JP5485873B2 - ヒトフューリンのための予備的な精製方法 - Google Patents
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Description
本発明は、不活性前駆体タンパク質から成熟タンパク質へのプロセシングに使用される、組換えヒトフューリン、切断型ヒトフューリン又はフューリン誘導体の精製方法に関する。
タンパク質分解性哺乳動物サブチリシン様プロタンパク質コンバターゼ(SPC又はPC)ファミリーは、細菌サブチリシン及び酵母Kex2pに類似している。現在まで、フューリン、(PC3としても知られる)PC1、PC2、PACE4、PC4、(PC6としても知られる)PC5、PC7(LPC、PC8又はSPC7)を含めて、SPCファミリーの7種類のメンバーが同定され、その各々が独特の組織分布を示す。
非特許文献14は、硫酸アンモニウム分画、TOYOPEARL(登録商標)AF−Blueバッチ式分画及びDEAE−TOYOPEARL(登録商標)クロマトグラフィーを使用することによって、CHO細胞における切断型マウスフューリンの100倍精製を約10%の比較的低収率で達成した。同方法は、Methods Enzymol.1994;244:167〜75に発表されたように、Nakayama等によっても使用された。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
タンパク質溶液からフューリン又はフューリン誘導体を精製する方法であって、以下:(a)タンパク質溶液からの該フューリン又はフューリン誘導体を、pH6.0でフューリンを結合可能である陰イオン交換樹脂に結合させるステップ、(b)溶出によって該フューリン又はフューリン誘導体を回収するステップを含む、方法。
(項目2)
上記陰イオン交換樹脂が、Fractogel(登録商標)EMD TMAE 650M(Merck、Darmstadt、Germany)、Capto(商標)Q(GE Healthcare、Freiburg、Germany)及びCapto(商標)MMC(GE Healthcare、Freiburg、Germany)からなる群より選択されることを特徴とする、項目1に記載の方法。
(項目3)
上記陰イオン交換樹脂がCapto(商標)MMC(GE Healthcare、Freiburg、Germany)であることを特徴とする、項目1〜2に記載の方法。
(項目4)
上記フューリン誘導体が切断型フューリンであることを特徴とする、項目1に記載の方法。
(項目5)
上記切断型フューリンが、アミノ酸578から794をC末端側で欠く配列番号1のフューリンであることを特徴とする、項目4に記載の方法。
(項目6)
上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体がCapto MMC(商標)カラムに結合し、段階溶出によって回収されることを特徴とする、項目4に記載の方法。
(項目7)
上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体が、10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl 2 pH6.0中で上記Capto(商標)MMCカラムに結合し、30mM塩化ナトリウム、10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl 2 pH6.0で洗浄され、230mM塩化ナトリウム、10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl 2 pH6.0で溶出される、項目6に記載の方法。
(項目8)
上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体が、50mM Hepes、1mM CaCl 2 pH6.0中で上記Capto(商標)MMCカラムに結合し、30mM塩化ナトリウム50mM Hepes、1mM CaCl 2 pH6.0で洗浄され、230mM塩化ナトリウム、50mM Hepes、1mM CaCl 2 pH6.0で溶出される、項目7に記載の方法。
(項目9)
Capto(商標)MMCカラムに結合した上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体が勾配溶出によって回収されることを特徴とする、項目4に記載の方法。
(項目10)
Capto(商標)MMCカラムに結合した上記フューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体が勾配溶出によって回収され、該勾配が10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl 2 pH6.0中の0〜500mM NaClであることを特徴とする、項目9に記載の方法。
(項目11)
項目1に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体。
(項目12)
少なくとも100,000U/mgタンパク質の比活性を有する、項目1に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体。
(項目13)
エンド型タンパク質分解に活性な量の項目11に記載のフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
(項目14)
フューリン又はフューリン誘導体を回収する方法であって、以下:(a)タンパク質溶液からの該フューリン又はフューリン誘導体を、Capto(商標)MMCカラムに結合させるステップ、(b)該フューリン又はフューリン誘導体を溶出させるステップ、(c)該フューリン又はフューリン誘導体をArginine−Sepharoseカラムに結合させるステップ、および(d)該フューリン又はフューリン誘導体を溶出させるステップを含む、方法。
