CN114556104A - 用于表征宿主细胞蛋白的方法 - Google Patents

用于表征宿主细胞蛋白的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114556104A
CN114556104A CN202080072528.3A CN202080072528A CN114556104A CN 114556104 A CN114556104 A CN 114556104A CN 202080072528 A CN202080072528 A CN 202080072528A CN 114556104 A CN114556104 A CN 114556104A
Authority
CN
China
Prior art keywords
host cell
protein
characterizing
cell proteins
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080072528.3A
Other languages
English (en)
Inventor
郑晓菁
R·奥布雷恩约翰逊
T·格里尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN114556104A publication Critical patent/CN114556104A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/18—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns
    • B01D15/1864—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns
    • B01D15/1871—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to flow patterns using two or more columns placed in series
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/24—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the treatment of the fractions to be distributed
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B01D15/3809—Affinity chromatography of the antigen-antibody type, e.g. protein A, G, L chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8872—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample impurities

Abstract

提供了用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法。

Description

用于表征宿主细胞蛋白的方法
技术领域
本发明通常涉及表征宿主细胞蛋白。
背景技术
基于蛋白质的生物制药产品已经成为治疗癌症、自身免疫性疾病、感染和心脏代谢紊乱的重要药物，并且所述基于蛋白质的生物制药产品代表了制药行业中增长最快的产品部分之一。将基于蛋白质的生物治疗剂引入临床可能是一项持续数年的任务，其需要在各种研究和开发学科中进行协调努力，所述研究和开发学科包含发现、过程和调配物开发、分析表征以及临床前毒理学和药理学。基于蛋白质的生物制药产品必须达到非常高的纯度标准。因此，在药物开发、生产、储存和处理的不同阶段监测此类生物制药产品中的任何杂质可能都是重要的。
例如，宿主细胞蛋白质(HCP)可以存在于使用基于细胞的系统开发的基于蛋白质的生物制药中。药物产品中HCP的存在需要被监测，并且在超过一定量时可能是不可接受的。用于表征HCP的测定的分析方法应显示出足够的准确性和分辨率。直接分析可能需要分离出足够大量的产物用于测定，这是不期望的并且仅在选定的情况下是可能的。因此，当与相当高浓度的活性药物混合时，确定工作流程和分析测试以表征样品基质中的HCP是具有挑战性的任务。根据前述内容，将理解的是，需要用于在生物制药过程的各个阶段表征和监测HCP的改进方法。
发明内容
开发生物制药产品的关键标准可以是监测产品中的杂质。当这些杂质确实出现时，所述杂质的表征构成生物过程中的重要步骤。
本文公开的示例性实施例通过提供用于表征宿主细胞蛋白的方法来满足上述要求。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与色谱载体接触并且进行分级分离步骤而对所述样品基质中的宿主细胞蛋白进行富集步骤。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
另一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
一方面，所述分级分离步骤可以是基于大小的分级分离、基于疏水性的分级分离、基于电荷的分级分离、基于pI的分级分离、通过液相色谱的分级分离或其组合。在具体方面，通过液相色谱进行的分级分离步骤可以使用反相液相色谱来进行。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
在又另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
在又另一方面，所述方法可以进一步包括使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触并且进行分级分离步骤而对所述样品基质中的宿主细胞蛋白进行富集步骤。一方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。另一方面，所述亲和色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
另一方面，所述分级分离步骤可以是基于大小的分级分离、基于疏水性的分级分离、基于电荷的分级分离、基于pI的分级分离、通过液相色谱的分级分离或其组合。在具体方面，通过液相色谱进行的分级分离步骤可以使用反相液相色谱来进行。
在又另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以进一步包括使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与色谱载体接触、进行分级分离步骤并且使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋而对所述样品基质中的宿主细胞蛋白进行富集步骤。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
另一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
在又另一方面，所述分级分离步骤可以是基于大小的分级分离、基于疏水性的分级分离、基于电荷的分级分离、基于pI的分级分离、通过液相色谱的分级分离或其组合。在具体方面，通过液相色谱进行的分级分离步骤可以使用反相液相色谱来进行。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
在又另一方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。另一方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，所述液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触、进行分级分离步骤并且使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋而对所述样品基质中的宿主细胞蛋白进行富集步骤。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述亲和色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
在又另一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
一方面，所述分级分离步骤可以是基于大小的分级分离、基于疏水性的分级分离、基于电荷的分级分离、基于pI的分级分离、通过液相色谱的分级分离或其组合。在具体方面，通过液相色谱进行的分级分离步骤可以使用反相液相色谱来进行。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
在又另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。另一方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与色谱载体接触、进行分级分离步骤并且使用高场非对称波形离子迁移率谱(High-Field Asymmetric Waveform Ion Mobility Spectrometry)表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋而对所述样品基质中的宿主细胞蛋白进行富集步骤。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
在又另一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
一方面，所述分级分离步骤可以是基于大小的分级分离、基于疏水性的分级分离、基于电荷的分级分离、基于pI的分级分离、通过液相色谱的分级分离或其组合。在具体方面，通过液相色谱进行的分级分离步骤可以使用反相液相色谱来进行。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
在又另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触、进行分级分离步骤并且使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋而对所述样品基质中的宿主细胞蛋白进行富集步骤。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述亲和色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
另一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
另一方面，所述分级分离步骤可以是基于大小的分级分离、基于疏水性的分级分离、基于电荷的分级分离、基于pI的分级分离、通过液相色谱的分级分离或其组合。在具体方面，通过液相色谱进行的分级分离步骤可以使用反相液相色谱来进行。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征具有所关注蛋白质的样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触、用洗涤缓冲液洗涤所述亲和色谱载体并收集流通物；并且进行分级分离步骤而对所述样品基质中的宿主细胞蛋白进行富集步骤。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述亲和色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
一方面，所述分级分离步骤可以是基于大小的分级分离、基于疏水性的分级分离、基于电荷的分级分离、基于pI的分级分离、通过液相色谱的分级分离或其组合。在具体方面，通过液相色谱进行的分级分离步骤可以使用反相液相色谱来进行。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括所述富集步骤而不包括所述分级分离步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括所述分级分离步骤而不包括所述富集步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述流通物可以具有比所述样品基质减少的量的所关注蛋白质。
另一方面，所述方法可以进一步包括使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在具体方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。在另一具体方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，所述液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一个具体方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。另一方面，所述方法可以进一步包括使用高场非对称波形离子迁移率谱(FAIMS)装置表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋。另一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在另一具体方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置结合LC和MS来表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)使具有宿主细胞蛋白的所述样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；以及(b)通过使所述混合物与色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
另一方面，所述方法可以进一步包括使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在具体方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。在另一具体方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一个具体方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。另一方面，所述方法可以进一步包括使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。另一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在另一具体方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置结合LC和MS来表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)而不包括步骤(b)的方法多至少约500％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)而不包括步骤(b)的方法多至少约100％到约1000％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)使具有宿主细胞蛋白的所述样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；以及(b)通过使所述混合物与亲和色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白。一方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
另一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
在又另一方面，所述方法可以进一步包括使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在具体方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。在另一具体方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，所述液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一个具体方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。另一方面，所述方法可以进一步包括使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。另一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在另一具体方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置结合LC和MS来表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)而不包括步骤(b)的方法多至少约500％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)而不包括步骤(b)的方法多至少约100％到约1000％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)使具有宿主细胞蛋白的所述样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；(b)通过使所述混合物与色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及(c)使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。在另一具体方面，所述亲和色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在又另一个具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括从所述亲和色谱载体收集流通物。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
另一方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。另一方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。
在又另一方面，所述方法可以进一步包括使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。另一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在另一具体方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置结合LC和MS来表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)而不包括步骤(b)的方法多至少约500％的宿主细胞蛋白。
另一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)而不包括步骤(b)的方法多至少约100％到约1000％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)使具有宿主细胞蛋白的所述样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；(b)通过使所述混合物与亲和色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及(c)使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。一方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述亲和色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
另一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
在又另一方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。另一方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，所述液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。另一方面，所述方法可以进一步包括使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。另一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在另一具体方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置结合LC和MS来表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)而不包括步骤(b)的方法多至少约500％的宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)而不包括步骤(b)的方法多至少约100％到约1000％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白以及使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
一方面，与不包括高场非对称波形离子迁移率谱的方法相比，所述方法可以能够表征多至少约30％的宿主细胞蛋白。
另一方面，与不包括高场非对称波形离子迁移率谱的方法相比，所述方法可以能够表征多至少约30％到约75％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白以及使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋。一方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述亲和色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
