MX2013004627A - Metodo optimizado para captura de anticuerpo por cromatografia de modo mixto. - Google Patents

Abstract

Aquí se reporta un método para la purificación de un anticuerpo capturado directamente de sobrenadante de cultivo celular clarificado utilizando Streamline CST y/o Capto MMC, en donde impurezas especialmente relacionadas a producto (agregados y fragmentos) y relacionadas a proceso (proteína de célula hospedera, componentes de medios) pueden retirarse eficientemente, resultando en una preparación con una pureza comparable a cromatografía de afinidad de proteína A clásica.

Description

MÉTODO OPTIMIZADO PARA CAPTURA DE ANTICUERPO POR CROMATOGRAFÍA DE MODO MIXTO Aquí se reporta un método para la purificación de un anticuerpo capturado directamente de sobrenadantes de cultivo celular clarificado utilizando Streamline CST y/o Capto MC, en donde impurezas relacionadas especialmente a producto (agregados y fragmentos) e impurezas relacionadas a proceso (proteina de célula hospedera, ADN, componentes de medio) pueden ser retiradas eficientemente, resultando en una preparación con una pureza comparable con cromatografía de afinidad de proteína A clásica.

Antecedentes de la Invención La cromatografía de proteína A se emplea rutinariamente como una primera etapa de captura en procesos de purificación de anticuerpo monoclonal debido a su alta selectividad, resultando en buenos rendimientos y purezas totales. Sin embargo, una desventaja principal de esta cromatografía afinidad es su alto precio, que especialmente en caso de anticuerpos terapéuticos requeridos a altas dosis y/o para administración crónica puede representar un costo significante de factor de bienes. Además, el ligando de proteína A lixiviada de la matriz de afinidad debe retirarse por adicionales etapas de cromatografía debido a su inmunogenicidad potencial.

La cromatografía de modo mixto en resinas multimodales que exhiben funcionalidades iónicas e hidrofóbicas, puede ofrecer una alternativa valiosa, al enfoque de afinidad clásico. Debido a la tolerabilidad de sal del componente hidrofóbico, en la mayoría de los casos, una carga directa del sobrenadante de cultivo celular clarificado en la matriz es posible, resultando en una captura efectiva del anticuerpo monoclonal. Sin embargo, debido a la naturaleza multimodal de la resina, diferentes tipos de interacción del ligando con un anticuerpo monoclonal particular son posibles, requiriendo una condición de elución y lavado única diferente de la cromatografía de interacción hidrofóbica o de intercambio de iones tradicional.

En WO 2010/080062 un método de separación utilizando sistemas fase de polímero sencillo se reporta. Un proceso de fabricación para la producción de polipéptidos expresados en líneas celulares de insectos se reporta en WO 2008/073620.

Compendio de la Invención Se ha encontrado que un material de cromatografía 1 de intercambio de cationes débiles multimodal puede emplearse como primera etapa en un método de purificación de cromatografía en columna directamente con sobrenadante dé cultivo de células crudo. : Un aspecto aquí reportado es un método para producir un anticuerpo anti-IGF-lR que comprende las: siguientes etapas: : a) aplicar un sobrenadante para cultivo celular de células de mamífero crudas a un material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal, b) recuperar el anticuerpo anti-IGF-lR al aplicar una solución amortiguada que comprende etilen glicol y una sal inorgánica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal y de esta manera producir un anticuerpo anti-IGF-lR.

En una modalidad, el método comprende la siguiente etapa adicional a-1) antes de la etapa a) : a-1) aplicar una solución amortiguada que compréndé una sal inorgánica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal. i En una modalidad, el método comprende la siguienté etapa adicional a-b) después de la etapa a) y antes de la etapa b) : ; a-b) aplicar una solución amortiguada al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles ; I multimodal, con lo que el anticuerpo anti-IGF-lR no se i recupera del material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal.

En una modalidad, la etapa a-b) . comprende dos etapas a-bl) y a-b2) : a-bl) aplicar una solución amortiguada ique' comprende una sal inorgánica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal, y j a-b2) aplicar una solución amortiguada que comprende un desnaturalizante al material de cromatografía de intercambio de catión débil multimodal, con lo que el anticuerpo anti-IGF-lR no se recupera del material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal.

