JP5947802B2 - ミックスモードクロマトグラフィーによる抗体捕捉の最適化方法 - Google Patents
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Description
ここでは、Ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ ＣＳＴ及び／又はＣａｐｔｏ ＭＭＣを使用して、清澄化された細胞培養上清から直接捕捉された抗体を精製する方法であって、特に、生成物関連(凝集物及び断片)及びプロセス関連不純物(宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、培地成分)を効率的に除去することができ、古典的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに匹敵する純度の調製物を生じる方法が報告される。
プロテインＡクロマトグラフィーは、その高い感度のために、工業的なモノクローナル抗体精製プロセスにおける最初の捕捉工程として常套的に使用されており、良好な全収率及び純度が得られる。しかしながら、このアフィニティークロマトグラフィーの主な欠点は価格が高いことであり、特に、高用量が必要とされるか、及び／又は慢性投与のための治療用抗体の場合においては、顕著な商品原価ファクターとなりうる。さらに、アフィニティーマトリックスからの滲出プロテインＡリガンドは、その潜在的な免疫原性のためにさらなるクロマトグラフィー工程によって除去されなければならない。
イオン的及び疎水的官能性を示す多様式樹脂でのミックスモードクロマトグラフィーは、古典的な親和性アプローチに対する貴重な代替法を提供しうる。疎水性成分の塩耐性のために、殆どの場合、マトリックスへの清澄化細胞培養上清の直接添加が可能であり、モノクローナル抗体の効果的な捕捉が達成される。しかしながら、樹脂の多様な性質のため、特定のモノクローナル抗体とのリガンドの様々なタイプの相互作用が生じ得、伝統的なイオン交換又は疎水性相互作用クロマトグラフィーとは異なる独特の洗浄及び溶離条件を必要とする。
国際公開第２０１０／０８００６２号には、単一のポリマー相系を使用する分離方法が報告されている。昆虫細胞株において発現されるポリペプチドの生産のための製造方法は、国際公開第２００８／０７３６２０号に報告されている。
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料は、粗細胞培養上清を直接用いるカラムクロマトグラフィー精製法における第１工程として使用することができることが見出された。
ここに報告される一態様は、
ａ）哺乳動物細胞培養の粗培養上清を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
ｂ）エチレングリコールと無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用することにより、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を回収し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を生成させる工程
を含む抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の製造方法である。
ａ）哺乳動物細胞培養の粗培養上清を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
ｂ）エチレングリコールと無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用することにより、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を回収し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を生成させる工程
を含む抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の製造方法である。
一実施態様では、本方法は、工程ａ）の前に、次の付加工程ａ-１）を含む：
ａ-１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程。
ａ-１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程。
一実施態様では、本方法は、工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、次の付加工程ａ-ｂ）を含む：
ａ-ｂ）緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない工程。
ａ-ｂ）緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない工程。
一実施態様では、工程ａ-ｂ）は、２つの工程ａ-ｂ１）及び工程ａ-ｂ２）：
ａ-ｂ１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、及び
ａ-ｂ２）変性剤を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程
を含み、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない。
ａ-ｂ１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、及び
ａ-ｂ２）変性剤を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程
を含み、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない。
一実施態様では、変性剤は塩酸グアニジン及び尿素から選択される。
一実施態様では、無機塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化アンモニウムから選択される。
一実施態様では、工程ｂ）の緩衝液は、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、１０５０ｍＭ〜１３５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び約２０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコールを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する。
