CN117999485A - 用于表征生物的高分子量物质的基于质谱的策略 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及蛋白质表征领域，并且具体涉及通过实施包括使用柱后变性辅助SEC‑MS方法的工作流程来表征治疗性蛋白质的高分子量物质的方法，所述方法允许对高分子量物质的高度特异性、灵敏且全面的表征。

Description

用于表征生物的高分子量物质的基于质谱的策略
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年9月14日提交的美国临时专利申请第63/243,835号的优先权和权益，该美国临时专利申请通过引用并入本文。
技术领域
本发明一般涉及使用尺寸排阻色谱-质谱工作流程来表征治疗性蛋白质的高分子量尺寸变体的方法。
背景技术
治疗性蛋白质已经成为治疗癌症、自身免疫性疾病、感染和心脏代谢紊乱的重要药物，并且它们代表了制药行业中增长最快的产品部分中的一者。治疗性蛋白质产品必须达到非常高的纯度标准。因此，在治疗性蛋白质的药物开发、生产、储存和处理的不同阶段监测杂质可能是重要的。
高分子量(HMW)尺寸变体可能作为杂质存在于治疗性蛋白质样品中，并且由于它们对产品安全性和功效的影响而需要被密切监测和表征。由于最终药物物质(DS)样品中的HMW尺寸变体的复杂性和通常低的丰度，此类HMW物质的表征具有挑战性，并且传统上需要对HMW物质进行离线富集，随后使用各种分析工具进行分析。
因此，在本领域中，长期需要用于表征治疗性蛋白质产品中的此类HMW物质的有效方法。
发明内容
本文公开的示例性实施方案通过提供用于通过使用与质谱仪(SEC-MS)方法在线耦合的柱后变性辅助原生尺寸交换色谱来表征治疗性蛋白质产品中的此类HMW物质的方法来满足前述需求。这可以允许对直接来自未分级的样品中的HMW物质进行高度特异性、灵敏且全面的表征。该方法不仅基于完整组装体和组成亚基两者的准确的质量测量来提供高可信度的HMW物质鉴定，而且还允许深入分析相互作用性质和位置。此外，使用源自高质量、类似原生质谱的经提取离子色谱图，可以轻松地重建每个非共价和/或不可解离复合物的洗脱图谱，从而有助于理解复杂的HMW图谱。由于该方法不需要预先富集，因此对于在治疗性蛋白质产品的开发期间提供HMW物质的快速且深入的表征是可取的。
本公开提供一种用于表征感兴趣的蛋白质的至少一种高分子量物质的方法，所述方法包括：获得包含所述感兴趣的蛋白质和所述至少一种高分子量物质的样品；使所述样品与尺寸排阻色谱柱接触；洗涤所述柱以收集洗出液；向洗出液添加变性溶液以形成混合物；以及使所述混合物经历质谱仪以表征所述至少一种高分子量物质。
在该实施方案的一个方面，感兴趣的蛋白质为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或Fc融合蛋白。
在该实施方案的一个方面，所述洗出液包含所述至少一种高分子量物质。在该实施方案的一个方面，所述混合物还经历紫外线检测。
在该实施方案的一个方面，质谱仪为电喷雾电离质谱仪。在该实施方案的一具体方面，质谱仪为纳升电喷雾电离质谱仪
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪在原生条件下操作。在一具体方面，该方法进一步包括将来自使用获得的质谱的至少一个峰与通过在原生条件下对所述样品进行在线尺寸排阻色谱-质谱获得的质谱进行比较。
在该实施方案的一个方面，所述变性溶液包含乙腈、甲酸或乙腈和甲酸的组合。在该实施方案的一具体方面，所述变性溶液包含约60％v/v乙腈和4％v/v甲酸。在该实施方案的另一个具体方面，所述变性溶液包含约60％v/v乙腈。
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪在原生条件下操作。
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪中的所述混合物的流量小于约10μL/min。
在该实施方案的一个方面，将所述混合物分到所述质谱仪和紫外线检测器中。在该实施方案的一具体方面，使用多喷嘴发射器将去溶剂化气体与所述混合物一起添加。
在该实施方案的一个方面，在使(d)的所述混合物经历质谱仪之前向所述混合物添加去溶剂化气体。
在该实施方案的一个方面，所述至少一种高分子量物质为所述感兴趣的蛋白质的非共价高分子量物质或所述感兴趣的蛋白质的不可解离高分子量物质。
在该实施方案的一个方面，该方法进一步包括将来自质谱的至少一个峰与通过对所述样品进行在线尺寸排阻色谱-质谱获得的质谱进行比较。
本公开还提供一种用于表征感兴趣的蛋白质的至少一种高分子量物质的方法，所述方法包括：获得包含所述感兴趣的蛋白质和所述至少一种高分子量物质的样品；使用水解剂消化所述样品以形成经消化的样品；使所述经消化的样品与尺寸排阻色谱柱接触；洗涤所述柱以收集洗出液；向洗出液添加变性溶液以形成混合物；以及使所述混合物经历质谱仪以表征所述至少一种高分子量物质。
在该实施方案的一个方面，感兴趣的蛋白质为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或Fc融合蛋白。
在该实施方案的一个方面，所述洗出液包含所述至少一种高分子量物质。在该实施方案的一个方面，所述混合物还经历紫外线检测。
在该实施方案的一个方面，质谱仪为电喷雾电离质谱仪。在该实施方案的一具体方面，质谱仪为纳升电喷雾电离质谱仪
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪在原生条件下操作。在一具体方面，该方法进一步包括将来自质谱的至少一个峰与通过在原生条件下对所述样品进行在线尺寸排阻色谱-质谱获得的质谱进行比较。
在该实施方案的一个方面，所述变性溶液包含乙腈、甲酸或乙腈和甲酸的组合。在该实施方案的一具体方面，所述变性溶液包含约60％v/v乙腈和4％v/v甲酸。在该实施方案的另一个具体方面，所述变性溶液包含约60％v/v乙腈。
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪在原生条件下操作。
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪中的所述混合物的流量小于约10μL/min。
在该实施方案的一个方面，将所述混合物分到所述质谱仪和紫外线检测器中。在该实施方案的一具体方面，使用多喷嘴发射器将所述去溶剂化气体与所述混合物一起添加。
在该实施方案的一个方面，在使所述混合物经历质谱仪之前向所述混合物添加去溶剂化气体。
在该实施方案的一个方面，所述至少一种高分子量物质为所述感兴趣的蛋白质的非共价高分子量物质或所述感兴趣的蛋白质的不可解离高分子量物质。
在该实施方案的一个方面，该方法进一步包括将来自质谱的至少一个峰与通过对所述样品进行在线尺寸排阻色谱-质谱获得的质谱进行比较。
本公开还提供一种用于表征至少一种高分子量物质的方法，所述方法包括：获得包含至少两种感兴趣的蛋白质和所述至少一种高分子量物质的样品；使所述样品与尺寸排阻色谱柱接触；洗涤所述柱以收集洗出液；向洗出液添加变性溶液以形成混合物；以及使所述混合物经历质谱仪以表征所述至少一种高分子量物质。
在该实施方案的一个方面，感兴趣的蛋白质为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或Fc融合蛋白。
在该实施方案的一个方面，所述洗出液包含所述至少一种高分子量物质。在该实施方案的一个方面，所述混合物还经历紫外线检测。
在该实施方案的一个方面，质谱仪为电喷雾电离质谱仪。在该实施方案的一具体方面，质谱仪为纳升电喷雾电离质谱仪
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪在原生条件下操作。在一具体方面，该方法进一步包括将来自使用获得的质谱的至少一个峰与通过在原生条件下对所述样品进行在线尺寸排阻色谱-质谱获得的质谱进行比较。
在该实施方案的一个方面，所述变性溶液包含乙腈、甲酸或乙腈和甲酸的组合。在该实施方案的一具体方面，所述变性溶液包含约60％v/v乙腈和4％v/v甲酸。在该实施方案的另一个具体方面，所述变性溶液包含约60％v/v乙腈。
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪在原生条件下操作。
在该实施方案的一个方面，所述质谱仪中的所述混合物的流量小于约10μL/min。
在该实施方案的一个方面，将所述混合物分到所述质谱仪和紫外线检测器中。在该实施方案的一具体方面，使用多喷嘴发射器将所述去溶剂化气体与所述混合物一起添加。
在该实施方案的一个方面，在使(d)的所述混合物经历质谱仪之前向所述混合物添加去溶剂化气体。
在该实施方案的一个方面，所述至少一种高分子量物质为所述感兴趣的蛋白质的非共价高分子量物质或所述感兴趣的蛋白质的不可解离高分子量物质。
在该实施方案的一个方面，该方法进一步包括将来自质谱的至少一个峰与通过对所述样品进行在线尺寸排阻色谱-质谱获得的质谱进行比较。
在该实施方案的一个方面，在所述样品经历尺寸排阻色谱柱之前使用水解剂对所述样品进行消化。在一具体方面，水解剂为化脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)或其变体。
附图说明
图1显示使用示例性实施方案的本发明的有效性。
图2示出通常存在于治疗性蛋白质产品中的相对量杂质。
图3是根据一示例性实施方案的本发明的表示。
图4A示出根据一示例性实施方案获得的在原生(黑色迹线)或PCD条件(橙色和红色迹线)下获得的部分还原的mAb1(链间二硫键被破坏)的质谱。
图4B示出根据一示例性实施方案获得的在原生(黑色迹线)或PCD(橙色和红色迹线)条件下获得的mAb2二聚体的质谱。
图5示出根据一示例性实施方案的在IdeS消化之后对mAb3富集HMW样品进行的nSEC-UV/MS分析，显示了SEC-UV迹线(中央图)、峰分配以及在原生(蓝色迹线)或PCD(红色迹线)条件下获得的每个HMW峰的去卷积质谱。
图6示出根据一示例性实施方案的与FabRICATOR消化和去糖基的富集mAb3HMW样品相关联的尺寸变体质量的表格总结。
图7示出根据一示例性实施方案的对bsAb DS样品的nSEC-UV/MS分析，显示了SEC-TIC(左图，红色和蓝色迹线)以及在原生(蓝色迹线)或PCD(红色迹线)条件下获得的每个HMW峰的原始质谱。XIC是使用每种物质最丰富的电荷态生成的(灰色迹线，左图)。