En una modalidad, el desnaturalizante se elige de hidrocloruro de guanidinio, y urea.

En una modalidad, la sal inorgánica se elige de cloruro de sodio, cloruro de potasio, y cloruro de amonio.

En una modalidad, la solución amortiguada en l',a etapa b) comprende Tris 20 mM a 30 mM, cloruro de sodio 1050 mM a 1350 mM, y aproximadamente 20% (p/v) de etilen glicol á un valor de pH de pH 7.1 a pH 7.3.

En una modalidad, la solución amortiguada en la etapa a-1) comprende Tris 20 mM a 30 mM, y cloruro de sodio 80 mM a 120 mM a un valor de pH de pH 7.1 a pH 7.3. · En una I modalidad, la solución amortiguada en la etapa a;-bl!) comprende Tris 20 mM a 30 mM, y cloruro de sodio 80 mM a 120 mM a un valor de pH de pH 7.1 a pH 7.3. En una modalidad, la solución amortiguada en la etapa a-b2) comprende Tris 110 mM a 140 mM, cloruro de sodio 80 mM a 120 mM, y arginina 30 mM a 40 mM a un valor de pH desde pH 7.1 a pH 7.3. 1 ¡ En una modalidad, el material de cromatografía de intercambio de catión débil multimodal comprende agarosa entrelazada a la cual se conectan covalentemente un ácido carboxílico, éter, tioéter y un grupo funcional aromático qu contiene ligando de intercambio de cationes débiles multimodal .

Descripción Detallada de la Invención Aquí se reporta un proceso para la purificación de un anticuerpo monoclonal capturado a partir de sobrenadantes de cultivo celular clarificado utilizando Streamline CST 1 y/o Capto MC, que comprende condiciones optimizada para elución y lavado. Impurezas especialmente relacionadas a producto (agregados y fragmentos) y relacionadas a proceso (protéíná celular hospedera, componentes de medio) pueden retirarse 1 eficientemente, resultando en una preparación con una pureza comparable con cromatografía de afinidad clásica. De esta manera, con el método como se reporta aquí, puede reemplazarse una cromatografía de afinidad de protéíná A clásica. ; En una modalidad, el método no comprende una etapa de cromatografía de afinidad de proteína A.

Métodos cromatográficos generales y su uso se conocen por una persona con destreza en la técnica. Ver por ejemplo, Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentáis and Techniques, Heftmann, E. (ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992) ; Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed. ) , Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, C. F. , and Poole, S. K.,, Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, Protein Purification : Principies and Practice (1982),* Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; o Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. . , et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York (1987) .

La expresión "aplicar a" denota una etapa parcial de un método de purificación en donde una solución se pone en contacto con un material de cromatografía. Esto denota que ya sea a) la solución se agrega a un dispositivo cromatográfico en donde el material de cromatografía está contenido, o b) que el material de cromatografía se agrega a la solución. En el caso a), la solución pasa a través del dispositivo permitiendo una interacción entre el material de cromatografía y las sustancias contenidas en la solución. Dependiendo de las condiciones, tales como por ejemplo pH; conductividad, concentración de sal, temperatura y/o gasto dé flujo, algunas sustancias de la solución pueden ligarse al material de cromatografía y otras sustancias pueden recuperarse del material de cromatografía. Las sustancias que permanecen en solución o que se recuperan del material de cromatografía pueden encontrarse en el flujo pasante. El "flujo-pasante" denota la solución que se obtiene después del paso del dispositivo, que ya puede ser la solución aplicada o una solución amortiguada, que se utiliza para lavar1 la columna o provocar elución de sustancias que se ligan al material de cromatografía. En una modalidad, el dispositivo es una columna o un cásete. En el caso b) el material ¡ dei cromatografía puede agregarse, por ejemplo como un sólido a la solución, por ejemplo que contiene la sustancia de interés a purificar, permitiendo una interacción entre el material dé cromatografía y las sustancias en solución. Después de la interacción, se retira el material de cromatografía como por ejemplo por filtración, y la sustancia ligada al material de cromatografía también se retira de la solución mientras que las sustancias no ligadas al material de cromatografía permanecen en solución. : La expresión "modo de ligar-y-eluir" denota un modo de operación de una etapa de cromatografía, en donde solución que contiene una sustancia de interés a purificar, se aplica a un material de cromatografía, con lo que; la sustancia de interés liga al material de cromatografía. De esta manera, la sustancia de interés se retiene en : el material de cromatografía mientras que sustancias que no son de interés se retiran con el flujo pasante o el sobrenadante.