一方面，与不包括高场非对称波形离子迁移率谱的方法相比，所述方法可以能够表征多至少约30％的宿主细胞蛋白。
另一方面，与不包括高场非对称波形离子迁移率谱的方法相比，所述方法可以能够表征多至少约30％到约75％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)使具有宿主细胞蛋白的所述样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；(b)通过使所述混合物与色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及(c)使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。在具体方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
另一方面，所述方法可以进一步包括使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在具体方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。在另一具体方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，所述液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一个具体方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。另一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在另一具体方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置结合LC和MS来表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)和(b)但不包括步骤(c)的方法多至少约15％的宿主细胞蛋白。
在又另一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)和(b)但不包括步骤(c)的方法多至少约15％到约60％的宿主细胞蛋白。
在一个示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)使具有宿主细胞蛋白的所述样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；(b)通过使所述混合物与亲和色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及(c)使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。一方面，所述亲和色谱载体可以是蛋白A色谱载体。一方面，所述色谱载体可以包括蛋白A或蛋白G。在具体方面，所述蛋白A或所述蛋白G可以固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集流通物。另一方面，所述富集步骤可以进一步包括用洗脱缓冲液洗涤所述色谱载体并且收集洗脱级分。
另一方面，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加还原剂。一方面，所述处理可以包含向所述样品中添加烷基化剂。另一方面，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
一方面，所述样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。在具体方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
另一方面，所述方法可以进一步包括使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在具体方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。在另一具体方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。在其中的一方面，所述液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统。在又另一个具体方面，所述质谱仪可以是与液相色谱系统联用的串联质谱仪。另一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。在另一具体方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置结合LC和MS来表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)和(b)但不包括步骤(c)的方法多至少约15％的宿主细胞蛋白。
在又另一方面，所述方法可以能够表征比包括步骤(a)和(b)但不包括步骤(c)的方法多至少约15％到约60％的宿主细胞蛋白。
当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内，可以进行许多替换、修改、添加或重新布置。
附图说明
图1示出了通过不使用蛋白A色谱和使用蛋白A色谱的方法表征的样品基质中的蛋白质和独特肽的数量，连同根据示例性实施例实施的方法的再现性统计。
图2示出了根据示例性实施例实施的分级分离步骤的方案。
图3示出了通过不使用分级分离步骤和使用分级分离步骤的方法表征的样品基质中的蛋白质和独特肽的数量，连同根据示例性实施例实施的方法的再现性统计。
图4示出了通过使用蛋白A色谱步骤的方法和使用蛋白A色谱步骤和分级分离步骤的方法表征的样品基质中的蛋白质和独特肽的数量，连同根据示例性实施例实施的方法的再现性统计。
图5示出了通过其中进行蛋白质正常消化的方法和其中进行蛋白质天然消化的方法表征的样品基质中的蛋白质和独特肽的数量，连同根据示例性实施例实施的方法的再现性统计。
图6示出了通过不使用蛋白A色谱的方法和使用蛋白A色谱的方法表征的经受天然条件的样品基质中的蛋白质和独特肽的数量，连同根据示例性实施例实施的方法的再现性统计。
图7示出了通过不使用FAIMS装置的方法和使用FAIMS装置的方法表征的样品基质中的蛋白质和独特肽的数量，连同根据示例性实施例实施的方法的再现性统计。
图8示出了通过包括蛋白A色谱的不使用FAIMS装置和使用FAIMS装置的方法表征的样品基质中的蛋白质和独特肽的数量，连同根据示例性实施例实施的方法的再现性统计。
图9示出了根据以下的示例性实施例的在分析中检测到的HCP的数量和重叠：(A)天然对正常消化物；(B)正常对蛋白A耗竭的消化物；(C)天然对蛋白A耗竭的天然消化物；(D)使用和不使用FAIMS的蛋白A耗竭的天然消化物；以及(E)优化方法对所报告的HCP。所有经鉴定的蛋白质具有2+独特肽，其具有1％肽FDR和5％蛋白质FDR。
图10示出了根据示例性实施例进行的使用和不使用FAIMS的样品运行：(A)使用FAIMS(蓝色、红色和绿色)和不使用FAIMS(灰色)的样品运行的基峰色谱图，其中插图示出了HCP肽的DS干扰；(B)“揭示的”HCP肽的片段化光谱。肽序列包含K.KLEELDLDEQQR.K(SEQID NO：1)、K.VYACEVTHQGLSSPVTK.S(SEQ ID NO：2)和KLEELDLDEQQR(SEQ ID NO：3)。
图11示出了根据示例性实施例尝试的方法的所有组合在复制运行中检测到的HCP的数量和重叠。所有经鉴定的蛋白质具有2+独特肽，其具有1％肽FDR和5％蛋白质FDR。
图12示出了与所有其它方法(B-H)相比，在使用FAIMS(A)的蛋白A耗竭的天然消化物样品中检测到的HCP的数量和重叠。所有经鉴定的蛋白质具有2种或更多种独特肽，其具有1％肽FDR和5％蛋白FDR。
图13示出了示例性实施例的工作流程。
具体实施方式
宿主细胞蛋白(HCP)是一类必须从所有细胞源性蛋白治疗剂中去除的杂质。在这些治疗性蛋白质的基于细胞的生产期间，最终的基于蛋白质的药物产品必须被高度纯化，使得来自细胞的杂质在临床使用之前处于可接受的低水平。需要监测杂质，具体地源自哺乳动物表达系统(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)的宿主细胞蛋白(HCP)。最终药物物质中的总HCP水平的通用指南少于100ppm(John H.Chon和Gregory Zarbis-Papastoitsis，抗体的生产和下游加工的进展(Advances in the production and downstream processingof antibodies)，28，《新生物技术(NEW BIOTECHNOLOGY)》458-463(2011))。HCP是关于患者安全性和药物功效两者的问题。参见Leslie C.Eaton，用于重组生物制药的宿主细胞污染蛋白测定开发(Host cell contaminant protein assay development for recombinantbiopharmaceuticals)，705《色谱杂志A(JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A)》105-114(1995)；Xing Wang、Alan K.Hunter和Ned M.Mozier，在生物制剂开发中的宿主细胞蛋白：鉴定、定量和风险评估(Host cell proteins in biologics development：Identification，quantitation and risk assessment)，103《生物技术与生物工程(BIOTECHNOLOGY ANDBIOENGINEERING)》446-458(2009)；以及Christina L.Zuch De Zafra等人，生物技术源性产品中的宿主细胞蛋白：风险评估框架(Host cell proteins in biotechnology-derivedproducts：A risk assessment framework)，112《生物技术与生物工程》2284-2291(2015)。虽然HCP水平低于100ppm通常被认为是可接受的，但是与特定污染物相关的风险应该单独评估并且可能需要甚至更低的检测限(Daniel G.Bracewell、Richard Francis和C.MarkSmales，在过程开发和制造期间宿主细胞蛋白(HCP)鉴定的未来与其对照的基于风险的管理相关(The future of host cell protein(HCP)identification during processdevelopment and manufacturing linked to a risk-based management for theircontrol)，112《生物技术与生物工程》1727-1737(2015)；Tanja Wolter和AndreasRichter，用于控制生物制药中的宿主细胞杂质的测定(Assays for controlling host-cell impurities in biopharmaceuticals)，40《国际生物过程杂志(BIOPROCESSINTERNATIONAL)》40-46(2005)。
许多报道的病例描述了由于HCP活性引起的治疗性蛋白质或稳定剂的降解(NitinDixit等人，残留的宿主细胞蛋白促进硫酸酯酶药物产品中的聚山梨醇酯20降解，从而产生游离脂肪酸颗粒(Residual Host Cell Protein Promotes Polysorbate 20 Degradationin a Sulfatase Drug Product Leading to Free Fatty Acid Particles)，105《药物科学杂志(JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES)》1657-1666(2016)；Troii Hall等人，在单克隆抗体调配物中通过第XV组溶酶体磷脂酶A2异构体X1降解聚山梨醇酯20和80(Polysorbates 20 and 80 Degradation by Group XV Lysosomal Phospholipase A2Isomer X1 in Monoclonal Antibody Formulations)，105《药物科学杂志》1633-1642；Sharon X.Gao等人，归因于残留CHO细胞蛋白酶活性的高度纯化的单克隆抗体的片段化(Fragmentation of a highly purified monoclonal antibody attributed toresidual CHO cell protease activity)，108《生物技术与生物工程》977-982(2010)；Deepti Ahluwalia等人，治疗性蛋白质中的宿主细胞蛋白杂质的鉴定P1(Identificationof a host cell protein impurity in therapeutic protein，P1)，141《药物和生物医学分析杂志》32-38(2017)；Amareth Lim等人，《来自CHO无细胞培养基的组织蛋白酶D蛋白酶的表征及其对重组治疗性蛋白质的稳定性的影响的减轻》，34《生物技术进展(BIOTECHNOLOGY PROGRESS)》120-129(2017))。
FDA未规定HCP的最大可接受水平，但最终药物产品中的HCP浓度必须得到控制并且在批次之间是可再现的(FDA，1999)。然而，即使当总HCP杂质以低水平存在于药物物质中时，痕量的HCP可能对于可能引起免疫应答、注射后有毒性或生物活性的某些特定HCP是不可接受的(J.R.Bierich，用生物合成生长激素治疗垂体性侏儒症(Treatment ofPituitary Dwarfism with Biosynthetic Growth Hormone)，75《儿科学报(ACTAPAEDIATRICA)》13-18(1986)；T.Romer等人，《新的即用型重组人生长激素溶液的功效和安全性》，30《内分泌研究杂志(JOURNAL OF ENDOCRINOLOGICAL INVESTIGATION)》578-589(2007)；Daniel G.Bracewell、Richard Francis和C.Mark Smales，在过程开发和制造期间宿主细胞蛋白(HCP)鉴定的未来与其对照的基于风险的管理相关，112《生物技术与生物工程》1727-1737(2015)；Saloumeh Kadkhodayan Fischer等人，对磷脂酶B样2蛋白，来瑞组单抗临床材料中的宿主细胞杂质的特异性免疫应答(Specific Immune Response toPhospholipase B-Like 2 Protein，a Host Cell Impurity in Lebrikizumab ClinicalMaterial)，19《AAPS杂志(THE AAPS JOURNAL)》254-263(2016)；Andres H.Gutiérrez、Leonard Moise和Annie S.De Groot，关于仓鼠和人(Of[hamsters]and men)，8《人疫苗与免疫疗法(HUMAN VACCINES&IMMUNOTHERAPEUTICS)》1172-1174(2012)；Vibha Jawa等人，评估归因于基于抗体的生物治疗剂中的宿主细胞蛋白杂质的免疫原性风险(EvaluatingImmunogenicity Risk Due to Host Cell Protein Impurities in Antibody-BasedBiotherapeutics)，18《AAPS杂志》1439-1452(2016)；Naghmeh Abiri等人，OsrHSA的残留宿主细胞蛋白杂质的免疫原性的评估(Assessment of the immunogenicity of residualhost cellprotein impurities of OsrHSA)，13《公共科学图书馆·综合(PLOS ONE)》(2018))。如果HCP具有降解抗体的效力或改变抗体结合效力，也可能是不可容忍的(NitinDixit等人，残留的宿主细胞蛋白促进硫酸酯酶药物产品中的聚山梨醇酯20降解，从而产生游离脂肪酸颗粒，105《药物科学杂志》1657-1666(2016)；Troii Hall等人，在单克隆抗体调配物中通过第XV组溶酶体磷脂酶A2异构体X1降解聚山梨醇酯20和80，105《药物科学杂志》1633-1642)。因此，可能期望具有能够单独监测所有HCP组分的方法。
传统上，使用多克隆抗HCP抗体的酶联免疫吸附测定(ELISA)已经用来定量总体HCP丰度(Denise C.Krawitz等人，蛋白质组学研究支持使用多产物免疫测定来监测宿主细胞蛋白杂质(Proteomic studies support the use of multi-product immunoassays tomonitor host cellprotein impurities)，6《蛋白质组学(PROTEOMICS)》94-110(2006)；Catherine Em Hogwood、Daniel G Bracewell和C Mark Smales，重组CHO细胞中的宿主细胞蛋白动力学(Host cell protein dynamics in recombinant CHO cells)，4《生物工程(BIOENGINEERED)》288-291(2013)；Anne Luise Tscheliessnig等人，治疗性蛋白质生物加工中的宿主细胞蛋白分析-方法和应用(Host cell protein analysis in therapeuticprotein bioprocessing-methods and applications)，8《生物技术杂志(BIOTECHNOLOGYJOURNAL)》655-670(2013))。考虑到对单个HCP组分的测量的需求，ELISA可能不是用于评估HCP水平的最终解决方案。另外，一些弱免疫原性或非免疫原性HCP可能不产生用于ELISA检测的抗体，因此无法检测到这些HCP。虽然ELISA可用作过程中控制和释放测试，但其具有若干重要的限制，包含：仅测量总HCP水平、无法检测新的污染源以及对更多免疫原性蛋白质的偏倚(Wang，Daisy Richardson和Mohammed Shameem，宿主细胞蛋白测量和控制(Host-cell protein measurement and control)，28《国际生物过程杂志》32-38(2015)；JudithZhu-Shimoni等人，通过ELISA进行的宿主细胞蛋白测试和正交方法的使用(Host cellprotein testing by ELISAs and the use of orthogonal methods)，111《生物技术与生物工程》2367-2379(2014))。另一个复杂情况是ELISA通常依赖于从缺乏治疗性蛋白(无效菌株)的细胞系产生的抗原，所述细胞系的HCP谱可能与生产菌株的HCP谱基本上不同。另外，与治疗性蛋白质共纯化的HCP中有许多可以表现出非线性应答(参见Nabila Aboulaich等人，监测与单克隆抗体相关的宿主细胞蛋白的清除的新方法(Anovel approach tomonitor clearance of host cell proteins associated with monoclonalantibodies)，30《生物技术进展》1114-1124(2014)；Nicholas E.Levy等人，单克隆抗体生物加工中的宿主细胞蛋白产物相关杂质的鉴定和表征(Identification andcharacterization of host cell protein product-associated impurities inmonoclonal antibody bioprocessing)，111《生物技术与生物工程》904-912(2013)；Nicholas E.Levy等人，用于单克隆抗体纯化的色谱抛光步骤中的宿主细胞蛋白杂质(Hostcell protein impurities in chromatographic polishing steps for monoclonalantibody purification)，113《生物技术与生物工程》1260-1272(2015))。如果样品中的HCP浓度远高于无效菌株，并且不存在能够识别无效菌株的足够抗体，这可能潜在地导致对污染物的低估。此外，并非所有HCP都能通过ELISA检测，因为并非所有的蛋白质都具有免疫原性，并且因此缺乏相关抗体。监管机构意识到这些限制并且现在期望在广泛的药物生产之前能够检测特定污染物的正交方法。事实上，现在通常采用互补HCP检测方法，不仅为了更好的监督，而且为了对这些技术可以提供的工艺开发的实质性改进(Viktor Háda等人，蛋白质生物治疗剂的基于质谱的分析的最新进展、挑战和实际考虑：生物仿制药行业的观点(Recent advancements，challenges，and practical considerations in the massspectrometry-based analytics of protein biotherapeutics：A viewpoint pom thebiosimilar industry)，161《药物和生物医学分析杂志》214-238(2018)；Kristin NValente等人，用于CHO宿主细胞蛋白表征的蛋白质组学方法在生物制药制造中的应用(Applications of proteomic methods for CHO host cell protein characterizationin biopharmaceutical manufacturing)，53《生物技术当前述评(CURRENT OPINION INBIOTECHNOLOGY)》144-150(2018)；以及Matthew R.Schenauer、Gregory C.Flynn和AndrewM.Goetze，使用质谱鉴定和定量生物治疗剂中的宿主细胞蛋白杂质(Identification andquantification of host cell protein impurities in biotherapeutics using massspectrometry)，428《分析生物化学(ANALYTICAL BIOCHEMISTRY)》150157(2012))。