一実施態様では、工程ａ-１）の緩衝液は、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウムを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する。一実施態様では、工程ａ-ｂ１）の緩衝液は、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウムを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する。一実施態様では、工程ａ-ｂ２）の緩衝液は、１１０ｍＭ〜１４０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウム、及び３０ｍＭ〜４０ｍＭのアルギニンを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する。
一実施態様では、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カルボン酸、エーテル、チオエーテル及び芳香族官能基を含む多様式弱カチオン交換リガンドが共有結合している架橋アガロースを含有する。
ここでは、溶離及び洗浄の最適条件を含む、Streamline ＣＳＴ及び／又はCapto ＭＭＣを使用して、清澄化された細胞培養上清から捕捉された抗体を精製する方法が報告される。特に、生成物関連(凝集物及び断片)及びプロセス関連不純物(宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、培地成分)を効率的に除去することができ、古典的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに匹敵する純度の調製物が生じる。よって、古典的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを、ここで報告される方法に置き換えることができる。
一実施態様では、本方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー工程を含まない。
一般的なクロマトグラフィー方法及びその用途は当業者に知られている。例えば、Chromatography, 第5版, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (編), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F.,及び Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, Jら. (編), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989;又は Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. Mら. (編), John Wiley &?Sons, Inc., New York (1987)を参照。
「に適用する」なる用語は、溶液がクロマトグラフィー材料と接触させられる精製方法の一部の工程を示す。これは、ａ）溶液が、クロマトグラフィー材料を収容するクロマトグラフィー装置に添加されるか、又はｂ）クロマトグラフィー材料が溶液に添加されることを意味する。ケースａ）では、溶液は、溶液に含有される物質とクロマトグラフィー材料との間の相互作用を可能にする装置を通過する。条件、例えばｐＨ、伝導率、塩分濃度、温度、及び／又は流量に応じて、溶液のいくつかの物質がクロマトグラフィー材料に結合し、他の物質がクロマトグラフィー材料から回収されうる。溶液に残存するか又はクロマトグラフィー材料から回収される物質は、フロースルーに見出すことができる。「フロースルー」は、適用された溶液又は緩衝液のいずれかであり、カラムの洗浄、又はクロマトグラフィー材料に結合した物質の溶離に使用される、装置を通過した後に得られる溶液を示す。一実施態様では、装置はカラム又はカセットである。ケースｂ）では、クロマトグラフィー材料は、溶液中の物質とクロマトグラフィー材料との間の相互作用を可能にさせるように、例えば固体として、例えば精製される関心ある物質を含有する溶液に添加されうる。相互作用の後、クロマトグラフィー材料は、例えば濾過により除去され、クロマトグラフィー材料に結合した物質は、それとともに溶液から除去されるが、クロマトグラフィー材料に結合していない物質は、溶液に残ったままである。
「結合溶離（bind-and-elute）モード」なる用語は、精製されるべき関心ある物質を含む溶液がクロマトグラフィー材料に適用され、それによって関心ある物質がクロマトグラフィー材料に結合するクロマトグラフィー工程の操作モードを示す。よって、関心ある物質は、クロマトグラフィー材料に保持されているが、関心のない物質は、フロースルー又は上清と共に除去される。その後、関心ある物質は、溶離液を用いる第２工程において、クロマトグラフィー材料から回収される。一実施態様では、ここで報告されている方法は、結合溶離モードで操作される。
「緩衝液」なる用語は、酸性又はアルカリ性物質の添加又は放出によるｐＨの変化が、溶解した緩衝物質により一様にされた溶液を示す。このような性質を有する任意の緩衝液を使用することができる。一般的に、薬学的に許容可能な緩衝物質が使用される。一実施態様では、緩衝液は、リン酸及びその塩からなるリン酸緩衝液、又は酢酸及びその塩からなる酢酸緩衝液、又はモルホリン緩衝液、又は２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホン酸緩衝液、又はヒスチジン緩衝液、又はグリシン緩衝液、又はトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(トリス)緩衝液から選択される。他の実施態様では、緩衝液は、トリス緩衝液、又はクエン酸緩衝液、又はヒスチジン緩衝液から選択される。緩衝液は、無機塩、例えば塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化アンモニウム、又は硫酸アンモニウムを含有しうる。
この出願内で交換可能に使用される「連続溶離」及び「連続溶離法」なる用語は、溶離を生じさせる溶液の伝導率、すなわちクロマトグラフィー材料からの結合化合物の回収が変化する、すなわち連続的に上昇又は低下される、つまり、溶離を生じさせる物質の濃度のそれぞれ２％又は１％の変化以下の小さな一連の段階で、濃度が変化させられる方法を示す。この「連続溶離」において、一又は複数の条件、例えばｐＨ、イオン強度、塩分濃度、及び／又はクロマトグラフィーの流量は、線形的又は指数関数的又は漸近的に変化しうる。一実施態様では、変化は直線的である。
「段階溶離」なる用語は、例えば、溶離を引き起こす物質の濃度、すなわちクロマトグラフィー材料からの結合物質の回収が、一度に、すなわち、直接ある値／レベルから次の値／レベルまで上昇又は低下される方法を示す。この「段階溶離」では、一又は複数の条件、例えばｐＨ、イオン強度、塩分濃度、及び／又はクロマトグラフィーの流量は、最初の、例えば出発時の値から、第２の、例えば最終的な値まで、一度に全て変化することが可能である。よって、条件は、線形変化とは異なり、増加的に、すなわち段階的に変化する。