La sustancia de interés posteriormente se recupera del material de cromatografía en una segunda etapa con , una solución de elución. En una modalidad, el método como aquí se reporta se opera en el modo de ligar-y-eluir .

La expresión "solución amortiguada" denota una solución en donde cambios de pH debido a la adición ó liberación o desprendimiento de sustancias acídicas o alcalinas se nivelan por la sustancia amortiguadora disuelta. Cualquier sustancia amortiguadora con estas propiedades puede emplearse. En general, sustancias amortiguadoras farmacéuticas aceptables se emplean. En una modalidad, 1 la solución amortiguada se elige de una solución amortiguada con fosfato que consiste de ácido fosfórico y/o su sales, o una solución amortiguada de acetato que consiste de ácido acético y sus sales, o una solución amortiguada de citrato que consiste de ácido cítrico y/o sus sales, o una solución1 amortiguada de morfolina, o una solución amortiguada! 2- (N-morfolino) etansulfónico, o una solución amortiguada de histidina, o una solución amortiguada de glicina, o una; solución amortiguada de tris (hidroximetil) aminometano (Tris). En otra modalidad, la solución amortiguadora se elige de una solución amortiguada Tris o una solución amortiguada con citrato, o una solución amortiguada con histidina. La solución amortiguada puede comprender una sal inorgánica, tal como por ejemplo cloruro de sodio, sulfato de sodio, cloruro de potasio, sulfato de potasio, cloruro dé amonio, o sulfato de amonio.

Las expresiones "elución continua" y "método de í elución continua", , que se emplean en forma intercambiable en esta solicitud, denotan un método en donde la conductividad de una elución que provoca solución, es decir la recuperación de un compuesto ligado de un material de cromatografía se i cambia, es decir se eleva o reduce, en forma continua, es decir la concentración se cambia por una secuencia dé pequeñas etapas cada una no mayor que un cambio de 2%, o de I 1% de la concentración de la sustancia que provoca elución. En esta "elución continua" una o más condiciones, por ejemplo el pH, la concentración iónica, concentración de una sal y/9 el flujo de cromatografía, puede cambiarse en forma lineal o exponencial o asintótica. En una modalidad, el cambio es lineal. ¡ La expresión "etapa de elución" denota un método en donde por ejemplo la concentración de una sustancia que provoca elución, es decir la recuperación de una sustancia ligada de un material de cromatografía, se eleva o reduce dé inmediato, es decir directamente de un valor/nivel al siguiente valor/nivel. En esta "etapa de elución" una o más condiciones, por ejemplo el pH, la concentración iónica; concentración de una sal, y/o el flujo de una cromatografía^ puede cambiarse todo de inmediato desde un primer valor, por ejemplo de partida, a un segundo valor, por ejemplo final'. De esta manera, las condiciones se cambian en forma incremental, es decir por etapas, en contraste con un cambió lineal.

La expresión "material de cromatografía dé intercambio de cationes débiles multimodal" denota una matriz de alto peso molecular inmóvil, tal como agarosa entrelazada químicamente, que transporta sustituyentes cargados y ligados covalentemente utilizada como una fase estacionaria 1 en cromatografía de intercambio de iones. Para neutralidad de carga total se ligan contra iones no covalentemente ligados: El "material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal" tiene la capacidad de intercambiar sus contra iones catiónicos ligados en forma no covalente ¡por iones de carga similar de la solución circundante. Un "material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal" comprende ligandos enlazados covalentemente que son capaces de ejercer interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, interacciones de van-der-Waals así como la formación de enlaces de hidrógeno con moléculas que comprenden una solución circundante. .