已采用多种互补分析方法来监测HCP，包含1D/2D-PAGE和基于质谱的分析技术(Julita K.Grzeskowiak等人，基于亲和与非亲和的重组单克隆抗体下游加工比较的二维荧光差异凝胶电泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresisfor comparison of affinity and non-affinity based downstream processing ofrecombinant monoclonal antibody)，1216《色谱杂志A》4902-4912(2009)；CatalinDoneanu等人，通过全面的在线二维液相色谱/质谱分析生物治疗性蛋白质中的宿主细胞蛋白(Analysis of host-cell proteins in biotherapeutic proteins by comprehensiveonline two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry)，4《MABS》24-44(2012)；Mi Jin等人，通过二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)分析宿主细胞蛋白：下游过程开发的暗示(Profiling of host cell proteins by two-dimensional difference gelelectrophoresis(2D-DIGE)：Implications for downstream process development)，105《生物技术与生物工程》306-316(2010))。与串联质谱联用的液相色谱(LC-MS/MS)也可以提供用于同时鉴定和定量HCP杂质的方式，并且已经作为补充ELISA测定的主要正交方法出现。然而，对基于质谱的方法的主要挑战可能是，当与压倒性和高度浓缩的抗体药物物质混合时，质谱仪本身缺乏检测低浓度的HCP的能力。为了克服低ppm水平HCP与高丰度治疗性抗体之间的宽动态范围(超过6个数量级)的问题，一种策略是在质谱分析之前通过添加除了数据依赖性获取或数据非依赖性获取之外的另一分离维度，如2D-LC和离子迁移率以提高分离效率来解决共洗脱肽。在一项研究中，Ecker等人报道了使用具有数据独立获取的LC-MS/MS进行单数位ppm水平的HCP鉴定，并且还建立了包含来自无效菌株的HCP质量、保留时间和碎片离子的文库。尽管这种方法是敏感的，但所述方法可能失去仅与某一产品共表达的HCP(Dawn M Ecker、Susan Dana Jones和Howard L Levine，治疗性单克隆抗体市场(Thetherapeutic monoclonal antibody market)，7《MABS》9-14(2014))。另一项研究显示了使用2D-HPLC鉴定10到50ppm HCP的能力(Catalin Doneanu等人，通过全面的在线二维液相色谱/质谱分析生物治疗性蛋白质中的宿主细胞蛋白，4《MABS》24-44(2012)；DonaldE.Walker等人，用于支持朝向最佳宿主细胞蛋白清除的生物过程开发的模块化和自适应的基于质谱的平台(A modular and adaptive mass spectrometry-based platform forsupport of bioprocess development toward optimal host cell proteinclearance)，9《MABS》654-663(2017))。然而，2D-LC的循环时间非常长，并且这种方法对于较低水平的HCP(＜10ppm)分析可能不是足够敏感的。另外，这通常妨碍对新污染物的鉴定，从而降低其有用性(尽管存在可能限制这一缺点的替代方案)(Veronika Reisinger等人，基于质谱的宿主细胞蛋白鉴定方法及其在可比性试验中的应用(A mass spectrometry-based approach to host cell protein identification and its application in acomparability exercise)，463《分析生物化学》1-6(2014)；Simion Kreimer等人，通过具有平行反应监测验证的数据独立获取质谱数据的靶向和非靶向分析的宿主细胞蛋白谱分析(Host Cell Protein Profiling by Targeted and Untargeted Analysis of DataIndependent Acquisition Mass Spectrometry Data with Parallel ReactionMonitoring Verification)，89《分析化学(ANALYTICAL CHEMISTRY)》5294-5302(2017))。
多维色谱还显示通过提供HCP胰蛋白酶肽与治疗性蛋白质的那些肽的更好分离来提高灵敏度(参见Catalin Doneanu等人，同上；Matthew R.Schenauer等人，同上；G.Joucla等人，用于从CHO上清液捕获抗体的阳离子交换对多模式阳离子交换树脂：通过质谱鉴定污染性宿主细胞蛋白(Cation exchange versus multimodal cation exchange resins forantibody capture from CHO supernatants：Identification of contaminating HostCell Proteins by mass spectrometry)，942-943《色谱杂志B(JOURNAL OFCHROMATOGRAPHY B)》126-133(2013)；Qingchun Zhang等人，使用质谱在单克隆抗体纯化期间对宿主细胞蛋白的全面跟踪(Comprehensive tracking of host cell proteinsduring monoclonal antibody purifications using mass spectrometry)，6《MABS》659-670(2014)；Amy Farrell等人，使用二维数据独立LC-MSE的定量宿主细胞蛋白分析(Quantitative Host Cell Protein Analysis Using Two Dimensional DataIndependent LC-MSE)，87《分析化学》9186-9193(2015)；Feng Yang等人，用于可靠地检测治疗性抗体中10ppm水平残留宿主细胞蛋白的2D LC-MS/MS策略(A2D LC-MS/MS Strategyfor Reliable Detection of 10-ppm Level Residual Host Cell Proteins inTherapeutic Antibodies)，90《分析化学》13365-13372(2018)；Regina Kufer等人，作为两个新颖样品制备工作流程的肽分级分离和天然消化的评估以通过LC-MS/MS改进HCP表征(Evaluation of Peptide Fractionation and Native Digestion as Two Novel SamplePreparation Workflows to Improve HCP Characterizationby LC-MS/MS)，91《分析化学》9716-9723(2019))。例如，高pH离线分级分离可以与低pH反相色谱组合以大大降低样品复杂性。然而，离线和在线多维色谱都不能完全抵消来自治疗性蛋白质的干扰并且可以显著降低样品吞吐量，使其不适合在生产期间进行常规分析。离子迁移率尽管很少用于HCP分析，但可以潜在地提供另外的分离而不降低样品吞吐量(参见Catalin Doneanu等人，同上)。
其它策略集中于样品基质制备以通过用亲和纯化、有限消化去除样品基质中的抗体或通过使用多克隆抗体捕获HCP来富集HCP(Lihua Huang等人，用于抗体中HCP的鸟枪法蛋白质组学表征的新颖样品基质制备(A Novel Sample matrix Preparation forShotgun Proteomics Characterization of HCPs in Antibodies)，89《分析化学》5436-5444(2017)；Jenny Heidbrink Thompson等人，使用液相色谱/质谱结合HCP富集策略在哺乳动物细胞源性抗体药物中对宿主细胞蛋白(HCP)的改进的检测(Improved detection ofhost cell proteins(HCPs)in a mammalian cell-derived antibody drug usingliquid chromatography/mass spectrometry in conjunction with an HCP-enrichmentstrategy)，28《质谱中的快速通信(RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY)》855-860(2014)；James A Madsen等人，通过亲和耗竭、LC-MS/MS和多变量分析对生物治疗剂中的宿主细胞蛋白的完全表征(Toward the complete characterization of host cellproteins in biotherapeutics via affinity depletions，LC-MS/MS，and multivariateanalysis)，7《MABS》1128-1137(2015))。去除治疗性蛋白质可以使HCP的检测改善几个数量级，但存在偏倚结果或无意地从样品中去除HCP的风险。
现有方法的主要挑战之一可能是缺乏检测样品基质中低浓度HCP(例如，0.01-10ppm)的能力，所述样品基质具有HCP与药物之间的宽动态范围(5-8级)，这可能导致HCP信号在分析中被抑制。
测量和监测数千个HCP的能力成比例地增加了所获取的数据量。如果这些信息可以用于确定关键HCP并且由此为风险管理创建改进的基础，则存在显著的益处。开发这种HCP文库可以有利于生物制药过程中的内部HCP筛选、调节和监测杂志以及找到用于药物发现的较新靶标。HCP文库还可以用于通过将串联质谱和蛋白质属性与确认存在于文库中的那些进行比较来验证药物物质中或整个纯化过程中低丰度HCP的属性。用于将来分析的DIA文库可以从大量HCP获得的质量、保留时间和碎片离子来构建。
考虑到现有方法的限制，开发了一种用于鉴定HCP的有效且高效的方法。
除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的任何方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试，但现在对特定方法和材料进行描述。所提及的所有出版物特此通过引用并入本文。
术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”；并且术语“约”和“大约”应理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的；并且在提供范围的情况下，包含端点。
在一些示例性实施例中，本公开提供了用于表征宿主细胞蛋白的方法。如本文所使用的，术语“宿主细胞蛋白”包含源自宿主细胞的蛋白质，并且可以与期望的所关注蛋白质无关。宿主细胞蛋白可以是工艺相关的杂质，所述杂质可以源自制造工艺并且可以包含三个主要类别：细胞底物源性、细胞培养物源性和下游源性。细胞底物源性杂质包含但不限于源自宿主生物体的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物源性杂质包含但不限于诱导剂、抗生素、血清和其它介质组分。下游源性杂质包含但不限于酶、化学和生化加工试剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如，单克隆抗体)和其它可浸出物。
在一些示例性实施例中，宿主细胞蛋白的pI可以在约4.5到约9.0的范围内。一方面，pI可以为约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。
在一些示例性实施例中，本公开提供了用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法。一方面，样品基质可以从生物过程的任何步骤获得，如培养细胞培养液(CCF)、采集的细胞培养液(HCCF)、过程性能鉴定(PPQ)、下游加工中的任何步骤、包括最终经调配产品的药物物质(DS)或药物产品(DP)。另一方面，样品基质可以选自澄清、色谱纯化、病毒灭活或过滤的下游过程的任何步骤。另一方面，药物产品可以选自在临床、运输、储存或处理中制造的药物产品。
在一些示例性实施例中，组合物中的宿主细胞蛋白的类型可以为至少两种。
在一些示例性实施例中，样品基质可以进一步包括所关注蛋白质。如本文所使用的，术语“蛋白质”或“所关注蛋白质”可以包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体以及通过肽键连接的其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以含有一个或多个多肽以形成单一功能性生物分子。蛋白质可以包含任何生物治疗性蛋白质、用于研究或疗法的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来生产，如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于最近讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述，参见Ghaderi等人，“用于生物治疗性糖蛋白的生产平台非人唾液酸化的发生、影响和挑战(Production platforms for biotherapeutic glycoproteins.Occurrence，impact，andchallenges of non-human sialylation)”，(Darius Ghaderi等人，用于生物治疗性糖蛋白的生产平台非人唾液酸化的发生、影响和挑战，28《生物技术和基因工程综述(BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERINGREVIEWS)》147-176(2012))。一方面，蛋白质包括修饰、加合物和其它共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包含例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAGtag、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记以及其它染料等。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白质，如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及源性蛋白质，如初级源性蛋白质和次级源性蛋白质。一方面，所述所关注蛋白质可以是抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白或其组合。
如本文所使用的术语“抗体”包含包括四条多肽链、通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。可以将VH区和VL区进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有更保守的被称作框架区(FR)的区域。每个VH和VL由自氨基端到羧基端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施例中，抗大ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同或可以是天然的或经人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。
如本文所使用的，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白，其特异性结合抗原以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术源自完整抗体分子，所述标准技术如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或可以合成。可以通过化学方法或通过分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
如本文所使用的，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，如例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补性决定区(CDR)区域，以及三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。在一些示例性实施例中，抗体片段含有足够的亲本抗体的氨基酸序列，其中所述抗体片段是与亲本抗体结合同一抗原的片段；在一些示例性实施例中，片段以与亲本抗体的亲和力相当的亲和力与抗原结合和/或与亲本抗体竞争与抗原结合。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或其可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，并且更通常包括至少约200个氨基酸。
短语“双特异性抗体”包含能够选择性结合两个或多个表位的抗体。双特异性抗体通常包括两条不同的重链，每条重链特异性结合两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，同一抗原上)的不同表位。如果双特异性抗体能够选择性结合两个不同的表位(第一表位和第二表位)，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一到两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的靶标上(例如，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。
典型的双特异性抗体具有两条重链，所述两条重链各自具有三个重链CDR，随后是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每条重链缔合，或可以与每条重链缔合且可以结合由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位，或可以与每条重链缔合且使得重链中的一个或两个重链能够与一个或两个表位结合。BsAb可以分成两个主要类别：一类是带有Fc区(IgG样)；以及另一类是缺乏Fc区，后者通常小于包括Fc的IgG和IgG样双特异性分子。IgG样bsAb可以具有不同的形式，如但不限于三功能抗体、旋钮成孔IgG(kih IgG)、crossMab、orth-FabIgG、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、二合一或双功能Fab(DAF)、IgG-单链Fv(IgG-scFv)或κλ体。非IgG样不同形式包含串联scFv、双抗体形式、单链双抗体、串联双抗体(TandAbs)、双亲和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、纳米抗体或通过对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法产生的抗体(Gaowei Fan、Zujian Wang和Mingju Hao，双特异性抗体及其应用(Bispecificantibodies and their applications)，8《血液学与肿瘤学杂志(JOURNAL OFHEMATOLOGY&ONCOLOGY)》130；Dafne Müller和Roland E.Kontermann，双特异性抗体(Bispecific Antibodies)，《治疗性抗体手册(HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES)》265-310(2014))。
产生bsAb的方法不限于基于两种不同的杂交瘤细胞系的体细胞融合的四杂交瘤(quadroma)技术、涉及化学交联剂的化学缀合以及利用重组DNA技术的基因方法。bsAb的实例包含在以下专利申请中公开的bsAb，所述专利申请特此通过引用并入本文：于2010年6月25日提交的美国序列第12/823838号；于2012年6月5日提交的美国序列第13/488628号；于2013年9月19日提交的美国序列第14/031075号；于2015年7月24日提交的美国序列第14/808171号；于2017年9月22日提交的美国序列第15/713574号；于2017年9月22日提交的美国序列第15/713569号；于2016年12月21日提交的美国序列第15/386453号；于2016年12月21日提交的美国序列第15/386443号；于2016年7月29日提交的美国序列第15/22343号；以及于2017年11月15日提交的美国序列第15814095号。在制造双特异性抗体期间的若干个步骤中可能存在低水平的同二聚体杂质。当使用完整质量分析进行时，由于同二聚体杂质的低丰度以及当使用常规液相色谱进行时这些杂质与主要物种的共洗脱，此类同二聚体杂质的检测可能是具有挑战性的。
如本文所使用的“多特异性抗体”或“Mab”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。虽然这些分子通常将仅结合两种抗原(即，双特异性抗体，bsAb)，但具有另外特异性的抗体，如三特异性抗体和KIH三特异性抗体也可以通过本文公开的系统和方法来解决。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。
在一些示例性实施例中，所关注蛋白质的pI可以在约4.5到约9.0的范围内。一方面，pI可以为约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。
在一些示例性实施例中，样品基质中的所关注蛋白质的类型可以为至少两种。一方面，所述至少两种所关注蛋白质之一可以是单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、融合蛋白或抗体-药物复合物。在一些其它实施例中，所述至少两种所关注蛋白质之一的浓度可以为约20mg/mL到约400mg/mL。在一些示例性实施例中，组合物中的所关注蛋白质的类型有两种。在一些示例性实施例中，组合物中的所关注蛋白质的类型有三种。在一些示例性实施例中，组合物中的所关注蛋白质的类型有五种。
在一些示例性实施例中，组合物中的两种或更多种所关注蛋白质可以选自trap蛋白、嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、纳米体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子或肽激素。
