JP5448825B2 - 非凝集抗体Fcドメインの製造方法 - Google Patents
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本明細で引用される限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全刊行物は、引用することによりあたかも完全に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
って、例えば、「1ペプチド鎖」への言及は1若しくはそれ以上のペプチド鎖への言及であり、そして当業者に既知のその同等物を包含する。
(M−L−V2−H−CH2−CH3)(t)
(I)
ここでMは生物活性ペプチド鎖であり、Lはペプチド鎖リンカーであり、V2は免疫グロブリン可変領域のC末端の一部分であり、Hは免疫グロブリン可変ヒンジ領域ペプチド鎖の一部分であり、CH2は免疫グロブリンH鎖CH2定常領域ペプチド鎖であり、およびCH3は免疫グロブリンH鎖CH3定常領域ペプチド鎖であり、ならびにtは4未満若しくはこれに等しい整数である、
を含んでなるペプチド鎖を意味している。ミメティボディのCH2−CH3部分は抗体Fcドメインの一部分を含んでなり、そしてプロテインAにより結合され得るFcペプチド
鎖である。ミメティボディ分子はFcドメインを含んでなるペプチド鎖の一属を代表する。Fcペプチド鎖のこの属は、例えばFcドメインを含んでなる抗体分子、Fcドメインを含んでなるFc融合ペプチド鎖、およびFcドメインを含んでなるミメティボディペプチド鎖を包含する(図1)。
態で含み得る(図1)が、しかし4本以上の個別のFcペプチド鎖をその凝集形態で含むことができる。
1mlあたりおよそ30mgのヒトIgG抗体の動的結合能力を有する。動的結合能力は、20cmの床高をもつカラム中で500cm/hの移動相速度での前端分析により10%破過で測定される。Mabselect SuRe(R)(GE Healthcare UK Ltd.、英国バーミンガムシャー州リトル・シャルフォント)はこうした形式の別の例である。Mabselect SuRe(R)プロテインAクロマトグラフィー樹脂はMabselect(R)に本質的に同一であるが、しかし塩基性pHを耐えるプロテインAペプチド鎖分子に複合されている。他の形式は、プレート若しくはキャピラリーとして供給される不溶性物質にプロテインA分子の集団が直接若しくは間接的に結合されているプレートおよびキャピラリーの形式である。当業者は、不溶性物質に結合されたプロテインAペプチド鎖の集団を提供するのに適する他の形式およびガラス、金属若しくは有機ポリマーのような不溶性物質を認識するであろう。
l Institute 1640(RPMI−1640)細胞培地は、こうした標準的緩衝真核生物細胞培地組成物の2例である。7.4のpH値のリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)のような他の水性組成物中に存在する凝集および非凝集Fcペプチドもまた、プロテインA複合物質に結合することができる。
の塩濃度および3.24ないし3.93のpHを有する水性溶液とのプロテインAペプチド鎖の集団の他の接触方法を認識するであろう。
た非凝集ミメティボディFcペプチド鎖の溶液の製造方法であり;ミメティボディFcペプチド鎖の総パーセント収率は70%以上である。
プロテインAクロマトグラフィーは、特定の溶離条件を使用する場合に抗体Fcドメイン(Fcペプチド鎖)を含んでなる凝集および非凝集ペプチド鎖を分離するのに使用し得る(表1)。
こうしたドメインを特異的に結合する。標準的条件下のプロテインAクロマトグラフィーは、双方の分類の分子がFcドメインを含んでなるために、凝集Fcペプチド鎖および非凝集Fcペプチド鎖双方の精製された混合物を生じる。結果、本発明において、プロテインAクロマトグラフィーカラムに負荷された混合物中に双方の分類のペプチド鎖が存在する場合に凝集Fcペプチド鎖から非凝集Fcペプチド鎖を分離し得るプロテインAクロマトグラフィーカラム溶離条件の選択(表1)は、当該技術分野で教示若しくは示唆されなかった。
(M−L−V2−H−CH2−CH3)(t)
(I)
ここで、Mはエリスロポエチン受容体結合分子であり、tは4未満若しくはそれに等しい整数であり、そして他の構成要素は上で定義されたとおりである
を有する。C1374C細胞により発現されるミメティボディのCH2−CH3部分は抗体Fcドメインの一部分を含んでなり、そしてプロテインAにより結合され得る。標準的なサイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SE−HPLC)分析は、C1374C細胞培養物上清が、Fcドメインを欠く他のペプチド鎖に加えて高分子量Fcドメインを含んでなるミメティボディ凝集物(例えばt>4を伴うミメティボディ分子)およびt≦4を伴う非凝集Fcドメインを含んでなるミメティボディ分子双方を含有する(表1)ことを示す。所望の非凝集ミメティボディ産物分子は一般式(M−L−V2−H−CH2−CH3)の4本のペプチド鎖よりなる。
法を使用して測定した。
プロテインAクロマトグラフィーカラムからの溶離後に回収されるFcペプチド鎖の質量での総パーセント収率は、溶離緩衝液トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩濃度およびpHの関数である(表2および図2)。