A una persona con destreza en la técnica,, procedimientos y métodos son bien conocidos para convertir i una secuencia de aminoácidos, por ejemplo de un polipéptido, en una secuencia de ácidos nucleicos correspondiente que codifica esta secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, un ácido nucleico se caracteriza por su secuencia de ácidos nucleicos que consiste de nucleótidos individuales e igualmente por la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de esta manera codificada.

La expresión "bajo condiciones adecuadas para ligar" y equivalentes gramaticales de la misma como se emplea dentro de esta solicitud, denota que una sustancia de interés, por ejemplo un anticuerpo anti-IGF-lR, liga a una fase estacionaria cuando se pone en contacto con él, por ejemplo un material de intercambio de iones. Esto no necesariamente denota que 100% de la sustancia de interés sé liga pero esencialmente 100% de la sustancia de interés se liga, es decir al menos 50% de la sustancia de interés se liga, de preferencia al menos 75% de la sustancia de interés se liga, de preferencia al menos 85% de la sustancia de interés se liga, más preferible más de 95% de la sustancia de interés se liga a la fase estacionaria.

El término "anticuerpo" aquí se emplea en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitados a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos ) , y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiben la actividad de enlace de antigeno deseada. Anticuerpos de origen natural1 son moléculas con estructuras variantes. Por ejemplo1, anticuerpos IgG nativos son glicoproteinas heterb tetraméricas de aproximadamente 150,000 Daltons, compuestas por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que son enlazadas con disulfuro. Del extremo -N á -C, cada cadena pesada tiene un dominio variable (VH) , también denominado un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido por tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y opcionalmente CH4) . Similarmente, del extremo -N a -C, cada cadena ligera tiene el dominio variable (VL) , también denominado un dominio ligero variable o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio de cadena ligera constante (CL) . , La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?) , con base en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

Receptor de factor de crecimiento tipo insulina humana I (IGF-IR, EC 2.7.112, antigeno CD 221) pertenece a la familia de proteina tirosina quinasas transmembrana (LeRoith,, D., et al., Endocrin. Rev. 16 (1995) 143-163; Adams, T.E.,: ef al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063). IGF-IR liga a IGF-I con alta afinidad e inicia la respuesta fisiológica a este ligando in vivo. IGF-IR también liga a IGF-II, sin' embargo con una afinidad ligeramente menor. La sobre-expresión de IGF-IR promueve la transformación neoplástica de¡ células y existe evidencia que IGF-IR está involucrado, en transformación maligna de células y por lo tanto es un objetivo útil para el desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento de cáncer (Adams, T-.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063). Anticuerpos anti-IGF-lR ejemplares, sus secuencias de codificación y métodos de producción, se reportan en WO 2004/087756, WO 2007/045456, y O 2007/115814.

Para la purificación de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina, que se han producido por ejemplo por métodos de cultivo celular, en general iuná combinación de diferentes etapas de cromatografía se emplea.

Normalmente, una cromatografía de afinidad de proteína A es seguida por una o dos etapas de separación adicionales. En una modalidad, las etapas de cromatografía adicionales son una etapa de cromatografía de intercambio de cationes y de aniones o vice versa. La etapa de purificación final es una1 así denomina "etapa de pulido" para la eliminación de! impurezas en trazas e inmunoglobulinas agregadas tipo, contaminantes, proteína de célula hospedera (HCP = host cell protein) residual, ADN (ácido nucleico de célula hospedera),' viru o endotoxinas. En una modalidad, la etapa de, purificación final es una cromatografía de intercambio dei aniones en modo de flujo pasante.

Se ha encontrado que material de cromatografía de ' intercambio de cationes débiles multimodal puede utilizarse como una primera etapa en un método de purificación por cromatografía en columna directamente con sobrenadante dé cultivo celular crudo en lugar de la cromatografía de afinidad de proteína A comúnmente empleada. , Un aspecto aquí reportado es un método para producir anticuerpo anti-IGF-lR que comprende las siguientes etapas : a) aplicar un sobrenadante de cultivo de células de mamífero crudas a un material de cromatografía ¡ de intercambio de cationes débiles multimodal, b) recuperar el anticuerpo anti-IGF-lR al aplicar una solución amortiguada que comprende etilen glicol y .una sal inorgánica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal y de esta manera producir1 uri anticuerpo anti-IGF-lR.