在一些示例性实施例中，样品基质可以是共调配物。
在一些示例性实施例中，所关注蛋白质可以从哺乳动物细胞中纯化。哺乳动物细胞可以是人来源的或非人来源的，可以包含原代上皮细胞(例如，角质形成细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和视网膜上皮细胞)、已建立的细胞系及其菌株(例如，293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWb细胞、Chang细胞、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LSI80细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28 VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-1细胞、LLC-PKi细胞、PK(15)细胞、GHi细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MHiCi细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞、BSC-1细胞、RAf细胞、RK细胞、PK-15细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官的成纤维细胞(包含但不限于心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样、扁桃体、骨髓和血液)、脾和成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系(例如，CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、邓普斯细胞(Dempsey cell)、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、Midi细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDMiC3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、菌株2071(小鼠L)细胞、L-M菌株(小鼠L)细胞、L-MTK′(小鼠L)细胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞(Indian muntjac cell)、SIRC细胞、Cn细胞和詹森细胞(Jensen cell)、Sp2/0、NS0、NS1细胞或其衍生物)。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品基质与色谱载体接触来富集样品基质中的宿主细胞蛋白。
如本文所使用的，术语“色谱”是指其中由液体或气体携带的化学混合物可以由于化学实体在其固定液相或固相周围或在固定液相或固相上方流动时的差异分布而分离成组分的过程。色谱的非限制性实例包含传统反相(RP)、离子交换(IEX)和正相色谱(NP)。与疏水性相互作用、亲水性相互作用和离子相互作用分别是主要相互作用模式的RP、NP和IEX色谱不同，混合模式色谱可以采用这些相互作用模式中的两种或更多种相互作用模式的组合。若干类型的液相色谱可以与质谱仪一起使用，如快速分辨液相色谱(RRLC)、超高效液相色谱(UPLC)、超快速液相色谱(UFLC)和纳米液相色谱(nLC)。关于色谱方法和原理的进一步详细信息，参见Colin等人(COLIN F.POOLE等人，《液相色谱：基本原理和仪器(LIQUIDCHROMATOGRAPHY FUNDAMENTALS AND INSTRUMENTATION)》(2017))。
在一些示例性实施例中，所述色谱载体可以是液相色谱载体。如本文所使用的，术语“液相色谱”是指其中由液体携带的化学混合物可以由于化学实体在其固定液相或固相周围或在固定液相或固相上方流动时的差异分布而分离成组分的过程。液相色谱的非限制性实例包含反相液相色谱、离子交换色谱、大小排阻色谱、亲和色谱、混合模式色谱或疏水性色谱。
如本文所使用的，“离子交换色谱”可以包含分离，包含基于两种物质相应的离子电荷的差异通过其将两种物质作为整体在所关注分子和/或色谱材料上或局部地在所关注分子和/或色谱材料的特定区域上分离的任何方法，并且因此可以采用阳离子交换材料或阴离子交换材料。离子交换色谱是基于所关注分子的局部电荷和色谱材料的局部电荷之间的差异来分离分子的。可以在结合-洗脱模式、流通模式或混合模式下操作填充离子交换色谱柱或离子交换膜装置。在用平衡缓冲液或具有不同pH和/或电导率的另一种缓冲液洗涤柱或膜装置之后，可以通过增加洗脱缓冲液的离子强度(例如电导率)以与溶质竞争离子交换基质的带电位点来实现产物回收。改变pH并且由此改变溶质的电荷可以是实现溶质洗脱的另一种方式。电导率或pH的变化可以是逐渐的(梯度洗脱)或逐步(逐步洗脱)。然后可以在下一次使用之前使柱再生。阴离子或阳离子取代基可以连接到基质上，以形成用于色谱的阴离子或阳离子载体。阴离子交换取代基的非限制性实例包含二乙基氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)和季胺(Q)基团。阳离子取代基包含羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸酯(P)和磺酸酯(S)。纤维素离子交换培养基或载体可以包含可从英国肯特郡梅德斯通的沃特曼有限公司(Whatman Ltd.Maidstone，Kent，U.K.)获得的DE23TM、DE32TM、DE52TM、CM-23TM、CM-32TM和CM-52TM。基于
Figure BDA0003597434960000301
的和-locross连接的离子交换剂也是已知的。例如，DEAE-、QAE-、CM-和
Figure BDA0003597434960000302
以及DEAE-、Q-、CM-和
Figure BDA0003597434960000303
和
Figure BDA0003597434960000304
快速流动以及CaptoTM S全部均可从通用电气医疗集团(GE Healthcare)获得。另外，DEAE和CM衍生的乙二醇-甲基丙烯酸共聚物，如TOYOPEARLTMDEAE-650S或M和TOYOPEARLTM CM-650S或M可从宾夕法尼亚州费城的托索哈斯公司(TosoHaas Co.，Philadelphia，Pa.)获得，或从加利福尼亚州赫拉克勒斯的伯乐公司(BioRad，Hercules，Calif.)获得的Nuvia S和UNOSphereTM S、从马萨诸塞州EMD密理博公司(EMDMillipore，MA)获得的
Figure BDA0003597434960000305
S。
如本文所使用的，术语“疏水性相互作用色谱树脂”可以包含可以用苯基、辛基或丁基化学品共价改性的固相。其可以使用疏水性的性质来将分子彼此分离。在这种类型的色谱中，疏水性基团，如苯基、辛基、己基或丁基可以连接到固定柱上。在分子表面上具有疏水性氨基酸侧链的穿过柱的分子能够与柱上的疏水性基团相互作用并且与所述疏水性基团结合。疏水性相互作用色谱树脂或载体的实例包含苯基琼脂糖凝胶FF、Capto苯基(瑞典乌普萨拉的通用电气医疗集团(GE Healthcare，Uppsala，Sweden))、苯基650-M(日本东京的东曹生命科学事业部(Tosoh Bioscience，Tokyo，Japan))和Sartobind苯基(美国纽约的赛多利斯公司(Sartorius corporation，NewYork，USA))。
如本文所使用的，术语“混合模式色谱(MMC)”或“多模式色谱”包含溶质通过多于一种相互作用模式或机制与固定相相互作用的色谱方法。MMC可以用作传统反相(RP)、离子交换(IEX)和正相色谱(NP)的替代或补充工具。与疏水性相互作用、亲水性相互作用和离子相互作用分别是主要相互作用模式的RP、NP和IEX色谱不同，混合模式色谱可以采用这些相互作用模式中的两种或更多种相互作用模式的组合。混合模式色谱介质可以提供不能通过单模式色谱再现的独特选择性。与基于亲和的方法相比，混合模式色谱还可以提供潜在的成本节约、更长的柱寿命和操作灵活性。在一些示例性实施例中，混合模式色谱介质可以由直接地或通过间隔子与有机或无机载体，有时称为基础基质偶联的混合模式配体构成。载体可以呈颗粒形式，如基本上球形的颗粒、整料、过滤器、膜、表面、毛细管等。在一些具体示例性实施例中，载体可以由天然聚合物制备，如交联的碳水化合物材料，如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋、角叉菜胶、结冷胶、海藻酸盐等。为了获得高吸附能力，载体可以是多孔的，并且然后将配体偶联到外表面以及孔表面。此类天然聚合物载体可以根据标准方法来制备，如反相悬浮凝胶化(Stellan Hjertén，用于分子和颗粒色谱的琼脂糖球的制备(The preparation of agarose spheres for chromatography of molecules andparticles)，79《生物化学与生物物理学报(BBA)》-包含光合作用的生物物理学(BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA(BBA)-BIOPHYSICS INCLUDING PHOTOSYNTHESIS)393-398(1964)，所述文献通过引用并入本文)。可替代地，载体可以由合成聚合物制备，如交联的合成聚合物，例如苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等。此类合成聚合物可以根据标准方法来生产，参见例如，Eduardo Vivaldo-Lima等人，关于悬浮聚合的更新综述(An Updated Review onSuspension Polymerization)，36《工业与工程化学研究(INDUSTRIAL&ENGINEERINGCHEMISTRY RESEARCH)》939-965(1997)。多孔的天然或合成聚合物载体也可从商业来源，如瑞典乌普萨拉的安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)获得。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品基质与亲和色谱载体接触来富集样品基质中的宿主细胞蛋白。
如本文所使用的，“亲和色谱”可以包含分离，包含基于两种物质对色谱材料的亲和力通过其将两种物质分离的任何方法。亲和色谱载体的非限制性实例包含但不限于蛋白A树脂、蛋白G树脂、包括针对其产生结合分子的抗原的亲和载体以及包括Fc结合蛋白的亲和载体。亲和色谱树脂可以通过将蛋白A、蛋白G、针对其产生结合分子的抗原或Fc结合蛋白固定在树脂，如琼脂糖或琼脂糖凝胶上来形成。存在若干种蛋白A树脂的商业来源。蛋白A树脂的非限制性实例包含MabSelect SuReTM、MabSelect SuRe LX、MabSelect、MabSelectXtra、来自通用电气医疗集团的rProtein A Sepharose以及来自EMD密理博公司的ProSepHC、ProSep Ultra和ProSep Ultra Plus。
一方面，亲和色谱材料可以在样品基质加载之前用合适的缓冲液平衡。在这种平衡后，可以将样品基质加载到柱上。一方面，在加载亲和色谱材料后，可以使用适当的洗涤缓冲液将亲和色谱材料洗涤一次或多次。在一些具体方面，可以收集来自洗涤的流通物。在一些具体方面，可以进一步处理来自洗涤的流通物。任选地，在洗脱柱之前可以使用其它洗涤，包含使用不同缓冲液的洗涤。可以收集来自洗涤的流通物并且将其进一步处理。亲和色谱材料也可以使用适当的洗脱缓冲液洗脱。可以使用本领域的技术人员熟知的技术监测洗脱液。例如，可以追踪OD280处的吸光度。然后可以制备所关注洗脱级分以进行进一步处理。
一方面，可以在与亲和色谱树脂接触之前将亲液盐溶液补充到包括所关注蛋白质的样品基质中。亲液盐溶液包括至少一种亲液盐。合适的亲液盐的实例包含但不限于硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠、硫酸钾、磷酸钾、磷酸钠及其组合。一方面，亲液盐为硫酸铵；另一方面，亲液盐为硫酸钠；以及另一方面，亲液盐为柠檬酸钠。亲液盐以约0.3M到约1.1M的浓度存在于亲液盐溶液中。在一个实施例中，亲液盐以约0.5M的浓度存在于亲液盐溶液中。
在一些示例性实施例中，所述富集步骤可以进一步包括处理从所述色谱载体获得的样品。
在一些示例性实施例中，所述处理可以包含向所述样品中添加水解剂以产生肽。如本文所使用的，术语“水解剂”是指可以进行蛋白质的消化的大量不同药剂中的任何一种或其组合。可以进行酶消化的水解剂的非限制性实例包含胰蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、化脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶以及来自佐氏曲霉(Aspergillus Saitoi)的蛋白酶。可以进行非酶消化的水解剂的非限制性实例包含使用高温、微波、超声、高压、红外、溶剂(非限制性实例是乙醇和乙腈)、固定化酶消化(IMER)、磁性颗粒固定化酶和芯片上固定化酶。对于讨论蛋白质消化的可用技术的最近综述，参见Switazar等人，“蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述(Protein Digestion：AnOverview of the Available Techniques and Recent Developments)”(Linda Switzar、Martin Giera和Wilfried M.A.Niessen，蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述，12《蛋白质组学研究杂志(JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH)》1067-1077(2013))。水解剂中的一种或组合可以以序列特异的方式切割蛋白质或多肽中的肽键，从而产生可预测的较短肽的集合。
可以适当地选择水解剂与蛋白质的术语比率和消化所需的时间，以获得蛋白质的消化。当酶与底物比率不适当地高时，其可能引起非特异性切割(潜在地将所有蛋白质/肽断裂成单独的氨基酸)，由此限制鉴定蛋白质的能力以及降低序列覆盖率。另一方面，低的E/S比率需要较长消化时间，并且因此样品制备时间也较长。酶与底物的比率可以在约1∶0.5到约1∶500的范围内。
如本文所使用的，术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。存在若干种方法用于使用适当的水解剂进行样品中的蛋白质的消化，例如酶消化或非酶消化。
用于消化样品中的蛋白质的广泛接受的方法之一涉及使用蛋白酶。许多蛋白酶都是可用的，并且所述蛋白酶中的每种蛋白酶在特异性、效率和最佳消化条件方面都具有其自己的特性。蛋白酶是指内肽酶和外肽酶两者，如基于蛋白酶在肽内的非末端或末端氨基酸处切割的能力而分类的。可替代地，蛋白酶也指六个不同的类别：天冬氨酸、谷氨酸和金属蛋白酶、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸蛋白酶，如根据催化机制分类的。术语“蛋白酶”和“肽酶”可互换使用，是指水解肽键的酶。
除了使宿主细胞蛋白与水解剂接触之外，所述方法还可以任选地包含用于还原宿主细胞蛋白、烷基化宿主细胞蛋白、缓冲宿主细胞蛋白和/或使样品基质脱盐的步骤。这些步骤可以按所期望的任何合适方式来完成。
在一些示例性实施例中，处理可以包含向样品中添加蛋白质还原剂。如本文所使用的，术语“蛋白质还原剂”是指用于还原蛋白质中的二硫键的药剂。用于还原蛋白质的蛋白质还原剂的非限制性实例是二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、埃尔曼试剂、盐酸羟胺、氰基硼氢化钠、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)或其组合。
在一些示例性实施例中，处理可以包含向样品中添加蛋白质烷基化试剂。如本文所使用的，术语“蛋白质烷基化剂”是指用于烷基化蛋白质中的某些游离氨基酸残基的药剂。蛋白质烷基化剂的非限制性实例是碘乙酰胺(IOA)、氯乙酰胺(CAA)、丙烯酰胺(AA)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)和4-乙烯基吡啶或其组合。
在一些示例性实施例中，所述处理可以包含添加来自由以下组成的组中的一种或多种：烷基化剂、还原剂、水解剂或其组合。向所述样品中添加这些药剂可以有所不同。可以通过向所述药剂中添加所述样品或通过向所述样品中添加所述药剂来进行添加。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品基质与色谱载体接触来富集样品基质中的宿主细胞蛋白以及进行分级分离步骤。如本文所使用的，术语“分级分离”可以包含分离从消化存在于样品基质中的宿主细胞蛋白中获得的各种肽的过程。所述过程可以涉及使用适当的肽分级分离技术来分离肽，所述肽分级分离技术可以基于肽的各种一般性质对肽进行分级分离，所述一般性质如肽的pI、疏水性、金属结合能力、暴露的硫醇基团的含量、大小、电荷、形状、溶解度、稳定性和沉降速度、与各种离子基团结合的能力以及作为从复杂的生物样品基质中分离肽的基础的底物的亲和力。还可以基于肽的细胞位置来分离肽，由此允许提取细胞质、细胞核和膜蛋白。
在一些示例性实施例中，分级分离可以是基于大小的分级分离。一方面，可以通过使用凝胶电泳进行基于大小的分级分离。可以在以下文献中找到关于凝胶电泳的详细信息：Zaifang Zhu、Joann Lu和Shaorong Liu，通过毛细管凝胶电泳进行的蛋白质分离：综述(Protein separation by capillary gel electrophoresis：A review)，709《分析化学学报(ANALYTICA CHIMICA ACTA)》21-31(2012)，所述文献通过引用并入本文。可以在以下文献中找到进一步的原理和基础：SAMEH MAGDELDIN，《凝胶电泳：原理和基础(GEL ELECTROPHORESIS：PRINCIPLES AND BASICS)》(2012)，所述文献通过引用并入本文。
一方面，可以通过使用透析进行基于大小的分级分离。可以使用分子截留膜过滤器或一系列膜过滤器来进行透析。也可以使用透析盒来进行透析。一种此类透析方法的实例可以包含使用Slide-A-LyzerTM透析盒。盒设计有助于使表面积与样品体积比最大化，并且能够获得优异的样品回收率。
一方面，可以通过使用毛细管电泳进行基于大小的分级分离。可以在以下文献中找到关于毛细管电泳的最新趋势和进展：Robert Voeten等人，毛细管电泳：趋势和最新进展(Capillary Electrophoresis：Trends and Recent Advances)，90《分析化学》1464-1481(2018)以及Maria Ramos-Payán等人，用于复杂样品分析的毛细管电泳的最新趋势：综述(Recent trends in capillary electrophoresis for complex samples analysis：Areview)，39《电泳(ELECTROPHORESIS)》111-125(2017)，所述文献通过引用并入本文。可以在以下文献中找到进一步的原理和基础：Harry Whatley，毛细管电泳的基本原理和模式(Basic Principles and Modes of Capillary Electrophoresis)，《毛细管电泳的临床和法医学应用(CLINICAL AND FORENSIC APPLICATIONS OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS)》21-58，所述文献通过引用并入本文。
一方面，可以使用大小排阻色谱进行基于大小的分级分离。短语“大小排阻色谱”或“SEC”或“凝胶过滤”包含液柱色谱技术，所述技术可以根据分子在溶液中的大小对分子进行分选。如本文所使用的，术语“SEC色谱树脂”或“SEC色谱介质”在本文中可互换地使用，并且可以包含在SEC中使用的将杂质与期望产物(例如，双特异性抗体产物的同二聚体污染物)分离的任何种类的固相。树脂的体积、待使用的柱的长度和直径以及动态容量和流速可以取决于若干参数，如待处理的流体的体积、待经受本发明的过程的流体中的蛋白质浓度等。确定每个步骤的这些参数完全在本领域的技术人员的一般技能之内。可以在以下文献中找到关于大小排阻色谱的简要实际综述：Richard R.Burgess，大小排阻色谱的简要实际综述：拇指规则、限制和故障排除(A brief practical review of size exclusionchromatography：Rules of thumb，limitations，and troubleshooting)，150《蛋白质表达和纯化(PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION)》81-85(2018)以及Gloria Brusotti等人，关于大小排阻色谱的进展和蛋白质生物制药和蛋白质聚集体分析的应用：微型综述(Advances on Size Exclusion Chromatography and Applications on the Analysisof Protein Biopharmaceuticals and Protein Aggregates：A Mini Review)，81《色谱学(CHROMATOGRAPHIA)》3-23(2017)，所述文献各自通过引用并入本文。可以在以下文献中找到SEC的进一步原理和基础：Paula Hong、Stephan Koza和Edouard S.P.Bouvier，分析蛋白质生物治疗剂及其聚集体的综述大小排阻色谱(A Review Size-ExclusionChromatography For The Analysis Of Protein Biotherapeutics And TheirAggregates)，35《液相色谱与相关技术杂志(JOURNAL OF LIQUID CHROMATOGRAPHY&RELATED TECHNOLOGIES)》2923-2950(2012)，所述文献通过引用并入本文。大小排除色谱的较新方法还可以用于这些方法，如Singh等人，用于蛋白质样品大小分级分离的新型自动化系统(New Automated Systems for Size-fractionation of Protein Samples)，24《生物分子技术杂志(JOURNAL OF BIOMOLECULAR TECHNOLOGIES)》S60-S61(2013)所展示的，所述文献通过引用并入本文。