图8示出根据一示例性实施方案的与去糖基化bsAb样品相关联的尺寸变体质量的表格总结。
图9示出使用PCD辅助nSEC-UV/MS分析在a)完整水平和b)亚域水平(在IdeS消化之后)表征的mAb4 DS第1批和第2批的HMW图谱。根据一示例性实施方案，示出了代表每种与HMW相关的物质的洗脱图谱的UV图谱(黑色迹线)和XIC(彩色迹线)(仅显示HMW区域)。XIC是使用每种物质最丰富的电荷态生成的。
图10示出根据一示例性实施方案的在完整水平和子域水平通过PCD辅助nSEC-MS在mAb4第1批和第2批DS样品中检测到的不可解离二聚体物质的表格总结。
图11示出根据一示例性实施方案的在原生(黑色迹线)和PCD(红色迹线)两种条件下使用nSEC-MS在a)T0和b)25℃持续6个月在共同配制的mAb-A和mAb-B样品中检测到的HMW物质。每个二聚体的相对丰度使用来自去卷积质谱的积分峰面积进行估计并进行注释。
图12示出根据一示例性实施方案的在T0和在25℃储存6个月之后共同配制的mAb-A和mAb-B的原生SEC-UV迹线。
具体实施方式
在产品的生产和开发期间，生物产品中与产品相关的变体的鉴定和量化可能是非常重要的。此类变体的鉴定对于开发安全且有效的产品可能至关重要。因此，表征此类变体的稳健方法和/或工作流程可能是有益的。
治疗性蛋白质通常表现出某种程度的尺寸异质性，含有与产品相关的杂质(包括HMW聚集体和低分子量(LMW)片段)。这些物质通常是由在产品制造、运输和储存期间由于环境应力而导致mAb分子的化学和酶降解引起的(Roberts CJ.Therapeutic proteinaggregation:Mechanisms,design,and control.Trends Biotechnol 2014:32(7):372-380；Cordoba AJ,Shyong BJ,Breen D,Harris RJ.Non-enzymatic hinge regionfragmentation of antibodies in solution.J Chromatogr B Analyt Technol BiomedLife Sci 2005:818(2):115-121；Xiang T,Lundell E,Sun Z,Liu H.Structural effectof a recombinant monoclonal antibody on hinge region peptide bondhydrolysis.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci2007:858(1-2):254-262)。LMW片段可以经由不同的化学或酶降解途径产生(例如，酸、碱和酶驱动的多肽键水解、链间二硫键断裂等)，产生截短形式的mAb分子(Wang S,Liu AP,Yan Y,Daly TJ,LiN.Characterization of product-related low molecular weight impurities intherapeutic monoclonal antibodies using hydrophilic interactionchromatography coupled with mass spectrometry.J Pharm Biomed Anal 2018:154(468-475；Vlasak J,Ionescu R.Fragmentation of monoclonal antibodies.MAbs 2011:3(3):253-263)。
相比之下，HMW物质的形成是复杂得多的过程。生成的HMW形式在尺寸、构象、相互作用性质(共价或非共价)和缔合位点方面可能有所不同(Paul R,Graff-Meyer A,Stahlberg H,Lauer ME,Rufer AC,Beck H,Briguet A,Schnaible V,Buckel T,BoeckleS.Structure and function of purified monoclonal antibody dimers induced bydifferent stress conditions.Pharm Res 2012:29(8):2047-2059)。除了应力条件之外，蛋白质一级序列及其高阶结构都促成其经由不同途径聚集的趋势。因此，几乎不可能使用一般规则来预测或描述每个分子的蛋白质聚集行为。由于HMW物质(从可溶性低聚物到可见颗粒)可能会通过引发不需要的免疫原性反应和/或改变其药代动力学行为来影响药物安全性和功效(Narhi LO,Schmit J,Bechtold-Peters K,Sharma D.Classification ofprotein aggregates.J Pharm Sci 2012:101(2):493-498)，需要贯穿整个产品生命周期对HMW物质进行详细表征、持续监测和控制(Parenky A,Myler H,Amaravadi L,Bechtold-Peters K,Rosenberg A,Kirshner S,Quarmby V.New FDA draft guidance onimmunogenicity.AAPS J 2014:16(3):499-503)。此外，对聚集机制的深入理解(如通过深入表征所实现的)不仅为HMW物质的风险评定提供了框架，而且还可能为通过蛋白质工程设计具有降低的聚集倾向的蛋白质分子提供见解。
由于其复杂性，治疗性蛋白质产品中HMW尺寸变体的表征通常依赖于大量分析和生物物理工具。沉降速度分析超速离心(SV-AUC)和尺寸排阻色谱(SEC)因其出色的分辨率和定量性能而被广泛用于表征mAb HMW物质(Lebowitz J,Lewis MS,Schuck P.Modernanalytical ultracentrifugation in protein science:A tutorial review.ProteinSci 2002:11(9):2067-2079；Hughes H,Morgan C,Brunyak E,Barranco K,Cohen E,Edmunds T,Lee K.A multi-tiered analytical approach for the analysis andquantitation of high-molecular-weight aggregates in a recombinant therapeuticglycoprotein.AAPS J 2009:11(2):335-341)。特别地，具有UV检测的SEC通常用作批次释放测定，以直接监测治疗性mAb产品中可溶性聚集体的水平和洗脱图谱(Lowe D,DudgeonK,Rouet R,Schofield P,Jermutus L,Christ D.Aggregation,stability,andformulation of human antibody therapeutics.Adv Protein Chem Struct Biol 2011:8441-61；Zolls S,Tantipolphan R,Wiggenhorn M,Winter G,Jiskoot W,Friess W,HaweA.Particles in therapeutic protein formulations,part 1:Overview of analyticalmethods.J Pharm Sci 2012:101(3):914-935)。为了实现对HMW物质的详细阐明和对聚集机制的深入见解，几乎总是需要mAb HMW物质的富集，随后通过其他技术进行深入表征(Paul R.等人,同上；Rouby G,Tran NT,Leblanc Y,Taverna M,BihoreauN.Investigation of monoclonal antibody dimers in a final formulated drug byseparation techniques coupled to native mass spectrometry.MAbs 2020:12(1):e1781743；Lu C,Liu D,Liu H,Motchnik P.Characterization of monoclonal antibodysize variants containing extra light chains.MAbs2013:5(1):102-113；Remmele RL,Jr.,Callahan WJ,Krishnan S,Zhou L,Bondarenko PV,Nichols AC,Kleemann GR,PipesGD,Park S,Fodor S等人Active dimer of epratuzumab provides insight into thecomplex nature of an antibody aggregate.J Pharm Sci 2006:95(1):126-145；IwuraT,Fukuda J,Yamazaki K,Kanamaru S,Arisaka F.Intermolecular interactions andconformation of antibody dimers present in igg1 biopharmaceuticals.JBiochem2014:155(1):63-71；Plath F,Ringler P,Graff-Meyer A,Stahlberg H,LauerME,Rufer AC,Graewert MA,Svergun D,Gellermann G,Finkler C等人Characterizationof mab dimers reveals predominant dimer forms common in therapeutic mabs.MAbs2016:8(5):928-940)。例如，在非还原条件下进行的毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(CE-SDS)可用于区分和估计共价和非共价结合的HMW物质的水平(Rouby G.等人，同上；Remmele RL等人，同上；Plath F.等人,同上)。此外，当在还原条件下操作时，CE-SDS可以进一步评定分子间二硫键扰乱对共价聚集体的形成的可能贡献。