Para el método aquí reportado, no se requiere pre-acondicionamiento del sobrenadante de cultivo crudo. Esto fue sorprendente ya que para sobrenadantes de cultivo que se obtienen, en donde un anticuerpo diferente se ha producido, al menos una reducción de la conductividad se requiere para permitir captura del anticuerpo directamente del sobrenadante de cultivo. En forma adicional, la captura del anticuerpo anti-IGF-lR del sobrenadante de cultivo celular crudo casi es cuantitativa. Como las condiciones generalmente aplicables para la recuperación de polipéptidos de materiales de cromatografía de intercambio de cationes y las condiciones para ligar por interacciones hidrofóbicas al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal dirigen a condiciones novedosas dirigidas opuestas para la recuperación de un anticuerpo del material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal se requirieron. i ' En una modalidad, el método comprende la siguiente etapa adicional a-1) antes de la etapa a): , a-1) aplicar una solución amortiguada que comprende una sal inorgánica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal. j En otra modalidad, el método comprende la siguienté Í etapa adicional a-b) después de la etapa de a) y antes de la etapa b) : , a-b) aplicar una solución amortiguada al material de cromatografía de intercambio de cationes débílES multimodal, con lo que el anticuerpo anti-IGF-lR no sé i recupera del material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal.

En una modalidad adicional, la etapa a-b) comprende dos etapas a-bl) y a-b2) : a-bl) aplicar una solución amortiguada qué comprende una sal inorgánica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal, y i I a-b2) aplicar una solución amortiguada que comprende un desnaturalizante al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal, en donde el anticuerpo anti-IGF-lR no se recupera del material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal.

También en una modalidad, el desnaturalizante se elige de hidrocloruro de guanidinio, urea y arginina. En una modalidad, la sal inorgánica se elige de cloruro de sodio, cloruro de potasio, y cloruro de amonio. También en una modalidad,, la solución amortiguada en la etapa b) comprende Tris 20 mM a 30 mM, cloruro de sodio 1050 mM a 1350 mM, y aproximadamente 20% (p/v) de etilen glicol a un valor de pH desde pH 7.1 a pH 7.3. En una modalidad, la solución amortiguada en la etapa a-1) comprende Tris 20 mM a 30 mM, y cloruro de sodio 80 mM a 120 mM a un valor de pH de pH 7.1 a pH 7.3. En una modalidad adicional, la solución amortiguada en la etapa a-bl) comprende Tris 20 mM a 30 mM, y cloruro de sodio 80 mM a 120 mM a un valor de pH desde pH 7.1 a pH 7.3: En otra modalidad, la solución amortiguada en la etapa a-b2) comprende Tris 110 mM a 140 mM, cloruro de sodio 80 mM a 120 mM, y arginina 30 mM a 40 mM a un valor de pH desde pH 7.1 a pH 7.3. Todavía en otra modalidad, el material , de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal comprende agarosa entrelazada a la cual un¦ grupo funcional de ácido carboxilico, éter, tioéter y aromático que contiene ligando de intercambio de cationes débiles multimodal se enlaza de manera covalente. En una modalidad, un volumen total de cinco volúmenes de columna de la solución amortiguada en la etapa a-1), se aplica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal: En otra modalidad, un volumen total de cinco volúmenes' de columna de la solución amortiguada en la etapa a-bl) se aplica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal. También en una modalidad, un volumen total de diez volúmenes de columna de la solución amortiguada en la etapa a-b2), se aplica al material dé cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal. Todavía en una modalidad, un volumen total de diez volúmenes de columna' de la solución amortiguada en la etapa b) sé aplica al material de cromatografía de intercambio dé cationes débiles multimodal.