「多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料」なる用語は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーの固定相として使用される、共有結合した荷電置換基を担持する、化学的に架橋したアガロースのような固定された高分子量マトリックスを示す。全体の電荷的中性のため、共有的に結合していない対イオンがそこに結合している。「多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料」は、その共有的に結合していないカチオン性対イオンを、周囲の溶液の類似した荷電イオンに交換する能力を有している。「多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料」は、イオン性相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、並び周囲溶液に含まれる分子との水素結合の形成に働きかけることが可能な、共有的に結合したリガンドを含む。
当業者には、例えばポリペプチドの、アミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応の核酸配列に転換させるための手順及び方法はよく知られている。よって、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列により、またそれによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により、特徴付けられる。
この出願で使用される「結合に適した条件下」なる用語及びその文法的同義語は、関心ある物質、例えば抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、それに接触した場合に固定相、例えばイオン交換材料に結合することを示す。これは、関心ある物質の１００％が結合することを必ずしも示すものではないが、関心ある物質の本質的に１００％、すなわち関心ある物質の少なくとも５０％が結合する、好ましくは関心ある物質の少なくとも７５％が結合する、好ましくは関心ある物質の少なくとも８５％が結合する、さらに好ましくは関心ある物質の９５％以上が固定相に結合する。
ここでの「抗体」なる用語は、ジスルフィド結合した２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であるＩｇＧ抗体を意味する。ＮからＣ末端へ、各重鎖は、可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも称される可変ドメイン(ＶＨ)を有し、３又は４の定常ドメイン(ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、場合によってはＣＨ４)が続く。同様に、ＮからＣ末端へ、各軽鎖は、可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインと称される可変ドメイン(ＶＬ)を有し、定常軽鎖(ＣＬ)ドメインが続く。抗体の軽鎖には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と称される２つのタイプの一方があてがわれている。
ヒトインスリン様成長因子Ｉレセプター(ＩＧＦ-ＩＲ、ＥＣ２.７.１１２、ＣＤ２２１抗原)は、膜貫通タンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属している(LeRoith, Dら, Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; Adams, T.Eら, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。ＩＧＦ-ＩＲは、高親和力でＩＧＦ-Ｉに結合し、インビボでこのリガンドに対する生理学的応答を開始する。しかしながら、ＩＧＦ-ＩＲはＩＧＦ-ＩＩに、わずかに低い親和力で結合する。ＩＧＦ-ＩＲの過剰発現は細胞の腫瘍化を促進させ、ＩＧＦ-ＩＲが細胞の癌化に関与し、よって癌の治療の治療剤を開発するための有用な標的である証拠が存在する(Adams, T.Eら, Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063)。例示的な抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体、それらのコード化配列及び生産方法は、国際公開第２００４／０８７７５６号、国際公開第２００７／０４５４５６号、及び国際公開第２００７／１１５８１４号に報告されている。
例えば、細胞培養法により産生された免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の精製では、一般的には、異なったクロマトグラフィー工程の組合せが用いられる。通常、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーには、一又は二の付加的な分離工程が続く。一実施態様では、前記付加的なクロマトグラフィー工程は、カチオン及びアニオン交換クロマトグラフィー工程又はその逆である。最終精製工程は、微量不純物及び汚染物質、例えば凝集した免疫グロブリン、残留ＨＣＰ(宿主細胞タンパク質)、ＤＮＡ(宿主細胞核酸)、ウイルス、又は内毒素を除去するための、いわゆる「ポリッシュ工程」である。一実施態様では、最終精製工程は、フロースルー式のアニオン交換クロマトグラフィーである。
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料を、よく使用されているプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーの代わりに、細胞培養の粗培養上清を直接用いるカラムクロマトグラフィー精製法での第１工程として使用することができることが見出された。
ここで報告される一態様は、次の工程：
ａ）哺乳動物細胞培養の粗培養上清を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
ｂ）無機塩とエチレングリコールを含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用することにより、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を回収し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を生成させる工程、
を含む抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の生産方法である。
ａ）哺乳動物細胞培養の粗培養上清を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
ｂ）無機塩とエチレングリコールを含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用することにより、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を回収し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を生成させる工程、