有限的酶消化(例如，IdeS消化和有限的Lys-C消化)随后进行质谱(MS)分析也被证明在基于准确的质量测量测定在子域水平的聚集界面中是有效的(Rouby G.等人,同上；Remmele RL等人,同上；Iwura等人,同上；PlathF.等人,同上)。最后，为了实现肽水平或甚至残基水平的聚集界面和机制的阐明，可以采用更复杂的策略，诸如蛋白质足迹(例如，氢-氘交换MS和羟基自由基足迹)以及自下而上的交联分析来分别研究非共价和共价HMW物质(Iacob RE,Bou-Assaf GM,Makowski L,EngenJR,Berkowitz SA,Houde D.Investigating monoclonal antibody aggregation using acombination of h/dx-ms and other biophysical measurements.J Pharm Sci2013:102(12):4315-4329；Zhang A,Singh SK,Shirts MR,Kumar S,Fernandez EJ.Distinctaggregation mechanisms of monoclonal antibody under thermal and freeze-thawstresses revealed by hydrogen exchange.Pharm Res 2012:29(1):236-250；Yan Y,WeiH,Jusuf S,Krystek SR,Jr.,Chen J,Chen G,Ludwig RT,Tao L,Das TK.Mapping thebinding interface in a noncovalent size variant of a monoclonal antibodyusing native mass spectrometry,hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry,and computational analysis.J Pharm Sci2017:106(11):3222-3229；Deperalta G,Alvarez M,Bechtel C,Dong K,McDonald R,Ling V.Structural analysis of atherapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting.MAbs2013:5(1):86-101)。
在过去几年中，在接近原生条件下将SEC与直接MS检测在线耦合(原生SEC-MS)引起了人们对研究mAb HMW物质的极大兴趣(Rouby等人,同上；Ehkirch A,Hernandez-AlbaO,Colas O,Beck A,Guillarme D,Cianferani S.Hyphenation of size exclusionchromatography to native ion mobility mass spectrometry for the analyticalcharacterization of therapeutic antibodies and related products.J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci 2018:1086(176-183)；Haberger M,Leiss M,Heidenreich AK,Pester O,Hafenmair G,Hook M,Bonnington L,Wegele H,Haindl M,Reusch D等人Rapid characterization of biotherapeutic proteins by size-exclusion chromatography coupled to native mass spectrometry.MAbs 2016:8(2):331-339。
使用可以保留蛋白质构象和非共价相互作用的MS兼容流动相，原生SEC-MS(nSEC-MS)可以基于准确的质量测量提供快速且改善的尺寸变体的鉴定。此外，由于方法和仪器两者的最新进展，nSEC-MS已成为高度灵敏的方法，该方法可以直接从未分级的药物物质(DS)样品中轻松地检测出极低水平的HMW物质(例如，0.01％)(Yan Y,Xing T,Wang S,LiN.Versatile,sensitive,and robust native lc-ms platform for intact massanalysis of protein drugs.J Am Soc Mass Spectrom 2020:31(10):2171-2179)。尽管取得了这些显著的成功，但仅应用nSEC-MS方法仍然无法获得HMW物质的完整图谱。首先，作为非变性方法，nSEC-MS分析无法区分非共价结合和共价结合的HMW复合物，除非可以检测到由共价交联产生的明确的质量差异。不幸的是，由于大型复合物的色谱分辨率和质量分辨能力两者都不足，后者极难实现。例如，通过不同机制(例如，非共价和共价相互作用)形成的二聚体物质通常在SEC分离期间共洗脱，并通过MS检测用平均质量进行测量。因此，不能通过nSEC-MS方法直接测定非共价和共价二聚体物质的分布。其次，与符合预期的寡聚物质(例如，二聚体、三聚体、四聚体等)相比，非常规HMW物质(例如，与额外的轻链复合的mAb单体)的可信鉴定通常无法仅通过完整质量测量来建立(Lu等人,同上；Yan等人,同上)。这是因为对于以低丰度存在的大型HMW物质的质量测量，通常预计质量准确度降低，这可能会导致质量分配不明确。
为了克服这些挑战，本发明提供一种新的柱后变性辅助nSEC-MS方法(PCD辅助nSEC-MS)，该方法被优化以将SEC解析的非共价HMW物质解离成用于后续MS检测的组成组分。因此，该新的方法使得在相同的SEC分离条件下同时检测非共价和不可解离HMW物质得以实现。此外，该策略通过以下改善异质HMW物质的鉴定：1)确认从非共价HMW复合物解离的组成亚基的标识；以及2)通过去除共洗脱、非共价物质的干扰来实现对不可解离HMW物质的更准确的质量测量。此外，通过结合有限的酶消化步骤，PCD辅助nSEC-MS方法可以轻松地揭示在子域水平的mAb聚集体的相互作用性质和相互作用界面两者。
本发明还通过以下提供一种更准确的共价交联测量：(a)减少来自共洗脱、非共价物质的干扰；以及(b)减小物质的尺寸。例如，具有Fab2-Fc二聚体的共洗脱物质可能因未消化和部分消化的物质而产生干扰。参见图1，顶图。使用本发明，可以通过使用蛋白酶(诸如IdeS)来去除来自未消化的物质的干扰信号。参见图1，底图。
除非另外描述，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所述的任何方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试，但现在对特定方法和材料进行描述。所提及的所有出版物特此通过引用并入本文。
术语“一个(a)”应理解为意指“至少一个”；并且术语“约”和“大约”应理解为允许标准变化，如本领域普通技术人员将理解的；并且在提供范围的情况下，包含端点。
在一些示例性实施方案中，本公开提供一种用于表征感兴趣的蛋白质的至少一种高分子量物质的方法。
如本文所使用的，术语“蛋白质”、“治疗性蛋白质”或“感兴趣的蛋白质”可以包含具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包括一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基、相关的天然存在的结构变体以及经由肽键连接的其合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物构成的聚合物。“合成肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成肽或多肽可以例如使用自动化多肽合成仪合成。各种固相肽合成方法是已知的。蛋白质可以含有一个或多个多肽以形成单一功能性生物分子。另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以包含任何生物治疗性蛋白质、用于研究或疗法的重组蛋白、陷阱蛋白和其他嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体。在另一个示例性方面，蛋白质可以包含抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可以使用基于重组细胞的生产系统来生产，诸如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述，参见Ghaderi等人，“Production platforms forbiotherapeutic glycoproteins.Occurrence,impact,and challenges of non-humansialylation,”(BIOTECHNOL.GENET.ENG.REV.147-175(2012))。在一些示例性实施例中，蛋白质包括修饰、加合物和其它共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包含例如抗生物素蛋白、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡糖胺、岩藻糖、甘露糖和其它单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记以及其它染料等。蛋白质可以根据组成和溶解度来分类，并且因此可以包含简单蛋白质，诸如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及源性蛋白质，诸如初级源性蛋白质和次级源性蛋白质。
在一些示例性实施方案中，蛋白质可以为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体，抗体片段、单克隆抗体或Fc融合蛋白。
