CN117677848A - 将基于等电聚焦的分级与质谱法分析关联 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及表征所关注蛋白质的电荷变体的方法。具体地，本发明涉及使用脱盐尺寸排阻色谱法‑还原肽图质谱法来鉴定通过毛细管等电聚焦分离的电荷变体。

Description

将基于等电聚焦的分级与质谱法分析关联

相关申请的交叉引用

本申请要求于2021年6月30日提交的美国临时专利申请第63/217,125号和于2022年1月20日提交的美国临时专利申请第63/301,350号的优先权和权益，所述美国临时专利申请各自通过引用并入本文。

技术领域

本申请涉及用于表征治疗性蛋白质的电荷变体的方法。

背景技术

治疗性肽和蛋白质的生物物理性质，包含结构域特异性变体，可能会影响其安全性、功效和保质期。例如，不同电荷变体的存在可能改变蛋白质溶解度、结合和稳定性。

治疗性肽或蛋白质，如抗体，可以获得不同的变体并由于各种翻译后修饰(PTM)、蛋白质降解、酶促修饰和化学修饰而变成非均质的。这些生物物理性质的改变可能发生在肽和蛋白质产生期间和之后的几乎任何时候。由于这些生物物理特性的改变可能会影响治疗性肽和蛋白质的安全性、功效和保质期，因此鉴定特定治疗性肽或蛋白质的不同变体并且进一步询问对电荷变体负责的修饰是很重要的。

等电聚焦(IEF)已成为用于基于电荷(pI)分离样品的组分，从而允许分离蛋白质的电荷变体的常用工具。IEF分析也可以与质谱法(MS)分析相结合，以获得关于与每个电荷变体相关联的蛋白质的进一步信息。然而，常规方法在可以用于IEF-MS分析的技术方面受到限制。到目前为止，还无法对高分辨率的窄IEF级分进行还原肽图分析。因此，还无法鉴定与特定电荷变体相关联的特定蛋白质修饰的位点，例如氨基酸残基。

因此，应当理解，需要专门表征与电荷变体相关联的治疗性蛋白质的修饰的方法和系统。

发明内容

已经开发了一种用于表征所关注蛋白质的电荷变体的方法。在一示例性实施例中，使包含所关注蛋白质的样品经受毛细管等电聚焦分析。生成蛋白质样品的UV迹线，所述UV迹线包含与电荷变体相对应的UV峰。在等电聚焦后收集所述样品的级分。可以以高通量方式收集级分，使得其代表等电聚焦步骤的整个样品输出，并且可以包括窄间隔，例如，15秒间隔。使用脱盐尺寸排阻色谱法对级分进行进一步处理，所述脱盐尺寸排阻色谱法除了修改级分缓冲液以与质谱法分析相容之外，还按尺寸分离分析物。最后，使来自脱盐尺寸排阻色谱法的洗脱液经受质谱法分析，所述质谱法分析可以用于鉴定与每个级分相对应的以及因此与每个电荷变体相对应的特定翻译后修饰。

本公开提供了一种用于表征所关注蛋白质的电荷变体的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)使包含所关注蛋白质的样品经受毛细管等电聚焦，以分离所述所关注蛋白质的电荷变体；(b)从所述毛细管等电聚焦步骤中收集级分；(c)使所述级分经受脱盐尺寸排阻色谱法；以及(d)使来自步骤(c)的洗脱液经受质谱法分析，以表征所述所关注蛋白质的所述电荷变体。

一方面，所述蛋白质是抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。另一方面，所述毛细管等电聚焦是成像的毛细管等电聚焦。又另一方面，所述脱盐尺寸排阻色谱法系统耦接到所述质谱仪。

一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪。另一方面，所述质谱法分析包括完整质量分析或还原肽图分析。又另一方面，所述质谱仪能够进行多重反应监测或平行反应监测。

一方面，所述方法进一步包括其中在脱盐尺寸排阻色谱法之前使所述级分与至少一种水解剂接触的步骤。在一具体方面，所述至少一种水解剂选自由以下组成的组：胰蛋白酶、糜蛋白酶、LysC、LysN、AspN、GluC和ArgC。