を含む抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の生産方法である。
ここで報告されている方法では、粗培養上清のプレコンディショニングは必要ない。これは、種々の抗体が産生される培養から得られる培養上清では、培養上清から直接抗体の捕捉を可能にするためには、少なくとも伝導率の低下が必要であるので、驚くべきことであった。さらに、粗細胞培養上清からの抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の捕捉は、ほぼ定量的である。カチオン交換クロマトグラフィー材料からのポリペプチドの回収のための一般的に適用可能な条件と多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に対しての疎水性相互作用による結合の条件は反対方向に向いているので、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料からの抗体の回収のための新規な条件が必要であった。
一実施態様では、本方法は、工程ａ）の前に、次の付加工程ａ-１）
ａ-１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程
を含む。
ａ-１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程
を含む。
一実施態様では、本方法は、工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、次の付加工程ａ-ｂ）
ａ-ｂ）緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない工程
を含む。
ａ-ｂ）緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない工程
を含む。
さらなる実施態様では、工程ａ-ｂ）は、２つの工程ａ-ｂ１）及び工程ａ-ｂ２）：
ａ-ｂ１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、及び
ａ-ｂ２）変性剤を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程
を含み、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない。
ａ-ｂ１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、及び
ａ-ｂ２）変性剤を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程
を含み、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない。
一実施態様では、変性剤は塩酸グアニジン、尿素、及びアルギニンから選択される。一実施態様では、無機塩は塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化アンモニウムから選択される。また一実施態様では、工程ｂ）の緩衝液は、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、１０５０ｍＭ〜１３５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び約２０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコールを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する。一実施態様では、工程ａ-１）の緩衝液は、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウムを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する。さらなる実施態様では、工程ａ-ｂ１）の緩衝液は、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウムを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する。他の実施態様では、工程ａ-ｂ２）の緩衝液は、１１０ｍＭ〜１４０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウム、及び３０ｍＭ〜４０ｍＭのアルギニンを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する。さらなる他の実施態様では、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料は、カルボン酸、エーテル、チオエーテル及び芳香族官能基を含む多様式弱カチオン交換リガンドが共有結合している架橋アガロースを含有する。一実施態様では、工程ａ-１）の緩衝液の５カラム容量の全容量が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。他の実施態様では、工程ａ-ｂ１）の緩衝液の５カラム容量の全容量が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。また一実施態様では、工程ａ-ｂ２）の緩衝液の１０カラム容量の全容量が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。さらなる実施態様では、工程ｂ）の緩衝液の１０カラム容量の全容量が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。
緩衝液の個々の成分は、次の効果を有していることが見出されている：
次の実施例及び図は、その真の範囲は添付の請求の範囲に記載されている本発明の理解を補助するために提供されている。本発明の精神から逸脱しないで、記載された手順に修正をなすことができることが理解される。
材料及び方法
特に別の記載がなければ、種々の方法は、材料製造者のマニュアルに従い実施した。
特に別の記載がなければ、種々の方法は、材料製造者のマニュアルに従い実施した。
組換えＤＮＡ技術
Sambrook, Jら, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されたように、標準的な方法を使用して、ＤＮＡを操作した。製造者の使用説明書に従い、分子生物学用試薬を使用した。
Sambrook, Jら, Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されたように、標準的な方法を使用して、ＤＮＡを操作した。製造者の使用説明書に従い、分子生物学用試薬を使用した。
タンパク質定量：
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用し、３２０ｎｍの参照波長で、２８０ｎｍでの光学密度(ＯＤ)を測定することにより決定した。
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用し、３２０ｎｍの参照波長で、２８０ｎｍでの光学密度(ＯＤ)を測定することにより決定した。