如本文所使用的术语“抗体”包含包括四个多肽链、通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链以及其多聚体(例如，IgM)的免疫球蛋白分子。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的被称作框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的实施方案中，抗大ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同或可以是天然的或经人工修饰的。可以基于两个或更多个CDR的并列分析来定义氨基酸共有序列。如本文所使用，术语“抗体”还包含完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所使用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包含任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或经基因工程化的多肽或糖蛋白，其与抗原特异性结合以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以例如使用任何合适的标准技术衍生自完整抗体分子，所述标准技术如蛋白水解消化或涉及操纵和表达编码抗体可变结构域以及任选地恒定结构域的DNA的重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包含例如，噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成。可以通过化学方法或通过分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如，将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型、或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
如本文所使用的，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的实例包含但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fc片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd’片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域，以及三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段是免疫球蛋白重链和轻链的可变区的组合，并且ScFv蛋白是重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链和重链可变区通过肽连接子连接。抗体片段可以通过各种方式产生。例如，抗体片段可以通过完整抗体的片段化酶促地或化学地产生和/或抗体片段可以由编码部分抗体序列的基因重组地产生。可替代地或另外地，抗体片段可以完全地或部分地合成产生。抗体片段可以任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外地，抗体片段可以包括例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可以任选地包括多分子复合物。
如本文所使用的，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可以通过本领域的任何可获得或已知的方式源自单个克隆，包含任何真核、原核或噬菌体克隆。可以使用本领域已知的各种技术来制备可用于本公开的单克隆抗体，包含使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。
如本文所使用的，术语“Fc融合蛋白”包含在其自然状态下未融合的两种或更多种蛋白质的部分或全部，这些蛋白质中的一者为免疫球蛋白分子的Fc部分。包含与抗体衍生的多肽(包括Fc结构域)的各个部分融合的某些异源多肽的融合蛋白的制备已例如由以下描述：Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.ScL USA 88:10535,1991；Byrn等人,Nature 344:677,1990,以及Hollenbaugh等人,"Construction of Immunoglobulin FusionProteins",在Current Protocols in Immunology中,增刊4,第10.19.1-10.19.11页,1992。“受体Fc融合蛋白”包含与Fc部分的受体耦合的一个或多个胞外结构域中的一者或多者，其在一些实施方案中包含铰链区，随后是免疫球蛋白的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc融合蛋白含有与单个或多于一个配体结合的两条或更多条不同受体链。例如，Fc融合蛋白为阱(trap)，诸如例如IL-1阱(例如，利纳西普(Rilonacept)，其含有与融合至hIgG1的Fc的IL-1R1胞外区融合的IL-1RAcP配体结合区；参见美国专利号6,927,004，该美国专利通过引用整体并入本文)，或VEGF阱(例如阿柏西普，其含有与融合至hIgG1的Fc的VEGF受体Flk1的Ig结构域3融合的VEGF受体Flt1的Ig结构域2；例如，SEQ ID NO:1；参见美国专利号7,087,411和7,279,159，这些美国专利通过引用整体并入本文。
如本文所用，术语“杂质”可以包含存在于蛋白质生物制药产品中的任何不期望的蛋白质。杂质可以包含工艺和产品相关的杂质。杂质可以进一步是已知结构、部分表征的或未鉴定的。
工艺相关的杂质可以来自制造工艺，并且可以包含三大类：细胞底物来源的、细胞培养物来源的和下游来源的。细胞底物源性杂质包含但不限于源自宿主生物体的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物源性杂质包含但不限于诱导剂、抗生素、血清和其它介质组分。下游源性杂质包含但不限于酶、化学和生化加工试剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如，单克隆抗体)和其它可浸出物。
与产品相关的杂质(例如，前体、某些降解产物)可能是在制造和/或储存期间产生的分子变体，其在活性、功效和安全性方面不具有与所需产品相当的特性。此类变体可能需要相当大的努力来分离和表征，以便鉴定修饰的类型。产品相关的杂质可以包含截短的形式、修饰的形式和聚集体。截短的形式由水解酶或催化肽键的切割的化学品形成。修饰的形式包含但不限于脱酰胺的、异构化的、错配的S-S连接的、氧化的或改变的缀合形式(例如，糖基化、磷酸化)。修饰的形式也可以包含任何翻译后修饰的形式。聚集体包含所需产物的二聚体和更高倍数。(Q6B规格：生物技术/生物产品的测试程序和验收标准，ICH 1999年8月，美国卫生与公众服务部)。
如图2所示，与产品相关的杂质是治疗性蛋白质产品中的主要杂质，并且因此需要仔细表征。一些与产品相关的杂质或与产品相关的蛋白质变体会损害结合亲和力。这里，受损的结合亲和力包括与体内感兴趣的蛋白质的靶标或针对感兴趣的蛋白质设计的抗原的结合亲和力降低。受损的结合亲和力可以是小于感兴趣的蛋白质对体内感兴趣的蛋白质的靶标或针对感兴趣的蛋白质设计的抗原的亲和力的任何亲和力。
如本文所使用的，通用术语“翻译后修饰”或“PTM”是指多肽在其核糖体合成期间(共翻译修饰)或之后(翻译后修饰)经历的共价修饰。PTM通常由特定的酶或酶途径引入。许多发生在蛋白质骨架内特定特征蛋白质序列(特征序列)的位点。已记录了数百个PTM，并且这些修饰总是会影响蛋白质结构或功能的某些方面(Walsh,G."Proteins"(2014)第二版，由Wiley and Sons,Ltd.出版，ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包含但不限于切割、N-末端延伸、蛋白质降解、N-末端的酰化、生物素化(赖氨酸残基与生物素的酰化)、C-末端的酰胺化、糖基化、碘化、辅基基团的共价连接、乙酰化(通常在蛋白质N-末端处添加乙酰基基团)、烷基化(通常在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基基团(例如甲基、乙基、丙基))、甲基化、腺苷化、ADP-核糖基化、多肽链内或之间的共价交联、磺化、异戊烯化、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰(其中维生素K是谷氨酸残基的羧基化的辅因子，导致γ-羧基谷氨酸盐(glu残基)的形成)、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价键合)、甘氨酰化(甘氨酸残基的共价连接)、糖基化(将糖基基团添加到天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸上，产生糖蛋白)、异戊二烯化(添加类异戊二烯基团，如法呢醇和香叶基香叶醇)、脂酰化(连接脂质酸官能团)、磷酸泛酸硫基乙胺化(添加来自辅酶A的4′-磷酸泛酸硫基乙胺基部分，诸如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中)、磷酸化(通常向丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸中添加磷酸基团)和硫酸化(通常向酪氨酸残基中添加硫酸基团)。改变氨基酸的化学性质的翻译后修饰包含但不限于瓜氨酸化(通过脱亚胺基化将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺化(将谷氨酰胺转化为谷氨酸或将天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包含但不限于二硫键的形成(两个半胱氨酸氨基酸的共价键合)和蛋白质水解切割(肽键处蛋白质的切割)。某些翻译后修饰涉及添加其他蛋白质或肽，如ISG化(与ISG15蛋白质的共价键合(干扰素刺激基因))、SUMO化(与SUMO蛋白质的共价键合(小泛素相关修饰物))和泛素化(与蛋白质泛素的共价键合)。对于由UniProt策划的PTM的更详细的受控词汇表，参见欧洲生物信息研究所蛋白质信息资源SIB瑞士生物信息研究所、欧洲生物信息研究所Drs-果蝇霉素前体-黑腹果蝇(果蝇)-Drs基因与蛋白质，http://www.uniprot.org/docs/ptmlist(最近一次访问是2019年1月15日)。
