로 산출한다.

DNA -역치-시스템:

예를 들면, 문헌 [Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9, 398-403 (1992)]을 참조한다.

숙주 세포 단백질 측정:

미세 적정 플레이트 웰의 벽을 혈청 알부민과 스트렙타비딘(Streptavidin)의 혼합물로 코팅한다. HCP에 대한 양 유래 다클론성 항체를 미세 적정 플레이트 웰의 벽에 결합시킨다. 세척 단계 후에, 미세 적정 플레이트의 상이한 웰들을 상이한 농도의 HCP 검량 서열 및 샘플 용액과 함께 배양한다. 배양후에 비결합 샘플 물질을 완충 용액으로 세척하여 제거한다. 검출을 위해, 웰을 항체 퍼옥시다제 접합체와 함께 배양하여 결합된 숙주 세포 단백질을 검출한다. ABTS와 함께 배양하고 405 nm에서 검출함으로써, 고정된 퍼옥시다제 활성을 검출한다.

실시예 1

다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질 캅토 (등록상표) MMC 상에서 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용한 항- IGF -1R 항체의 크로마토그래피

크로마토그래피는 하기 파라미터를 사용하여 수행하였다:

수지: 캅토(등록상표) MMC

컬럼 직경: 1 cm

층 높이: 14.6 cm

적용 용액: 조 세포 배양 상등액

부하량: 물질 ml 당 항체 30 mg

단계 (a-1) 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1

단계 (a-b1) 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1

단계 (b) 25 mM 트리스-HCl, 1200 mM NaCl, 20%(w/v) 에틸렌 글리콜, pH 7.2

용출 방법: 단계 용출

유량: 250 cm/h

수득된 항체의 분석용 크기 배제 크로마토그램을 도 1에 나타내었다.

실시예 2

다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질 캅토 (등록상표) MMC 상에서 본원에 기술된 바와 같은 방법과 상이한 조건하에 항- IGF -1R 항체의 실시예 1에 대한 비교 크로마토그래피

크로마토그래피는 하기 파라미터를 사용하여 수행하였다:

수지: 캅토(등록상표) MMC

컬럼 직경: 1 cm

층 높이: 14.6 cm

적용 용액: 조 세포 배양 상등액

부하량: 물질 ml 당 항체 30 mg

단계 (a-1) 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1

단계 (a-b1) 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1

단계 (b) 다양함 - 하기 표 참조

용출 방법: 단계 용출

유량: 250 cm/h

하기에 나타낸 표로부터 단계 (b)의 약간 상이한 조건을 사용하여 정제는 덜 효과적으로 수행될 수 있었음을 볼 수 있다.

실시예 3

크로마토그래피는 하기 파라미터를 사용하여 수행하였다:

수지: 캅토(등록상표) MMC

컬럼 직경: 1 cm

층 높이: 14.6 cm

적용 용액: 조 세포 배양 상등액

부하량: 물질 ml 당 항체 30 mg

단계 (a-1) 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1

단계 (a-b1) 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1

단계 (a-b2) 125 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, 38 mM 아르기닌, pH 8.7

용출 방법: 단계 용출

유량: 250 cm/h

상응하는 용출 다이어그램을 도 2에 나타내었으며, 도 3A에 단계 (b)에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그램을, 도 3B에 단계 (a-b2)에 대한 분석용 크기 배제 크로마토그램을 나타내었다.

실시예 4

다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질 캅토 (등록상표) MMC 상에서 본원에 기술된 바와 같은 방법과 상이한 조건하에 항- IGF -1R 항체의 실시예 3에 대한 비교 크로마토그래피

크로마토그래피는 하기 파라미터를 사용하여 수행하였다:

수지: 캅토(등록상표) MMC

컬럼 직경: 1 cm

층 높이: 14.6 cm

적용 용액: 조 세포 배양 상등액

부하량: 물질 ml 당 항체 30 mg

단계 (a-1) 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1

단계 (a-b1) 25 mM 트리스-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1

단계 (a-b2) 다양함 - 하기 표 참조

용출 방법: 단계 용출

유량: 250 cm/h

하기에 나타낸 표로부터 단계 (b)의 약간 상이한 조건을 사용하여 정제가 덜 효과적으로 수행될 수 있었음을 볼 수 있다.