プチド鎖および凝集Fcペプチド鎖の質量パーセンテージを表す。総パーセント収率値はプロテインAクロマトグラフィーカラムからの溶離後の非凝集Fcペプチドおよび凝集Fcペプチド鎖分子双方の効率的回収の尺度である。これらの実験について、C1374C細胞培養、上清収集、プロテインAクロマトグラフィーカラム調製、カラム平衡化および上清負荷は上で実施例1に記述されたとおり実施した。クロマトグラフィーは19℃と25℃の間の温度で実施した。カラム中の樹脂は、測定されたA280nm値が基礎値に戻るまでpH7.4の50mM NaH2PO4および150mM NaClを含有する溶液で初回洗浄した。カラムをその後、pH5.0の100mMトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩(NH2C(CH2OH)3・CH3COOH;(JT Baker、ニュージャージー州フィリップスバーグ)の溶液で第二回洗浄した。プロテインAクロマトグラフィーカラム樹脂に結合されたペプチド鎖は、各個別のプロテインAクロマトグラフィー実験で、表2に示される濃度およびpH値のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩(NH2C(CH2OH)3・CH3COOH;(JT Baker、ニュージャージー州フィリップスバーグ)の溶液で溶離した。溶離緩衝液の塩濃度およびpH値は双方とも各個別の実験で変動した。サンプル中のタンパク質濃度および凝集Fcペプチド鎖含量は、上で実施例1に記述されたところの標準的SE−HPLC法を使用して測定した。
TotalPercentYield(x,y)=−0.676x+0.209xy−62.4y+295.747
式中
x=トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩濃度;mM
および
y=pH
である。
プロテインAクロマトグラフィーカラム精製後に回収される溶離されたサンプル中の凝集Fcペプチド鎖の質量パーセンテージは、溶離緩衝液トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩濃度およびpHの関数である(表2および図3)。該実験データからのパーセント凝集物値はサンプル中に存在する凝集および非凝集双方の全Fcペプチド鎖の質量での総量に関する溶離後に回収された精製されたサンプル中に存在する凝集Fcペプチド鎖の質量パーセンテージを表す。パーセント凝集物値は、プロテインAクロマトグラフィー後に回収される溶離されたサンプル中の凝集Fcペプチド鎖汚染レベルの尺度である。差別的に述べられれば、パーセント凝集物は回収された溶離されたサンプルの純度の尺度である。
PercentAggregate(x,y)=0.00242x2−0.0213x−0.0819xy−1.576y2+0.551y+29.680
式中
x=トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩濃度;mM
および
y=pH
である。
最適のFcペプチド鎖総パーセント収率およびパーセント凝集物値をもつ溶離液サンプルを得るためのプロテインAクロマトグラフィー溶離緩衝液の塩およびpH値を、数学的
最適化問題解決技術を使用して同定した。
ObjectiveFunction1=[m(TotalPercentYield)×m(PercentAggregate)]1/2
を使用して目的関数値を計算した。計算された目的関数値(z軸)をその後、プロテインAクロマトグラフィー溶離緩衝液トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩濃度(x軸およびpH(y軸)の関数としてプロットした(データは示されない)。標準的多項式曲線当てはめをその後最小二乗法を使用して実施して、プロットしたデータに当てはめた最適化多項式を得た。得られた多項式を”ObjectiveFunction2”等式と呼称した。
bjectiveFunction1値のいくつかは、実験的に決定した総パーセント収率およびパーセント凝集物値を使用して計算した(表2)。プロットした他のObjectiveFunction1値(表3)は、上述された表2のデータ組を当てはめた等式を使用して生成したTotalPercentYieldおよびPercentAggregate値を使用して計算した。表2および表3双方の目的関数値をその後プロットし、そして当てはめたObjectiveFunction2等式を生成するのに使用した。これは、当てはめた多項式を歪ませ得る当てはめたObjectiveFunction2等式を生成するのに使用したデータ組に「ギャップ」が存在しなかったことを確実にするために行った。
ObjectiveFunction2(x,y)=(3.58×10−5)exp[−0.5(0.00171x2−0.1927xy+50.515y2+0.4540x−348.52y+589.487)]
式中
x=トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩濃度;mM
および
y=pH