如本文所使用的，术语“色谱”是指其中由液体或气体携带的化学混合物可以由于化学实体在其固定液相或固相周围或在固定液相或固相上方流动时的差异分布而分离成组分的过程。色谱法的非限制性实例包含传统的反相(RP)、离子交换(IEX)、混合模式色谱法和正相色谱法(NP)。
尺寸排阻色谱法或凝胶过滤依赖于组分的分离作为其分子尺寸的函数。分离取决于物质在多孔固定相中花费的时间的量(与在流体中的时间相比)。分子将驻留在孔中的概率取决于分子和孔隙的尺寸。此外，物质渗透到孔隙中的能力由大分子的扩散迁移率决定，对于小分子来说，大分子的扩散迁移率更高。非常大的大分子可能根本无法穿透固定相的孔隙；并且对于非常小的大分子来说，渗透的概率接近于一。虽然较大分子尺寸的组分移动通过固定相的速度更快，但小分子尺寸的组分通过固定相的孔隙的路径长度更长，并且因此在固定相中保留的时间更长。
色谱材料可以包含尺寸排阻材料，其中尺寸排阻材料为树脂或膜。用于尺寸排阻的基质优选是惰性凝胶介质，惰性凝胶介质可以是交联多糖的复合物，例如球形珠形式的交联琼脂糖和/或葡聚糖。交联程度决定了溶胀凝胶珠中存在的孔隙的尺寸。大于一定尺寸的分子不会进入凝胶珠，并且因此以最快的速度移动通过色谱床。较小的分子(诸如去污剂、蛋白质、DNA等，其取决于凝胶珠的大小和形状而不同程度地进入凝胶珠)在通过床时被延迟。因此，分子通常按照分子尺寸减小的顺序洗脱。
适用于病毒的尺寸排阻色谱的多孔色谱树脂可以由具有不同物理特性的葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺或二氧化硅制成。也可以使用聚合物组合。最常用的是在商标名下的那些。“SEPHADEX”可以从Amersham Biosciences获得。来自不同构造的材料的其他尺寸排除支持物也是合适的，例如Toyopearl 55F(聚甲基丙烯酸酯，来自Tosoh Bioscience，亚拉巴马州蒙哥马利(Montgomery Pa.))和Bio-Gel P-30Fine(BioRad Laboratories，赫拉克勒斯，加利福尼亚州(Hercules，Calif.))。
如本文所使用的，术语“混合模式色谱(MMC)”或“多模式色谱”包含溶质通过多于一种相互作用模式或机制与固定相相互作用的色谱方法。MMC可以用作传统反相(RP)、离子交换(IEX)和正相色谱(NP)的替代或补充工具。与疏水性相互作用、亲水性相互作用和离子相互作用分别是主要相互作用模式的RP、NP和IEX色谱不同，混合模式色谱可以采用这些相互作用模式中的两种或更多种相互作用模式的组合。混合模式色谱介质可以提供不能通过单模式色谱再现的独特选择性。与基于亲和力的方法相比，混合模式色谱法还可以提供潜在的成本节约和操作灵活性。本发明可以包括使用能够进行基于尺寸排阻的分离的混合模式色谱法。
在一些示例性实施方案中，用于从尺寸排阻色谱法获得所述洗出液的流动相可以包含挥发性盐。在一些具体实施方案中，流动相可以包含乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
如本文所使用的，术语“质谱仪”包括能够鉴定特异性分子物质并且测量其准确的质量的装置。所述术语意味着包含任何分子检测器，多肽或肽可以洗脱到所述分子检测器中以进行检测和/或表征。质谱仪可以包含三个主要部分：离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。分析物原子、分子或簇可以被转移到气相中，并且同时(如以电喷雾电离的方式)被电离。离子源的选择在很大程度上取决于应用。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可以为纳升电喷雾电离质谱仪。
如本文所使用的，术语“纳升电喷雾”或“纳喷雾”是指以非常低的溶剂流速的电喷雾电离，通常为每分钟微升或数百纳升的样品溶液或更低，通常不使用外部溶剂输送。形成纳升电喷雾的电喷雾输注装置可以使用静态纳升电喷雾发射器或动态纳升电喷雾发射器。静态纳升电喷雾发射器在延长的时期内对小体积样品(分析物)溶液进行连续分析。动态纳升电喷雾发射器使用毛细管柱和溶剂输送系统在通过质谱仪进行分析之前对混合物进行色谱分离。
如本文所用，术语“质量分析仪”包含可以根据物质的质量分离物质(即，原子、分子或簇)的装置。可以用于快速蛋白质测序的质量分析仪的非限制性实例为飞行时间(TOF)、磁/电扇区、四极质量过滤器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅里叶变换离子回旋共振(FTICR)以及加速器质谱(AMS)技术。
在一些示例性实施方案中，用于方法的流动相与质谱仪兼容。
在一些示例性实施方案中，样品可以包含约10μg至约100μg的感兴趣的蛋白质。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪中的流速可以为约10nL/min至约1000μL/min。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可以具有约0.8kV至约5kV的喷雾电压。
在一些示例性实施方案中，质谱可以在原生条件下进行。
如本文所使用的，术语“原生条件”或“原生MS”或“原生ESI-MS”可以包含在保持分析物中非共价相互作用的条件下进行质谱。有关原生MS的详细综述，参考综述：ElisabettaBoeri Erba和Carlo Petosa,The emerging role of native mass spectrometry incharacterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes,24Protein Science1176–1192(2015)；(Hao Zhang等人,Native mass spectrometry ofphotosynthetic pigment-protein complexes,587FEBS Letters 1012–1020(2013))。
在一些示例性实施方案中，质谱仪可以为串联质谱仪。
如本文所使用的，术语“串联质谱”包括通过使用多阶段的质量选择和质量分离来获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可以被转移到气相中并被完整地电离，并且所述样品分子可以在第一质量选择步骤之后以一些可预测和可控制的方式被诱导分裂。多级MS/MS或MSn可以通过首先选择并分离前体离子(MS2)、将其碎裂、分离初级碎片离子(MS3)、将其碎裂、分离次级碎片(MS4)等来进行，只要可以获得有意义的信息或碎片离子信号是可检测的。串联MS已通过各种分析器组合成功地执行。对于特定应用，组合哪种分析器由许多不同的因素确定，诸如灵敏度、选择性和速度，还有大小、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别是空间串联和时间串联，但也存在混合的情况，其中时间串联分析器在空间上耦接或与空间串联分析器耦接。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子激活装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计具体的m/z分离函数，使得在仪器的一个区段中，离子在中间区域中被选择、解离，并且然后将产物离子传输到另一个分析器进行m/z分离和数据采集。在时间串联中，离子源中产生的质谱仪离子可以在同一物理装置中被捕获、隔离、碎裂和m/z分离。
通过质谱仪鉴定的肽可以用作完整蛋白质及其翻译后修饰的替代代表。所述肽可以通过关联实验和理论MS/MS数据而用于蛋白质表征，后者从蛋白质序列数据库中的可能的肽产生。表征可以包含但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰或鉴定翻译后修饰或可比性分析或其组合。
如本文所使用的，术语“数据库”是指可能存在于样品中的蛋白质序列的编译集合，例如以FASTA格式的文件的形式。相关蛋白质序列可以源自正在研究的物质的cDNA序列。可用于搜索相关蛋白质序列的公共数据库包括由例如Uniprot或Swiss-prot托管的数据库。可以使用本文中称为“生物信息学工具”的工具来搜索数据库。生物信息学工具针对数据库中所有可能的序列搜索未解释的MS/MS谱的能力，并提供经解释(注释)的MS/MS谱作为输出。此类工具的非限制性实例是Mascot(www.matrixscience.com)、Spectrum Mill(www.chem.agilent.com)、PLGS(www.waters.com)、PEAKS(www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(www.sagenresearch.com)、OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(www.thegpm.org/TANDEM/)、ProteinProspector(prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(fields.scripps.edu/sequest)。
在一些实施方案中，可以通过将还原剂添加到样品来处理包含感兴趣的蛋白质的样品。
如本文所使用的，术语“还原”是指蛋白质中的二硫键的还原。用于还原蛋白质的还原剂的非限制性实例是二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、埃尔曼试剂、盐酸羟胺、氰基硼氢化钠、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)或其组合。在一些具体实施方案中，处理可以进一步包括烷基化。在一些其他具体示例性实施方案中，处理可以包括蛋白质上的巯基基团的烷基化。