サイズ排除ＨＰＬＣ：
ＡＳＩ-１００ ＨＰＬＣシステム(Dionex, Idstein, Germany)において、Ｔｏｓｏｈ Ｈａａｓ ＴＳＫ ３０００ ＳＷＸＬカラムを用い、クロマトグラフィーを実施した。ＵＶダイオードアレイ検出器(Dionex)により、溶離ピークを２８０ｎｍでモニターした。１ｍｇ／ｍｌまで濃縮したサンプルを溶解させた後、安定したベースラインが達成されるまで、２００ｍＭのリン酸二水素カリウムと２５０ｍＭの塩化カリウムからなるｐＨ７のバッファーを用い、カラムを洗浄した。分析実験を、０．５ｍｌ／分の流量を使用し、室温で３０分、均一濃度条件下で実施した。Chromeleon(Dionex, Idstein, Germany)を用い、クロマトグラムをマニュアルで積分した。
ＡＳＩ-１００ ＨＰＬＣシステム(Dionex, Idstein, Germany)において、Ｔｏｓｏｈ Ｈａａｓ ＴＳＫ ３０００ ＳＷＸＬカラムを用い、クロマトグラフィーを実施した。ＵＶダイオードアレイ検出器(Dionex)により、溶離ピークを２８０ｎｍでモニターした。１ｍｇ／ｍｌまで濃縮したサンプルを溶解させた後、安定したベースラインが達成されるまで、２００ｍＭのリン酸二水素カリウムと２５０ｍＭの塩化カリウムからなるｐＨ７のバッファーを用い、カラムを洗浄した。分析実験を、０．５ｍｌ／分の流量を使用し、室温で３０分、均一濃度条件下で実施した。Chromeleon(Dionex, Idstein, Germany)を用い、クロマトグラムをマニュアルで積分した。
逆相ＨＰＬＣ(ＲＰ-ＨＰＬＣ)：
純度はＲＰ-ＨＰＬＣにより分析される。アセトニトリル／ＴＦＡ水溶液勾配を使用し、Poroshellカラムでアッセイは実施される。溶離プロファイルが、２１５ｎｍでのＵＶ吸光度としてモニターされる。溶離物質の割合が、溶離タンパク質の全ピーク面積に基づき算出される。
純度はＲＰ-ＨＰＬＣにより分析される。アセトニトリル／ＴＦＡ水溶液勾配を使用し、Poroshellカラムでアッセイは実施される。溶離プロファイルが、２１５ｎｍでのＵＶ吸光度としてモニターされる。溶離物質の割合が、溶離タンパク質の全ピーク面積に基づき算出される。
ＤＮＡ-閾値-システム
例えば、Merrick, H., 及び Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照。
例えば、Merrick, H., 及び Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照。
宿主細胞タンパク質定量：
マイクロタイタープレートのウェルの壁面に血清アルブミン及びストレプトアビジンをコートする。ＨＣＰに対するヤギ由来ポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁面に結合させる。洗浄工程の後、マイクロタイタープレートの種々のウェルを、種々の濃度のＨＣＰ較正列及びサンプル溶液と共にインキュベートする。インキュベート後、結合していないサンプル物質を、緩衝液で洗浄することにより除去する。検出では、ウェルを抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートし、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定ペルオキシダーゼの活性を、ＡＢＴＳと共にインキュベートし、４０５ｎｍで検出することで検出する。
マイクロタイタープレートのウェルの壁面に血清アルブミン及びストレプトアビジンをコートする。ＨＣＰに対するヤギ由来ポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁面に結合させる。洗浄工程の後、マイクロタイタープレートの種々のウェルを、種々の濃度のＨＣＰ較正列及びサンプル溶液と共にインキュベートする。インキュベート後、結合していないサンプル物質を、緩衝液で洗浄することにより除去する。検出では、ウェルを抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベートし、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定ペルオキシダーゼの活性を、ＡＢＴＳと共にインキュベートし、４０５ｎｍで検出することで検出する。
実施例１
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣにおけるここで報告された方法を用いた抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体のクロマトグラフィー
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １４．６ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり３０ｍｇの抗体
工程ａ-１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ｂ） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、ｐＨ７．２
溶離方法： 段階溶離
流速： ２５０ｃｍ／ｈ
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣにおけるここで報告された方法を用いた抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体のクロマトグラフィー
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １４．６ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり３０ｍｇの抗体
工程ａ-１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ｂ） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコール、ｐＨ７．２
溶離方法： 段階溶離
流速： ２５０ｃｍ／ｈ
得られた抗体の分析用サイズ排除クロマトグラムを図１に示す。
実施例２
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣにおけるここで報告された方法とは異なる条件を用いる、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の実施例１に対する比較クロマトグラフィー
クロマトグラフィーを次のパラメーターを用いて実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １４．６ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり３０ｍｇの抗体
工程ａ-１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ｂ） 可変−以下の表を参照
溶離方法： 段階溶離
流速： ２５０ｃｍ／ｈ