である。ObjectiveFunction2等式は、69.0mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩濃度および3.58のpHで0.466の極大を有する。
Objectivefunction2等式若しくはそのグラフ表示のいずれかを使用して同定される特定のプロテインAクロマトグラフィー緩衝液の塩濃度およびpH値は、質量で5%未満の凝集物を含んでなる精製されたFcペプチド鎖溶離液サンプルを70%以上のFcペプチド鎖の総パーセント収率で生じることが実験的に確認された(表5)。具体的には、得られた溶離されたサンプルは、84.7%以上のFcペプチドの質量での総パーセント収率(すなわち総パーセント収率値は84.7%以上であった)で質量で2.93%の凝集Fcペプチド鎖(すなわちパーセント凝集物値は2.93%であった)を含有した。
シメチル)アミノメタン酢酸塩を含有する溶離緩衝液でプロテインAクロマトグラフィーカラム樹脂から溶離した。プロテインAクロマトグラフィーカラムをその後、3.0のpHの0.1Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩の溶液でストリップした。サンプル中のタンパク質濃度、凝集Fcペプチド鎖含量および非凝集Fcペプチド鎖含量は、上の実施例1で記述されたところの標準的SE−HPLC法を使用して測定した。
Claims (8)
- a)非凝集Fcペプチド鎖および凝集Fcペプチド鎖を含む水性サンプルを提供する段階;
b)不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Fcペプチド鎖および凝集Fcペプチド鎖の総質量の70%以上を結合することが可能なプロテインAペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階;
c)トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩からなる41mMないし97mMの塩濃度および3.42ないし3.74のpHを有する水性溶液とプロテインAペプチド鎖の該集団を接触させる段階;ならびに
d)プロテインAペプチド鎖の集団との接触物から該水性溶液を除去して、5%未満の凝集Fcペプチド鎖を含む精製された非凝集Fcペプチド鎖の溶液を生じさせる段階
を含んでなり、
Fcペプチド鎖の総パーセント収率が70%以上である、
精製された非凝集Fcペプチド鎖の溶液の製造方法。 - 不溶性物質に結合されたプロテインAペプチド鎖の集団が0.005cmないし0.05cmの理論段値に同等な高さを有する、請求項1に記載の方法。
- 非凝集Fcペプチド鎖がミメティボディである、請求項1に記載の方法。
- a)非凝集Fcペプチド鎖および凝集Fcペプチド鎖を含む水性サンプルを提供する段階;
b)不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集Fcペプチド鎖および凝集Fcペプチド鎖の総質量の70%以上を結合することが可能なプロテインAペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階;
c)トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩からなる55mMないし85mMの塩濃度および3.50ないし3.66のpHを有する水性溶液とプロテインAペプチド鎖の該集団を接触させる段階;ならびに
d)プロテインAペプチド鎖の集団との接触物から該水性溶液を除去して、5%未満の凝集Fcペプチド鎖を含む精製された非凝集Fcペプチド鎖の溶液を生じさせる段階
を含んでなり、
Fcペプチド鎖の総パーセント収率が70%以上である、
精製された非凝集Fcペプチド鎖の溶液の製造方法。 - 不溶性物質に結合されたプロテインAペプチド鎖の集団が0.005cmないし0.05cmの理論段値に同等な高さを有する、請求項4に記載の方法。
- 非凝集Fcペプチド鎖がミメティボディである、請求項4に記載の方法。
- a)非凝集ミメティボディFcペプチド鎖および凝集ミメティボディFcペプチド鎖を含む水性サンプルを提供する段階;
b)不溶性物質に結合されかつサンプル中の非凝集ミメティボディFcペプチド鎖および凝集ミメティボディFcペプチド鎖の総質量の70%以上を結合することが可能なプロテインAペプチド鎖の集団と該サンプルを接触させる段階;
c)トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン酢酸塩からなる55mMないし85mMの塩濃度および3.50ないし3.66のpHを有する水性溶液とプロテインAペプチド鎖の該集団を接触させる段階;ならびに
d)プロテインAペプチド鎖の集団との接触物から該水性溶液を除去して、5%未満の凝集ミメティボディFcペプチド鎖を含む精製された非凝集ミメティボディFcペプチド鎖の溶液を生じさせる段階
を含んでなり、
ミメティボディFcペプチド鎖の総パーセント収率が70%以上である、
精製された非凝集ミメティボディFcペプチド鎖の溶液の製造方法。 - 不溶性物質に結合されたプロテインAペプチド鎖の集団が0.005cmないし0.05cmの理論段値に同等な高さを有する、請求項7に記載の方法。
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