一方面，可以使用场流分级分离进行基于大小的分级分离。场流分级分离(FFF)是一类“软影响”洗脱技术，主要用于在层状微流体流内分离超分子、蛋白质和生物颗粒(直径＜100μm)的异质混合物。在Messaud等人的文章中提供了FFF的概述(Fathi A.Messaud等人，关于场流分级分离技术及其在聚合物的分离和表征中的应用的概述(An overview onfield-flow fractionation techniques and their applications in the separationand characterization of polymers)，34《聚合物科学进展(PROGRESS IN POLYMERSCIENCE)》351-368(2009))，所述文献通过引用并入本文。可以在以下文献中找到FFF的另外的技术：T.Kowalkowski等人，场流分级分离：理论、技术、应用和挑战(Field-FlowFractionation：Theory，Techniques，Applications and the Challenges)，36《分析化学中的锐评(CRITICAL REVIEWS IN ANALYTICAL CHEMISTRY)》129-135(2006)以及BarbaraRoda等人，生物分析中的场流分级分离：最近趋势的综述(Field-flow fractionation inbioanalysis：A review of recent trends)，635《分析化学学报》132-143(2009)，所述文献各自通过引用并入本文。
在一些示例性实施例中，分级分离可以是基于疏水性的分级分离。一方面，可以使用反相色谱进行基于大小的分级分离。反相色谱是最广泛使用的色谱模式，其允许基于蛋白质的疏水性来分离蛋白质。分离是基于极性流动相与疏水性(非极性)固定相之间的分析物分配系数。在肽的情况下，极性较大的肽首先洗脱，而极性较小的肽与在固体二氧化硅载体周围形成“液体样”层的疏水性基团的相互作用更强。RPLC因其易于与梯度洗脱一起使用、与水性样品的相容性和保留机制的多功能性而广泛应用于肽分离中，从而允许由pH、有机改性剂或添加剂的变化引起的分离变化。一方面，可以使用pH梯度色谱进行基于大小的分级分离。
在一些示例性实施例中，反相色谱可以包括使用纳米LC的低pH反相液相色谱分离。一方面，反相色谱可以包括高pH反相液相色谱分离。在具体方面，反相色谱可以包括与低pH反相液相色谱正交的高pH反相液相色谱分离。可以在以下文献中找到使用高pH和低pH反相液相色谱进行自上而下蛋白质组学的一种这样的二维分离的概述：Zhe Wang等人，使用用于自上而下蛋白质组学的高pH和低pH反相液相色谱的二维分离(Two-dimensionalseparation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography fortop-down proteomics)，427《国际质谱杂志(INTERNATIONAL JOURNAL OF MASSSPECTROMETRY)》43-51(2018)。
在一些示例性实施例中，分级分离可以是基于电荷的分级分离。另一方面，可以使用离子交换色谱进行基于电荷的分级分离。在具体方面，离子交换色谱可以是阳离子交换色谱。在另一具体方面，离子交换色谱可以是阴离子交换色谱。
在一些示例性实施例中，分级分离可以是基于pI的分级分离。一方面，可以使用离子交换色谱进行基于电荷的分级分离。在具体方面，离子交换色谱可以是阳离子交换色谱。在另一具体方面，离子交换色谱可以是阴离子交换色谱。一方面，可以通过等电聚焦进行基于电荷的分级分离。等电聚焦(IEF)可以提供蛋白质的分离，其中蛋白质可以在存在pH梯度的情况下在电场的影响下根据其电荷行进，直到分子的净电荷为零(例如，等电点，pI)。分离可以根据氨基酸和暴露的带电荷的残基的组成来考虑，所述暴露的带电荷的残基表现为弱酸和弱碱。蛋白质的迁移将遵循电泳的基本原理；然而，迁移率将在存在pH梯度的情况下通过在接近pI值的值处减慢迁移而改变。在Pergande以及Cologna Melissa Pergande和Stephanie Cologna，肽和蛋白质的等电点分离(Isoelectric Point Separations ofPeptides and Proteins)，5《蛋白质组学(PROTEOMES)》4(2017)的文章中提供了IEF的概述，所述文献通过引用并入本文。可以在以下文献中找到针对IEF的另外的技术：FindleyCornell，用于检测和鉴定单克隆蛋白质的等电聚焦、印迹和探针方法(IsoelectricFocusing，Blotting and Probing Methods for Detection and Identification ofMonoclonal Proteins)，30《临床生物化学家综述(THE CLINICAL BIOCHEMIST REVIEWS)》123-130(2009)；Tomasz
Figure BDA0003597434960000371
使用基于pI的方法和ZipTip移液管尖端的蛋白质组学中的肽的分级分离(Fractionation of peptides in proteomics with the use of pI-basedapproach and ZipTip pipette tips)，34《药学和生物医学分析杂志(JOURNAL OFPHARMACEUTICAL AND BIOMEDICAL ANALYSIS)》851-860(2004)；C.F.Ivory，替代性电聚焦技术的简要综述(A Brief Review of Alternative Electrofocusing Techniques)，35《分离科学技术(Separation Science and Technology)》1777-1793(2000)；G.B.Smejkal，多室电解槽中的溶液相等电分级分离：用于分析复杂蛋白质组的分治策略(Solutionphase isoelectric fractionation in the multi-compartment electrolyser：Adivide and conquer strategy for the analysis of complex proteomes)，4《功能基因组学和蛋白质组学简报(BRIEFINGS IN FUNCTIONAL GENOMICS AND PROTEOMICS)》76-81(2005)；以及David Garfin，《细胞生物学精要(ESSENTIAL CELL BIOLOGY)》中的蛋白质的凝胶电泳(GEL ELECTROPHORESIS OF PROTEINS)，第1卷，实用方法，197-268(2003)，所述文献各自通过引用并入本文。
在基于pI的分级分离方面的进一步改进可以用于分级分离步骤，如SubhashiniSelvaraju和Ziad El Rassi，用于在生物流体和基质中耗竭、预分级分离和富集蛋白质以进行深入蛋白质组学分析的基于液相的分离系统(Liquid-phase-based separationsystems for depletion，prefractionation and enrichment of proteins inbiological fluids and matrices for in-depth proteomics analysis-An updatecovering theperiod)-涵盖时间段2008-2011的更新，33《电泳》74-88(2011)中描绘的方法。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括使用质谱仪进一步表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，所述表征可以包含鉴定从分级分离步骤获得的肽。可以通过比较源自多肽片段化的质谱与由蛋白质的计算机模拟消化产生的理论质谱来进一步进行肽鉴定。然后通过将肽序列分配给蛋白质来完成蛋白质推断。
如本文所使用的，术语“质谱仪”包含能够鉴定特定分子物种并且测量其准确质量的装置。所述术语意味着包含任何分子检测器，多肽或肽可以洗脱到所述分子检测器中以进行检测和/或表征。质谱仪可以包含三个主要部分：离子源、质量分析仪和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中，并且同时(如以电喷雾电离的方式)或通过单独的过程被电离。离子源的选择在很大程度上取决于应用。
在一些示例性实施例中，所述质谱仪可以是串联质谱仪。
如本文所使用的，术语“串联质谱”包含通过使用多阶段的质量选择和质量分离来获得关于样品基质分子的结构信息的技术。先决条件是样品基质分子可以被转移到气相中并被完整地电离，并且样品基质分子可以在第一质量选择步骤之后以一些可预测和可控制的方式被诱导分裂。多级MS/MS或MSn可以通过首先选择并分离前体离子(MS2)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS3)、将其碎裂、分离次级碎片(MS4)等来进行，只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号是可检测的。串联MS已通过各种分析仪组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析仪可以由许多不同的因素确定，如灵敏度、选择性和速度，以及大小、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析仪在空间上耦合或与空间串联分析仪耦合。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析仪。可以设计特定的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中离解，并且然后将产物离子传输到另一个分析仪进行m/z分离和数据获取。在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、隔离、碎裂和m/z分离。
通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后修饰的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。所述表征包含但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰或鉴定翻译后修饰或可比性分析或其组合。
如本文所使用的，术语“数据库”是指生物信息学工具，所述生物信息学工具提供了针对数据库中的所有可能序列搜索未解读的MS-MS光谱的可能性。此类工具的非限制性实例是Mascot(http：//www.matrixscience.com)、Spectrum Mill(http：//www.chem.agilent.com)、PLGS(http：//www.waters.com)、PEAKS(http：//www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(http：//download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(http：//www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(http：//www.sagenresearch.com)、OMSSA(http：//www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(http：//www.thegpm.org/TANDEM/)、蛋白质探勘者(Protein Prospector)(http：//www.http：//prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(https：//www.proteinmetrics.com/products/byonic)、Andromeda(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21254760)或Sequest(http：//fields.scripps.edu/sequest)。
在一些示例性实施例中，质谱仪可以与液相色谱系统联用。在另一示例性实施例中，质谱仪可以与纳米液相色谱联用。一方面，用于在液相色谱中洗脱蛋白质的流动相可以是可以与质谱仪相容的流动相。在具体方面，流动相可以是乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵、乙腈、水、甲酸、挥发性酸或其组合。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括使用高场非对称波形离子迁移率谱进一步表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。如本文所使用的，“高场非对称波形离子迁移率谱”或“FAIMS”或“差分迁移率谱”或“DMS”可以包含大气压离子迁移率技术，所述技术通过气相离子在强电场和弱电场中的行为来分离气相离子。FAIMS装置可以很容易地与电喷雾电离连接，并且已经在蛋白质组学研究中作为液相色谱(LC)与质谱(MS)之间的另外的分离模式实施。FAIMS分离可以与LC和MS两者正交，并且可以用作在线分级分离的方式以改进复杂样品中肽的检测。FAIMS可以通过过滤掉化学噪声来改进动态范围以及伴随地离子的检测限。FAIMS还可以用于去除干扰离子物种，并且选择通过串联MS鉴定最佳的肽电荷状态。可以在Swearingen和Moritz(Krisfian E Swearingen和Robert L Moritz，基于质谱的蛋白质组学的高场非对称波形离子迁移率谱(High-fieldasymmetric waveform ion mobility spectrometry for mass spectrometry-basedproteomics)，9《蛋白质组学的专家综述(Expert Review of Proteomics)》505-517(2012))发表的文章中找到关于FAIMS用于基于质谱的蛋白质组学的用途的综述，所述文献通过引用并入本文。可以在以下若干综述中找到关于FAIMS的进一步详细信息：RogerGuevremont，高场非对称波形离子迁移率谱：用于质谱的新工具(High-field asymmetricwaveform ion mobility spectrometry：A new tool for mass spectrometry)，1058《色谱杂志A》3-19(2004)；Alexandre A.Shvartsburg等人，蛋白质的场非对称波形离子迁移率谱研究：离子迁移率谱中的偶极对准？(Field Asymmetric Waveform Ion MobilitySpectrometry Studies of Proteins：Dipole Alignment in Ion MobilitySpectrometry？)，110《物理化学杂志B(THE JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B)》21966-21980(2006)；Beata M.Kolakowski和Zoltán Mester，高场非对称波形离子迁移率谱(FAIMS)和差分迁移率谱(DMS)的应用综述(Review of applications of high-fieldasymmetric waveform ion mobility spectrometry(FAIMS)and differential mobilityspectrometry(DMS))，132《分析师(THE ANALYST)》842(2007)，所有所述文献均通过引用并入本文。Kolakowski和Mester对FAIMS的一般综述，Nazarov和同事对FAIMS的一系列理论和实践探索(Nazarov，离子迁移率的电场依赖性(Electric field dependence of the ionmobility)，285《国际质谱杂志》149-156(2009))；Bradley B.Schneider等人，作为用于大气压电离质谱的预过滤器的平面差分迁移率光谱仪(Planar differential mobilityspectrometer as a pre-filter for atmospheric pressure ionization massspectrometry)，298《国际质谱杂志》45-54(2010)；Evgeny V.Krylov等人，用于差分迁移率谱的选择和产生(Selection and generation of waveforms for differentialmobility spectrometry)，81《科学仪器的评论(REVIEW OF SCIENTIFIC INSTRUMENTS)》024101(2010)；Bradley B.Schneider等人，差分迁移率质谱仪系统的分离过程中的化学效应的控制(Control of Chemical Effects in the Separation Process of aDiiferential Mobility Mass Spectrometer System)，16《欧洲质谱杂志(EUROPEANJOURNAL OF MASS SPECTROMETRY)》57-71(2010)；Stephen L.Coy等人，通过差分迁移率预过滤质谱(DMS-MS)检测辐射暴露生物标志物(Detection of radiation-exposurebiomarkers by differential mobility prefiltered mass spectrometry(DMS-MS))，291《国际质谱杂志》108-117(2010)；Bradley B.Schneider等人，差分迁移率质谱仪系统的分离过程中的化学效应的控制(Control of Chemical Effects in the SeparationProcess of a Diiferential Mobility Mass Spectrometer System)，16《欧洲质谱杂志》57-71(2010)以及Shvartsburg的书籍(ALEXANDRE A.SHVARTSBURG，差分离子迁移率谱非线性离子转运和FAIMS的基本原理(DIFFERENTIAL ION MOBILITY SPECTROMETRY NONLINEAR ION TRANSPORT AND FUNDAMENTALS oFFAIMS)(2009))，所有所述文献均通过引用并入本文。
任何商业或适配的质谱仪和FAIMS细胞/系统/装置可以用于表征宿主细胞蛋白。FAIMS池的大小可能有所不同-可以是长度为65mm、宽度为20mm以及分析间隙为2mm的“全大小”池(FS-FAIMS)；并且可以是长度为15mm、宽度为5mm以及分析间隙为0.38mm的“四分之一大小”池(QS-FAIMS)。所使用的FAIMS装置可以是通过Ionalytics进行的c-FAIMS或通过Sionex进行的p-FAIMS。也可以使用小型化的基于芯片的FAIMS系统，如从奥钛纳米科技公司(Owlstone Nanotech Inc.)获得的：UltraFAIMS A1和Lonestar气体分析仪。每个装置中的两个芯片由两个叉指电极构成，所述两个叉指电极在芯片的表面上产生蜿蜒的几何形状，其中每行是不同的平面FAIMS通道。来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)的FAIMS ProTM接口也可以用于所述方法。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与亲和色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白以及进行分级分离步骤的步骤。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与蛋白A色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白以及进行分级分离步骤的步骤。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白、进行分级分离步骤以及使用质谱仪表征宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白的步骤。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白、进行分级分离步骤以及使用串联质谱仪表征宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白的步骤。一方面，串联质谱仪可以是空间串联的或时间串联的。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白、进行分级分离步骤以及使用与液相色谱系统联用的质谱仪表征宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白的步骤。一方面，液相色谱系统可以是纳米液相色谱系统(nLC)。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白、进行分级分离步骤以及使用FAIMS-MS表征宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白的步骤。一方面，用于FAIMS的载气可以包含挥发性化学改性剂。在具体方面，挥发性化学改性剂可以是异丙醇或二氯甲烷。