如本文所使用的，术语“处理”或“同位素标记”可以指化学标记蛋白质。化学标记蛋白质的方法的非限制性实例包括使用试剂(诸如4-plex、6-plex和8-plex等)进行相对和绝对定量的同量异位标签(iTRAQ)；胺的还原脱甲基化、胺的氨甲酰化、蛋白质C末端的18O-标记或蛋白质的任何胺基或巯基基团以标记胺或巯基基团。
在一些实施方案中，可以在使包含感兴趣的蛋白质的样品经历色谱柱之前对样品进行消化。
如本文所使用的，术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。存在若干种方法以使用适当的水解剂进行样品中的蛋白质的消化，例如酶消化或非酶消化。
如本文所使用的，术语“水解剂”是指可以进行蛋白质的消化的大量不同药剂中的任何一者或其组合。可以进行酶消化的水解剂的非限制性实例包含胰蛋白酶、内切蛋白酶Arg-C、内切蛋白酶Asp-N、内切蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、化脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶以及来自佐氏曲霉(Aspergillus Saitoi)的蛋白酶。可以进行非酶消化的水解剂的非限制性实例包含使用高温、微波、超声、高压、红外、溶剂(非限制性实例是乙醇和乙腈)、固定化酶消化(IMER)、磁性颗粒固定化酶和芯片上固定化酶。对于讨论蛋白质消化的可用技术的最近综述，参见Switazar等人,"Protein Digestion:An Overview of the AvailableTechniques and Recent Developments"(J.Proteome Research 2013,12,1067-1077)。水解剂中的一种或组合可以以序列特异的方式切割蛋白质或多肽中的肽键，从而产生可预测的较短肽的集合。
如本文所提供的用数字和/或字母连续标记的方法步骤并不意味着将方法或其任何实施例限制为特定指示顺序。
在整个说明书中引用了各种出版物，包含专利、专利申请、公开的专利申请、登录号、技术文章和学术文章。这些所引用的参考文献中的每一者在本文中通过引用整体并且出于所有目的并入本文。
通过参考以下实例，将更全面地理解本公开，提供这些实例是为了更详细地描述本公开。它们旨在说明实例并且不应被解释为限制本公开的范围。
实例
材料
去离子水由安装有MilliPak Express 20过滤器(Millipore Sigma，伯灵顿，马萨诸塞州，类别号MPGP02001)的Milli-Q整体水净化系统提供。醋酸铵(LC/MS级)购自Sigma-Aldrich(圣路易斯，MO，产品号73594)。肽N-糖苷酶F(PNGase F)购自New England BiolabsInc(伊普斯威奇，马萨诸塞州，产品号P0704L)。购自Genovis(坎布里奇，马萨诸塞州，产品号A0-FR1-250)。Invitrogen UltraPure 1M Tris-HCl缓冲液，pH 7.5(参考号15567-027)、PierceTMDTT(二硫苏糖醇，No-WeighTM格式，参考号A39255)和乙腈(ACN；Optima LC/MS级，产品号A955-4)购自Thermo Fisher Scientific(沃尔瑟姆，马萨诸塞州)。甲酸(FA，98-100％，用于痕量金属分析的Suprapur)购自Millipore Sigma(伯灵顿，马萨诸塞州，产品号1.11670.0250)。2-丙醇(IPA；HPLC级)购自Sigma Aldrich(圣路易斯，密苏里州，产品号65-0447-4L)。
样品制备
所有mAb均在Regeneron Pharmaceutical,Inc.的CHO细胞中生产。mAb3富集HMW样品是通过使用半制备规模SEC柱从mAb3 DS样品中分级HMW物质而生成的。最终富集HMW样品含有0.7％三聚体、66.8％二聚体和32.5％单体。在脱盐SEC-MS分析之前，通过在50mMTris-HCl(pH 7.5)中于37℃用2mM DTT处理mAb1 30分钟来进行有限还原，以仅还原链间二硫键。为了进行完整水平分析，所有mAb样品(包括富集HMW样品、单独DS样品和共同配制DP样品)均在50mM Tris-HCl(pH 7.0)中于45℃用PNGase F(每10μg蛋白质1IUB毫单位)处理1小时，以从每个重链CH2结构域去除N-聚糖链。对于亚域分析，将去糖基化的mAb3 HMW样品和mAb4 DS样品的等分试样各自在50mM Tris-HCl(pH 7.5)中于37℃用FabRICATOR(每1μg蛋白质1IUB毫单位)进行位点特异性消化1小时，以生成F(ab)'2和Fc片段。
PCD辅助nSEC-MS
在配备有Acquity BEH200 SEC柱(4.6×300mm，1.7μm，Waters，米尔福德，马萨诸塞州)的UltiMate 3000UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific，不莱梅，德国)上进行原生SEC色谱分析，其中柱温箱设置到30℃。应用0.2mL/mL的150mM醋酸铵等度流分离和洗脱蛋白质尺寸变体。为了实现柱后变性，由二级泵以0.2mL/min的流速输送由60％ ACN、36％水和4％ FA组成的变性溶液，并且然后在经历MS检测之前使用T型混合器与SEC洗出液(1:1混合)混合。为了实现在线原生MS分析，将组合分析流(0.4mL/min)分成用于纳升电喷雾电离(NSI)-MS检测的微流(<10μL/min)以及用于UV检测的剩余高流量(图3)。使用配备有微流-纳升喷雾电喷雾电离(MnESI)源和微型整体多喷嘴(M3)发射器(Newomics，伯克利，加利福尼亚)的Thermo Q Exactive UHMR(Thermo Fisher Scientific，不来梅，德国)进行原生MS分析。详细的实验设置和仪器参数描述于以下文献：Yan Y,Xing T,Wang S,LiN.Versatile,sensitive,and robust native LC-MS platform for intact massanalysis of protein drugs.J Am Soc Mass Spectrom2020:31(10):2171-2179，该文献通过引用整体并入。为了禁用PCD，将变性溶液的流量设置为零。使用Acquity BEH200 SEC保护柱(4.6×30mm，1.7μm，/>)以类似方式对部分还原的mAb1进行脱盐SEC-MS分析。
数据分析
使用来自Protein Metrics的Intact MassTM软件对原生或PCD条件下的nSEC-MS分析的完整质谱进行去卷积。
实例1.PCD辅助nSEC-MS方法。
为了改进基于nSEC-MS的对mAb HMW物质的表征，引入了柱后变性(PCD)策略，以在SEC分离之后、在MS检测之前解离非共价HMW复合物。这种策略是非常理想的，因为它不仅可以通过确认组成亚基来改善非共价HMW复合物的分配，而且还可以通过减少来自共洗脱、非共价物质的干扰来提供对不可解离HMW物质的更准确的质量测量。
利用先前描述的nLC-MS平台(Yan等人(2020),同上)，该平台可以适应高流速(高达0.8mL/min)，通过将柱后变性剂流(0.2mL/min)经由T型混合器引入nSEC流(0.2mL/min)可以轻松地实现PCD与nSEC-MS的集成(图3)。
基于两个主要考虑因素精心选择变性溶剂。首先，在柱后混合之后的最终流量仍应与直接MS检测高度兼容。其次，由于变性时间短(例如，从T型混合器到MS的时间少于1秒)，所需的变性溶剂应能够在柱后混合之后立即破坏大部分非共价相互作用。
在评定了一系列含有不同水平的乙腈(ACN)和甲酸(FA)的变性溶剂体系之后，选择了由60％ACN、4％FA和36％水组成的优化配方用于PCD应用。为了评定所选变性溶剂的有效性，将mAb1(IgG4亚类)部分还原(链间二硫键被破坏)，并使用短SEC保护柱使其经历PCD辅助nSEC-MS分析(图4A)。由于IgG4分子中两个CH3结构域之间以及重链和轻链(HC和LC)的N末端区域之间存在强链间非共价相互作用(Rose RJ,Labrijn AF,van den Bremer ET,Loverix S,Lasters I,van Berkel PH,van de Winkel JG,Schuurman J,Parren PW,HeckAJ.Quantitative analysis of the interaction strength and dynamics of humanigg4 half molecules by native mass spectrometry.Structure 2011:19(9):1274-1282)，部分还原的mAb1在nSEC-MS条件下主要被检测为完整H2L2复合物。仅观察到低水平的HL、H2L和LC物质，这可能是经由源内解离生成的(图4A，黑色迹线)。相反，在应用PCD条件(60％ACN/4％FA)之后，这些非共价复合物(例如H2L2、H2L和HL)完全被解离并检测为游离HC和LC(图4A，红色迹线)。还测试了仅含有60％ACN的替代变性溶剂，该替代变性溶剂在解离部分还原的mAb复合物中显示出相当的有效性(图2A，橙色迹线)。
在另一个实例中，通过nSEC-MS分析检测到的mAb2二聚体种类(图4B，黑色迹线)在应用PCD(60％ACN/4％FA)后显示出接近完全解离成单体(图4B，红色迹线)，提示大多数(如果不是全部)二聚体物质是非共价的。此外，在低m/z区域还观察到与未折叠物质相对应的低水平的高电荷单体信号。与第一个实例不同，仅含有60％ ACN的替代变性溶剂的应用不会导致mAb2二聚体物质的完全解离(图4B，橙色迹线)，提示低pH值和有机溶剂的组合在破坏非共价相互作用中更有效。随后，所开发的PCD条件也已被应用于其他非共价系统(例如，抗体-抗原复合物和病毒衣壳)，在这些系统中始终可以实现快速且有效的解离(数据未显示)。因此，所开发的PCD条件被认为在破坏mAb HMW复合物中存在的大多数非共价相互作用中是有效的，尽管仍然可能的是：一些紧密缔合的非共价复合物可以在治疗后幸存下来。最后，需要注意的是，应用所报道的nLC-MS平台(Yan等人(2013),同上)，与mAb相关的物质在选定的PCD条件(60％ACN/4％ FA)下均表现出“类似原生”的质谱。此特征非常理想，因为它减少了同时从相同复合物解离并在同一MS扫描中检测到的多个物质的谱重叠。例如，在PCD条件下，解离的HC和LC的MS信号在重叠最小的m/z规模上很好地分离(图4A)。此外，与变性条件下的典型ESI-MS谱相比，“类似原生”的谱表现出更少的电荷态和更大的空间分辨率，使它们更容易被解释和处理(例如，生成经提取的离子色谱图)。