一方面，所述方法进一步包括其中在脱盐尺寸排阻色谱法之前使所述级分与至少一种还原剂接触的步骤。另一方面，所述脱盐尺寸排阻色谱法在天然条件下进行。

当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。

附图说明

图1展示了根据示例性实施例的本发明的方法的工作流程。

图2A示出了根据示例性实施例的来自通过毛细管等电聚焦(cIEF)检测到的UV迹线的峰与来自脱盐尺寸排阻色谱法-质谱法(SEC-MS)分析的对应峰的相关性。

图2B示出了根据示例性实施例的通过脱盐SEC-MS和对应的cIEF峰和级分鉴定出的电荷变体。

图3A示出了根据示例性实施例的通过脱盐SEC-MS检测到的电荷变体的与通过cIEF检测到的主UV峰相对应的去卷积质谱。

图3B示出了根据示例性实施例的通过脱盐SEC-MS检测到的电荷变体的与通过cIEF检测到的B1 UV峰相对应的去卷积质谱。

图3C示出了根据示例性实施例的通过脱盐SEC-MS检测到的电荷变体的与通过cIEF检测到的B2 UV峰相对应的去卷积质谱。

图3D示出了根据示例性实施例的通过脱盐SEC-MS检测到的电荷变体的与通过cIEF检测到的A1 UV峰相对应的去卷积质谱。

图3E示出了根据示例性实施例的通过脱盐SEC-MS检测到的电荷变体的与通过cIEF检测到的A2 UV峰相对应的去卷积质谱。

图3F示出了根据示例性实施例的通过脱盐SEC-MS检测到的电荷变体的与通过cIEF检测到的A3 UV峰相对应的去卷积质谱。

图4示出了根据示例性实施例的通过cIEF检测到的每个UV峰的还原肽图光谱。

图5A示出了根据示例性实施例的针对通过cIEF检测到的每个UV峰，天冬氨酸异构化在多个氨基酸残基处的分布。

图5B示出了根据示例性实施例的针对通过cIEF检测到的每个UV峰，天冬氨酸环化在多个氨基酸残基处的分布。

图5C示出了根据示例性实施例的针对通过cIEF检测到的每个UV峰，天冬酰胺脱酰胺化在多个氨基酸残基处的分布。

图5D示出了根据示例性实施例的针对通过cIEF检测到的每个UV峰，天冬酰胺琥珀酰亚胺在多个氨基酸残基处的分布。

图5E示出了根据示例性实施例的针对通过cIEF检测到的每个UV峰，赖氨酸糖化在多个氨基酸残基处的分布。

图5F示出了根据示例性实施例的针对通过cIEF检测到的每个UV峰，C末端赖氨酸在每条重链上的分布。

图5G示出了根据示例性实施例的针对通过cIEF检测到的每个UV峰，N-乙酰神经氨酸的分布。

具体实施方式

哺乳动物细胞中产生的治疗性抗体，包含单克隆抗体(mAb)或双特异性抗体(bsAb)，由于促成尺寸和电荷变体的翻译后修饰(PTM)、酶促修饰和化学修饰而是非均质的。这些修饰可以包含例如糖基化、去糖基化、酰胺化、脱酰胺化、氧化、糖化、末端环化、C末端赖氨酸变异、C末端精氨酸变异、N末端焦谷氨酸变异、C末端甘氨酸酰胺化、C末端脯氨酸酰胺化、琥珀酰亚胺形成、唾液酸化或去唾液酸化。此外，蛋白质产物的聚集、降解、变性、片段化或异构化也可能引入电荷非均匀性。表1示出了示例性蛋白质修饰和其对改变肽或蛋白质的电荷的影响。

表1：可能引起电荷变体的示例性蛋白质修饰

在治疗性肽或蛋白质(如单克隆抗体)的制备期间，由于蛋白质降解和/或PTM的存在，可能引入电荷非均质性。需要对所制备的药物物质内的蛋白质的电荷变体形式进行表征，以充分了解蛋白质的性质(如效力)与和电荷变体相关联的物理和化学变化之间的相关性。

存在允许分离蛋白质电荷变体的若干种方法，所述方法包含离子交换色谱法和等电聚焦(IEF)。IEF已经由于其基于pI对样品组分进行高分辨率分离的能力，以及其考虑表面暴露的氨基酸和内部氨基酸而不会因疏水相互作用而损失分辨率的能力而成为更常见的方法。IEF，尤其是毛细管IEF(cIEF)，也可以与质谱法(MS)分析相结合，以获得关于蛋白质样品的进一步信息。然而，用于cIEF和MS的缓冲液不是立即相容的，这对使用由cIEF分离的样品进行MS分析造成了困难。已经采取了两种主要的方法来解决这个问题，使用到MS的离线或在线连接。

当使用离线连接时，收集来自cIEF的级分，将缓冲液修饰为与MS相容，并使经修饰的级分经受MS分析。然而，从cIEF收集的级分一直是低通量的，使得收集的级分很少，但很大，这降低了电荷变体分析的分辨率和特异性。

可替代地，可以使用在线连接，将分离的样品从cIEF输出到MS中，而无需级分收集步骤。这需要中间在线步骤，如临时色谱法或透析法，以在cIEF和MS分析之间修饰样品缓冲液。尽管这种在线连接保留了cIEF的高分辨率分离，但其不允许对经cIEF分离的样品进行替代性处理，例如对所关注蛋白质进行消化或还原，并且因此仅限于完整质量分析。

因此，需要以灵活和高分辨率的方式表征所关注蛋白质的电荷变体的方法和系统。具体地，需要鉴定与电荷变体相关联的位点特异性蛋白质修饰的方法。

本公开提出了一种鉴定与所关注蛋白质的电荷变体相关联的位点特异性蛋白质修饰的新型方法。所述方法采用具有到MS的离线连接的cIEF。与先前的方法不同，cIEF级分是以全面和高通量的方式收集的，例如收集来自cIEF毛细管的所有输出，分离成各自表示15秒间隔的级分。这种新型高通量级分收集允许离线处理经cIEF分离的样品，而没有pI分辨率的实质性损失。可以进一步处理收集的级分，例如，通过使其与水解剂和/或还原剂接触以产生用于还原肽图分析的还原肽。可以根据用户的需要使收集的级分经受各种处理步骤，或者如果用于例如完整质量分析，则不进行处理步骤。

然后，使收集的级分单独经受脱盐尺寸排阻色谱法(SEC)，例如Yan等人,2020,《美国质谱学会会志(J Am Soc Mass Spectrom)》,31:2171-2179中所描述。这种高通量脱盐SEC方法允许有效处理级分，进一步按尺寸分离样品组分，以及将级分缓冲液修饰成与MS相容。脱盐SEC系统可以与质谱仪在线连接。