在一个具体示例性实施例中，FAIMS装置可以与MS结合使用。在另一具体示例性实施例中，FAIMS装置可以与LC和MS结合使用。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白、进行分级分离步骤以及使用LC-FAIMS-MS表征宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白的步骤。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白以及进行分级分离步骤的步骤，其中所述方法可以能够表征比包括富集步骤而不包括分级分离步骤的方法多至少约20％的宿主细胞蛋白。一方面，所述方法可以能够表征多至少约20％的宿主细胞蛋白、多至少约25％的宿主细胞蛋白、多至少约30％的宿主细胞蛋白、多至少约35％的宿主细胞蛋白、多至少约40％的宿主细胞蛋白、多至少约45％的宿主细胞蛋白、多至少约50％的宿主细胞蛋白、多至少约55％的宿主细胞蛋白、多至少约60％的宿主细胞蛋白、多至少约65％的宿主细胞蛋白、多至少约70％的宿主细胞蛋白、多至少约75％的宿主细胞蛋白、多至少约80％的宿主细胞蛋白、多至少约85％的宿主细胞蛋白、多至少约90％的宿主细胞蛋白、多至少约95％的宿主细胞蛋白、多至少约100％的宿主细胞蛋白、多至少约105％的宿主细胞蛋白、多至少约110％的宿主细胞蛋白、多至少约115％的宿主细胞蛋白、多至少约120％的宿主细胞蛋白、多至少约125％的宿主细胞蛋白、多至少约130％的宿主细胞蛋白、多至少约135％的宿主细胞蛋白、多至少约140％的宿主细胞蛋白、多至少约145％的宿主细胞蛋白、多至少约150％的宿主细胞蛋白、多至少约155％的宿主细胞蛋白、多至少约160％的宿主细胞蛋白、多至少约165％的宿主细胞蛋白、多至少约170％的宿主细胞蛋白、多至少约175％的宿主细胞蛋白、多至少约180％的宿主细胞蛋白、多至少约185％的宿主细胞蛋白、多至少约190％的宿主细胞蛋白、多至少约195％的宿主细胞蛋白或多至少约200％的宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白以及进行分级分离步骤的步骤，其中所述方法可以能够表征比包括分级分离步骤而不包括富集步骤的方法多至少约20％的宿主细胞蛋白。一方面，所述方法可以能够表征多至少约20％的宿主细胞蛋白、多至少约25％的宿主细胞蛋白、多至少约30％的宿主细胞蛋白、多至少约35％的宿主细胞蛋白、多至少约40％的宿主细胞蛋白、多至少约45％的宿主细胞蛋白、多至少约50％的宿主细胞蛋白、多至少约55％的宿主细胞蛋白、多至少约60％的宿主细胞蛋白、多至少约65％的宿主细胞蛋白、多至少约70％的宿主细胞蛋白、多至少约75％的宿主细胞蛋白、多至少约80％的宿主细胞蛋白、多至少约85％的宿主细胞蛋白、多至少约90％的宿主细胞蛋白、多至少约95％的宿主细胞蛋白、多至少约100％的宿主细胞蛋白、多至少约105％的宿主细胞蛋白、多至少约110％的宿主细胞蛋白、多至少约115％的宿主细胞蛋白、多至少约120％的宿主细胞蛋白、多至少约125％的宿主细胞蛋白、多至少约130％的宿主细胞蛋白、多至少约135％的宿主细胞蛋白、多至少约140％的宿主细胞蛋白、多至少约145％的宿主细胞蛋白、多至少约150％的宿主细胞蛋白、多至少约155％的宿主细胞蛋白、多至少约160％的宿主细胞蛋白、多至少约165％的宿主细胞蛋白、多至少约170％的宿主细胞蛋白、多至少约175％的宿主细胞蛋白、多至少约180％的宿主细胞蛋白、多至少约185％的宿主细胞蛋白、多至少约190％的宿主细胞蛋白、多至少约195％的宿主细胞蛋白或多至少约200％的宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白以及进行分级分离步骤的步骤，其中所述方法可以能够表征比包括富集步骤而不包括分级分离步骤的方法多约20％-200％的宿主细胞蛋白。一方面，所述方法可以能够表征多约20％-约30％的宿主细胞蛋白、多约30％-约40％的宿主细胞蛋白、多约40％-约50％的宿主细胞蛋白、多约50％-约60％的宿主细胞蛋白、多约60％-约70％的宿主细胞蛋白、多约70％-约80％的宿主细胞蛋白、多约80％-约90％的宿主细胞蛋白、多约90％-约100％的宿主细胞蛋白、多约100％-约150％的宿主细胞蛋白或多约100％-约200％的宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。
在一些示例性实施例中，用于表征样品中的宿主细胞蛋白的方法可以包括通过使样品与色谱载体接触并且进行分级分离步骤富集样品中的宿主细胞蛋白的步骤，其中所述方法可以能够表征比包括分级分离步骤而不包括富集步骤的方法多约20％-200％的宿主细胞蛋白。一方面，所述方法可以能够表征多约20％-约30％的宿主细胞蛋白、多约30％-约40％的宿主细胞蛋白、多约40％-约50％的宿主细胞蛋白、多约50％-约60％的宿主细胞蛋白、多约60％-约70％的宿主细胞蛋白、多约70％-约80％的宿主细胞蛋白、多约80％-约90％的宿主细胞蛋白、多约90％-约100％的宿主细胞蛋白、多约100％-约150％的宿主细胞蛋白或多约100％-约200％的宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物以及通过使所述混合物与色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白。所述色谱载体可以是液相色谱载体。如上所述，液相色谱载体可以包含反相液相色谱、离子交换色谱、大小排阻色谱、亲和色谱、混合模式色谱、疏水性色谱或混合模式色谱。
如本文所使用的，“非变性消化条件”或“天然条件”可以包含不引起蛋白质变性的条件。蛋白质变性可以指分子的三维形状从其天然状态改变而不破坏肽键的过程。蛋白质变性可以使用如离液剂等蛋白质变性剂来进行。离液溶质通过干扰由非共价力，如氢键、范德华力和疏水性作用介导的分子内相互作用来增加系统的熵。非变性条件的非限制性实例包含水或缓冲液。所使用的水可以是蒸馏的和/或去离子的。在一些示例性实施例中，溶剂可以是HPLC级。缓冲液的非限制性实例可以包含乙酸铵、三盐酸盐、碳酸氢铵、甲酸铵或其组合。一方面，缓冲液的浓度可以为至多1M。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物以及通过使所述混合物与亲和色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物以及通过使所述混合物与蛋白A亲和色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；通过使所述混合物与色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及从亲和色谱载体收集流通物。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括：使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；通过使所述混合物与色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。一方面，所述质谱仪可以是串联质谱仪。串联质谱仪可以是空间串联的或时间串联的。一方面，所述质谱仪可以与液相色谱系统联用。另一方面，所述质谱仪可以与纳米液相色谱系统联用。一方面，用于在液相色谱中洗脱蛋白质的流动相可以是可以与质谱仪相容的流动相。在具体方面，流动相可以是乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵、乙腈、水、甲酸、挥发性酸或其组合。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置进行表征。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；通过使所述混合物与色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白，其中所述方法可以能够表征比包括不包括使所述混合物与色谱载体接触的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。一方面，所述方法可以能够表征多至少约50％宿主细胞蛋白、多至少约75％宿主细胞蛋白、多至少约100％宿主细胞蛋白、多至少约125％宿主细胞蛋白、多至少约150％宿主细胞蛋白、多至少约175％宿主细胞蛋白、多至少约200％宿主细胞蛋白、多至少约225％宿主细胞蛋白、多至少约250％宿主细胞蛋白、多至少约275％宿主细胞蛋白、多至少约300％宿主细胞蛋白、多至少约325％宿主细胞蛋白、多至少约350％宿主细胞蛋白、多至少约375％宿主细胞蛋白、多至少约400％宿主细胞蛋白、多至少约425％宿主细胞蛋白、多至少约450％宿主细胞蛋白、多至少约475％宿主细胞蛋白、多至少约500％宿主细胞蛋白、多至少约525％宿主细胞蛋白、多至少约550％宿主细胞蛋白、多至少约575％宿主细胞蛋白、多至少约600％宿主细胞蛋白、多至少约625％宿主细胞蛋白、多至少约650％宿主细胞蛋白、多至少约675％宿主细胞蛋白、多至少约700％宿主细胞蛋白、多至少约725％宿主细胞蛋白、多至少约750％宿主细胞蛋白、多至少约775％宿主细胞蛋白、多至少约800％宿主细胞蛋白、多至少约825％宿主细胞蛋白、多至少约850％宿主细胞蛋白、多至少约875％宿主细胞蛋白、多至少约900％宿主细胞蛋白、多至少约925％宿主细胞蛋白、多至少约950％宿主细胞蛋白、多至少约975％宿主细胞蛋白或多至少约1000％宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置进行表征。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；通过使所述混合物与色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白，其中所述方法可以能够表征比不包括使所述混合物与亲和色谱载体接触的方法多约50％-约100％的宿主细胞蛋白。一方面，所述方法可以能够表征多约50％-约100％的宿主细胞蛋白、约50％-约500％的宿主细胞蛋白、约100％-约500％的宿主细胞蛋白、约100％-约1000％的宿主细胞蛋白或约500％-约1000％的宿主细胞蛋白。一方面，所述色谱载体可以是亲和色谱载体。一方面，所述方法可以进一步包括使用FAIMS装置进行表征。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括：使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；通过使所述混合物与亲和色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及使用FAIMS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括：使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；通过使所述混合物与亲和色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及使用FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。一方面，用于FAIMS装置的载气可以包含挥发性化学改性剂。一方面，挥发性化学改性剂可以是异丙醇。另一方面，FAIMS装置可以与MS结合使用。在另一具体方面，FAIMS装置可以与LC和MS结合使用。在另一具体方面，FAIMS-MS可以与LC联用。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括：使具有宿主细胞蛋白的样品基质经受非变性消化条件以形成混合物；通过使所述混合物与亲和色谱载体接触来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；以及使用nLC-FAIMS-MS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括：通过使混合物与亲和色谱载体接触来富集样品基质中的宿主细胞蛋白以形成样品；使具有宿主细胞蛋白的样品经受非变性消化条件以形成混合物；以及使用FAIMS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白，其中所述方法可以能够表征比不包括FAIMS的方法多至少约15％的宿主细胞蛋白。一方面，所述方法可以能够表征多至少约15％的宿主细胞蛋白、多至少约16％的宿主细胞蛋白、多至少约17％的宿主细胞蛋白、多至少约18％的宿主细胞蛋白、多至少约19％的宿主细胞蛋白、多至少约20％的宿主细胞蛋白、多至少约21％的宿主细胞蛋白、多至少约22％的宿主细胞蛋白、多至少约23％的宿主细胞蛋白、多至少约24％的宿主细胞蛋白、多至少约25％的宿主细胞蛋白、多至少约26％的宿主细胞蛋白、多至少约27％的宿主细胞蛋白、多至少约28％的宿主细胞蛋白、多至少约29％的宿主细胞蛋白、多至少约30％的宿主细胞蛋白、多至少约31％的宿主细胞蛋白、多至少约32％的宿主细胞蛋白、多至少约33％的宿主细胞蛋白、多至少约34％的宿主细胞蛋白、多至少约35％的宿主细胞蛋白、多至少约36％的宿主细胞蛋白、多至少约37％的宿主细胞蛋白、多至少约38％的宿主细胞蛋白、多至少约39％的宿主细胞蛋白、多至少约40％的宿主细胞蛋白、多至少约41％的宿主细胞蛋白、多至少约42％的宿主细胞蛋白、多至少约43％的宿主细胞蛋白、多至少约44％的宿主细胞蛋白、多至少约45％的宿主细胞蛋白、多至少约46％的宿主细胞蛋白、多至少约47％的宿主细胞蛋白、多至少约48％的宿主细胞蛋白、多至少约49％的宿主细胞蛋白或多至少约50％的宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，用于表征宿主细胞蛋白的方法可以包括：通过使混合物与亲和色谱载体接触来富集样品基质中的宿主细胞蛋白以形成样品；使具有宿主细胞蛋白的样品经受非变性消化条件以形成混合物；以及使用FAIMS表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白，其中所述方法可以能够表征比不包括FAIMS的方法多至少约15％到约60％的宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)通过使样品与亲和色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白；以及(b)使用FAIMS表征宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)通过使样品与亲和色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白；以及(b)使用FAIMS表征宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白，其中所述方法能够表征比不包括步骤(b)的方法多至少约30％的宿主细胞蛋白。一方面，所述方法可以能够表征多至少约30％的宿主细胞蛋白、多至少约35％宿主细胞蛋白、多至少约40％宿主细胞蛋白、多至少约45％宿主细胞蛋白、多至少约50％宿主细胞蛋白、多至少约55％宿主细胞蛋白、多至少约60％宿主细胞蛋白、多至少约65％宿主细胞蛋白、多至少约70％宿主细胞蛋白、多至少约75％宿主细胞蛋白、多至少约80％宿主细胞蛋白、多至少约85％宿主细胞蛋白、多至少约90％宿主细胞蛋白、多至少约95％宿主细胞蛋白或多至少约100％宿主细胞蛋白。
在一些示例性实施例中，用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法可以包括：(a)通过使样品与亲和色谱载体接触来富集样品中的宿主细胞蛋白；以及(b)使用FAIMS表征宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白，其中所述方法能够表征比不包括步骤(b)的方法多至少约30％到约75％的宿主细胞蛋白。
应当理解，所述方法不限于任何前述蛋白质、宿主细胞蛋白、色谱载体、质谱、分级分离方法，并且用于表征宿主细胞蛋白质的方法可以通过任何合适的方式进行。
如本文提供的用数字和/或字母连续标记的方法步骤并不意味着将所述方法或其任何实施例限制为特定指示顺序。
在整个说明书中引用了各种出版物，包含专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文章和学术文章。这些所引用的参考文献中的每个参考文献通过引用整体并且出于所有目的并入本文。
通过参考以下实例，将更充分地理解本发明。然而，以下实例不应被解释为限制本发明的范围。
实例
(A)针对包括Ab1的制剂鉴定的HCP的数量。
材料：去离子水由安装有MilliPak Express20过滤器(马萨诸塞州伯灵顿密理博西格玛公司(MilliporeSigma，Burlington，MA))的Milli-Q整体水净化系统提供。乙酸铵(LC/MS级)、乙酸和碳酸氢铵(LC/MS级)、来自普洛麦格公司(Promega)的供应有重悬浮缓冲液的测序级修饰的胰蛋白酶、来自英杰公司(Invitrogen)的pH为7.5的UltraPure 1MTris-HCl、来自英杰公司的pH为8的UltraPure 1M Tris-HCl、来自赛默飞世尔科技公司的三氟乙酸(TFA，测序级)、来自飞世尔公司(Fisher)的乙腈(Optima LC/MS级)、来自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)的冰乙酸、来自西格玛奥德里奇公司的碘乙酰胺、来自西格玛奥德里奇公司的二硫苏糖醇(DTT)、来自阿法埃莎(Alfa Aesar)的尿素(超纯)、来自赛默飞世尔科技公司的pH为8.4的达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、来自通用电气医疗集团的rProtein A琼脂糖快速流动抗体纯化树脂以及来自西格玛奥德里奇公司的乙酸铵(LC/MS级)。针对HCP分析的制剂包含抗体Ab1。
数据分析：使用嵌入到Proteome Discoverer 2.2(赛默飞世尔科技公司)中的SEQUEST和MASCOT，针对SwissProt小鼠蛋白质数据库进行肽数据库搜索。搜索参数为：通过离子阱分析的前体离子质量的容差为20ppm，碎片离子质量的容差为0.5Da。在数据库搜索期间指定胰蛋白酶。将甲硫氨酸氧化(+16Da)设定为可变修饰。错误发现率(FDR)是通过使用靶-诱饵策略来确定的，并且被设定为1％用于肽鉴定并且设定为5％用于蛋白质鉴定，其中每种蛋白质检测最少1种独特肽(Alexander S.Hebert等人，一小时酵母蛋白质组(TheOne Hour Yeast Proteome)，13《分子与细胞蛋白质组学(MOLECULAR&CELLULARPROTEOMICS)》339-347(2013))。
实例1：采集的细胞培养液中的HCP
将采集的细胞培养液干燥，并且在8M尿素、100mM Tris-HCl中重构。将样品用10mM二硫苏糖醇还原并在50℃下温育30分钟。然后将还原的样品在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化1小时。烷基化后，将样品用分子量截留过滤器缓冲液交换到100mM碳酸氢铵中，并且在37℃下在黑暗中用胰蛋白酶(1∶20w/w酶∶底物比率)消化过夜。然后通过添加三氟乙酸(TFA)终止消化。然后通过反相液相色谱分离所得胰蛋白酶肽，随后进行在线质谱分析。使用Thermo Scientific Easy-nLC 1200通过以下步骤进行分离：通过首先在ThermoScientific Acclaim PepMapTM 100阱柱(C18，75μm ID；床长度：2cm；粒度：3μm；孔径：
Figure BDA0003597434960000481
)上对胰蛋白酶肽进行浓缩和脱盐，并且然后在填充有Acquity BEH固定相(C18，粒度：1.7μm；孔径：
Figure BDA0003597434960000482
)的新型Objective PicoFrit柱(360μm OD；75μm ID；10μm尖端ID；床长度：25cm)上使用含有0.1％甲酸的水(流动相A)和含有0.1％甲酸的80％乙腈/20％水(流动相B)将所述胰蛋白酶肽分离。使用保持在6％流动相B持续前10分钟，然后在接下来的120分钟内从6％增加到50％流动相B的梯度曲线分离肽。MS和MS/MS实验是在具有用于MS/MS实验的肽片段化的较高能量碰撞解离(HCD)的Thermo Scientific Orbitrap Fusion LumosTribrid质谱仪上进行的(Thermo-Orbitrap Fusion(Q-OT-qIT，美国加利福尼亚州圣何塞市的赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific，San Jose，CA，USA)))。
在没有任何处理的情况下，在HCCF中鉴定的HCP的数量为1279(参见图1)。另外，在没有任何处理的情况下，在HCCF中鉴定的独特肽的总数为5675。
实例2：使用蛋白A耗竭表征HCP
2.1蛋白A色谱
将蛋白质样品干燥并重悬浮于DPBS中。将rProtein A琼脂糖凝胶填充在柱中并且用5个柱体积的DPBS，pH 8.4平衡。将蛋白质样品移液到每个柱上并且在室温下温育4分钟。收集并保存HCP流通物。将每个柱用3个柱体积的pH为8.4的DPBS洗涤，并且将HCP洗脱液与流通物组合。将收集的HCP洗脱液缓冲液交换到50mM乙酸铵中。
2.2 HCP分析
如实例1所展示的，在分析HCP洗脱液之前对其进行处理。
使用蛋白A色谱鉴定的HCP的数量为1906(参见图1)。另外，使用蛋白A色谱在HCCF中鉴定的独特肽的总数为9245。
实例3：使用分级分离方法表征HCP
PierceTM高pH反相肽分级分离试剂盒用于此步骤(参见图2)。
3.1旋转柱的调节
去除并丢弃来自柱底部的保护性白色尖端，并且将柱置于2.0mL样品管中。将管在5000×g下离心2分钟，以去除溶液并填充树脂材料，并且丢弃液体。去除顶部螺旋盖，并且向柱加载300μL ACN(飞世尔公司)到柱中，并且更换盖，并且将旋转柱放回到2.0mL样品管中并在5000×g下离心2分钟。丢弃ACN并且报告洗涤步骤。然后将旋转柱用0.1％TFA溶液(赛默飞世尔科技公司)洗涤两次，如以上针对ACN洗涤所描述的。
3.2 HCCF的分级分离
根据表1所示制备洗脱溶液。将来自采集的细胞培养液的100μg蛋白质添加到300μL 0.1％TFA溶液中。将旋转柱置于新的2.0mL样品管中，并且将样品溶液加载到柱上。在更换顶盖之后，将样品管在3000×g下离心2分钟。收集“流通物”级分。然后将柱置于新的2.0mL样品管中，并且将[300]μL水添加到柱上并再次离心以收集“洗涤”级分。然后将柱置于新的2.0mL样品管中，并且向其中添加[300]μL的适当的洗脱溶液并在3000×g下离心2分钟以收集级分。在新的2.0mL样品管中，使用来自表1的适当的洗脱溶液，针对剩余的步骤梯度级分重复此步骤。使用真空离心(例如，SpeedVac浓缩器)将每个样品管的液体内容物蒸发至干燥。在LC-MS分析之前，将干燥样品重悬浮于适当体积的0.1％甲酸(FA)中。
3.3 HCP分析
如实例1中所展示的，在分析之前对所述级分中的每种级分进行处理。通过分级分离方法鉴定的HCP的数量为2023(参见图3)。另外，使用分级分离方法在HCCF中鉴定的独特肽的总数为11750。
表1.