Se ha encotrado que los componentes individuales de las soluciones amortiguadas tienen los siguientes efectos: Rendi¬LMWsHMWsPureza miento Sal NaCl 0 + NH4C1 + + etilen 0 0 0 glocol Desnatura -Urea 0 + lizante Arginina- 0 + +: incremento; -: decremento; 0: sin efecto Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan' para ayudar en comprender la presente invención, el alcance real de la cual se establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que pueden hacerse modificaciones en los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención .

Descripción de las Figuras Figura 1 Cromatograma de exclusión de tamaño, analítico del eluato de cromatografía de anticuerpo anti-IGF-' IR en la etapa b) del Ejemplo 1. i Figura 2 Cromatograma de elución del anticuerpo anti-IGF-lR que se obtiene con un método como se reporta aquí' de acuerdo con las condiciones denotadas en el ejemplo Ejemplo 3.

Figura 3 Cromatograma de exclusión de tamaño analítica del eluato de cromatografía de anticuerpo anti-IGF-IR que se obtiene en la etapa b) (a) y para el eluato qué sé obtiene de la etapa a-b2) (b) .

Figura 4 Cromatograma de elución de una aplicación de un sobrenadante de cultivo crudo que comprende anticuerpo anti-IL13R.

Figura 5 Cromatograma de elución de una aplicación de un sobrenadante de cultivo pre acondicionado que comprende un anticuerpo anti-IL13R. ( Ejemplo Materiales y Métodos Si no se indica de otra forma, los métodos diferentes se han realizado de acuerdo con el manual del fabricante del material.

Técnicas de ADN Recombinantes : Métodos estándar se emplearon para manipular ADN como se describe en Sambrook, J. , et al., Molecular cloning:, A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Los reactivos biológicos; moleculares se emplearon de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Determinación de proteina: Se determinó concentración de proteina al' determinar la densidad óptica (OD) a 280 nm, con una longitud1 de onda de referencia de 320 nm, utilizando el coeficiente de! extinción molar calculado en base a la secuencia de1 aminoácidos. ? HPLC con Exclusión de Tamaño : La cromatografía se realizó con una columna a Tosoh Haas TSK 3000 SWXL en un sistema ASI-100 HPLC (Dionex, Idstein, Alemania) . Los picos de elución se supervisaron a 280 nm por un detector de matriz de diodos de UV (Dionex) .

Después de disolución de las muestras concentradas a 1 mg/ml, la columna se lavó con amortiguador que consiste de fosfato dihidrógeno de potasio 200 mM y cloruro de potasio 250 mM pH 7.0 hasta que se logra una línea de referencia estable. Las corridas de análisis se realizan bajo condiciones isocráticas utilizando un gasto de flujo de 0.5 ml/min, durante1 30 minutos a temperatura ambiente. Los cromatogramas : se integraron manualmente con Chromeleon (Dionex, Idstein; Alemania) . : HPLC de Fase Inversa (RP-HPLC) : , La pureza se analiza por RP-HPLC. El ensayo, se realiza en una columna Poroshell utilizando un gradiente de acetonitrilo/TFA acuoso. El perfil de elución se supervisa como absorbencia de UV a 215 nm. Los porcentajes de las substancias eluídas se calculan con base en el área pico total de las proteínas eluídas.

Sistema de-umbral-AD : ver Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403 Determinación de proteina de células hospederas : Las paredes de los pozos de una placa de micro titulación se revisten con una mezcla de albúmina de suero y Estreptavidina . Un anticuerpo policlonal derivado de cabra contra HCP se liga a las paredes de los pozos de la placa de micro titulación. Después de una etapa de lavado, diferentes pozos de la placa de micro titulación se incuban con una secuencia de calibración de HCP de diferentes concentraciones y solución de muestra. Después de la incubación, material de muestra no ligado se retira al . lavar con solución amortiguadora. Para la detección los pozos se incuban con un conjugado de peroxidasa de anticuerpo para detectar proteina de célula hospedera ligada. La actividad de peroxidasa fija se detecta por incubación con ABTS y detección a 405 nm.