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣにおけるここで報告された方法とは異なる条件を用いる、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の実施例１に対する比較クロマトグラフィー
クロマトグラフィーを次のパラメーターを用いて実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １４．６ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり３０ｍｇの抗体
工程ａ-１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ｂ） 可変−以下の表を参照
溶離方法： 段階溶離
流速： ２５０ｃｍ／ｈ
以下にまとめた表から、工程ｂ）のわずかに異なる条件を用いると、精製はあまり効果的ではない形で実施されうることが分かる。
実施例３
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣにおける、ここで報告された方法を用いた抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体のクロマトグラフィー
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １４．６ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり３０ｍｇの抗体
工程ａ-１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ２） １２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、３８ｍＭのアルギニン、ｐＨ８．１
工程ｂ） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０％(ｗ／ｖ）のエチレングリコール、ｐＨ７．２
溶離方法： 段階溶離
流速： ２５０ｃｍ／ｈ
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣにおける、ここで報告された方法を用いた抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体のクロマトグラフィー
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １４．６ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり３０ｍｇの抗体
工程ａ-１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ２） １２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、３８ｍＭのアルギニン、ｐＨ８．１
工程ｂ） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０％(ｗ／ｖ）のエチレングリコール、ｐＨ７．２
溶離方法： 段階溶離
流速： ２５０ｃｍ／ｈ
対応する溶離ダイアグラムを図２に示し、工程ｂ）の分析的サイズ排除クロマトグラムを図３ａ、工程ａ-ｂ２）を図３ｂ）に示す。
実施例４
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣにおける、ここで報告された方法とは異なる条件を用いる、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の実施例３に対する比較クロマトグラフィー
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １４．６ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり３０ｍｇの抗体
工程ａ-１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ２） 可変−以下の表を参照
工程ｂ） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０％(ｗ／ｖ）のエチレングリコール、ｐＨ７．２
溶離方法： 段階溶離
流速： ２５０ｃｍ／ｈ
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣにおける、ここで報告された方法とは異なる条件を用いる、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の実施例３に対する比較クロマトグラフィー
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １４．６ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり３０ｍｇの抗体
工程ａ-１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ１） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．１
工程ａ-ｂ２） 可変−以下の表を参照
工程ｂ） ２５ｍＭのトリス-ＨＣｌ、１２００ｍＭのＮａＣｌ、２０％(ｗ／ｖ）のエチレングリコール、ｐＨ７．２
溶離方法： 段階溶離
流速： ２５０ｃｍ／ｈ
以下にまとめた表から、工程ｂ）のわずかに異なる条件を用いると、精製はあまり効果的ではない形で実施されうることが分かる。
実施例５
粗培養上清のプレコンディショニングをしない、抗ＩＬ１３Ｒ抗体の比較例
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １０ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり２１ｍｇの抗体
工程ａ-１） ７０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．３、１０．９ｍＳ／ｃｍ
工程ａ-ｂ） ７０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．３、１０．９ｍＳ／ｃｍ
工程ｂ） １ＭのＫＣｌ、ｐＨ３．０、１０５．６ｍＳ／ｃｍ
溶離方法： 段階溶離
流速： １５０ｃｍ／ｈ
適用抗体の８８％がクロマトグラフィー材料に結合せず、フロースルーに見出された(図４)。
粗培養上清のプレコンディショニングをしない、抗ＩＬ１３Ｒ抗体の比較例
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １０ｃｍ
適用液： 粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり２１ｍｇの抗体
工程ａ-１） ７０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．３、１０．９ｍＳ／ｃｍ
工程ａ-ｂ） ７０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．３、１０．９ｍＳ／ｃｍ