(項目15)
上記フューリン誘導体が切断型フューリンであることを特徴とする、項目14に記載の方法。
(項目16)
上記切断型フューリンが、アミノ酸578から794をC末端側で欠く配列番号1で示される配列を有することを特徴とする、項目15に記載の方法。
(項目17)
項目14に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体。
(項目18)
少なくとも290,000U/mgタンパク質の比活性を有する、項目17に従って精製されたフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体。
(項目19)
エンド型タンパク質分解に活性な量の項目18に記載のフューリン、切断型フューリン又はフューリン誘導体と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
アミノ酸578から794を欠く切断型ヒトフューリン(配列番号1)を、80〜200L規模のケモスタット発酵によって培養されたCHO細胞において発現させた。フューリン含有CHO細胞上清を約50倍に濃縮し(0.6m2 Hydrosart 30kDa膜を備えた限外ろ過ユニット、Sartorius Goettingen、Germany)、50mM Hepes、1mM CaCl2、pH6.0に対して透析ろ過し、使用するまで(1週間以内)−20℃で貯蔵した。
上述したように発現させ、分析した切断型フューリンを、フューリン又は切断型フューリン調製物にはこれまで使用されなかった異なるクロマトグラフィー樹脂を用いて、比較しながら精製した。2種類の陰イオン交換樹脂、すなわち、Fractogel(登録商標)EMD TMAE 650(Merck、Darmstadt、Germany)とCapto(商標)Q(GE Healthcare、Freiburg、Germany)、及び混合陽イオン交換/疎水性相互作用ゲル(Capto(商標)MMC)(GE Healthcare)を、CHO細胞上清に由来する切断型フューリンの精製及び濃淡膜電位について試験した。クロマトグラフィーの運転を、50mM Hepes/1mM CaCl2緩衝剤を用いて、pH7.5(Fractogel(登録商標)EMD TMAE 650及びCapto(商標)Q)及び5.5〜8.0(Capto(商標)MMC)で実施した。切断型フューリンカラムロード及び導電率は、個々のクロマトグラフィー運転ごとに異なった(表1)。結合したフューリンをローディングバッファー中の線形0〜500mM NaCl勾配によって15CV以内で溶出させた。調製されたすべての切断型フューリン試料は、内毒素を含まないことに留意されたい。
異なるカラムに対する結果は各グループ内で比較的均一であったので、概観しやすいように平均を計算した。Fractogel(登録商標)EMD TMAE 650を用いた5つの実験、Capto(商標)Qを用いた3つの実験、及びCapto(商標)MMCを用いた3つの実験の平均をそれぞれ表2に示す。
Fractogel(登録商標)EMD TMAE 650及びCapto(商標)Qは、切断型フューリンの純度をそれぞれ3倍及び8倍増加させることができたのに対して、Capto(商標)MMCでは32の精製倍率が得られた。カラム溶出物における切断型フューリン収率は、Capto(商標)MMCでは65%、Capto(商標)Qでは56%、Fractogel(登録商標)EMD TMAE 650では49%であった。
緩衝剤コスト(約500ユーロ/1Lカラム)を削減するために、代替緩衝系を試験した。Hepes濃度の減少は、カラム流液及び洗浄画分中の切断型フューリンがかなり急増したので、不可能であった。Capto(商標)MMCカラムに5,000〜30,000Uフューリン/mLゲルを充填し、ローディングバッファー中の0〜500mM NaCl勾配によって15CV以内で溶出させた。
実施例4 導電率の変更による、Capto(商標)MMCカラムを用いた切断型フューリン精製の最適化
Capto(商標)MMCカラムに70,000〜100,000Uフューリン/mgゲルを充填した。充填液を10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl2、pH6.0で透析して、導電率約1mS/cmを得た。導電率を1mS/cmに調節することによって、Capto(商標)MMCカラムの流液及び洗浄画分中の切断型フューリンの損失を約17%から検出不可能なレベルにまでかなり減少させることができた。さらに、カラムロードを約100,000Uフューリン/mLゲルまで増加させることができた(表4)。150,000Uフューリン/mLゲルの適用後に、かなりの切断型フューリンの急増が認められた。しかし、大規模調製のための最適化中にカラムロードを150,000U/mLゲルに増加することができると期待できる。
実施例5 勾配又は段階溶出によるCapto(商標)MMCカラムからの切断型フューリンの回収