Ejemplo 1 Cromatografía de un anticuerpo anti-IGF-lR con un método como se reporta aquí en el material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal CaptoMR MMC La cromatografía se realiza con los siguientes parámetros: Resina: Capto1111 MMC diámetro de columna: 1 cm altura de lecho: 1 .6 cm solución aplicada: sobrenadante de cultivo celular crudo carga: 30 mg anticuerpo por mi i de material etapa a-1) Tris-HCl 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7.1 etapa a-bl) Tris-HCl 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7.1 etapa b) Tris-HCl 25 mM, NaCl 1200 mM, etilen glicol 20% (p/v) , pH 7.2 método de elución: etapa de elución ! gasto de flujo: 250 cm/h ! El cromatograma de exclusión de tamaño analítica del anticuerpo obtenido se ilustra en la Figura 1.

Ejemplo 2 Cromatografías comparativas al Ejemplo 1 de un anticuerpo anti-IGF-lR con condiciones diferentes del método I como se reporta aquí en el material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal Capto1411 MMC La cromatografía se realizo con los siguientes parámetros : resina : Capto MMC diámetro de columna: 1 cm altura de lecho: 14.6 cm , i solución aplicada: sobrenadante de cultivo celular crudo carga : 30 mg anticuerpo por mi de material etapa a-1) Tris-HCl 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7.1 etapa a-bl) Tris-HCl 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7.1 etapa b) variable - ver tabla siguiente método de elución: etapa de elución gasto de flujo: 250 cm/h De la tabla presentada a continuación, puede verse que con condiciones ligeramente diferentes de la etapa b) ,; la I purificación puede hacerse menos efectiva.

Ejemplo 3 Cromatografía de anticuerpo anti-IGF-lR con un método como se reporta aquí en un material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal Capto1*1* MMC La cromatografía se realizó con los siguientes parámetros: ; resina: Capto1® MMC diámetro de columna 1 cm altura de lecho: 14.6 cm ; solución aplicada: sobrenadante de cultivo i celular crudo carga : 30 mg anticuerpo por mi de material etapa a-1) Tris-HCl 25 mM, NaCl 100 mM, pH 7.1 etapa a-bl) Tris-HCl 25 mM, NaCl 100 mM, pH etapa a-b2] Tris-HCl 125 mM, NaCl 100 mM, 38 mM arginina, pH 8.7 etapa b) Tris-HCl 25 mM, NaCl 1200 mM, etilen glicol al 20% (p/v) , pH 7.2 ¡ método de elución etapa de elución gasto de flujo: 250 cm/h El correspondiente diagrama de elución se ilustra en la Figura 2 y la cromatograma de exclusión de tamaño analítico para la etapa b) en la Figura 3a y para la etapa a- b2) en la Figura 3b) . i Ejemplo 4 Cromatografías comparativas al Ejemplo 3 de un anticuerpo anti-IGF-IR con condiciones diferentes del método como se reporta aquí en el material de cromatogafía de intercambio de cationes débiles multimodal Capto*1* MMC La cromatografía se realiza con los siguientes1 parámetros: resina: Capto*® MMC column diameter: 1 cm altura de lecho: 14.6 cm solución aplicada: sobrenadante de cultivo celular crudo carga : 30 mg anticuerpo por mi de material etapa a-1) 25 itiM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1 . etapa a-bl) 25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.1 etapa a-b2) variable - ver tabla a continuación etapa b) 25 mM Tris-HCl, 1200 mM NaCl, etilen glicol al 20% (p/v) , pH 7.2 método de elución: etapa de elución gasto de flujo: 250 cm/h De la tabla presentada a continuación puede verse que con condiciones ligeramente diferentes de la etapa b) , la purificación puede hacerse menos efectiva.

Ejemplo 5 i Ejemplo comparativo un anticuerpo anti-IL13R sin pre-acondicionamiento del sobrenadante de cultivo crudo .