使来自脱盐SEC的级分输出经受MS分析，例如完整质量分析或还原肽图分析。MS分析产生分析物的碎片，并根据质荷(m/z)比将其分离。这种分离允许鉴定蛋白质的修饰，如PTM。具体地，还原肽图分析的分辨率允许PTM的位点特异性鉴定，例如鉴定所关注蛋白质上的特定氨基酸残基处的特定化学变化。由已知的cIEF级分产生的经鉴定的位点特异性修饰可以与所关注蛋白质的特定电荷变体相关联。此方法允许对产生电荷变体的位点特异性蛋白质修饰进行高分辨率、高通量分析，从而允许监测和改进治疗性蛋白质生产过程，以验证和优化蛋白质生物物理特性和同质性。

除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所描述的任何方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试，但现在对特定方法和材料进行描述。

术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”；并且术语“约”和“大约”应理解为允许标准变化，如本领域的普通技术人员将理解的；并且在提供范围的情况下，包含端点。如本文所使用的，术语“包含(include)”、“包含(includes)”和“包含(including)”意指是非限制性的，并且被理解为分别意指“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”。

如本文所使用的，术语“蛋白质”或“所关注蛋白质”可以包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体和通过肽键连接的其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以包括一种或多种多肽以形成单一功能性生物分子。在另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。所关注蛋白质可以包含以下中的任一种：生物治疗蛋白、用于研究或疗法的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来产生，如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))和哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于最近讨论生物治疗性蛋白及其生产的综述，参见Ghaderi等人,“用于生物治疗性糖蛋白的生产平台-非人唾液酸化的发生、影响和挑战(Production platforms forbiotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-humansialylation)”(Darius Ghaderi等人,用于生物治疗性糖蛋白的生产平台-非人类唾液酸化的发生、影响和挑战),28《生物技术和基因工程综述(BIOTECHNOLOGY AND GENETICENGINEERING REVIEWS)》147-176(2012)，所述文献的全部教导内容并入本文)。在一些示例性实施例中，蛋白质包括修饰、加合物和其它共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包含例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAGtag、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记以及其它染料等。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白，如球状蛋白和纤维状蛋白；缀合蛋白，如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白，如初级衍生的蛋白和次级衍生的蛋白。

在一些示例性实施例中，所关注蛋白质可以是重组蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白、scFv和其组合。

如本文所使用的，术语“重组蛋白”是指由于在已经引入到合适的宿主细胞中的重组表达载体上携带的基因的转录和翻译而产生的蛋白质。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是选自由以下组成的组的同种型的抗体：IgG、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在某些示例性实施例中，抗体分子是全长抗体(例如，IgG1)，或者可替代地抗体可以是片段(例如，Fc片段或Fab片段)。

如本文所使用的，术语“抗体”包含包括四个多肽链、通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每个重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施例中，抗大ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同或可以是天然的或经人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。如本文所使用的，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术衍生自完整抗体分子，所述标准技术如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成。可以通过化学方法或通过分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。

如本文所使用的，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双功能抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域以及三功能抗体、四功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。在一些示例性实施例中，抗体片段包括亲本抗体的足够的氨基酸序列，所述氨基酸序列是所述亲本抗体的片段，使得其如亲本抗体那样与同一抗原结合；在一些示例性实施例中，片段与具有与亲本抗体的亲和力相当的亲和力的抗原结合和/或与亲本抗体竞争以与抗原结合。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或抗体片段可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，并且更通常包括至少约200个氨基酸。

术语“双特异性抗体”包含能够与两个或多个表位选择性结合的抗体。双特异性抗体通常包括两个不同的重链，其中每个重链与两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，同一抗原上)的不同表位特异性结合。如果双特异性抗体能够与两个不同的表位(第一表位和第二表位)选择性结合，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一个至两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的靶标上(例如，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。

典型的双特异性抗体具有两个重链，所述两个重链各自具有三个重链CDR，随后是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每个重链缔合，或者可以与每个重链缔合且可以与由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位结合，或者可以与每个重链缔合且使得所述重链中的一个或两个重链能够与一个或两个表位结合。BsAb可以分成两个主要类别：一类是带有Fc区(IgG样)；以及另一类是缺乏Fc区，后者通常小于包括Fc的IgG和IgG样双特异性分子。IgG样bsAb可以具有不同形式，如但不限于三功能抗体、杵臼IgG(kih IgG)、crossMab、orth-Fab IgG、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、二合一或双功能Fab(DAF)、IgG-单链Fv(IgG-scFv)或κλ体。非IgG样不同形式包含串联scFv、双抗体形式、单链双抗体、串联双抗体(TandAbs)、双亲和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、纳米抗体或通过对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法产生的抗体(Gaowei Fan、Zujian Wang和Mingju Hao,双特异性抗体及其应用(Bispecific antibodies and their applications),8《血液学与肿瘤学杂志(JOURNALOF HEMATOLOGY&ONCOLOGY)》130；Dafne Müller和Roland E.Kontermann,双特异性抗体(Bispecific Antibodies),《治疗性抗体手册(HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES)》265-310(2014)，所述文献的全部教导内容并入本文)。产生bsAb的方法不限于基于两种不同的杂交瘤细胞系的体细胞融合的四杂交瘤(quadroma)技术、涉及化学交联剂的化学缀合以及利用重组DNA技术的基因方法。bsAb的实例包含在以下专利申请中公开的bsAb，所述专利申请特此通过引用并入：于2010年6月25日提交的美国序列号12/823838；于2012年6月5日提交的美国序列号13/488628；于2013年9月19日提交的美国序列号14/031075；于2015年7月24日提交的美国序列号14/808171；于2017年9月22日提交的美国序列号15/713574；于2017年9月22日提交的美国序列号15/713569；于2016年12月21日提交的美国序列号15/386453；于2016年12月21日提交的美国序列号15/386443；于2016年7月29日提交的美国序列号15/22343；以及于2017年11月15日提交的美国序列号15814095。

如本文所使用的，“多特异性抗体”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。虽然这些分子通常将仅与两种抗原(即，双特异性抗体，bsAb)结合，但具有另外特异性的抗体，如三特异性抗体和KIH三特异性抗体也可以通过本文所公开的系统和方法来解决。

如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。

在一些示例性实施例中，所关注蛋白质的pI可以在约4.5至约9.0的范围内。在一个示例性具体实施例中，pI可以为约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。在一些示例性实施例中，组合物中的所关注蛋白质的类型可以超过一种。

在一些示例性实施例中，所关注蛋白质可以从哺乳动物细胞中产生。哺乳动物细胞可以是人来源的或非人来源的，可以包含原代上皮细胞(例如，角质形成细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和视网膜上皮细胞)、已建立的细胞系及其菌株(例如，293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWo细胞、Chang细胞、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LSI80细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-l细胞、LLC-PKi细胞、PK(15)细胞、GHi细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MHiCi细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞、BSC-1细胞、RAf细胞、RK细胞、PK-15细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官(包含但不限于心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样、扁桃体、骨髓和血液)、脾和成纤维细胞以及成纤维细胞样细胞系)的成纤维细胞(例如，CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、邓普斯细胞(Dempsey cell)、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、Midi细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDMiC3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、菌株2071(小鼠L)细胞、L-M菌株(小鼠L)细胞、L-MTK'(小鼠L)细胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞(Indian muntjac cell)、SIRC细胞、Cn细胞和詹森细胞(Jensen cell)、Sp2/0、NS0、NS1细胞或其衍生物)。

在一些示例性实施例中，可以在脱盐SEC-MS分析之前制备包含所关注蛋白质的样品。制备步骤可以包含烷基化、还原、变性和/或消化。

如本文所使用的，术语“蛋白质烷基化剂”是指用于使蛋白质中的某些游离氨基酸残基烷基化的药剂。蛋白质烷基化剂的非限制性实例是碘乙酰胺(IOA)、氯乙酰胺(CAA)、丙烯酰胺(AA)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)和4-乙烯基吡啶或其组合。

如本文所使用的，“蛋白质变性”可以指分子的三维形状从其天然状态改变的过程。蛋白质变性可以使用蛋白质变性剂来进行。蛋白质变性剂的非限制性实例包含热、高或低pH、还原剂如DTT(参见下文)或暴露于离液剂。若干种离液剂可以用作蛋白质变性剂。离液溶质通过干扰由非共价力，如氢键、范德华力(van der Waals force)和疏水作用介导的分子内相互作用来增加系统的熵。离液剂的非限制性实例包含丁醇、乙醇、盐酸胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、N-月桂酰肌氨酸、尿素和其盐。

如本文所使用的，术语“蛋白质还原剂”是指用于还原蛋白质中的二硫键的药剂。用于还原蛋白质的蛋白质还原剂的非限制性实例是二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、埃尔曼试剂(Ellman's reagent)、盐酸羟胺、氰基硼氢化钠、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)或其组合。

如本文所使用的，术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。存在若干种方法用于使用适当的水解剂进行样品中的蛋白质的消化，例如酶消化或非酶消化。

如本文所使用的，术语“消化酶”是指可以进行蛋白质的消化的大量不同药剂中的任一种。可以进行酶促消化的水解剂的非限制性实例包含来自赛氏曲霉(AspergillusSaitoi)的蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶XIII、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tryp-N、糜蛋白酶、曲霉胃蛋白酶I、LysN蛋白酶(Lys-N)、LysC蛋白内切酶(Lys-C)、蛋白内切酶Asp-N(Asp-N)、蛋白内切酶Arg-C(Arg-C)、蛋白内切酶Glu-C(Glu-C)或外膜蛋白T(OmpT)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、V8蛋白酶或其生物激活片段或同源物或其组合。对于讨论蛋白质消化的可用技术的最近综述，参见Switazar等人,“蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述(Protein Digestion:An Overview of the Available Techniques and RecentDevelopments)”(Linda Switzar、Martin Giera和Wilfried M.A.Niessen,蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述,12《蛋白质组学研究杂志(JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH)》1067-1077(2013))。

如本文所使用的，多肽的术语“电荷变体”或“变体”是指包括与所关注蛋白质的参考氨基酸序列或天然氨基酸序列至少约70％-99.9％(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％)相同或相似的氨基酸序列的多肽。可以通过例如BLAST算法执行序列比较，其中选择算法的参数以在相应参考序列的整个长度上给出相应序列之间的最大匹配(例如，预期阈值：10；字长：3；查询范围内的最大匹配数：0；BLOSUM 62矩阵；空位罚分：存在11，扩展1；条件组成评分矩阵调节)。多肽的变体也可以指包括参考氨基酸序列的多肽，除了一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)突变，例如，错义突变(例如，保守取代)、无义突变、缺失或插入。以下参考文献涉及通常用于序列分析的BLAST算法：BLAST算法：Altschul等人(2005)《欧洲联合生化学会杂志(FEBS J.)》272(20):5101-5109；Altschul,S.F.等人,(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410；Gish,W.等人,(1993)《自然遗传学(Nature Genet.)》3:266-272；Madden,T.L.等人,(1996)《酶学方法(Meth.Enzymol.)》266:131-141；Altschul,S.F.等人,(1997)《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25:3389-3402；Zhang,J.等人,(1997)《基因组研究(Genome Res.)》7:649-656；Wootton,J.C.等人,(1993)《计算化学(Comput.Chem.)》17:149-163；Hancock,J.M.等人,(1994)《计算机应用生物科学(Comput.Appl.Biosci.)》10:67-70；比对评分系统：Dayhoff,M.O.等人,《蛋白质序列和结构图谱学(Atlas of Protein Sequence and Structure)》中的“蛋白质演化变化的模型(Amodel of evolutionary change in proteins.)”(1978)第5卷,增刊3.M.O.Dayhoff(编辑),第345-352页,美国国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.),华盛顿特区(Washington,D.C.)；Schwartz,R.M.等人,《蛋白质序列和结构图谱学》中的“用于检测距离关系的基质(Matrices for detecting distant relationships.)”(1978)第5卷,增刊3.M.O.Dayhoff(编辑),第353-358页,美国国家生物医学研究基金会,华盛顿特区；Altschul,S.F.,(1991)《分子生物学杂志》219:555-565；States,D.J.等人,(1991)《方法(Methods)》3:66-70；Henikoff,S.等人,(1992)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》89:10915-10919；Altschul,S.F.等人,(1993)《分子生物学杂志》36:290-300；比对统计：Karlin,S.等人,(1990)《美国国家科学院院刊》87:2264-2268；Karlin,S.等人,(1993)《美国国家科学院院刊》90:5873-5877；Dembo,A.等人,(1994)《概率年报(Ann.Prob.)》22:2022-2039；以及Altschul,S.F.《基因组研究中的理论和计算方法(Theoretical and Computational Methods in Genome Research)》中的“评估多个不同的局部比对的统计显著性(Evaluating the statistical significance ofmultipledistinct local alignments)”(S.Suhai编辑),(1997),第1-14页,普莱南出版公司(Plenum),纽约；所述文献的全部教导内容并入本文。

一些变体可以是多肽在其核糖体合成期间(共翻译修饰)或之后(翻译后修饰“PTM”)进行的共价修饰。PTM通常由特定的酶或酶途径引入。许多发生在蛋白质骨架内的特定特征蛋白质序列(例如，特征序列)的位点处。已经记录了数百个PTM，并且这些修饰总是影响蛋白质结构或功能的某个方面(Walsh,G.“蛋白质(Proteins)”(2014)第二版，由威利父子公司出版(Wiley and Sons,Ltd.),ISBN：9780470669853，所述文献的全部教导内容并入本文)。

在某些示例性实施例中，蛋白质组合物可以包括超过一种类型的所关注蛋白质的变体。此类变体可以包含酸性物种和碱性物种。酸性物种通常是早于来自CEX的主峰或晚于来自AEX的主峰洗脱的变体，而碱性物种是晚于来自CEX的主峰或早于来自AEX的主峰洗脱的变体。在一示例性实施例中，碱性物种可以比来自cIEF的主峰更早洗脱，并且酸性物种可以比来自cIEF的主峰更晚洗脱。

如本文所使用的，术语“酸性物种”、“AS”、“酸性区域”和“AR”是指以总酸性电荷为特征的蛋白质的变体。

在某些实施例中，样品可以包括超过一种类型的酸性物种变体。例如，但不限于此，可以基于出现的峰的色谱保留时间或通过使用IEF生成的UV峰对总酸性物种进行分类。

在负责酸性或碱性物种的化学降解途径中，在蛋白质和多肽中观察到的两种最常见的共价修饰是脱氨和氧化。甲硫氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸是最容易被氧化的氨基酸中的一些氨基酸：Met和Cys是因为其硫原子，并且His、Trp和Tyr是因为其芳香族环。

如本文所使用的，术语“氧化物种”、“OS”或“氧化变体”是指通过氧化形成的蛋白质的变体。此类氧化物种也可以通过各种方法检测，如离子交换，例如，WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱法)，或IEF。氧化变体可以由在组氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和/或酪氨酸残基处发生的氧化引起。

如本文所使用的，术语“碱性物种”、“碱性区域”和“BR”是指蛋白质的变体，例如，抗体或其抗原结合部分，其特征在于相对于蛋白质内存在的主要电荷变体物种的总碱性电荷。例如，在重组蛋白制剂中，可以通过各种方法检测此类碱性物质，如离子交换，例如，WCX-10HPLC(弱阳离子交换色谱法)，或IEF。示例性变体可以包含但不限于赖氨酸变体、天冬氨酸异构化、天冬酰胺处的琥珀酰亚胺形成、甲硫氨酸氧化、酰胺化、不完全二硫键形成、从丝氨酸突变为精氨酸、糖基化、片段化和聚集。通常，碱性物种在CEX期间比主峰更晚洗脱，或在AEX分析期间比主峰更早洗脱。(重组单克隆抗体的酸性和碱性物种的色谱分析(Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinantmonoclonal antibodies).《单克隆抗体(MAbs)》.2012年9月1日；4(5):578-585.doi:10.4161/mabs.21328，所述文献的全部教导通过引用并入本文。)

在某些实施例中，样品可以包括超过一种类型的碱性物种变体。例如，但不限于此，可以基于出现的峰的色谱保留时间或基于使用IEF生成的UV峰对总碱性物种进行划分。其中总碱性物种可以被划分的另一个实例可以是基于变体的类型-变体、结构变体或片段变体来划分。

如本文所使用的，“样品”可以从生物过程的任何步骤获得，如细胞培养液(CCF)、收获的细胞培养液(HCCF)、下游加工中的任何步骤、包括最终经调配产品的药物物质(DS)或药物产品(DP)。在一些其它具体示例性实施例中，样品可以选自澄清、色谱生产、病毒灭活或过滤的下游工艺的任何步骤。在一些具体示例性实施例中，药物产品可以选自在临床、运输、储存或处理中制造的药物产品。

在一些方面，所公开的方法可以包含使样品经受毛细管等电聚焦以分离所述所关注蛋白质的电荷变体。

如本文所使用的，“等电聚焦”或“IEF”，也简称为电聚焦，是基于带电分子(通常是蛋白质或肽)的等电点(pI)，例如，分子不带电荷时的pH，分离所述带电分子的技术。IEF起作用是因为在电场中处于pH梯度的分子会向朝向其pI迁移。存在多种用于进行IEF的技术。例如，在毛细管等电聚焦(cIEF)中，样品基于施加的电场行进穿过毛细管。可以在沿毛细管的某个点处使用UV检测器来检测分析物(如蛋白质)穿过毛细管的所述点的时间。由于穿过毛细管的行进时间与分析物的电荷(pI)直接相关，因此来自毛细管中的某个点的UV信号随时间的变化可以表示为UV迹线，其表示样品组分的变化电荷(pI)。在示例性实施例中，由cIEF生成的UV迹线表示所关注蛋白质的电荷变体，其中每个UV峰表示显著的电荷变体。还可以使用cIEF的变型，例如，成像的cIEF(icIEF)。

尺寸排阻色谱法(SEC)或凝胶过滤依赖于随其分子尺寸变化的组分的分离。与在流体中的时间相比，分离取决于物质在多孔固定相中所花费的时间的量。分子驻留在孔中的概率取决于分子和孔的大小。此外，物质渗透到孔中的能力由大分子的扩散迁移率决定，小分子的扩散率更高。非常大的大分子可能根本无法穿透固定相的孔；并且，对于非常小的大分子，渗透的概率接近于一。尽管较大分子大小的组分更快地移动通过固定相，但较小分子大小的组分穿过固定相的孔的路径长度更长，并且因此在固定相中保留的时间更长。

色谱材料可以包括尺寸排除材料，其中所述尺寸排除材料是树脂或膜。用于尺寸排除的基质优选地是惰性凝胶介质，所述惰性凝胶介质可以是交联多糖的复合物，例如，呈球形珠粒形式的交联琼脂糖和/或右旋糖酐。交联程度决定了溶胀凝胶珠粒中存在的孔的大小。大于一定大小的分子不会进入凝胶珠粒，并且因此最快移动穿过色谱床。进入凝胶珠粒的程度不同(取决于其大小和形状)的较小的分子，如洗涤剂、蛋白质、DNA等，在穿过床的过程中会受到阻碍。因此，分子通常以分子大小减小的顺序洗脱。

适用于病毒的尺寸排阻色谱法的多孔色谱树脂可以由具有不同物理特性的右旋糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或二氧化硅制成。还可以使用聚合物组合。最常用的是可从安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)获得的商品名为“SEPHADEX”的聚合物组合。来自不同结构材料的其它尺寸排除支持物也是合适的，例如Toyopearl 55F(聚甲基丙烯酸酯，来自宾夕法尼亚州蒙哥马利的东曹生命科学公司(Tosoh Bioscience,Montgomery Pa.))和Bio-Gel P-30Fine(加利福尼亚州赫拉克勒斯的BioRad实验室(BioRad Laboratories,Hercules,CA))。

在一些示例性实施例中，SEC可以在“脱盐模式”下操作，以在本地MS检测之前实现在线缓冲液交换。脱盐实现了从样品中去除缓冲盐以交换成水(使用用于预平衡SEC树脂的水)的目标。适于本发明方法的脱盐SEC方法描述于例如Yan等人,2020,《美国质谱学会会志》,31:2171-2179中。脱盐SEC允许随后对从cIEF洗脱的样品进行MS分析，否则可能具有不相容的缓冲条件。

可以将包括所关注蛋白质的样品的蛋白质负载调整至介于约50g/L与约1000g/L之间、约5g/L与约150g/L之间、介于约10g/L与约100g/L之间、介于约20g/L与约80g/L之间、介于约30g/L与约50g/L之间或介于约40g/L与约50g/L之间的柱的总蛋白质负载。在某些实施例中，将负载蛋白质混合物的蛋白质浓度调整至介于约0.5g/L与约50g/L之间或介于约1g/L与约20g/L之间的要装载到柱上的材料的蛋白质浓度。

如本文所使用的，术语“质谱仪”包含能够鉴定特定分子物种并且测量其准确质量的装置。所述术语意味着包含多肽或肽可以表征到其中的任何分子检测器。质谱仪可以包含三个主要部分：离子源、质量分析仪和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中，并且同时(如以电喷雾电离的方式)或通过单独的过程被电离。离子源的选择取决于应用。在一些示例性实施例中，所述质谱仪可以是串联质谱仪。如本文所使用的，术语“串联质谱法”包含通过使用多级质量选择和质量分离来获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是将样品分子转化为气相并被电离，使得在第一质量选择步骤之后以可预测且可控制的方式形成碎片。多级MS/MS或MSⁿ可以通过首先选择并分离前体离子(MS²)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS³)、将其碎裂、分离次级碎片(MS⁴)等来进行，只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号是可检测的。串联MS已通过各种分析仪组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析器可以由许多不同的因素确定，如灵敏度、选择性和速度，以及大小、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析器在空间上耦接或耦接到空间串联分析器。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计具体的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中离解，并且然后将产物离子传输到另一个分析器进行m/z分离和数据采集。在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、隔离、碎裂和m/z分离。通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后修饰的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。所述表征包含但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰或鉴定翻译后修饰或可比性分析或其组合。

在一些示例性方面，质谱仪可以在纳米电喷雾或纳米喷雾上工作。

如本文所使用的，术语“纳米电喷雾”或“纳米喷雾”是指通常在不使用外部溶剂递送的情况下，在非常低的溶剂流速下，通常每分钟样品溶液数百纳升或更低的电喷雾离子化。形成纳米电喷雾的电喷雾输注装置可以使用静态纳米电喷雾发射器或动态纳米电喷雾发射器。静态纳米电喷雾发射器在延长的时间段内对小样品(分析物)溶液体积进行连续分析。动态纳米电喷雾发射器使用毛细管柱和溶剂递送系统在质谱仪分析之前对混合物进行色谱分离。

在一些示例性实施例中，SEC-MS可以在天然条件下进行。

如本文所使用的，术语“天然条件”可以包含在保留分析物中非共价相互作用的条件下进行质谱法。有关天然MS的详细评论，参考评论：Elisabetta Boeri Erba和Carlo Pe-tosa,天然质谱法在表征大分子复合物的结构和动力学中的新兴作用(The emerging roleof native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics ofmacromolecular complexes),24《蛋白质科学(PROTEIN SCIENCE)》1176-1192(2015))。

在一些示例性方面，质谱仪可以是串联质谱仪。

如本文所使用的，术语“串联质谱法”包含通过使用多级质量选择和质量分离来获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可以被转移到气相中并被完整地电离，并且所述样品分子可以在第一质量选择步骤之后以一些可预测和可控制的方式被诱导分裂。多级MS/MS或MSⁿ可以通过首先选择并分离前体离子(MS²)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS³)、将其碎裂、分离次级碎片(MS⁴)等来进行，只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号是可检测的。串联MS已通过各种分析仪组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析仪可以由许多不同的因素确定，如灵敏度、选择性和速度，以及大小、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析器在空间上耦接或耦接到空间串联分析器。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计具体的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中离解，并且然后将产物离子传输到另一个分析器进行m/z分离和数据采集。在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、隔离、碎裂和m/z分离。

通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后修饰的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。所述表征包含但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰或鉴定翻译后修饰或可比性分析或其组合。

如本文所使用的，术语“数据库”是指可能存在于样品中的蛋白质序列的汇编集合，例如以FASTA格式的文件形式。相关的蛋白质序列可能来自正在研究的物种的cDNA序列。可以用于搜索相关蛋白质序列的公共数据库包含由例如Uniprot或Swiss-prot托管的数据库。可以使用本文中被称为“生物信息学工具”的内容搜索数据库。生物信息学工具提供了根据数据库中所有可能的序列搜索未解释的MS/MS谱的能力，并提供解释(注释)MS/MS谱作为输出。此类工具的非限制性实例是Mascot(www.matrixscience.com)、SpectrumMill(www.chem.agilent.com)、PLGS(www.waters.com)、PEAKS(www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(www.sagenresearch.com)、OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector(prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(fields.scripps.edu/sequest)。

在一些示例性实施例中，质谱仪耦接到色谱法系统，例如SEC或脱盐SEC。

应当理解，本发明不限于上述蛋白质、抗体、pI、蛋白质烷基化剂、蛋白质变性剂、蛋白质还原剂、消化酶、水解剂、电荷变体、翻译后修饰、样品、IEF系统、SEC系统、质谱仪、数据库或生物信息学工具中的任一者，并且可以通过任何合适的方式选择任何蛋白质、抗体、pI、蛋白质烷基化剂、蛋白质变性剂、蛋白质还原剂、消化酶、水解剂、电荷变体、翻译后修饰、样品、IEF系统、SEC系统、质谱仪、数据库或生物信息学工具。

通过参考以下实例，将更充分地理解本发明。然而，以下实例不应被解释为限制本发明的范围。

实例

实例1：本发明方法的概述

本文公开了一种用于表征所关注蛋白质的电荷变体的新型方法。用于本发明方法的示例性工作流程示出于图1中。使样品，例如来自治疗性蛋白质产品或任何所关注蛋白质的生产步骤的样品，经受毛细管等电聚焦(cIEF)。cIEF基于电荷(pI)分离蛋白质样品的组分，包含分离所关注蛋白质的电荷变体。生成穿过cIEF毛细管的样品组分的UV迹线，其中蛋白质浓度的局部最大值被视为“峰”，并且与蛋白质电荷变体相对应。从毛细管中连续收集级分。可以以高通量方式收集级分，使得收集所有cIEF洗脱液，并且级分表示窄间隔，例如，15秒间隔。此高通量级分收集允许保持cIEF的高分辨率分离，而不需要在线连接至质谱仪以进行后续MS分析。

任选地，可以使级分与水解剂、烷基化剂和/或还原剂接触以产生所关注蛋白质的还原肽片段。根据分析的期望浓度和分辨率，可以在随后的分析之前对级分进行重组。

然后，使级分经受脱盐尺寸排阻色谱法(SEC)。脱盐SEC有双重目的：用与质谱法(MS)分析相容的缓冲液交换收集的cIEF级分中的缓冲液，以及基于大小进一步分离级分组分。

最后，使来自脱盐SEC的洗脱液经受质谱法分析，例如完整质量分析或还原肽图分析。脱盐SEC可以与质谱仪在线连接(脱盐SEC-MS)。具体地，还原肽图分析允许鉴定可能有助于电荷变异的位点特异性蛋白质修饰。由于鉴定的蛋白质修饰源于已知级分，并且级分与cIEF UV迹线的已知部分一致，因此可以在位点特异性蛋白质修饰与蛋白质电荷变体之间得出因果关系。

实例2：蛋白质电荷变体的完整质量分析

使用本发明的方法，使双特异性抗体bsAb-1经受cIEF、分级和脱盐SEC-MS的步骤。由cIEF生成的UV迹线(以红色示出)和由脱盐SEC-MS生成的MS信号(以蓝色示出)可以如图2A所示相关。为此UV迹线指定了六个UV峰(与电荷变体相对应)：B2、B1、主峰、A1、A2和A3(从碱性到酸性排序)。每个蓝色峰表示级分的脱盐SEC-MS分析。

cIEF级分的脱盐SEC-MS分析允许将特定蛋白质修饰分配至电荷变体，如图2B所示。因为每个脱盐SEC-MS分析都来自已知级分，并且每个级分表示UV迹线的一个已知部分，所以通过MS检测到的蛋白质修饰可以与通过cIEF检测到的电荷变体直接相关联。以此方式，可以揭示所关注蛋白质的电荷变体的具体原因。

进一步的分析示出于图3中。证明了通过脱盐SEC-MS检测到的bsAb-1的每个电荷变体的去卷积质谱，其中每个质谱的特征在于可以用特定蛋白质修饰鉴定的各种m/z峰。图3A示出了主要电荷变体和表示主要mAb物种的峰。图3B示出了B1电荷变体和表示具有C末端赖氨酸的物种的峰。图3C示出了B2电荷变体和表示具有两个C末端赖氨酸的物种的峰。图3D示出了A1电荷变体和表示具有糖化修饰的物种的一个峰以及表示具有脱酰胺化修饰的物种的一个峰。图3E示出了A2电荷变体和表示具有糖化/葡糖醛酸基修饰的物种的一个峰、表示具有脱酰胺化修饰的物种的一个峰以及表示具有N-乙酰神经氨酸修饰的物种的一个峰。图3F示出了A3电荷变体和表示具有糖化/葡糖醛酸基修饰的物种的一个峰、表示具有脱酰胺化修饰的物种的一个峰以及表示具有两个N-乙酰神经氨酸修饰的物种的一个峰。

这些实验证明了本发明的方法使用脱盐SEC-MS来确定与通过cIEF检测到的电荷变体相对应的以及引起所述电荷变体的特异性蛋白质修饰的能力。

实例3：蛋白质电荷变体的还原肽图分析

本发明的方法还可以与还原肽图分析一起使用，以鉴定所关注蛋白质的特定残基处的蛋白质修饰，以及将这些位点特异性修饰与蛋白质的电荷变体相关联。使双特异性抗体bsAb-1经受如先前所描述的cIEF、分级和脱盐SEC-MS的步骤。在脱盐SEC之前，使级分经受蛋白质还原和水解，以产生还原的肽片段。

与通过cIEF检测到的每个电荷变体相对应的示例性MS信号示出于图4中。使用肽图分析肽，并鉴定特定残基处的特定蛋白质修饰，如图5所示。使用此方法，可以建立跨特定氨基酸残基处的蛋白质修饰的电荷变体的统计分布。图5A-5G展示了可能导致电荷变体的示例性修饰，包含天冬氨酸异构化、天冬氨酸环化、天冬酰胺脱酰胺化、天冬酰胺琥珀酰亚胺、赖氨酸糖化、C末端赖氨酸或N-乙酰神经氨酸。跨bsAb-1的轻链(LC)、第一重链(HC)或第二重链(HC^*)鉴定出特定的经修饰的残基。

这些实验证明了本发明的方法提供关于可能引起所关注蛋白质的特定电荷变体的特定蛋白质修饰的氨基酸残基水平分辨率的能力。此信息可以用于例如监测和/或修改治疗性蛋白质的生产过程，以实现可接受的生物物理性质和产品同质性。

Claims (11)

1.一种用于表征所关注蛋白质的电荷变体的方法，所述方法包括：

(a)使包含所关注蛋白质的样品经受毛细管等电聚焦，以分离所述所关注蛋白质的电荷变体；

(b)从所述毛细管等电聚焦步骤中收集级分；

(c)使所述级分经受脱盐尺寸排阻色谱法；以及

(d)使来自步骤(c)的洗脱液经受质谱法分析，以表征所述所关注蛋白质的所述电荷变体。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质是抗体、双特异性抗体、单克隆抗体、融合蛋白、抗体-药物缀合物、抗体片段或蛋白质药物产品。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述毛细管等电聚焦是成像的毛细管等电聚焦。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱盐尺寸排阻色谱法系统耦接到所述质谱仪。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱法分析包括完整质量分析或还原肽图分析。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪能够进行多重反应监测或平行反应监测。

8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括其中在脱盐尺寸排阻色谱法之前使所述级分与至少一种水解剂接触的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述至少一种水解剂选自由以下组成的组：胰蛋白酶、糜蛋白酶、LysC、LysN、AspN、GluC和ArgC。

10.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括其中在脱盐尺寸排阻色谱法之前使所述级分与至少一种还原剂接触的步骤。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱盐尺寸排阻色谱法在天然条件下进行。