级分编号 乙腈(％) 乙腈(μL) 三乙胺(0.1％)(μL)
1 5.0 50 950
2 7.5 75 926
3 10.0 100 900
4 12.5 125 875
5 15.0 150 850
6 17.5 175 825
7 20.0 200 800
8 50.0 500 500
实例4：使用蛋白A耗竭和分级分离方法表征HCP。
4.1蛋白A色谱
使用如实例2中所述的方法进行蛋白A色谱。
用10mM二硫苏糖醇还原流通物中的蛋白质并在50℃下温育30分钟。然后将还原的样品在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化1小时。烷基化后，将样品用分子量截留过滤器缓冲液交换到100mM碳酸氢铵中，并且在37℃下在黑暗中用胰蛋白酶(1∶20w/w酶∶底物比率)消化过夜。然后通过添加三氟乙酸(TFA)终止消化。然后使所得胰蛋白酶肽经受分级分离步骤。
4.2分级分离步骤
将所得胰蛋白酶肽如实例3中所述进行分级分离。
4.3 HCP分析
通过使用反相液相色谱使从步骤4.2中获得的经分级分离肽经受分离，随后进行在线质谱分析。使用Thermo Scientific Easy-nLC 1200通过以下步骤进行分离：通过首先在Thermo Scientific Acclaim PepMapTM 100阱柱(C18，75μm ID；床长度：2cm；粒度：3μm；孔径：
Figure BDA0003597434960000501
)上对胰蛋白酶肽进行浓缩和脱盐，并且然后在填充有Acquity BEH固定相(C18，粒度：1.7μm；孔径：
Figure BDA0003597434960000502
)的新型Objective PicoFrit柱(360μm OD；75μm ID；10μm尖端ID；床长度：25cm)上使用含有0.1％甲酸的水(流动相A)和含有0.1％甲酸的80％乙腈/20％水(流动相B)将所述胰蛋白酶肽分离。使用保持在6％流动相B持续前10分钟，然后在接下来的120分钟内从6％增加到50％流动相B的梯度曲线分离肽。MS和MS/MS实验是在具有用于MS/MS实验的肽片段化的较高能量碰撞解离(HCD)的Thermo Scientific OrbitrapFusion Lumos Tribrid质谱仪上进行的(Thermo-Orbitrap Fusion(Q-OT-qIT，美国加利福尼亚州圣何塞市的赛默飞世尔科技公司)。
通过所述方法(用蛋白A和分级分离步骤)鉴定的HCP的数量为3195(参见图4)。另外，使用改进的方法(用蛋白A和分级分离步骤)在HCCF中鉴定的独特肽的总数为23133。
实例5：使用正常消化表征HCP
5.1样品制备
在pH为7.4的100mM碳酸氢铵中，用胰蛋白酶消化Ab1，所述胰蛋白酶以1∶20的混合物∶底物浓度添加。
5.2HCP分析
使用实例1中概述的方法分析所获得的HCP的消化物。通过所述方法鉴定的HCP的数量为7(参见图5)，并且鉴定的独特肽的总数为9。
实例6：使用天然消化表征HCP
6.1样品制备
通过干燥样品并重悬浮于pH为8的25mM tris-HCl缓冲液中来对Ab1进行处理。将样品用胰蛋白酶(1∶400w/w酶∶底物比率)在37℃下消化过夜，其中最终pH为约7.4。将样品用3mM二硫苏糖醇还原并在90℃下温育10分钟。将样品酸化至约0.2％甲酸并在15000x g下离心2分钟。将上清液用于LC/MS分析。
6.2 HCP分析
使用实例1中概述的方法分析所获得的HCP的消化物。通过所述方法鉴定的HCP的数量为20(参见图5)，并且鉴定的独特肽的总数为37。
实例7：使用蛋白A耗竭随后是天然消化表征HCP
使用如实例2中所述的方法在蛋白A色谱耗竭后产生来自实验6.1的消化物。如上所述收集和分析流通物。通过这种方法(天然消化和蛋白A色谱)鉴定的HCP的数量为132(参见图6)，并且鉴定的独特肽的总数为424。
实例8：使用蛋白A耗竭表征HCP
8.1蛋白A色谱
将蛋白质样品干燥并重悬浮于DPBS中。将rProtein A琼脂糖凝胶填充在柱中并且用5个柱体积的DPBS，pH 8.4平衡。将蛋白质样品移液到每个柱上并且在室温下温育4分钟。收集并保存HCP流通物。将每个柱用3个柱体积的pH为8.4的DPBS洗涤，并且将HCP洗脱液与流通物组合。将收集的HCP洗脱液缓冲液交换到50mM乙酸铵中。
8.2 HCP分析
将HCP洗脱液干燥，并且在8M尿素、100mM Tris-HCl中重构。将样品用10mM二硫苏糖醇还原并在50℃下温育30分钟。然后将还原的样品在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化1小时。烷基化后，将样品用分子量截留过滤器缓冲液交换到100mM碳酸氢铵中，并且在37℃下在黑暗中用胰蛋白酶(1∶20w/w酶∶底物比率)消化过夜。然后通过添加三氟乙酸(TFA)终止消化。然后通过反相液相色谱分离所得胰蛋白酶肽，随后进行在线质谱分析。使用ThermoScientific Easy-nLC 1200通过以下步骤进行分离：通过首先在Thermo ScientificAcclaim PepMapTM 100阱柱(C18，75μm ID；床长度：2cm；粒度：3μm；孔径：
Figure BDA0003597434960000521
)上对胰蛋白酶肽进行浓缩和脱盐，并且然后在填充有Acquity BEH固定相(C18，粒度：1.7μm；孔径：
Figure BDA0003597434960000522
)的新型Objective PicoFrit柱(360μm OD；75μm ID；10μm尖端ID；床长度：25cm)上使用含有0.1％甲酸的水(流动相A)和含有0.1％甲酸的80％乙腈/20％水(流动相B)将所述胰蛋白酶肽分离。使用保持在6％流动相B持续前10分钟，然后在接下来的120分钟内从6％增加到50％流动相B的梯度曲线分离肽。MS和MS/MS实验是在具有用于MS/MS实验的肽片段化的较高能量碰撞解离(HCD)的Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪上进行的(Thermo-Orbitrap Fusion(Q-OT-qIT，美国加利福尼亚州圣何塞市的赛默飞世尔科技公司)。
使用蛋白A色谱鉴定的HCCF中的Ab1的HCP的数量为1759(参见图7)，并且独特肽的总数为7086。
实例9：使用蛋白A耗竭和FAIMS装置表征HCP
将来自在实例8中进行的蛋白A色谱的流通物中的蛋白质消化成肽并且使用如下所述的系统进行分析。
对于FAIMS启用的实验，除了将FAIMS装置置于纳米电喷雾源与质谱仪之间之外，设置与以上实例中所描述的设置相同。通过以下设置进行FAIMS分离：内电极温度＝100℃(除另有说明外)，外电极温度＝100℃，FAIMS载气流量＝4.6升/分钟，具有DV的非对称波形＝-5000V，入口板电压＝250V以及CV稳定时间＝25毫秒。FAIMS载气仅为N2，并且离子分离间隙为1.5mm。将所述CV应用于FAIMS电极。对于外部步进或单一CV实验，在整个分析中将所选择的CV应用于所有扫描。对于内部CV步进实验，将所选择的CV中的每一个应用于连续调查扫描和MS/MS循环(1秒)；MS/MS CV始终与来自对应调查扫描的适当CV配对。
使用蛋白A色谱结合使用FAIMS装置鉴定的HCCF中的Ab1的HCP的数量为2641(参见图7)，并且独特肽的总数为10606。
实例10：使用天然消化和蛋白A色谱表征HCP
10.1蛋白A色谱
使用如实例2中所述的方法，使用蛋白A色谱耗竭对Ab1样品进行纯化。如下所述收集和消化流通物。
10.2天然消化
通过干燥样品并重悬浮于pH为8的25mM tris-HCl缓冲液中来对Ab1进行处理。将样品用胰蛋白酶(1∶400w/w酶∶底物比率)在37℃下消化过夜，其中最终pH为约7.4。将样品用3mM二硫苏糖醇还原并在90℃下温育10分钟。将样品酸化至约0.2％甲酸并在15000x g下离心2分钟。将上清液用于LC/MS分析。
通过这种方法(天然消化和蛋白A色谱)鉴定的mAb1的HCP的数量为146(参见图8)，并且鉴定的独特肽的总数为363。
实例11：使用天然消化、蛋白A色谱和FAIMS表征HCP
还使用如实例9中所述的FAIMS装置分析来自实例10的上清液。
使用在结合使用FAIMS装置之后使用天然消化条件的方法鉴定的HCP的数量为214(参见图8)，并且独特肽的总数为505。
(B)针对包括Ab1的制剂鉴定的HCP的数量。
化学品：冰乙酸、尿素、碘乙酰胺(IAM)和二硫苏糖醇(DTT)购自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯)。三氟乙酸(TFA)、甲酸(FA)、乙腈和达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS 10x，无钙，无镁)从赛默飞世尔科技公司(伊利诺伊州罗克福德)获得，而rProtein A琼脂糖凝胶快速流动珠购自通用电气医疗集团(瑞典乌普萨拉)。具有重悬浮缓冲液的测序级修饰的胰蛋白酶是从普洛麦格公司(威斯康星州麦迪逊)获得的，tris HCl缓冲液(pH7.5和8.0)是从英杰公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德)获得的，并且人源化IgG1κ单克隆抗体标准品RM 8671购自国家标准和技术研究所(NIST)。
蛋白A耗竭：将药物物质缓冲液交换到DPBS中，调节至pH 8.4。将1mL蛋白A柱用五个柱体积的DPBS平衡。将药物物质添加到蛋白A柱中并且在室温下温育4分钟。将每个柱用三个柱体积的DPBS洗涤，并且收集洗脱液和流通物。通过在3000g和5℃下离心，将流通物和洗脱液用Amicon Ultra 3kDa离心过滤器(密理博公司(Millipore))缓冲液交换到50mM乙酸铵中。使用NanoDrop 1000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)测量蛋白质浓度。将来自每个样品中的蛋白质在真空中干燥或储存在-80℃下。
标准消化：将经干燥的药物物质样品在8M尿素/100mM Tris-HCl中重构。将蛋白质用10mM DTT还原并且在50℃下温育30分钟。将样品冷却到室温并用15mM IAM在黑暗中烷基化1小时。按照制造商的说明，将混合物用Amicon Ultra 3kDa离心过滤器(密理博公司)缓冲液交换到100mM碳酸氢铵中。用胰蛋白酶(1∶20的胰蛋白酶∶底物比率)在37℃下进行蛋白水解消化过夜。通过酸化至0.2％FA来淬灭消化。
天然消化：Huang等人2017，同上提供了对天然消化的详细描述。简而言之，将样品干燥并重悬于pH为8的25mM tris-HCl缓冲液中。然后将样品用胰蛋白酶(1∶400w/w酶∶底物比率)在37℃下消化过夜，其中最终pH为约7.4。随后，将样品用3mM DTT还原并在90℃下温育10分钟。将样品酸化至约0.2％FA并在15000g下离心2分钟。将上清液去除并用于LC-MS2分析。
NanoLC-MS2：将大约1μg消化的蛋白质注射到具有Easy-nLC(赛默飞世尔科技公司)的C18柱上(新Objective PicoFrit柱，360μm OD，75μm ID，10μm尖端ID，25cm床长度，填充有BEH C18颗粒[1.7μm，
Figure BDA0003597434960000541
沃特世公司(Waters)])。流动相A含有0.1％FA/水，并且流动相B含有0.1％FA/80％乙腈/20％水。线性LC梯度建立如下：0-10min：6％B；130分钟：50％B；140-155分钟：100％B。在配备有FAIMS Pro接口(赛默飞世尔科技公司)的OrbitrapFusion Lumos Tribrid质谱仪上分析洗脱液。由于蛋白A耗竭和天然消化物降低了样品中肽的动态范围，因此实施了标准蛋白质组学MS设置(例如，参见Alexander S.Hebert等人，一小时酵母蛋白质组，13《分子与细胞蛋白质组学》339-347(2013))。简而言之，在轨道阱中以一秒的循环时间进行调查扫描。MS扫描的m/z范围为360-1600，分辨率为60K，AGC目标为5E5，并且最大注入时间为50毫秒。在MS循环之间进行HCD碎裂，其中归一化碰撞能量为30％，随后在离子阱中进行分析。MS2扫描的m/z范围为100-2000，AGC目标为1E4，并且最大注入时间为35毫秒。将动态排除持续时间设定为30秒，具有单一重复计数，并且仅分析具有+2到+8的电荷状态的前体。Hebert等人已经描述了FAIMS Pro接口的操作(AlexanderS.Hebert等人，在混合轨道阱质谱仪上使用FAIMS的综合单次蛋白质组学(ComprehensiveSingle-Shot Proteomics with FAIMS on a Hybrid Orbitrap Mass Spectrometer)，90《分析化学》9529-9537(2018))。简而言之，将FAIMS电极温度设定为100℃，FAIMS载气流量为4.7升/分钟N2，具有DV的非对称波形为-5000V，入口板电压为250V，CV建立时间为25毫秒，并且将CV设定为-50V、-65V和-85V。当不用于实验时，将FAIMS Pro接口从MS去除。
数据分析：使用嵌入到Proteome Discoverer 2.2(赛默飞世尔科技公司)中的SEQUEST和Mascot，针对包含常见污染物的SwissProt小鼠蛋白质数据库进行肽和蛋白质鉴定的数据库搜索。对于通过轨道阱分析的前体离子质量，质量容差为20ppm，并且对于通过离子阱分析的碎片离子质量，质量容差为0.5Da。在数据库搜索期间指定胰蛋白酶。对于正常(烷基化)消化物，将甲硫氨酸氧化(+16Da)设定为可变修饰，并且将半胱氨酸氨基甲酰甲基化设定为固定修饰。错误发现率(FDR)是通过使用靶-诱饵策略来确定的，并且被设定为1％用于肽鉴定并且设定为5％用于蛋白质鉴定，其中每种蛋白质检测最少2种独特肽。
通过LC-MS2进行的HCP分析的一个主要挑战是与药物溶液(DS)中的治疗性蛋白质相比非常低的HCP浓度(约1-100ng HCP/mg产物)。由于胰蛋白酶肽在质谱仪中的表现几乎相同，不论胰蛋白酶肽是从哪种蛋白质加工而来，并且治疗性蛋白质在DS中大量存在，因此来自HCP的胰蛋白酶肽在典型的分析过程中遭受信号抑制和背景增加。为了检测在DS中与治疗性蛋白质共洗脱的1ppm HCP污染物，质谱仪需要超过六个数量级的动态范围，这超出了当前质谱仪可以实现的范围。这种灵敏度要求需要优化典型的蛋白质组学工作流程中的每个步骤，包含样品的消化、色谱/分离和仪器分析。但是，由于增加的灵敏度仅是分析的单个方面，因此还必须考虑资源和样品吞吐量。比较了用于改进HCP检测的若干种方法，以推荐实现分析的复杂性、速度与深度之间的平衡。为了在优化HCP方案的同时产生可广泛比较的数据集，使用国家标准和技术研究所人源化IgG1κ单克隆抗体标准品(NISTmAb)，但结果显示与所测试的其它治疗性蛋白质相同的趋势(数据未示出)。
实例12：使用NISTmAb的方法比较和优化
先前，Huang等人，同上报道了减轻HCP分析中的动态范围问题的简单且有效的方法，创造了“天然消化物(native digest)”。通过选择性消化较低丰度的HCP并且使相对较大且稳定的抗体保持完整，其显著减少了来自抗体肽的干扰，并且因此检测到的HCP数量远大于典型消化中的HCP数量。发现证实了这些结果(图＞9A)；与“正常”胰蛋白酶消化物(即，在消化前进行还原和烷基化的胰蛋白酶消化物)相比，相较于使用“天然”消化物，鉴定了超过四倍的HCP，以及独特肽数量的成比例增加(表1)。为了进行比较，使用蛋白A柱耗竭抗体样品(图9B)。发现蛋白A耗竭是比天然消化更有效的策略，检测与对照样品(正常消化)相比大约十倍多的HCP以及独特肽数量的成比例增加。然而，两种程序都有优点。例如，天然消化物比需要耗竭和消化的蛋白A方案需要更少的样品制备和起始材料，但还应注意，蛋白A耗竭可以是自动化的，并且样品分析不需要任何另外的仪器时间。
表1：分析中检测到的HCP和独特肽的数量
Figure BDA0003597434960000551
Figure BDA0003597434960000561
虽然这些结果代表了对HCP的传统鸟枪法蛋白质组学分析的相当大的改进，但在上述实验中检测到的大多数肽仍然来自抗体而不是所关注蛋白质。因此，测试了天然消化和蛋白A耗竭的组合，以确定与独立地蛋白A耗竭或天然消化相比，人们是否可以通过减少来自DS的干扰来进一步改善HCP肽信号。事实上，将天然消化物与蛋白A耗竭后的天然消化物进行比较表明灵敏度显著增加，超过了已经有效的单一方法可以提供的灵敏度(图9C)。从蛋白A耗竭和本机消化的结合中，检测到纯化DS样品中511个HCP，远远超过了本机消化样品(已鉴定84个HCP)和蛋白质A耗竭与自然消化样品(已鉴定144个HCP)。此外，结果是高度互补的，其中在先前的NISTmAb分析中检测到的超过99％的HCP也在蛋白A耗竭的天然消化物样品中检测到。这表明这些耗竭与消化策略之间的蛋白质鉴定中几乎没有偏差。考虑到HCP与治疗性蛋白质共纯化的频率(参见，Aboulaich等人，同上；Levy等人，(2014)，同上；以及Levy等人，.(2018)，同上)，存在合理的担忧：蛋白A耗竭或耗竭治疗性蛋白质或富集HCP的任何其它方法也可能无意地去除HCP。然而，由于在A蛋白耗竭的样品中也检测到在没有A蛋白耗竭的分析中检测到的几乎所有HCP，因此灵敏度的增加超过任何损失是由于HCP与蛋白A或治疗性蛋白质之间的相互作用引起的。
这些结果强调了减少来自DS背景干扰的重要性。然而，在组合多种耗竭方法后，发现DS的进一步去除不再有用，因为在蛋白A耗竭的天然消化物样品中检测到的主峰不再仅来自DS肽，而是来自HCP、蛋白A、胰蛋白酶自溶和其它肽的组合。本质上，最丰富的肽与最不丰富的肽之间的动态范围被降低到大约两个数量级，并且因此治疗性蛋白质的进一步去除不太可能增加对HCP的灵敏度。然而，这项分析还显示，一旦治疗性蛋白质耗竭，经纯化DS样品是多么复杂，其中在单个样品中检测到超过500种蛋白质和数千种肽(表1)。因此，似乎有可能的是，更好的肽分离和更快的MS分析将有助于进一步增加分析深度。事实上，这个策略将可能在大多数鸟枪法蛋白质组学分析中增加蛋白质鉴定。然而，重要的是考虑这种策略的增加的复杂性。例如，先前已经讨论了将分级分离用于HCP分析(Kufer等人，同上)。虽然发现DS的分级分离仍然是有用的，但其代表了仪器时间的显著增加，这对于常规分析是有问题的。离子迁移率是可以不添加样品制备和仪器时间的情况下实现与分级分离类似的益处的替代方案(参见，Doneanu等人，(2015)，同上)。
实例13：使用NISTmAb的方法比较和优化
研究高场非对称波形离子迁移率谱(FAIMS)作为可以用于代替DS肽分级分离的可能技术。其它地方已经详细报道了FAIMS的概述(参见，Hebert等人，(2018)，同上)。简而言之，FAIMS细胞驻留在纳米喷雾发射器与质谱仪传移管之间的接口处；内部是可以施加补偿电压(CV)的圆形电极。这使得离子能够在进入质谱仪之前进行气相分离。由于CV可以快速改变(约25毫秒/转换)，因此可以在整个单个运行中在多个CV之间切换，并且由此简化单个扫描。