カラムクロマトグラフィーの堅牢性を高めるために、切断型フューリンの溶出のための塩化ナトリウム勾配の代わりに段階勾配を使用した。(10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl2、pH6.0に対して透析された)切断型フューリン約80,000U/mLゲル(勾配)及び30,000U/mLゲル(段階勾配)をCapto(商標)MMCカラムに充填した。クロマトグラフィーの運転を、10mM酢酸ナトリウム/1mM CaCl2緩衝剤を用いてpH6で実施した。15カラム体積以内の酢酸ナトリウムローディングバッファー中の0〜500mM NaClの勾配溶出に加えて、30mM塩化ナトリウム含有平衡緩衝剤における追加の洗浄段階、及び同じ緩衝剤中の230mM塩化ナトリウムによる溶出を実施した。カラムを平衡緩衝剤30体積、次いで30mM塩化ナトリウム含有平衡緩衝剤10体積で洗浄した。切断型フューリンを230mM塩化ナトリウム含有平衡緩衝剤14体積で溶出させた。最初の230mM塩化ナトリウム溶出物3体積を収集した。その結果、精製倍率が低下し、溶出物中の切断型フューリン絶対濃度が減少した。それぞれ2つの実験の平均を表5に示す。これとは対照的に、段階溶出から溶出した切断型フューリンのピーク収集(peak collection)(図1)は、勾配溶出から得られたピーク収集(図2)よりも良好であった。
実施例6 Capto(商標)MMCカラムから溶出した切断型フューリンの更なるArginine−Sepharoseカラム精製
Capto(商標)MMCクロマトグラフィー後に得られた少なくとも20%純粋な切断型フューリン調製物は、既にプロVWFのオンカラム成熟が可能な精製度であった。精製倍率を高めるために、追加のArginine−Sepharoseクロマトグラフィー精製を実施することができる。
Claims (12)
- タンパク質溶液からフューリンポリペプチド又はフューリンポリペプチド誘導体を精製する方法であって、以下:
(a)該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体を、pH6.0でフューリンポリペプチド又はフューリンポリペプチド誘導体を結合可能である混合陽イオン交換/疎水性相互作用樹脂に結合させるステップ、
(b)溶出によって該樹脂から該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチドフューリン誘導体を回収するステップを含む、方法。 - 前記混合陽イオン交換/疎水性相互作用樹脂がCapto(商標)MMC(GE Healthcare、Freiburg、Germany)であることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記フューリンポリペプチド誘導体が切断型フューリンポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 前記切断型フューリンポリペプチドが、配列番号1にしたがうフューリンポリペプチドである、請求項3に記載の方法。
- 前記溶出が段階溶出である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フューリンポリペプチド、又は前記フューリンポリペプチド誘導体が、10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl2 pH6.0中で前記混合陽イオン交換/疎水性相互作用樹脂に結合し、30mM塩化ナトリウム、10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl2 pH6.0で洗浄され、230mM塩化ナトリウム、10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl2 pH6.0で溶出される、請求項1〜3および5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記フューリンポリペプチド、又は前記フューリンポリペプチド誘導体が、50mM Hepes、1mM CaCl2 pH6.0中で前記混合陽イオン交換/疎水性相互作用樹脂に結合し、30mM塩化ナトリウム、50mM Hepes、1mM CaCl2
pH6.0で洗浄され、230mM塩化ナトリウム、50mM Hepes、1mM CaCl2 pH6.0で溶出される、請求項1〜3および5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記溶出が勾配溶出である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記勾配溶出における勾配が10mM酢酸ナトリウム、1mM CaCl2 pH6.0中の0〜500mM NaClであることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- フューリンポリペプチド又はフューリンポリペプチド誘導体を回収する方法であって、以下:
(a)該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体を、混合陽イオン交換/疎水性相互作用樹脂に結合させるステップ、
(b)該混合陽イオン交換/疎水性相互作用樹脂から該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体を溶出させるステップ、
(c)溶出された該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体をArginine−Sepharose樹脂に結合させるステップ、および
(d)該Arginine−Sepharose樹脂から該フューリンポリペプチド又は該フューリンポリペプチド誘導体を溶出させるステップを含む、方法。 - 前記フューリンポリペプチド誘導体が切断型フューリンポリペプチドであることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 前記切断型フューリンポリペプチドが、配列番号1にしたがうフューリンポリペプチドである、請求項11に記載の方法。
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