실시예 5

조 배양 상등액의 예비-컨디셔닝을 하지 않은 항- IL13R 항체의 비교 실시예

크로마토그래피는 하기 파라미터를 사용하여 수행하였다:

수지: 캅토(등록상표) MMC

컬럼 직경: 1 cm

층 높이: 10 cm

적용 용액: 조 세포 배양 상등액

부하량: 물질 ml 당 항체 21 mg

단계 (a-1) 70 mM 인산칼륨, pH 7.3, 10.9 mS/cm

단계 (a-b) 70 mM 인산칼륨, pH 7.3, 10.9 mS/cm

단계 (b) 1 M KCl, pH 3.0, 105.6 mS/cm

용출 방법: 단계 용출

유량: 150 cm/h

적용 항체의 88%가 크로마토그래피 물질에 결합되지 않았으며, 관류에서 발견되었다(도 4).

실시예 6

조 배양 상등액의 예비- 컨디셔닝하에 항- IL13R 항체의 비교 실시예

크로마토그래피는 하기 파라미터를 사용하여 수행하였다:

수지: 캅토(등록상표) MMC

컬럼 직경: 1 cm

층 높이: 11 cm

적용 용액: 1.4 mS/cm으로 조정된 세포 배양 상등액

부하량: 물질 ml 당 항체 20 mg

단계 (a-1) 10 mM 인산칼륨, pH 6.5, 1.4 mS/cm

단계 (a-b) 10 mM 인산칼륨, pH 6.5, 1.4 mS/cm

단계 (b) 100 mM 인산칼륨, pH 7.5, 14.9 mS/cm

용출 방법: 선형 구배

유량: 150 cm/h

크로마토그램(도 5)에서, 날카로운 피크를 볼 수 있다. 수득된 항체는 68% 수율하에 96.6%의 순도를 가졌다.

Claims

(a-1) pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스 및 80 내지 120 mM 염화나트륨을 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계;
(a) 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하지 않고 직접 조 포유동물 세포 배양물 배양 상등액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계; 및
(b) pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스, 1050 내지 1350 mM 염화나트륨 및 20%(w/v) 에틸렌 글리콜을 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하여 항-IGF-1R 항체를 회수함으로써 항-IGF-1R 항체를 생성하는 단계를 포함하는,
항-IGF-1R 항체의 제조 방법.
삭제
제 1 항에 있어서,
단계 (a) 다음에 및 단계 (b) 전에 하기의 추가 단계 (a-b)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
(a-b) 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하여 항-IGF-1R 항체가 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수되지 않는 단계.
제 3 항에 있어서,
단계 (a-b)가 하기의 두 단계 (a-b1) 및 (a-b2)를 포함하여, 항-IGF-1R 항체가 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 회수되지 않는 것을 특징으로 하는 방법:
(a-b1) 무기 염을 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계; 및
(a-b2) 변성제를 포함하는 완충 용액을 다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질에 적용하는 단계.
제 4 항에 있어서,
변성제가 구아니디늄 하이드로클로라이드 및 우레아로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
삭제
제 4 항에 있어서,
단계 (a-b1)에서의 완충 용액이 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 20 내지 30 mM 트리스 및 80 내지 120 mM 염화나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서,
단계 (a-b2)에서의 완충 용액이 pH 7.1 내지 pH 7.3의 pH 값에서 110 내지 140 mM 트리스, 80 내지 120 mM 염화나트륨 및 30 내지 40 mM 아르기닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서,
다중모드 약 양이온 교환 크로마토그래피 물질이, 카복실산, 에터, 티오에터 및 방향족 작용기를 함유하는 다중모드 약 양이온 교환 리간드가 공유 결합되는 가교결합된 아가로스를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.