实例2.对富集HMW物质进行PCD辅助nSEC-MS分析。
在程序开发的后期阶段通常需要对mAb HMW物质进行扩展表征，作为DS异质性表征的一部分。经常对富集HMW材料进行有限酶消化(例如，IdeS消化)，随后是完整质量分析，以了解在子域水平的相互作用界面。为此，在经历PCD辅助nSEC-MS分析之前，对主要含有二聚体物质的mAb3富集HMW样品进行IdeS消化处理。由于IdeS在铰链区下切割mAb分子，释放F(ab)'2和Fc片段，因此该策略允许在亚域水平对二聚体相互作用的有效表征。经消化的HMW样品的SEC-UV分析(图5，中)显示出多个解析的UV峰，包括对应于F(ab)'2和Fc单体的两个主要峰，以及可能对应于与HMW相关的物质的四个其他峰(P1-P4)，这是由于在富集的HMW样品中存在各种子域相互作用。随后，使用来自nSEC-MS分析的准确的质量测量来分配每个峰的标识(图5、图6)。尽管原生复合物的完整质量测量可以轻松地区分聚集状态和相互作用的伴侣(例如，P1中的F(ab)'2三聚体、P2中的F(ab)'2二聚体、P3中的F(ab)'2-Fc异二聚体以及P4中的Fc二聚体)，由于来自完整基于质量的分配的相当大的模糊性，因此对每个物质的详细阐明仍然具有挑战性。
例如，P4b中的Fc二聚体表现出观察到的质量(95,023Da)与非共价二聚体的预测的质量(95,018Da)一致，而P4a中的Fc二聚体表现出与预测质量相比大约14Da的质量增加(图5)。这种质量增加可能归因于非共价复合物内氧化修饰(+16Da)或维持共价复合物的共价交联(例如，两个组氨酸残基之间的14Da)的存在。不幸的是，在完整复杂水平实现的质量分辨率和精度不能引起明确的分配并区分两种截然不同的场景。相似地，非共价和共价二聚体两者可能的共存以及来自IdeS消化的不完整反应产物也使P3中F(ab)'2-Fc异二聚体的可信阐明变得更加复杂，所有这些都只会彼此之间表现出小的质量差异。最后，虽然nSEC-MS分析轻松地证实三个部分解析的峰(P2a、P2b和P2c)均含有具有相似观察到的质量(196,864-196,867Da)的F(ab)'2二聚体物质，但无法从该分析中检索到表征HMW样品中存在的明显异质F(ab)'2-F(ab)'2相互作用的其他有意义的信息。
为了减少歧义并改善表征，在SEC分离后实施了PCD，以提供基于相互作用性质的第二个维度的分离。例如，在PCD条件下，在P4a和P4b中观察到Fc二聚体物质的独特解离行为。P4b中的Fc二聚体(其已基于原生复合物的观察到的质量暂时被指定为非共价物质)在PCD条件下完全解离为Fc/2亚基。该结果证实了P4b中Fc二聚体的非共价性质。相反，在P4a中应用PCD引起Fc/2亚基(例如，从非共价Fc复合物解离)和不可解离Fc/2二聚体物质两者的形成。如在原生条件下检测到的P4a中Fc二聚体的较大质量一致，与非共价Fc/2二聚体相比，不可解离Fc/2二聚体也显示出约14Da的质量增加。该Δ质量被提出对应于先前报道的在两个组氨酸(His)残基之间发生的共价交联(交联剂质量：13.98Da)(Xu CF,Chen Y,YiL,Brantley T,Stanley B,Sosic Z,Zang L.Discovery and characterization ofhistidine oxidation initiated cross-links in an igg1monoclonal antibody.AnalChem 2017:89(15):7915-7923；Powell T,Knight MJ,Wood A,O'Hara J,BurkittW.Photoinduced cross-linking of formulation buffer amino acids to monoclonalantibodies.Eur J Pharm Biopharm 2021:160(35-41))。随后的肽图分析还从Fc区鉴定了几种His-His交联二肽，这些二肽可能有助于P4a中的Fc二聚体(数据未显示)。P3b中的F(ab)'2-Fc二聚体也观察到了相同的共价交联，与非共价F(ab)'2-Fc二聚体相比，测量其质量高出～14Da。PCD的应用通过将该物质解离成Fc/2亚基和不可解离F(ab)'2-Fc/2复合物进一步证实了该分配，由于His-His交联，该复合物也表现出大约14Da的质量增加。
相比之下，P3a中的物质显示出观察到的质量比非共价F(ab)'2-Fc二聚体低大约18Da，并且在PCD条件下被轻松地解离成Fc/2和互补的Fc/2剪切mAb物质。因此，P3a中的物质被指定为不完全IdeS消化产物，其中仅一条重链被裂解。最后，尽管在完整复合物水平上观察到相似的质量，但P2b中的F(ab)'2二聚体在PCD条件下表现出与P2a和P2c中不同的解离行为(图5)。具体来说，通过应用PCD，P2a和P2c中的二聚体几乎完全解离，从而引起仅检测到F(ab)'2单体。这一观察结果表明P2a和P2c两者中F(ab)'2二聚体的非共价性质，其可能由于构象差异而通过SEC分离。相比之下，P2b显示出大量F(ab)'2二聚体在PCD条件下保持不可解离，提示存在“类似共价”F(ab)'2二聚体。此外，随着共洗脱、非共价F(ab)'2二聚体的解离，可以实现对P2b中不可解离二聚体的更准确的质量测量。事实上，该分析表明，P2b中的不可解离二聚体表现出比非共价二聚体(理论质量：196,865Da)更低的质量(196,856Da)，提示可能存在具有负Δ质量的共价交联。尽管这种共价交联的鉴定仍在进行中并且超出了本手稿的范围，但来自PCD辅助nSEC-MS分析的信息对于指导调查很有价值。
实例3.对未分级DS样品中的HMW物质进行PCD辅助nSEC-MS分析。
直接分析来自未分级的mAb DS样品中的HMW物质是非常理想的，因为它对资源的需求较少，并且消除了由于样品处理而导致的HMW图谱的潜在变化(例如，人工HMW形成或不稳定HMW物质的解离)。为了证明PCD辅助nSEC-MS方法在阐明来自未分级样品的复杂的HMW物质的适用性，使在SEC分离期间表现出复杂的HMW图谱(四个部分解析的HMW峰)的双特异性抗体(bsAb)DS样品经历分析(图7)。bsAb(HH*L2)DS样品由两条相同的轻链(LC)和两条不同的重链(HC和HC*)组成，通常含有低水平的单特异性mAb杂质(H2L2和H*2L2)，这些杂质可进一步促进HMW物质的复杂性增加。例如，nSEC-MS分析表明HMW1和HMW2峰两者中存在两种不同的二聚体，包括bsAb同二聚体(HH*L2×2)和由bsAb和单特异性H*2L2物质(去卷积质量如图8所示)组成的异二聚体(HH*L2+H*2L2)。与HMW2峰相比，HMW1峰中异二聚体物质的相对丰度稍高。PCD的应用进一步支持了这些分配，其中bsAb和H*2L2单体两者均从二聚体物质解离，并在HMW1和HMW2峰中检测到。有趣的是，PCD的应用导致HMW1和HMW2峰中异二聚体的完全解离，表明这些物质的非共价性质。相比之下，HMW2峰中的bsAb同二聚体经历了部分解离，而在PCD条件下有相当数量的bsAb同二聚体保持完整，提示存在不可解离bsAb同二聚体。由于单体物质只能在PCD条件下从非共价二聚体的解离生成，因此使用单体信号(例如，bsAb单体和H*2L2单体)构建的经提取离子色谱图(XIC)可以代表非共价二聚体的洗脱图谱。
同时，在PCD条件下使用bsAb同二聚体信号构建的XIC可以代表不可解离bsAb同二聚体的洗脱图谱。应用此策略，很明显，非共价同二聚体和非共价异二聚体两者均在HMW1和HMW2峰中洗脱，而不可解离bsAb同二聚体在宽阔且独特的区域中洗脱，其中峰顶与HMW2峰对齐(图7，左图)。同样，基于准确的质量测量，nSEC-MS分析初步将HMW3峰鉴定为由bsAb单体和两个额外LC组成的复合物。随后，PCD的应用不仅证实了所提出的组合物，而且还揭示了两个额外的LC以不可解离二聚体形式存在(例如，可能经由链间二硫键)，并且然后经由非共价相互作用与bsAb分子缔合。解离的LC二聚体和bsAb单体的XIC也证实了它们与HMW3峰共洗脱，进一步支持了该假设。最后，基于准确的质量测量，由于CH2结构域中的剪切，HMW4峰中的物质被提出为由bsAb单体和Fab片段组成的复合物。由于该物质在PCD条件下保持完整，我们认为它是由不可解离bsAb同二聚体物质的截断产生的降解产物。
从未分离的DS样品中直接阐明HMW物质的能力使PCD辅助nSEC-MS方法非常适合于工艺开发支持，其中需要快速周转以促进决策。为了测试该区域的实用性，随后应用该方法来评定在工艺变更之前和之后mAb程序的HMW图谱的可比性。如SEC-UV迹线所示，在工艺改变之前和之后的mAb4 DS批的HMW图谱通常具有可比性，仅峰形存在微小差异(图9A，黑色迹线)。通过来自nSEC-MS分析的准确的质量测量，第1批和第2批中的主要HMW峰轻松地被鉴定为mAb4二聚体物质(图9A，黑色迹线)。
然后，PCD的应用揭示了在两个DS批中存在非共价二聚体(图9A，品红色迹线，由PCD条件下mAb4单体信号的XIC表示)和不可解离二聚体(图9A，蓝色迹线，由PCD条件下未解离的mAb4二聚体信号的XIC表示)。很明显，尽管基于UV峰值和观察到的质量，HMW物质通常被认为具有可比性，但在两个批之间非共价二聚体和不可解离二聚体的分布有很大不同。具体而言，第2批含有显著更高水平的非共价二聚体物质，而第1批含有显著更高水平的不可解离二聚体物质。此外，还可以基于UV峰面积和从PCD辅助nSEC-UV/MS分析生成的XIC，使用以下公式来估计总HMW物质中非共价二聚体的相对丰度：
其中XIC二聚体和XIC单体分别表示在二聚体洗脱和单体洗脱区域中出现的单体信号的积分XIC峰面积；UV二聚体和UV单体分别表示二聚体和单体峰的积分UV峰面积。在这种计算中，使用二聚体洗脱区域中PCD诱导的单体信号对非共价二聚体进行定量，并针对真实单体信号进行归一化。由于仅使用单体信号，因此可以减轻不同物质(例如，二聚体与单体)的MS响应差异，从而引起更可靠的定量。