工程ｂ） １ＭのＫＣｌ、ｐＨ３．０、１０５．６ｍＳ／ｃｍ
溶離方法： 段階溶離
流速： １５０ｃｍ／ｈ
適用抗体の８８％がクロマトグラフィー材料に結合せず、フロースルーに見出された(図４)。
実施例６
粗培養上清のプレコンディショニングした、抗ＩＬ１３Ｒ抗体の比較例
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １１ｃｍ
適用液： １．４ｍＳ／ｃｍに調節された粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり２０ｍｇの抗体
工程ａ-１） １０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５、１．４ｍＳ／ｃｍ
工程ａ-ｂ） １０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５、１．４ｍＳ／ｃｍ
工程ｂ） １００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５、１４．９ｍＳ／ｃｍ
溶離方法： 線形溶離
流速： １５０ｃｍ／ｈ
クロマトグラム(図５)において、鋭いピークが見られる。得られた抗体は９６．６％の純度を有し、６８％の収率であった。
粗培養上清のプレコンディショニングした、抗ＩＬ１３Ｒ抗体の比較例
クロマトグラフィーを次のパラメーターで実施した：
樹脂： ＣａｐｔｏＴＭＭＭＣ
カラム直径： １ｃｍ
ベッド高： １１ｃｍ
適用液： １．４ｍＳ／ｃｍに調節された粗細胞培養上清
添加： 材料１ｍｌ当たり２０ｍｇの抗体
工程ａ-１） １０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５、１．４ｍＳ／ｃｍ
工程ａ-ｂ） １０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５、１．４ｍＳ／ｃｍ
工程ｂ） １００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．５、１４．９ｍＳ／ｃｍ
溶離方法： 線形溶離
流速： １５０ｃｍ／ｈ
クロマトグラム(図５)において、鋭いピークが見られる。得られた抗体は９６．６％の純度を有し、６８％の収率であった。
Claims (10)
- ａ）哺乳動物細胞培養の粗培養上清を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料であるＣａｐｔｏ（登録商標） ＭＭＣに適用する工程、
ｂ）エチレングリコールと無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用することにより、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を回収し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体を生成させる工程
を含む抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体の製造方法であって、
多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料は、細胞培養の粗培養上清を直接用いるカラムクロマトグラフィー精製法での第１工程として使用され、
工程ｂ）の緩衝液が、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、１０５０ｍＭ〜１３５０ｍＭの塩化ナトリウム、及び２０％(ｗ／ｖ)のエチレングリコールを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有する、製造方法。 - 工程ａ）の前に、次の付加工程ａ-１）：
ａ-１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。 - 工程ａ）の後で工程ｂ）の前に、次の付加工程ａ-ｂ）：
ａ-ｂ）緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用し、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない工程
を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。 - 工程ａ-ｂ）が、２つの工程ａ-ｂ１）及び工程ａ-ｂ２）：
ａ-ｂ１）無機塩を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、及び
ａ-ｂ２）変性剤を含有する緩衝液を多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程
を含み、よって、抗ＩＧＦ-１Ｒ抗体が、多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料から回収されない
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。 - 変性剤が塩酸グアニジン及び尿素から選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
- 無機塩が、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び塩化アンモニウムから選択されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
- 工程ａ-１）の緩衝液が、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウムを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有することを特徴とする請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
- 工程ａ-ｂ１）の緩衝液が、２０ｍＭ〜３０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウムを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有することを特徴とする請求項４から７のいずれか一項に記載の方法。
- 工程ａ-ｂ２）の緩衝液が、１１０ｍＭ〜１４０ｍＭのトリス、８０ｍＭ〜１２０ｍＭの塩化ナトリウム、及び３０ｍＭ〜４０ｍＭのアルギニンを、ｐＨ７．１〜ｐＨ７．３のｐＨ値で含有することを特徴とする請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
- 多様式弱カチオン交換クロマトグラフィー材料が、カルボン酸、エーテル、チオエーテル及び芳香族官能基を含む多様式弱カチオン交換リガンドが共有結合している架橋アガロースを含有することを特徴とする請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
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