La cromatografía se realizó con los siguientes parámetros: resina: Capto1411 MMC diámetro de columna: 1 cm altura de lecho: 10 cm i solución aplicada:. sobrenadante de cultivo 1 celular crudo ' carga 21 mg anticuerpo por mi de material : etapa fosfato de potasio 70 mM, pH 7.3, 10.9 mS/cm : etapa fosfato de potasio 70 mM, pH 7.3, 10.9 mS/cm etapa b) KC1 1M, pH 3.0, 105.6 mS/cm método de elución: etapa de elución gasto de flujo: 150 cm/h ¦ 88% del anticuerpo aplicado no se liga al material de cromatografía y se encuentra en el flujo pasante (Figura 4). , , Ejemplo 6 Ejemplo comparativo un anticuerpo anti-IL13R con pre-acondicionamiento del sobrenadante de cultivo crudo.

La cromatografía se realiza con los siguientes parámetros: 1 resina: Capto141* MMC diamétro de columna: 1 cm ' altura de lecho: 11 cm solución aplicada: sobrenadante' de cultivo cellular ajustado a 1.4 mS/cm carga: 20 mg anticuerpo por mi de material etapa a-1) fosfato de potasio 10 mM, pH 6.5, 1.4 mS/cm etapa a-b) fosfato de potasio 10 mM, pH 6.5, i 1.4 mS/cm etapa b) fosfato de potasio 100 mM, pH 7.5, 14.9 mS/cm método de elución: gradiente lineal gasto de flujo: 150 cm/h En el cromatograma (Figura 5) puede verse un pico marcado. El anticuerpo obtenido tuvo una pureza de 96.6% con rendimiento de 68%. , I

Claims (11)

REIVINDICACIONES ,

1. Método para producir un anticuerpo anti-IGF-lR1, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) aplicar un sobrenadante de cultivo de células de mamífero crudas a un material de cromatografía de intercambio dé cationes débiles multimodal, b) recuperar el anticuerpo anti-IGF-1R al aplicar una solución amortiguada que compréndé etilen glicol y una sal inorgánica, al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal y de esta manera producir un anticuerpo anti-IGF-lR.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1; 1 caracterizado porque el método comprende la siguiente etapa adicional a-1) antes de la etapa a) : a-1) aplicar una solución amortiguada que comprende una sal inorgánica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal.

3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el método comprende la siguiente etapas adicional a-b) después de la etapa a) y antes de la etapa b) : a-b) aplicar una solución amortiguada al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal, con lo que el anticuerpo anti-, IGF-1R no se recupera del material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la etapa a-b) comprende dos etapas a-bl) y a-b2): a-bl) aplicar una solución amortiguada que comprende una sal inorgánica al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal, y a-b2) aplicar una solución amortiguada que comprende un desnaturalizante, al material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal, con lo que el anticuerpo anti-IGF-lR no se recupera del material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el desnaturalizante se elige de hidrocloruro de guanidinio, y urea.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la sal inorgánica se elige de cloruro de sodio, cloruro de potasio, y cloruro de amonio.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la solución amortiguada en la etapa b) comprende Tris 20 mM a 30 mM, cloruro de sodio 1050 mM a 1350 mM, y aproximadamente, etilen glicol al 20% (p/v) a un valor de pH de pH 7.1 a pH 7.3.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque la solución amortiguada en la etapa a-1) comprende Tris 20 mM a 30 mM, y cloruro de sodio 80 mM a 120 mM a un valor de pH desde pH 7.1 a pH 7.3.

9. El método de conformidad con cualquiera de las I reivindicaciones 4 a 8, caracterizado porque la solución1 amortiguada en la etapa a-bl) comprende Tris 20 mM a 30 mM, y cloruro de sodio 80 mM a 120 mM a un valor de pH desde pH 7.1 a pH 7.3. i

10. El método de conformidad con cualquiera de las, reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque la solución, amortiguada en la etapa a-b2) comprende Tris 110 mM a 140 mM,' cloruro de sodio 80 mM a 120 mM, y arginina 30 mM a 40 mM a> un valor de pH desde pH 7.1 a pH 7.3.

11. El método de conformidad con cualquiera de las' reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el' material de cromatografía de intercambio de cationes débiles multimodal comprende agarosa entrelazada a la cual un grupo funcional de ácido carboxílico, éter, tioéter y aromático que contiene ligando de intercambio de cationes débiles multimodal se enlaza covalentemente .