举例来说，考虑使用和不使用FAIMS的同一样品运行，如图10所示。即使对于如通过蛋白A柱和天然消化而耗竭治疗性蛋白质的样品，所检测的许多主要肽仍来自治疗性蛋白质。在这些肽的洗脱期间进行的全MS扫描表明潜在感兴趣的若干离子。虽然主要的DS肽离子是丰富的，但存在可能是HCP肽并且保证分析的若干其它较低丰度的离子，但在下一个峰开始洗脱之前可能不被选择用于MS2片段化。这是特别令人担忧的，由于HCP离子通常比DS肽离子强度低两个数量级，即使在治疗性蛋白质已经耗竭的样品中也是如此。相比之下，如果使用具有三个不同CV的FAIMS细胞运行同一样品，则获得三个独特的基峰色谱图(BPC)。在-50V的CV下，BPC与不使用FAIMS的样品运行类似，并且在全MS光谱中，观察到相同的主要DS肽离子。在具有-85V和-65V的CV的光谱中，DS肽离子消失，从而使得能够分析在没有FAIMS的情况下未检测到的HCP肽。在此实例中，FAIMS基本上将样品分成三次不同的运行，而没有出现占空比的任何显著增加或另外的样品制备步骤。
FAIMS用于HCP分析的主要优势是它能够降低样品复杂度，从而能够检测更多低丰度肽。原则上，其类似于其它类型的分级分离而不需要另外的样品制备或仪器时间。另外，由于FAIMS的过滤效应引起的背景噪声的降低也可以允许更好的前体离子选择和改进的MS2光谱，从而增加肽ID的置信度。虽然FAIMS接口可能潜在地降低信号，但信号的任何降低都伴随有背景噪声的降低(即，在大多数观察到的情况下，信噪比得到改善)。与不使用FAIMS运行的样品相比，发现添加FAIMS使HCP的鉴定提高了约20％(表1和图9D)。
通过这种优化的工作流程，不仅鉴定了大量HCP(使用FAIMS在蛋白A耗竭的天然消化物样品中的602)，而且发现其高度强健并且与先前报道的方法很好地保持一致。当提及针对HCP含量分析DS时，再现性尤其重要，并且发现这里描述的技术是相当可再现的(图11)。例如，上述优化方法中的HCP鉴定在复制样品之间变化最多4％。如图12所示，即使在不同的技术或样品制备之间也存在非常广泛的重叠。在不使用FAIMS的情况下检测到的蛋白A耗竭的天然消化物样品所特有的63种蛋白质说明，HCP的最大数量可以通过将样品运行一次使用FAIMS和一次不使用FAIMS后获得的鉴定组合来获得。这些结果也与文献报道的结果很好地匹配，使用优化方案鉴定了Huang等人，同上报告的60种蛋白质中的59种(图9E)。复制品与方案之间的这种一致性为这些技术在生物制药生产期间HCP的常规分析中的使用提供了强有力的支持。
首先耗竭蛋白A柱上的抗体的样品，然后在沉淀任何剩余抗体的同时特异性消化HCP并且最终使用高场非对称波形离子迁移率谱(FAIMS)通过鸟枪法蛋白质组学和补偿电压(CV)切换来降低光谱复杂性的这种多因素方法(如图13所示)允许比任何单一方法大一个数量级的分析深度，同时保持HCP常规分析所需的简单性和高通量。

Claims (43)

1.一种用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法，所述方法包括：
通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白；
对来自所述亲和色谱的流通物进行分级分离；以及
使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和色谱载体是蛋白A色谱载体。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括用洗涤缓冲液洗涤所述亲和色谱载体并且收集所述流通物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述亲和色谱载体包括蛋白A或蛋白G。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述蛋白A或所述蛋白G固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪是串联质谱仪。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述质谱仪与液相色谱系统联用。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述液相色谱系统是纳米液相色谱系统。
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用高场非对称波形离子迁移率谱装置表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品基质进一步包括所关注蛋白质。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述所关注蛋白质是抗体。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述所关注蛋白质是融合蛋白。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级分离是基于大小的分级分离。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级分离是基于疏水性的分级分离。
15.根据权利要求1所述的方法，其中分级分离是基于电荷的分级分离。
16.根据权利要求1所述的方法，其中分级分离是基于pI的分级分离。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述分级分离包括通过液相色谱进行的分级分离。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述液相色谱是反相液相色谱。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法能够表征比通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白而不进行所述分级分离步骤的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法能够表征比进行分级分离而不通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白的方法多至少约50％的宿主细胞蛋白。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法能够表征比通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白而不进行所述分级分离步骤的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法能够表征比进行分级分离而不通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白的方法多至少约50％到约75％的宿主细胞蛋白。
23.一种用于表征具有所关注蛋白质的样品基质中的宿主细胞蛋白的方法，所述方法包括：
通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白；
用洗涤缓冲液洗涤所述亲和色谱载体；
收集流通物；
对在进行所述富集步骤之后获得的样品进行分级分离；以及
使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述流通物具有比所述样品基质减少的量的所关注蛋白质。
25.一种用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法，所述方法包括：
通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触以获得混合物来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白；
使所述混合物经受非变性消化条件；以及
使用质谱仪表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述亲和色谱载体是蛋白A色谱载体。
27.根据权利要求25所述的方法，其进一步包括从所述亲和色谱载体中收集所述流通物。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述亲和色谱载体包括蛋白A或蛋白G。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述蛋白A或所述蛋白G固定在琼脂糖或琼脂糖凝胶树脂上。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述质谱仪是串联质谱仪。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述质谱仪与液相色谱系统联用。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述液相色谱系统是纳米液相色谱系统。
33.根据权利要求25所述的方法，其中所述质谱仪是高场非对称波形离子迁移率谱仪。
34.根据权利要求28所述的方法，其中所述样品基质进一步包括所关注蛋白质。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述所关注蛋白质是选自由以下组成的组的至少一种：抗体或其片段或衍生物、融合蛋白和生理学活性的非抗体蛋白。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述方法能够表征比使所述混合物经受非变性消化条件以形成混合物而不通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触以获得混合物来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白的方法多至少约500％的宿主细胞蛋白。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述方法能够表征比使所述混合物经受非变性消化条件以形成混合物而不通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触以获得混合物来富集所述混合物中的宿主细胞蛋白的方法多至少约100％到约1000％的宿主细胞蛋白。
38.一种用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法，所述方法包括：
通过使所述样品基质与亲和色谱载体接触来富集所述样品基质中的宿主细胞蛋白；以及
使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法能够表征比不包括高场非对称波形离子迁移率谱的方法多至少约30％的宿主细胞蛋白。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述方法能够表征比不包括高场非对称波形离子迁移率谱的方法多至少约30％到约75％的宿主细胞蛋白。
41.一种用于表征样品基质中的宿主细胞蛋白的方法，所述方法包括：
通过使样品基质与亲和色谱载体接触以获得混合物来富集所述样品基质中的所述宿主细胞蛋白；
使所述混合物经受非变性消化条件；以及
使用高场非对称波形离子迁移率谱表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法能够表征比通过使样品基质与亲和色谱载体接触以获得混合物来富集所述样品基质中的所述宿主细胞蛋白并且使所述混合物经受非变性消化条件并且使用除高场非对称波形离子迁移率谱装置之外的质谱装置表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白的方法多至少约15％的宿主细胞蛋白。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述方法能够表征比通过使样品基质与亲和色谱载体接触以获得混合物来富集所述样品基质中的所述宿主细胞蛋白并且使所述混合物经受非变性消化条件并且使用除高场非对称波形离子迁移率谱装置之外的质谱装置表征所述宿主细胞蛋白中的至少一种宿主细胞蛋白的方法多至少约15％到约60％的宿主细胞蛋白。
CN202080072528.3A 2019-10-15 2020-10-15 用于表征宿主细胞蛋白的方法 Pending CN114556104A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962915344P 2019-10-15 2019-10-15
US62/915,344 2019-10-15
US202062986324P 2020-03-06 2020-03-06
US62/986,324 2020-03-06
PCT/US2020/055744 WO2021076735A1 (en) 2019-10-15 2020-10-15 Methods for characterizing host-cell proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114556104A true CN114556104A (zh) 2022-05-27

Family

ID=73598173

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080072528.3A Pending CN114556104A (zh) 2019-10-15 2020-10-15 用于表征宿主细胞蛋白的方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20210109107A1 (zh)
EP (1) EP4045919A1 (zh)
JP (1) JP2022551756A (zh)
KR (1) KR20220079910A (zh)
CN (1) CN114556104A (zh)
AU (1) AU2020368409A1 (zh)
BR (1) BR112022006866A2 (zh)
CA (1) CA3157858A1 (zh)
IL (1) IL292145A (zh)
MX (1) MX2022004662A (zh)
WO (1) WO2021076735A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20240032972A (ko) * 2021-07-13 2024-03-12 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 위치 선택적 다이메틸화에 의한 단백질 n-말단 신규 서열분석
WO2023244521A1 (en) * 2022-06-17 2023-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for characterizing host-cell proteins

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1348628A (en) 1919-08-11 1920-08-03 Combs Binny Frank Identification-marker for receptacles such as milk-cans
US1522343A (en) 1923-05-02 1925-01-06 Thom Clarence Magnetic separator

Also Published As

Publication number Publication date
CA3157858A1 (en) 2021-04-22
EP4045919A1 (en) 2022-08-24
KR20220079910A (ko) 2022-06-14
MX2022004662A (es) 2022-05-25
AU2020368409A1 (en) 2022-05-19
WO2021076735A1 (en) 2021-04-22
BR112022006866A2 (pt) 2022-07-05
JP2022551756A (ja) 2022-12-13
US20210109107A1 (en) 2021-04-15
IL292145A (en) 2022-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Maria et al. Purification process of recombinant monoclonal antibodies with mixed mode chromatography
JP5448825B2 (ja) 非凝集抗体Ｆｃドメインの製造方法
CN107849122B (zh) 用低电导率洗涤缓冲液进行亲和层析纯化
JP2015502959A (ja) ＩｇＧ２ジスルフィドアイソフォームの分離
US20230314388A1 (en) Method and system of identifying and quantifying antibody fragmentation
US20210109107A1 (en) Methods for characterizing host-cell proteins
JP2023052110A (ja) タンパク質を同定及び定量化する方法及びシステム
CN115698722A (zh) 用于表征低丰度宿主细胞蛋白的方法
Kröner et al. Analytical characterization of complex, biotechnological feedstocks by pH gradient ion exchange chromatography for purification process development
JP2021529749A (ja) 混合物からポリペプチドを調製するための複数の疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用
CN107835819A (zh) 在亲和层析中减少宿主细胞蛋白的方法
WO2023164145A1 (en) Size exclusion chromatography for characterizing host cell proteins
US20230166199A1 (en) Methods for characterizing host-cell proteins
US20230408527A1 (en) Methods for characterizing host-cell proteins
US20230002445A1 (en) Coupling isoelectric focusing-based fractionation with mass spectrometry analysis
US20210017223A1 (en) Separation Method
CN117677848A (zh) 将基于等电聚焦的分级与质谱法分析关联
CN117642634A (zh) 使用免疫沉淀和天然scx-ms检测对治疗性抗体和相关产物进行生物分析
EA042991B1 (ru) Способ и система идентификации и количественного определения белка
AU2017347809A1 (en) Purification process for removal of tyrosine sulfation antibody variants; purified compositions

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination