CN117642634A - 使用免疫沉淀和天然scx-ms检测对治疗性抗体和相关产物进行生物分析 - Google Patents

使用免疫沉淀和天然scx-ms检测对治疗性抗体和相关产物进行生物分析 Download PDF

Info

Publication number
CN117642634A
CN117642634A CN202280049373.0A CN202280049373A CN117642634A CN 117642634 A CN117642634 A CN 117642634A CN 202280049373 A CN202280049373 A CN 202280049373A CN 117642634 A CN117642634 A CN 117642634A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
cells
protein
scx
antibodies
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280049373.0A
Other languages
English (en)
Inventor
严悦恬
王顺海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of CN117642634A publication Critical patent/CN117642634A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/563—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving antibody fragments
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明总体上涉及表征抗体和相关产物的方法。具体地，本发明涉及使用免疫沉淀和天然强阳离子交换色谱法‑质谱法来特异性地且灵敏地检测样品中的抗体和相关产物并且对所述抗体和相关产物进行定量。

Description

使用免疫沉淀和天然SCX-MS检测对治疗性抗体和相关产物进 行生物分析
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年7月13日提交的美国临时专利申请第63/221,439号的优先权和权益，所述美国临时专利申请通过引用并入本文。
技术领域
本发明总体上涉及用于表征抗体和相关产物的方法。
背景技术
治疗性肽或蛋白质在细胞培养悬浮液中表达以用于生产。随后，肽或蛋白质被纯化以去除工艺相关杂质。经纯化的治疗性肽或蛋白质的产物质量属性被广泛表征，以确保保留其与药代动力学相关的相关安全性、功效和保质期特征。
治疗性肽或蛋白质的改变可能发生在生产和/或纯化过程期间和之后的任何时间点。由于多种翻译后修饰、蛋白质降解、酶促修饰和化学修饰，治疗性肽或蛋白质可能变成异质的。生物制药产品的生物物理特性的这些改变可能会影响相关的安全性、疗效和保质期。
治疗性肽或蛋白质的其它关键特征包含决定体内疗法的丰度和时间的如药代动力学和药效学等特性。了解体内治疗剂的处理对于确定如何最佳地生产和递送治疗剂至关重要，例如确定施用途径、剂量以及治疗作用和副作用。
准确且有效地评估治疗性肽或蛋白质的这些特征(通常是在使检测复杂化的如血清等复杂基质的背景下)需要高通量、高灵敏度和高特异性技术。应当理解，需要用于实现治疗性肽和蛋白质以及其关键特征的准确表征和定量的方法和系统。
发明内容
天然SCX-MS方法已开发用于抗体和相关产物的检测和定量。使用涂覆有抗人Fc抗体的琼脂糖珠粒进行免疫沉淀可以用于拉下样品中的人抗体。消化酶IdeS或其变体可以用于切割固定化抗体，产生可以洗脱并收集的Fab2片段。然后可以使此片段经受天然SCX-MS分析，用于灵敏且稳健的定量。本发明的方法被证明即使在纯溶液或血清中的低浓度下也能有效且准确地对抗体进行准确定量，如实例中所表明的。
本公开提供了一种用于表征抗体的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)将所述抗体固定在固相底物上；(b)使所述固定化抗体与消化酶接触以产生所述抗体的未结合片段；(c)洗脱所述抗体片段；以及(d)使所述洗脱液经受天然SCX-MS分析以表征所述抗体。
在一个方面中，所述抗体是单克隆抗体或双特异性抗体。
在一个方面中，所述固定步骤包括使包含所述抗体的样品与能够与所述抗体结合的固相底物接触。在具体方面中，所述样品是血清样品。
在一个方面中，所述固相底物包括珠粒。在具体方面中，所述珠粒是琼脂珠粒或磁性珠粒。
在具体方面中，所述固相底物的所述结合是通过将抗体粘附到所述固相底物进行的。在另外的具体方面中，所述抗体是抗Fc抗体。
在一个方面中，所述方法进一步包括在固定所述抗体之后洗涤所述固相底物的步骤。
在一个方面中，所述消化酶是IdeS或其变体。在另一方面中，所述抗体片段是Fab2片段。
在一个方面中，所述洗脱包括离心所述固相底物和抗体片段的步骤。
在一个方面中，所述SCX系统耦接到所述质谱仪。另一方面，所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪。
在一个方面中，所述抗体的表征包括抗体的定量，任选地其中所述定量相对于内标归一化。
当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。
附图说明
图1展示了根据示例性实施例的本发明的方法的工作流程。
图2示出了根据示例性实施例的用于分离抗体的不同SCX柱在SCX-MS总离子色谱图(TIC)中的性能比较。
图3A示出了根据示例性实施例的一系列不同抗体的SCX-MS TIC。
图3B示出了根据示例性实施例的不同浓度的mAb1的质谱图。
图3C示出了根据示例性实施例的不同浓度的mAb2的质谱图。
图4A示出了根据示例性实施例的mAb1 Fab2和内标mAb2 Fab2的SCX-MS TIC。
图4B示出了根据示例性实施例的与内标相比，纯溶液中测得的mAb1浓度在20pg与20ng之间的线性度。
图4C示出了根据示例性实施例的与内标相比，纯溶液中测得的mAb1浓度在20ng与2μg之间的线性度。
图4D示出了根据示例性实施例的纯溶液中浓度在20pg与2μg之间的mAb1的质谱图。
图5A示出了根据示例性实施例的当相对于内标归一化时血清中测得的mAb1浓度的线性度。
图5B示出了图5A的嵌入图，所述嵌入图展示了根据示例性实施例的在低浓度下在血清中测得的mAb1浓度的线性度。
图5C示出了图5B的嵌入图，所述嵌入图展示了根据示例性实施例的在低浓度下在血清中测得的mAb1浓度的线性度。
图6A示出了根据示例性实施例的在未相对于内标归一化的情况下血清中测得的mAb1浓度的线性度。
图6B示出了图6A的嵌入图，所述嵌入图展示了根据示例性实施例的血清中低浓度下测得的mAb1浓度的线性度。
图6C示出了图6B的嵌入图，所述嵌入图展示了根据示例性实施例的血清中低浓度下测得的mAb1浓度的线性度。
图7A示出了根据示例性实施例的质谱图中血清中的mAb1的检测限(LOD)。
图7B示出了根据示例性实施例的质谱图中血清中的mAb1的定量限(LOQ)。
具体实施方式
由于各种翻译后修饰(PTM)、蛋白质降解、酶促修饰和化学修饰，治疗性肽或蛋白质可能变为异质的，这些修饰或降解可以在肽或蛋白质的生产和纯化期间及之后的任何时间点被引入。异质变体的鉴定和表征对于控制生物制药产品的生物物理特性的质量属性至关重要。在生物制药工业中需要快速灵敏的高通量分析方法来控制和监测治疗性肽或蛋白质的生产和纯化，如单克隆抗体或抗体-药物缀合物的生产。
施用之后治疗性肽或蛋白质在体内的处理进一步决定了治疗剂的如功效和安全性等特征。肽或蛋白质的药代动力学(PK)和药效学(PD)等特性可能只有在施用之后才会变得明显。另外，对治疗性肽或蛋白质的修饰可能会在体内继续进行，从而产生在制造期间可能无法预测的生物转化产物。因此，为了充分了解治疗剂的重要属性，可以对生物样品进行分析，这对所关注蛋白质或肽的灵敏和特异性表征以及定量提出了增加的复杂性和挑战。
基于电喷雾电离质谱法(ESIMS)的完整蛋白质分析已成为开发期间治疗性蛋白质表征的重要工具。最常见的是，在变性条件下MS耦接到反相液相色谱法(RPLC)。然而，此方法的灵敏度以及由所得具有多种分析物电荷状态的复合物样品产生的信噪比具有限制，这可能使对于低丰度抗体的准确定量不可靠。
最近，已经描述了包括在线耦接到ESIMS的天然离子交换色谱法的LC-MS系统(Yan等人,2020,《美国质谱学会会志(J Am Soc Mass Spectrom)》,31:2171-2179)。与常规的变性RPLC-MS相比，使用天然强阳离子交换色谱法(SCX)-MS为治疗性抗体的分析提供了许多优势。与RPLC相比，天然SCX-MS可以表现出高灵敏度和宽动态范围，以及从基质中分离目标分析物(例如血清样品中的血清蛋白)的优异能力。天然SCX-MS图谱的特征还可以是优异的MS空间分辨率，从而更容易检测蛋白质变体或生物转化产物。
如上文所描述的，需要灵敏的方法来表征样品中的如治疗性抗体等治疗性蛋白质和肽，并且对所述治疗性蛋白质和肽进行定量。本公开阐述了一种用于表征抗体的新型天然SCX-MS方法，其适于开发治疗性抗体。
除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的任何方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试，但现在对特定方法和材料进行描述。
术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”，并且术语“约”和“大约”应理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的，并且在提供范围的情况下，包含端点。如本文所使用的，术语“包含(include)”、“包含(includes)”和“包含(including)”意指是非限制性的，并且被理解为分别意指“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprising)”。
如本文所使用的，术语“蛋白质”或“所关注蛋白质”可以包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体和通过肽键连接的其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是本领域的技术人员已知的。蛋白质可以包括一种或多种多肽以形成单一功能性生物分子。在另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。所关注蛋白质可以包含以下中的任一种：生物治疗蛋白、用于研究或疗法的重组蛋白、trap蛋白和其它嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来产生，如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))和哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于最近讨论生物治疗性蛋白及其生产的综述，参见Ghaderi等人,“用于生物治疗性糖蛋白的生产平台-非人唾液酸化的发生、影响和挑战(Production platforms forbiotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-humansialylation)”(Darius Ghaderi等人,用于生物治疗性糖蛋白的生产平台-非人类唾液酸化的发生、影响和挑战),28《生物技术和基因工程综述(BIOTECHNOLOGY AND GENETICENGINEERING REVIEWS)》147-176(2012)，所述文献的全部教导内容并入本文)。在一些示例性实施例中，蛋白质包括修饰、加合物和其它共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包含例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAGtag、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记以及其它染料等。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白，如球状蛋白和纤维状蛋白；缀合蛋白，如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白，如初级衍生的蛋白和次级衍生的蛋白。
在一些示例性实施例中，所关注蛋白质可以是重组蛋白、抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、融合蛋白、scFv和其组合。
如本文所使用的，术语“重组蛋白”是指由于在已经引入到合适的宿主细胞中的重组表达载体上携带的基因的转录和翻译而产生的蛋白质。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是抗体，例如，嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体。在某些示例性实施例中，重组蛋白可以是选自由以下组成的组的同种型的抗体：IgG、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在某些示例性实施例中，抗体分子是全长抗体(例如，IgG1)，或者可替代地抗体可以是片段(例如，Fc片段或Fab片段)。
如本文所使用的，术语“抗体”包含包括四个多肽链、通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区散布有更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基端到羧基端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在本发明的不同实施例中，抗大ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同或可为天然的或经人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。如本文所使用的，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含特异性地结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术衍生自完整抗体分子，所述标准技术如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成。可以通过化学方法或通过分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
如本文所用，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2(或“Fab2”)片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双功能抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域，以及三功能抗体、四功能抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。在一些示例性实施例中，抗体片段包括亲本抗体的足够的氨基酸序列，所述氨基酸序列是所述亲本抗体的片段，使得其如亲本抗体那样与同一抗原结合；在一些示例性实施例中，片段与具有与亲本抗体的亲和力相当的亲和力的抗原结合和/或与亲本抗体竞争以与抗原结合。抗体片段可以通过任何方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或抗体片段可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。在一些示例性实施例中，抗体片段可以通过用消化酶IdeS或其变体消化来产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多个链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。功能性抗体片段通常包括至少约50个氨基酸，并且更通常包括至少约200个氨基酸。