使用这种策略，在第1批和第2批DS样品中，总HMW物质中非共价二聚体的相对丰度估计分别为～11％和～86％。此外，第1批和第2批样品中的不可解离二聚体也表现出不同的洗脱图谱，其中第2批样品显示出更高水平的早期洗脱物质。(图9A，蓝色迹线)。一致地，在亚域水平上对二聚体相互作用的进一步分析(例如，在IdeS消化后)(图9B)也揭示了第2批DS样品中更高水平的非共价复合物，包括非共价F(ab)'2二聚体(图9B，品红色迹线，由解离的F(ab)'2单体的XIC表示)和非共价Fc二聚体(图9B，棕色迹线，由解离的Fc/2单体的XIC表示)。包括不可解离F(ab)'2二聚体(图9B，蓝色迹线，由不可解离F(ab)'2二聚体的XIC表示)和不可解离F(ab)'2-Fc异二聚体(图9B，橙色迹线，由未解离的F(ab)'2-Fc二聚体的XIC表示)的不可解离复合物也在两个批中检测到。特别地，不可解离F(ab)'2二聚体显示出与在完整水平(图9A，蓝色迹线)观察到的相似的洗脱图谱(图9B，蓝色迹线)，显示出两个批中两个部分分离的峰。一致地，与第1批相比，第2批显示出更高水平的早期洗脱、不可解离F(ab)'2二聚体物质(图9A和5B，蓝色迹线)。随后，通过在PCD条件下从非共价复合物去除干扰实现了不可解离复合物的准确的质量测量，并且准确的质量测量然后用于研究相互作用的性质。
据观察，与非共价F(ab)'2二聚体的预测的质量相比，晚洗脱、不可解离F(ab)'2二聚体始终表现出大约20Da的质量下降，提示潜在存在具有负Δ质量的共价交联。相比之下，观察到的早期洗脱、不可解离F(ab)'2二聚体的质量与非共价二聚体的质量相当，提示它们是经由小的共价交联或通过在PCD条件下维持的强的非共价相互作用形成的。最后，第1批和第2批两者中的不可解离F(ab)'2-Fc异二聚体表现出广泛的洗脱图谱(图9b，橙色迹线)，这归因于三种不同的物质，包括1)可能经由His-His交联形成的[F(ab)'2-Fc]+14Da共价二聚体；2)具有未知交联的[F(ab)'2-Fc]-30Da共价二聚体；以及3)由于不完全IdeS消化(Fc/2-剪除mAb)导致的[F(ab)'2-Fc]-18Da复合物(图10)。总之，可以极详细的检查两个DS批之间因工艺变化而产生的HMW图谱差异，并将其归因于子域级别相互作用的差异。尽管对这些相互作用(特别是确切的共价交联)的完整理解可能仍然需要离线分馏和进一步表征，但对未分级的DS样品的快速分析提供了必要的信息来评定来自工艺变化的影响并构建用于风险评定的框架。
实例4.对共同配制的mAb样品中的异分子间相互作用进行PCD辅助nSEC-MS分析。
在储存或稳定性条件下，共同配制的mAb药物产品(DP)样品(例如，含有多于一种治疗性mAb)中形成的HMW物质的表征在开发过程中非常重要(行业指南：用于联合使用的两种或更多种新研究用药物的共同开发。药品评价与研究中心。罗克维尔(MD)：美国食品药品监督管理局2013)。然而，由于这些样品中经常存在高度复杂的HMW图谱，涉及同源和异源分子间相互作用，此类分析提出了独特的分析挑战极(Kim J,Kim YJ,Cao M,De Mel N,Albarghouthi M,Miller K,Bee JS,Wang J,Wang X.Analytical characterization ofcoformulated antibodies as combination therapy.MAbs 2020:12(1):1738691)。
为了应对这些挑战，PCD辅助nSEC-MS方法的实用性也在研究中进行了评定，以支持共同配制的mAb项目的开发。例如，在加速稳定性条件下测试了由两种mAb(mAb-A和mAb-B)组成的共同配制的DP样品。三种主要的HMW物质，即mAb-A同二聚体、mAb-B同二聚体和mAb-A/B异二聚体，在T0(无应激，总HMW％＝0.7％)和T6m(25℃持续6个月，总HMW％＝1.5％)样品中均通过nSEC-MS分析基于其不同的分子量轻松地被鉴定出(图11，图12)。使用来自去卷积质谱的积分峰面积，可以估计三个二聚体的相对丰度。有趣的是，除了两种同二聚体之外，在T0样品中轻松地检测到低但明显水平的mAb-A/B异二聚体(图11A)，提示当两种mAb混合时，可能自发地开始了异源分子间相互作用。在25℃保存6个月之后，mAb-A/B异二聚体的相对丰度显著增加(从11％到30％)，而mAb-A同二聚体和mAb-B同二聚体的丰度保持不变或分别减少。
这一观察结果提示，在加速稳定性条件下，mAb-A/B异二聚体的生长速度比同二聚体更快。此外，通过PCD的应用，可以对不可解离二聚体物质(图11，红色迹线)进行相同的计算和比较，从而提供对相互作用性质的高水平评定。例如，在PCD条件下，在T0和T6m样品中观察到mAb-B同二聚体的相对丰度的显著下降，提示非共价相互作用对mAb-B同二聚体的形成的贡献比其他两种物质更显著(例如，mAb-A同二聚体和mAb-A/B异二聚体)。此外，观察到不可解离mAb-A/B异二聚体表现出更快的生长速度(从20％到40％)，并在6个月之后成为最丰富的不可解离二聚体物质。这种快速分析显示出，mAb-A和mAb-B之间的异分子间相互作用在加速稳定性条件下是有利的，可能是经由共价交联或紧密但非共价的相互作用。该信息对于指导未来的研究以阐明导致异源二聚化的确切相互作用，并且从而促进制剂开发以最大限度地减少这种类型的相互作用非常有价值。
HMW尺寸变体的综合表征在治疗性mAb的开发期间非常重要。本发明的PCD辅助nSEC-MS方法的开发使得有效解离非共价HMW复合物以改善MS表征得以实现。具体来说，PCD的应用不仅允许进行差异检测，还改善对非共价和不可解离HMW物质两者的鉴定。通过确认组成亚基，可以更有信心地鉴定大型且意想不到的非共价HMW复合物。通过去除来自共洗脱、非共价物质的干扰，可以获得不可解离HMW复合物的更准确的质量测量，并且因此有利于潜在交联的鉴定。
此外，使用该方法，可以使用完整整体(对于不可解离物质)或组成亚基(对于非共价物质)的XIC轻松地重建每个HMW复合物的洗脱图谱，这进一步增加了鉴定的可信度。由于出色的灵敏度和特异性，该方法可以非常有效地直接从未分级DS样品中阐明复杂的HMW物质，从而使其非常适合于需要快速周转的任务。此外，该方法的实用性在不同的应用中得到了证明，包括在后期开发阶段的深入HMW表征、可比性评定以及强制降解研究。最后，随着mAb治疗性形式(例如，bsAb和共同制剂)日益复杂，该方法对我们的分析库来说是有价值的补充以应对与HMW表征相关联的日益增加的挑战。

Claims (21)

1.一种用于表征感兴趣的蛋白质的至少一种高分子量物质的方法，所述方法包括：
a.获得包含所述感兴趣的蛋白质和所述至少一种高分子量物质的样品；
b.使所述样品与尺寸排阻色谱柱接触；
c.洗涤所述柱以收集洗出液；
d.向所述洗出液添加变性溶液以形成混合物；以及
e.使所述混合物经历质谱仪以表征所述至少一种高分子量物质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质为抗体。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述洗出液包含所述至少一种高分子量物质。
4.根据权利要求1所述的方法，其中(d)的所述混合物还经历紫外线检测。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪为纳升电喷雾电离质谱仪。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪在原生条件下操作。
7.根据权利要求6所述的方法，其进一步包括将来自使用(e)获得的质谱的至少一个峰与通过在原生条件下对(a)的所述样品进行在线尺寸排阻色谱-质谱获得的质谱进行比较。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述变性溶液包含乙腈、甲酸或乙腈与甲酸的组合。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述变性溶液包含约60％v/v乙腈和4％v/v甲酸。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述变性溶液包含约60％v/v乙腈。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述质谱仪在原生条件下操作。
12.根据权利要求1所述的方法，其中在(b)之前使用水解剂消化(a)的所述样品。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述水解剂为蛋白酶酵素。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述蛋白酶酵素为IdeS。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱仪中(d)的所述混合物的流量小于约10μL/min。
16.根据权利要求1所述的方法，其中将(d)的所述混合物分到所述质谱仪和紫外线检测器中。
17.根据权利要求1所述的方法，其中在使(d)的所述混合物经历质谱仪之前向所述混合物添加去溶剂化气体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中使用多喷嘴发射器将所述去溶剂化气体与(d)的所述混合物一起添加。
19.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种高分子量物质为所述感兴趣的蛋白质的非共价高分子量物质。
20.根据权利要求1所述的方法，其中至少一种高分子量物质为所述感兴趣的蛋白质的不可解离高分子量物质。
21.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将来自使用(e)获得的质谱的至少一个峰与通过对(a)的所述样品进行在线尺寸排阻色谱-质谱获得的质谱进行比较。
CN202280061505.1A 2021-09-14 2022-09-13 用于表征生物的高分子量物质的基于质谱的策略 Pending CN117999485A (zh)

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