术语“双特异性抗体”包含能够与两个或多个表位选择性结合的抗体。双特异性抗体通常包括两个不同的重链，其中每个重链与两个不同分子(例如，抗原)上或同一分子上(例如，同一抗原上)的不同表位特异性结合。如果双特异性抗体能够与两个不同的表位(第一表位和第二表位)选择性结合，则第一重链对第一表位的亲和力通常比第一重链对第二表位的亲和力低至少一个至两个或三个或四个数量级，反之亦然。由双特异性抗体识别的表位可以位于相同或不同的靶标上(例如，位于相同或不同的蛋白质上)。双特异性抗体可以例如通过组合识别同一抗原的不同表位的重链来制备。例如，编码识别同一抗原的不同表位的重链可变序列的核酸序列可以与编码不同重链恒定区的核酸序列融合，并且此类序列可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达。
典型的双特异性抗体具有两个重链，所述两个重链各自具有三个重链CDR，随后是CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域以及免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链不赋予抗原结合特异性但可以与每个重链缔合，或者可以与每个重链缔合且可以与由重链抗原结合区结合的表位中的一个或多个表位结合，或者可以与每个重链缔合且使得所述重链中的一个或两个重链能够与一个或两个表位结合。bsAb可以分成两个主要类别：一类是带有Fc区(IgG样)；以及另一类是缺乏Fc区，后者通常小于包括Fc的IgG和IgG样双特异性分子。IgG样bsAb可以具有不同形式，如但不限于三功能抗体、杵臼IgG(kih IgG)、crossMab、orth-Fab IgG、双可变结构域Ig(DVD-Ig)、二合一或双功能Fab(DAF)、IgG-单链Fv(IgG-scFv)或κλ体。非IgG样不同形式包含串联scFv、双抗体形式、单链双抗体、串联双抗体(TandAbs)、双亲和力再靶向分子(DART)、DART-Fc、纳米抗体或通过对接锁定(dock-and-lock，DNL)方法产生的抗体(Gaowei Fan、Zujian Wang和Mingju Hao,双特异性抗体及其应用(Bispecific antibodies and their applications),8《血液学与肿瘤学杂志(JOURNALOF HEMATOLOGY&ONCOLOGY)》130；Dafne Müller和Roland E.Kontermann,双特异性抗体(Bispecific Antibodies),《治疗性抗体手册(HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES)》265-310(2014)，所述文献的全部教导内容并入本文)。产生bsAb的方法不限于基于两种不同的杂交瘤细胞系的体细胞融合的四杂交瘤(quadroma)技术、涉及化学交联剂的化学缀合以及利用重组DNA技术的基因方法。bsAb的实例包含在以下专利申请中公开的bsAb，所述专利申请特此通过引用并入：于2010年6月25日提交的美国序列号12/823838；于2012年6月5日提交的美国序列号13/488628；于2013年9月19日提交的美国序列号14/031075；于2015年7月24日提交的美国序列号14/808171；于2017年9月22日提交的美国序列号15/713574；于2017年9月22日提交的美国序列号15/713569；于2016年12月21日提交的美国序列号15/386453；于2016年12月21日提交的美国序列号15/386443；于2016年7月29日提交的美国序列号15/22343；以及于2017年11月15日提交的美国序列号15814095。
如本文所使用的，“多特异性抗体”是指对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体。虽然这些分子通常将仅与两种抗原(即，双特异性抗体，bsAb)结合，但具有另外特异性的抗体，如三特异性抗体和KIH三特异性抗体也可以通过本文所公开的系统和方法来解决。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。
在一些示例性实施例中，所关注蛋白质可以从哺乳动物细胞中产生。哺乳动物细胞可以是人来源的或非人来源的，可以包含原代上皮细胞(例如，角质形成细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和视网膜上皮细胞)、已建立的细胞系及其菌株(例如，293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK(NBL-1)细胞、911细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWo细胞、Chang细胞、Detroit 562细胞、HeLa 229细胞、HeLa S3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LSI80细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-MK2细胞、克隆M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-l细胞、LLC-PKi细胞、PK(15)细胞、GHi细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC 256细胞、MHiCi细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞、BSC-1细胞、RAf细胞、RK细胞、PK-15细胞或其衍生物)、来自任何组织或器官(包含但不限于心脏、肝脏、肾脏、结肠、肠、食道、胃、神经组织(脑、脊髓)、肺、血管组织(动脉、静脉、毛细管)、淋巴组织(淋巴腺、腺样、扁桃体、骨髓和血液)、脾和成纤维细胞以及成纤维细胞样细胞系)的成纤维细胞(例如，CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、邓普斯细胞(Dempsey cell)、Detroit 551细胞、Detroit 510细胞、Detroit 525细胞、Detroit 529细胞、Detroit 532细胞、Detroit 539细胞、Detroit 548细胞、Detroit 573细胞、HEL 299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、Midi细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDMiC3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、菌株2071(小鼠L)细胞、L-M菌株(小鼠L)细胞、L-MTK'(小鼠L)细胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSA1细胞、Swiss/3T3细胞、印度麂细胞(Indian muntjac cell)、SIRC细胞、Cn细胞和詹森细胞(Jensen cell)、Sp2/0、NS0、NS1细胞或其衍生物)。
如本文所使用的，“样品”可以从生物过程的任何步骤获得，如细胞培养液(CCF)、收获的细胞培养液(HCCF)、下游加工中的任何步骤、包括最终经调配产品的药物物质(DS)或药物产品(DP)。在一些其它具体示例性实施例中，样品可以选自澄清、色谱生产、病毒灭活或过滤的下游工艺的任何步骤。在一些具体的示例性实施例中，药物产品可以选自在临床、运输、储存或处理中制造的药物产品。
样品也可以在施用治疗性肽或蛋白质之前和/或之后取自受试者，在这种情况下，所述样品可以是“生物样品”或“PK样品”。生物样品可以是例如组织样品、血液样品、血清样品、唾液样品或尿液样品。在示例性实施例中，血清样品取自受试者以便在施用之后表征所关注蛋白质和/或对所述所关注蛋白质进行定量。在一些示例性实施例中，生物样品取自小鼠。
如本文所使用的，术语“杂质”可以包含存在于蛋白质生物制药产物中的任何不期望的蛋白质。杂质可以包含与工艺和产物相关杂质。杂质可以进一步具有已知结构、可以部分表征或未鉴定。工艺相关杂质可以衍生自制造工艺，并且可以包含三大类：细胞底物衍生的、细胞培养物衍生的和下游衍生的。细胞底物衍生的杂质包含但不限于衍生自宿主生物体的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物衍生的杂质包含但不限于诱导剂、抗生素、血清和其它介质组分。下游衍生的杂质包含但不限于酶、化学和生化加工试剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如，单克隆抗体)和其它可浸出物。产物相关杂质(例如，前体、某些降解产物)可以是在制造和/或储存期间产生的分子变体，所述分子变体在活性、功效和安全性方面不具有与期望产物的性质相当的性质。此类变体可能需要在分离和表征方面付出相当大的努力以便鉴定修饰的类型。产物相关杂质可以包含截短形式、修饰形式和聚集体。截短形式是由水解酶或催化肽键切割的化学物质形成的。修饰形式包含但不限于脱酰胺化、异构化、错配的S-S连接、氧化或改变的缀合形式(例如，糖基化、磷酸化)。修饰形式还可以包含任何翻译后修饰形式。聚集体包含二聚体和更高倍数的期望产物。(Q6B规范：生物技术/生物产物的测试程序和验收标准(Q6B Specifications:Test Procedures and Acceptance Criteriafor Biotechnological/Biological Products),国际人用药品注册技术协调会(ICH)1999年8月,美国卫生与人类服务部(U.S.Dept.of Health and Humans Services))。
如本文所用，一般术语“翻译后修饰”或“PTM”是指多肽在其核糖体合成期间(共翻译修饰)或之后(翻译后修饰)经历的共价修饰。PTM通常由特定的酶或酶途径引入。许多发生在蛋白质骨架内的特定特征蛋白质序列(特征序列)的位点处。已经记录了数百个PTM，并且这些修饰总是影响蛋白质结构或功能的某个方面(Walsh,G.“蛋白质(Proteins)”(2014)第二版，由威利父子公司出版(Wiley and Sons,Ltd.),ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包含但不限于切割、N端延伸、蛋白质降解、N端酰化、生物素化(赖氨酸残基与生物素的酰化)、C端酰胺化、糖基化、碘化、辅基的共价连接、乙酰化(添加乙酰基，通常在蛋白质的N端处)、烷基化(添加烷基(例如，甲基、乙基、丙基)，通常在赖氨酸或精氨酸残基处)、甲基化、腺苷酸化、ADP-核糖基化、多肽链内或之间的共价交联、磺化、异戊二烯化、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基端酰胺化)、维生素K依赖性修饰，其中维生素K是谷氨酸残基羧化的辅助因子，导致形成γ-羧基谷氨酸(谷氨酸残基)、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价键)、甘氨酸化(共价键甘氨酸残基)、糖基化(将糖基添加到天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸，生成糖蛋白)、异戊二烯化(添加类异戊二烯基团，如法尼醇和香叶基香叶醇)、脂酰化(脂酸酯功能的连接)、磷酸巯基乙胺化(从辅酶A中添加4'-磷酸泛酰巯基乙胺基部分，如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中)、磷酸化(添加磷酸基团，通常是丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸)和硫酸化(添加硫酸基团，通常添加到酪氨酸残基)。改变氨基酸化学性质的翻译后修饰包含但不限于瓜氨酸化(通过脱氨基化将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺化(将谷氨酰胺转化为谷氨酸或天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包含但不限于二硫键的形成(两个半胱氨酸氨基酸的共价连接)和蛋白水解切割(蛋白质在肽键处的切割)。某些翻译后修饰涉及添加其它蛋白质或肽，如ISG化(与ISG15蛋白共价连接(干扰素刺激基因))、SUMO化(与SUMO蛋白共价连接(小泛素相关修饰剂))和泛素化(与蛋白质泛素共价连接)。对于由UniProt策划的PTM的更详细的受控词汇表，参见欧洲生物信息研究所蛋白质信息资源SIB瑞士生物信息研究所、欧洲生物信息研究所Drs-果蝇霉素前体-黑腹果蝇(果蝇)-Drs基因与蛋白质(European BioinformaticsInstitute Protein Information ResourceSIB Swiss Institute of Bioinformatics,European Bioinformatics Institute Drs-Drosomycin precursor-Drosophilamelanogaster(Fruit fly)-Drs gene&protein)，http://www.uniprot.org/docs/ptmlist(最近一次访问是2019年1月15日)。
治疗性肽或蛋白质的翻译后修饰、电荷变体或尺寸变体可以出现在治疗性肽或蛋白质的产生、制造、储存、递送或施用期间的任何时间点。肽或蛋白质的另外修饰可以在被称为“生物转化”的工艺中在施用于受试者之后在体内发生。与施用前治疗剂相比，生物转化产物可以具有经修饰的特性。生物转化通常会引起治疗剂尺寸的减小，使得可能优选对较小分析物具有更高灵敏度的检测方法。在一些示例性实施例中，本发明的方法的特征是对所关注蛋白质的生物转化产物具有高灵敏度。
在一些示例性实施例中，用于表征所关注蛋白质和/或对所述所关注蛋白质进行定量的方法可以任选地包括使用免疫沉淀(IP)富集样品基质中的所关注蛋白质。如本文所使用的，术语“免疫沉淀”可以包含使用与所述特定蛋白质特异性结合的抗体将蛋白质抗原从溶液中沉淀出来的过程。免疫沉淀可以是直接的，其中将靶蛋白的抗体固定在固相底物上，或者免疫沉淀可以是间接的，其中将游离抗体添加到蛋白质混合物并且稍后用例如蛋白A/G珠粒捕获。
在一些示例性实施例中，固相底物可以是珠粒，例如琼脂糖珠粒或磁性珠粒。珠粒可以涂覆在链霉亲和素中以促进与抗体的粘附。然后，生物素化的“捕获”抗体可以与链霉亲和素涂覆的珠粒接触，粘附到珠粒上并且形成能够与粘附的抗体的抗原结合的“免疫沉淀珠粒”。在一些示例性实施例中，粘附的捕获抗体可以是抗Fc抗体，并且具体地可以是抗人Fc抗体。
抗人Fc抗体将优先与任何人抗体(例如治疗性抗体)的Fc结构域结合，因此可以用于从样品中免疫沉淀或“拉下”治疗性抗体，从而使其富集以进行分析。在免疫沉淀治疗性抗体之后，可以将消化酶与免疫沉淀混合物接触以切割治疗性抗体并且释放抗体片段，然后可以将所述抗体片段洗脱用于进一步分析。在示例性实施例中，IdeS或其变体用作消化酶。IdeS切割产生两个抗体片段：Fc片段和Fab2片段。当治疗性抗体的Fc结构域与抗人Fc捕获抗体结合时，用IdeS切割将导致释放未结合的Fab2片段，然后可以将所述片段洗脱以进行进一步分析。在示例性实施例中，使洗脱的Fab2片段经受液相色谱法-质谱法分析，特别是天然SCX-MS。
如本文所使用的，术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。存在若干种方法用于使用适当的水解剂进行样品中的蛋白质的消化，例如酶消化或非酶消化。
如本文所使用的，术语“消化酶”是指可以进行蛋白质的消化的大量不同药剂中的任一种。可以进行酶促消化的水解剂的非限制性实例包含来自赛氏曲霉(AspergillusSaitoi)的蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶XIII、胃蛋白酶、胰蛋白酶、Tryp-N、糜蛋白酶、曲霉胃蛋白酶I、LysN蛋白酶(Lys-N)、LysC蛋白内切酶(Lys-C)、蛋白内切酶Asp-N(Asp-N)、蛋白内切酶Arg-C(Arg-C)、蛋白内切酶Glu-C(Glu-C)或外膜蛋白T(OmpT)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、V8蛋白酶或其生物激活片段或同源物或其组合。对于讨论蛋白质消化的可用技术的最近综述，参见Switazar等人,“蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述(Protein Digestion:An Overview of the Available Techniques and RecentDevelopments)”(Linda Switzar、Martin Giera和Wilfried M.A.Niessen,蛋白质消化：可用技术和最新开发的概述,12《蛋白质组学研究杂志(JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH)》1067-1077(2013))。
在一些示例性实施例中，IdeS或其变体用于切割铰链区以下的抗体，产生Fc片段和Fab2片段。分析物的消化可能是有利的，因为尺寸减小可以增加使用LC-MS表征和检测分析物的灵敏度和特异性。当用于此目的时，可能优选分离出Fc片段并保留Fab2片段进行分析的消化。这是因为Fab2片段中含有所关注可变区，如抗体的互补决定区(CDR)，而Fc片段在抗体之间可能相对一致，因此提供的相关信息较少。另外，IdeS消化具有高效率，使分析物的回收率高。消化和洗脱过程可以在天然条件下进行，使得可以简单地耦接到天然LC-MS系统。
IdeS或其变体可商购获得并且可以作为例如或FabRICATOR/>销售。
如本文所使用的，术语“液相色谱法”是指其中由液体携带的生物/化学混合物可以由于在组分流过(或流入)固定液相或固相时组分的差异分布而分离成组分的过程。液相色谱法的非限制性实例包含反相液相色谱法、离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、亲水相互作用色谱法或混合模式色谱法。
在一些示例性实施例中，用于表征所关注蛋白质和/或对所述所关注蛋白进行定量的方法可以包含使用强阳离子交换(SCX)色谱法。阳离子交换色谱法是离子交换色谱法的一个子集，所述离子交换色谱法使用具有带负电荷的官能团的固定相来捕获带正电荷的分析物。可以逐渐调节色谱法缓冲液的pH，以便按照pI的顺序释放和洗脱分析物。
阳离子交换色谱法使用“阳离子交换色谱法材料”。根据所使用的阳离子交换色谱法材料，阳离子交换色谱法可以进一步细分为例如强阳离子交换(SCX)或弱阳离子交换。具有磺酸基团(S)的阳离子交换色谱法材料可以用于强阳离子交换剂，而具有羧甲基(CM)的阳离子交换色谱法材料可以用于弱阳离子交换剂。强阳离子交换剂包含例如使用硫酸甲酯官能团的SOURCE S和使用磺丙基官能团的SP琼脂糖凝胶。弱阳离子交换剂包含例如CM-纤维素，其使用羧甲基官能团。SCX可能是优选的，因为可以使用更宽pH范围的缓冲液，而不会失去强阳离子交换剂的电荷，从而可以有效分离具有宽pI范围的分析物。
阳离子交换色谱法材料可以从多家公司以不同的名称获得，例如Bio-Rex、Macro-Prep CM(可从美国加利福尼亚州赫拉克勒斯的BioRad实验室(BioRad Laboratories,Hercules,Calif.,USA)获得)；弱阳离子交换WCX 2(可从美国加利福尼亚州菲蒙市的赛弗吉公司(Ciphergen,Fremont,Calif.,USA)获得)；Dowex MAC-3(可从美国密歇根州米德兰市的陶氏化学公司(Dow chemical company,Midland,Mich.,USA)获得)；Mustang C(可从美国纽约州东山的颇尔公司(Pall Corporation,East Hills,N.Y.,USA)获得)；纤维素CM-23、CM-32、CM-52、hyper-D和partisphere(可从英国布伦特福德的沃特曼公司(Whatmanplc,Brentford,UK)获得)；Amberlite IRC 76、IRC 747、IRC 748、GT 73(可从德国斯图加特的东曹生命科学股份有限公司(Tosoh Bioscience GmbH,Stuttgart,Germany)获得)；CM1500、CM 3000(可从美国印第安纳州泰瑞豪特的BioChrom实验室(BioChrom Labs,TerreHaute,Ind.,USA)获得)；以及CM-琼脂糖凝胶快速流(可从德国GE医疗集团生命科学部门(GE Healthcare,Life Sciences,Germany)获得)。另外，可商购获得的阳离子交换树脂进一步包含羧甲基纤维素、Bakerbond ABX、固定在琼脂糖上的磺丙基(SP)(例如SP-琼脂糖凝胶快速流或SP-琼脂糖凝胶高性能，可从德国弗莱堡的GE医疗集团—安玛西亚生物科学欧洲股份有限公司(GE Healthcare—Amersham Biosciences Europe GmbH,Freiburg,Germany)获得)和固定在琼脂糖(例如可从德国GE医疗集团生命科学部门获得的S-琼脂糖凝胶快速流)上的磺酰基。
阳离子交换色谱法材料包含进行离子交换和疏水性相互作用技术的组合的混合型色谱法材料(例如Capto adhere、Capto MMC、MEP HyperCell、Eshmuno HCX等)、进行阴离子交换和阳离子交换技术的组合的混合型色谱法材料(例如羟基磷灰石、陶瓷羟磷灰石等)等。可以用于本发明的阳离子交换色谱法的阳离子交换色谱法材料可以包含但不限于如上文所描述的所有可商购获得的阳离子交换色谱法材料。
虽然变性RPLC-MS是表征治疗性蛋白质的常规技术，但天然SCX-MS可以提供如本文所描述的分析优势。例如，天然SCX-MS可以提高检测的灵敏度和特异性。在RPLC和SCX的检测限相当的情况下，SCX可以提供优异的数据质量和更高的信噪比。SCX可以具有改进的将靶分析物与基质蛋白(例如血清样品中的血清蛋白)分离的能力，并且另外可以具有改进的分离所关注蛋白质的生物转化产物的能力。因此，本发明的方法的优选色谱法是天然SCX，并且本文公开了使用天然SCX表征所关注蛋白质和/或对所述所关注蛋白质进行定量的新型方法。
如本文所使用的，术语“质谱仪”包含能够鉴定特定分子物种并且测量其准确质量的装置。所述术语意味着包含多肽或肽可以表征到其中的任何分子检测器。质谱仪可以包含三个主要部分：离子源、质量分析仪和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中，并且同时(如以电喷雾电离的方式)或通过单独的过程被电离。离子源的选择取决于应用。在一些示例性实施例中，所述质谱仪可以是串联质谱仪。如本文所使用的，术语“串联质谱法”包含通过使用多级质量选择和质量分离来获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是将样品分子转化为气相并被电离，使得在第一质量选择步骤之后以可预测且可控制的方式形成碎片。多级MS/MS或MSn可以通过首先选择并分离前体离子(MS2)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS3)、将其碎裂、分离次级碎片(MS4)等来进行，只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号是可检测的。串联MS已通过各种分析仪组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析仪可以由许多不同的因素确定，如灵敏度、选择性和速度，以及尺寸、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析仪在空间上耦接或耦接到空间串联分析仪。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析仪。可以设计具体的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中离解，并且然后将产物离子传输到另一个分析仪进行m/z分离和数据采集。在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、隔离、碎裂和m/z分离。通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后改性的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。所述表征包含但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰或鉴定翻译后修饰或可比性分析或其组合。
在一些示例性方面，质谱仪可以使用纳米电喷雾或纳米喷雾上工作。
如本文所使用的，术语“纳米电喷雾”或“纳米喷雾”是指通常在不使用外部溶剂递送的情况下，在非常低的溶剂流速下，通常每分钟样品溶液数百纳升或更低的电喷雾离子化。形成纳米电喷雾的电喷雾输注装置可以使用静态纳米电喷雾发射器或动态纳米电喷雾发射器。静态纳米电喷雾发射器在延长的时间段内对小样品(分析物)溶液体积进行连续分析。动态纳米电喷雾发射器使用毛细管柱和溶剂递送系统在质谱仪分析之前对混合物进行色谱分离。
在一些示例性实施例中，SCX-MS可以在天然条件下进行。
如本文所使用的，术语“天然条件”可以包含在保留分析物中非共价相互作用的条件下进行质谱法。天然质谱法是一种研究天然或近天然状态下完整生物分子结构的方法。术语“天然”是指溶液中的分析物在经受电离之前的生物状态。可以控制含有生物分析物的溶液的若干个参数，例如pH和离子强度，以维持溶液中的生物分析物的天然折叠状态。通常，天然质谱法基于电喷雾电离的特定方法，其中生物分析物从非变性溶剂中喷出。其它术语，如非共价、天然喷雾、电喷雾电离、非变性、大分子或超分子质谱法也可以描述天然质谱法。在示例性实施例中，与非天然MS相比，天然MS允许更佳的空间分辨率，从而改善了治疗性蛋白质的生物转化产物的检测。有关天然MS的详细评论，参考综述：Elisabetta BoeriErba和Carlo Pe-tosa,天然质谱法在表征大分子复合物的结构和动力学中的新兴作用(The emerging role of native mass spectrometry in characterizing thestructure and dynamics of macromolecular complexes),24《蛋白质科学(PROTEINSCIENCE)》1176-1192(2015))。
在一些示例性实施例中，SCX-MS可以在非天然条件下进行。所关注肽或蛋白质可以通过例如烷基化、还原、变性和/或消化来制备。
如本文所使用的，术语“蛋白质烷基化剂”是指用于使蛋白质中的某些游离氨基酸残基烷基化的药剂。蛋白质烷基化剂的非限制性实例是碘乙酰胺(IOA)、氯乙酰胺(CAA)、丙烯酰胺(AA)、N-乙基马来酰亚胺(NEM)、甲烷硫代磺酸甲酯(MMTS)和4-乙烯基吡啶或其组合。
如本文所使用的，“蛋白质变性”可以指分子的三维形状从其天然状态改变的过程。蛋白质变性可以使用蛋白质变性剂来进行。蛋白质变性剂的非限制性实例包含热、高或低pH、还原剂如DTT(参见下文)或暴露于离液剂。若干种离液剂可以用作蛋白质变性剂。离液溶质通过干扰由非共价力，如氢键、范德华力(van der Waals force)和疏水作用介导的分子内相互作用来增加系统的熵。离液剂的非限制性实例包含丁醇、乙醇、盐酸胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、N-月桂酰肌氨酸、尿素和其盐。
如本文所使用的，术语“蛋白质还原剂”是指用于还原蛋白质中的二硫键的药剂。用于还原蛋白质的蛋白质还原剂的非限制性实例是二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、埃尔曼试剂(Ellman's reagent)、盐酸羟胺、氰基硼氢化钠、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)或其组合。
在一些示例性方面，质谱仪可以是串联质谱仪。
如本文所使用的，术语“串联质谱法”包含通过使用多级质量选择和质量分离来获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可以被转移到气相中并被完整地电离，并且所述样品分子可以在第一质量选择步骤之后以一些可预测和可控制的方式被诱导分裂。多级MS/MS或MSn可以通过首先选择并分离前体离子(MS2)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS3)、将其碎裂、分离次级碎片(MS4)等来进行，只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号是可检测的。串联MS已通过各种分析仪组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析仪可以由许多不同的因素确定，如灵敏度、选择性和速度，以及尺寸、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析仪在空间上耦接或耦接到空间串联分析仪。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析仪。可以设计具体的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中离子被选择、在中间区域中离解，并且然后将产物离子传输到另一个分析仪进行m/z分离和数据采集。在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、隔离、碎裂和m/z分离。
通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后修饰的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。所述表征包含但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰或鉴定翻译后修饰或可比性分析或其组合。
如本文所使用的，术语“数据库”是指可能存在于样品中的蛋白质序列的汇编集合，例如以FASTA格式的文件形式。相关的蛋白质序列可能来自正在研究的物种的cDNA序列。可以用于搜索相关蛋白质序列的公共数据库包含由例如Uniprot或Swiss-prot托管的数据库。可以使用本文中被称为“生物信息学工具”的内容搜索数据库。生物信息学工具提供了根据数据库中所有可能的序列搜索未解释的MS/MS谱的能力，并提供解释(注释)MS/MS谱作为输出。此类工具的非限制性实例是Mascot(www.matrixscience.com)、SpectrumMill(www.chem.agilent.com)、PLGS(www.waters.com)、PEAKS(www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(www.sagenresearch.com)、OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector(prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(fields.scripps.edu/sequest)。
在一些示例性实施例中，质谱仪耦接到色谱法系统，例如SCX。
在一些示例性实施例中，质谱仪可以耦接到液相色谱法-多反应监测系统。更通常地，质谱仪可以能够通过选择反应监测(SRM)进行分析，包含连续反应监测(CRM)和平行反应监测(PRM)。
如本文所使用的，“多反应监测”或“MRM”是指一种具有高灵敏度、特异性和宽动态范围的可以对复合物基质内的小分子、肽和蛋白质进行精确定量的基于质谱法的技术(Paola Picotti和Ruedi Aebersold,基于选择反应监测的蛋白质组学：工作流程、潜力、误区和未来方向(Selected reaction monitoring–based proteomics:workflows,potential,pitfalls and future directions),9《自然方法(NATURE METHODS)》555–566(2012))。MRM通常可以用三重四极杆质谱仪进行，其中在第一个四极杆中选择对应于所选小分子/肽的前体离子，并且在第三个四极杆中选择用于监测的前体离子的碎片离子(YongSeok Choi等人,用于验证多种阿尔茨海默氏病生物标志物候选物的靶向人脑脊液蛋白质组学(Targeted human cerebrospinal fluid proteomics for the validation ofmultiple Alzheimers disease biomarker candidates),930《色谱法杂志B(JOURNAL OFCHROMATOGRAPHY B)》129–135(2013))。
在一些方面，本申请的方法或系统中的质谱仪可以是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪，其中质谱仪可以耦接到液相色谱法系统，其中质谱仪能够进行LC-MS(液相色谱法-质谱法)或LC-MRM-MS(液相色谱法-多重反应监测-质谱法)分析。
如本文所使用的，术语“质量分析仪”包含可以根据物种的质量分离物种(即，原子、分子或簇)的装置。可以采用的质量分析仪的非限制性实例是飞行时间(TOF)、磁电扇区、四极杆滤质器(Q)、四极杆离子阱(QIT)、轨道阱、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)以及还有加速器质谱法(AMS)技术。
应当理解，本发明不限于上述所关注蛋白质、抗体、抗体片段、样品、杂质、PTM、免疫沉淀方法、液相色谱法方法或系统、质谱仪、烷化剂、还原剂、消化酶、数据库或生物信息工具中的任何一者，并且任何所关注蛋白质、抗体、抗体片段、样品、杂质、PTM、免疫沉淀方法、液相色谱法方法或系统、质谱仪、烷化剂、还原剂、消化酶、数据库或生物信息工具可以通过任何合适的手段来选择。
通过参考以下实例，将更充分地理解本发明。然而，以下实例不应被解释为限制本发明的范围。
实例
本发明的方法的示例性实施例在图1中说明。所示出的第一个部件是含有与链霉亲和素部分缀合的琼脂糖珠粒的盒。然后将生物素化的抗人Fc抗体添加到所述盒中并且与链霉亲和素珠粒结合以产生免疫沉淀珠粒。生物素化的抗人Fc可以被生产或商业购买。示例性生物素-链霉亲和素反应包括在约室温下温育约15分钟。然后将包含分析物的样品添加到所述盒中并且温育以免疫沉淀或“拉下”分析物。示例性免疫沉淀过程包括在约室温下温育约1小时。所展示的实例是来自药代动力学研究的样品，所述样品包括三特异性抗体作为所关注蛋白质和分析物，但本发明的方法不限于此实例并且可以应用于包括任何抗体或抗体相关蛋白的任何合适的样品。
然后洗涤样品以去除非特异性结合的组分。示例性洗涤步骤包括用6个盒体积的HBS-EP缓冲液(思拓凡公司(Cytiva))洗涤所述盒，随后用6个盒体积的Tris-HCl(10mM，pH7.5)洗涤所述盒。然后将消化酶，例如IdeS或其变体添加到盒中并且温育，这引起结合的分析物的切割，例如将抗体的Fc片段与Fab2片段分离。示例性消化步骤包括每μg分析物添加40单位的IdeS蛋白(Genovis公司(Genovis))或1单位的消化酶，并且在约37℃下温育约30分钟至约1小时。将所述盒离心(“旋转沉降”)以洗脱游离的Fab2片段，并且收集洗脱液用于后续的天然SCX-MS分析。
用于天然SCX-MS分析的示例性方法描述于Yan等人,2020,《美国质谱学会会志》,31:2171-2179中，所述文献特此通过引用并入。在示例性实施例中，SCX-MS条件如下。SCX柱是YMC BioPro IEX SF 4.6×50mm，5μm。柱温度是45℃。移动相A(MPA)包括10mM乙酸铵，并且移动相B(MPB)包括300mM乙酸铵。流速为0.4毫升/分钟。梯度为：0-1分钟：100％ MPA；1-9分钟：100％ MPA至100％ MPB；9-10.5分钟：100％MPB；10.5-10.6分钟：100％ MPB至100％MPA；以及10.6-15分钟：100％ MPA。
MS分辨率设置为12,500(UHMR)。毛细管喷雾电压设置为3.0kV。毛细管温度设置为350℃。S透镜RF水平设置为200。源内碎裂能量设置为100。HCD捕获气体压力设置为3。使用2000与15,000之间的m/z范围窗口获取质谱。
实例1.SCX柱的选择
比较多个SCX柱的性能以优化本发明的方法。如上文所描述的制备Fab2片段并且经受天然SCX-MS分析。将Bioresolve SCX 2.1×50mm与YMC SCX 4.6×50mm进行比较。每个柱的SCX-MS总离子色谱图(TIC)示出于图2中，其中示出每个实验的对应流速和温度。基于所述方法所证实的灵敏度，YMC SCX 4.6×50mm用于另外的实验，使用10至300mM乙酸铵缓冲液的8分钟梯度。
实例2.确立纯溶液中的检测限和定量限
在纯溶液中对Fab2片段测试本发明的天然SCX-MS方法以确立检测限(LOD)。纯溶液包括含抗体分析物和内标抗体(300pg/μL或柱上600pg)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)。测试了一系列抗体作为分析物，其中pI范围从高到低，如图3A所示出的。测试的抗体的pI范围介于6.28与8.15之间。柱上测试的样品量范围为20pg至2μg，其中浓度范围介于10pg/μL与1μg/μL之间。
对每个样品进行15分钟的SCX运行，各自流速为0.2毫升/分钟，Ab9除外。测试的抗体包含IgG1和IgG4抗体以及mAb和bsAb，表示多种治疗性抗体。本发明的方法能够以高灵敏度有效地分离和分析每种抗体。浓度范围介于20pg与20ng之间的两种示例性抗体的质谱图示出于图3B和3C中。在这些条件下使用本发明的方法Fab2片段的绝对LOD被测定为20pg。
进一步评估纯溶液中的LOD和定量限(LOQ)，如图4中所示出的。使用天然SCX-MS分析mAb1的Fab2片段，其中mAb2的Fab2片段用作内标，如图4A中的TIC所示出的。图4B示出了在介于20pg与20ng之间的浓度范围内，如通过本发明的方法测量的mAb1的实际浓度与相对于内标归一化的强度的比较。实际浓度相对于测量浓度示出了与0.9954的加权R2的线性关系，证实了本发明的方法准确且灵敏地对低浓度分析物进行定量的能力。图4C示出了对介于20ng与2μg之间的浓度范围进行的相同比较，在这个较高浓度范围内再次证实了强线性关系。介于20pg与2μg之间的示例性质谱图示出于图4D中，进一步展示了本发明的方法的灵敏度和特异性。
实例3.确立血清中的检测限和定量限
使用来自小鼠血清样品的分析物进一步证实了本发明的方法的稳健性。血清中所关注蛋白质的分析提出了许多另外的挑战，包含生物转化引起的所关注蛋白质的异质性，以及如高浓度血清蛋白等复杂基质引起的干扰。
如先前所描述的制备mAb1的Fab2片段并且经受天然SCX-MS分析。响应比(相对于内标归一化的测得的分析物强度)与抗体实际浓度的线性关系示出于图5A中。图5B和图5C示出了另外的嵌入图，证实即使在低浓度下响应的线性度。这些结果证实了本发明的方法即使在低浓度下在血清中对抗体进行定量的灵敏度和有效性。
在未相对于内标归一化的情况下，通过绘制与抗体浓度相比的测得的强度的线性度图，进一步证实了本发明的方法的稳定性，如图6A所示出的。图6B和6C示出了另外的嵌入图，证实了在低浓度下在血清中测得的强度的线性度，即使在未相对于内标归一化的情况下。
展示了血清和纯溶液中mAb1 Fab2的LOD和LOQ的质谱图示出于图7中。血清中的LOD测定低至0.025μg/mL，这相当于SCX柱上的50pg，如图7A所示出的。血清中的LOQ测定低至0.05μg/mL，这相当于SCX柱上的100pg，如图7B所示出的。信噪比(S/N)5被指示为用于确立LOQ的合理标准。从血清样品中检测到的mAb1 Fab2的绝对强度高于在纯溶液中检测到的绝对强度，表明血清样品的灵敏度限制是由于co-IPed血清蛋白的噪音造成的。
除了本文所公开的实例之外，在本领域技术人员已知的更有利的条件下使用本发明的方法，甚至更低的LOD和LOQ是可能的，例如使用洗脱时间更晚的抗体或在IP期间使用更大的洗涤体积。

Claims (15)

1.一种用于表征抗体的方法，所述方法包括：
(a)将所述抗体固定在固相底物上；
(b)使所述固定化抗体与消化酶接触以产生所述抗体的未结合片段；
(c)洗脱所述抗体片段；以及
(d)使所述洗脱液经受天然SCX-MS分析以表征所述抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或双特异性抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定步骤包括使包含所述抗体的样品与能够与所述抗体结合的固相底物接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述固相底物包括珠粒。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述珠粒是琼脂糖珠粒或磁性珠粒。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述结合是通过将抗体粘附到所述固相底物进行的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗体是抗Fc抗体。
8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在固定所述抗体之后洗涤所述固相底物的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述消化酶是IdeS或其变体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体片段是Fab2片段。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗脱包括离心所述固相底物和所述抗体片段的步骤。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述SCX系统耦接到所述质谱仪。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪是电喷雾电离质谱仪、纳米电喷雾电离质谱仪或三重四极杆质谱仪。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗体的表征包括抗体的定量，任选地其中所述定量相对于内标归一化。
15.根据权利要求3所述的方法，其中所述样品是血清样品。
CN202280049373.0A 2021-07-13 2022-07-12 使用免疫沉淀和天然scx-ms检测对治疗性抗体和相关产物进行生物分析 Pending CN117642634A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163221439P 2021-07-13 2021-07-13
US63/221,439 2021-07-13
PCT/US2022/036873 WO2023287826A1 (en) 2021-07-13 2022-07-12 Bioanalysis of therapeutic antibodies and related products using immunoprecipitation and native scx-ms detection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117642634A true CN117642634A (zh) 2024-03-01

Family

ID=82851604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280049373.0A Pending CN117642634A (zh) 2021-07-13 2022-07-12 使用免疫沉淀和天然scx-ms检测对治疗性抗体和相关产物进行生物分析

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230017454A1 (zh)
EP (1) EP4370930A1 (zh)
JP (1) JP2024526735A (zh)
KR (1) KR20240031398A (zh)
CN (1) CN117642634A (zh)
AU (1) AU2022311899A1 (zh)
CA (1) CA3225727A1 (zh)
CO (1) CO2024000204A2 (zh)
IL (1) IL309775A (zh)
WO (1) WO2023287826A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024158961A1 (en) * 2023-01-25 2024-08-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mass spectrometry-based characterization of antibodies co-expressed in vivo

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1522343A (en) 1923-05-02 1925-01-06 Thom Clarence Magnetic separator

Also Published As

Publication number Publication date
US20230017454A1 (en) 2023-01-19
CA3225727A1 (en) 2023-01-19
KR20240031398A (ko) 2024-03-07
CO2024000204A2 (es) 2024-01-25
JP2024526735A (ja) 2024-07-19
WO2023287826A1 (en) 2023-01-19
IL309775A (en) 2024-02-01
EP4370930A1 (en) 2024-05-22
AU2022311899A1 (en) 2024-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12000811B2 (en) Method and system of identifying and quantifying antibody fragmentation
JP2023052110A (ja) タンパク質を同定及び定量化する方法及びシステム
JP2023550367A (ja) 治療用タンパク質開発のための、自動反復ｌｃ－ｍｓ／ｍｓ（ｈｃｐ－ａｉｍｓ）による宿主細胞タンパク質不純物の偏りのない高スループット同定及び定量方法
US20230017454A1 (en) Bioanalysis of therapeutic antibodies and related products using immunoprecipitation and native scx-ms detection
US20230032607A1 (en) Protein n-terminal de novo sequencing by position-selective dimethylation
US20230348533A1 (en) Bioanalysis of therapeutic antibodies and related products using immunoprecipitation and native sec-pcd-ms detection
US20240255518A1 (en) Characterization of serine-lysine cross-link in antibody high molecular weight species
US20230092532A1 (en) Method to prevent sample preparation-induced disulfide scrambling in non-reduced peptide mapping
US20230243843A1 (en) Sequence variance analysis by proteominer
US20240337664A1 (en) Characterization of crosslinking sites in antibody-drug conjugates
JP2024535263A (ja) 自動反復タンデム質量分析による血漿プロテオミクスプロファイリング方法
CN116018520A (zh) 准确测量未加工的c末端赖氨酸的重肽方法
CN117716237A (zh) 用于确定生物制剂的产物相关变体的基于质谱法的策略
WO2024158961A1 (en) Mass spectrometry-based characterization of antibodies co-expressed in vivo
CN117999485A (zh) 用于表征生物的高分子量物质的基于质谱的策略

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination