JP2023512521A - 天然液体クロマトグラフィ質量分析のためのプラットフォーム - Google Patents

Abstract

天然液体クロマトグラフィ質量分析システムおよび使用方法を開示する。天然液体クロマトグラフィ質量分析システムは、サンプルを分離することができる液体クロマトグラフィシステムと、液体クロマトグラフィシステムと流体連通するエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）システムと、を含むことができ、ＥＳＩ－ＭＳシステムは、マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタと、脱溶媒和ガスを改質するためのシステムと、質量分析計と、を備え、質量分析計は、イオンを受け取り、イオンの質量対電荷比を特性評価するように構成されている。【選択図】図１

Description

本発明は、タンパク質を特性評価するシステムおよび方法、具体的には、タンパク質バイオ医薬品などのタンパク質の特性評価のための天然液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＣ）プラットフォームに関する。

クロマトグラフィおよび電気泳動分離技術と組み合わせた、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析（ＭＳ）は、プロテオミクスの重要なテクノロジである。これは、分析ラボでのタンパク質バイオ医薬品の詳細な特性評価のための重要なツールになり、開発および規制当局への申請をサポートしている。タンパク質バイオ医薬品は、非常に高い純度基準を満たす必要があるため、薬剤の開発と製造の異なる段階でタンパク質を監視および特性評価することが重要である。

タンパク質バイオ医薬品の液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）ベースの分析は、データ品質の向上から多大な恩恵を受ける可能性があり、その後、信頼性が高く、かつあいまいさの少ない薬物特性評価の向上につながる可能性がある。異なるタンパク質属性の特性評価を提供するために、多種多様なＬＣ－ＭＳベースのアッセイを実施することができ、そのアッセイにおいては、ペプチドマッピング分析およびインタクト質量分析が最も日常的かつ広く適用される。分析の信頼性を向上させ、データ解釈と関連するあいまいさを減らすために、最適化された実験手順、微調整された機器パラメータ、さらには高度な質量分析計を使用するなど、ＬＣ－ＭＳ分析からのデータ品質を改善するための絶え間ない努力が必要である。

一態様では、本発明は、天然液体クロマトグラフィ質量分析システムであって、サンプルを分離することができる液体クロマトグラフィシステムと、液体クロマトグラフィシステムと流体連通するエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）システムと、を備え、ＥＳＩ－ＭＳシステムが、マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタと、脱溶媒和ガスを改質するためのシステムと、質量分析計と、を備え、質量分析計が、イオンを受け取り、イオンの質量対電荷比を特性評価するように構成されている、天然液体クロマトグラフィ質量分析システムを提供する。

いくつかの実施形態では、脱溶媒和ガスを改質するためのシステムは、キャップを有する容器を含み、キャップは、入口ラインポートおよび出口ラインポートと、入口ラインポートにシースガスを提供するためのシースガス入口ラインと、改質された脱溶媒和ガス出口ラインであって、改質された脱溶媒和ガスの出口ラインポートをマルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタに接続することができる、改質された脱溶媒和ガス出口ラインと、を有する。

いくつかの実施形態では、容器は、有機溶媒および追加の化学成分を含む。

いくつかの実施形態では、追加の化学成分は、酸である。

いくつかの実施形態では、酸は、トリフルオロ酢酸である。

いくつかの実施形態では、追加の化学成分は、塩基である。

いくつかの実施形態では、塩基は、トリエチルアミンである。

いくつかの実施形態では、有機共溶媒は、アセトニトリルである。

いくつかの実施形態では、シースガスは、窒素である。

いくつかの実施形態では、シースガス入口ラインは、入口ラインポートに部分的に挿入されている。

いくつかの実施形態では、改質された脱溶媒和ガス出口ラインは、出口ラインポートに部分的に挿入されている。

いくつかの実施形態では、シースガスは、シースガス入口ラインから、有機溶媒を収容する容器を通って脱溶媒和ガス出口ラインに流れる。

いくつかの実施形態では、マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタは、８つのノズルを含む。

いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィシステムは、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムを含む。

いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィシステムは、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＸ）カラムを含む。

いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィ質量分析システムは、液体クロマトグラフから質量分析計への流量を調整するための分析フロースプリッタをさらに含む。

いくつかの実施形態では、分析フロースプリッタは、約１～５μＬ／分の溶媒流量でエレクトロスプレーを提供することができる。

いくつかの実施形態では、質量分析計は、オービトラップ質量分析器を含む。

いくつかの実施形態では、サンプル中のタンパク質を特性評価する方法であって、サンプルの分離および断片化が可能な液体クロマトグラフィシステムにサンプルを供給することと、液体クロマトグラフィシステムと流体連通するエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）システムを使用して、断片化されたサンプルを分析することと、を含み、ＥＳＩ－ＭＳシステムが、マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタと、脱溶媒和ガスを改質するためのシステムと、質量分析計と、を備え、質量分析計が、イオンを受け取り、イオンの質量対電荷比を特性評価し、タンパク質の成分を識別してタンパク質を特性評価するように構成されている、方法を開示する。

いくつかの実施形態では、タンパク質は、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはこれらの組み合わせである。

いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

いくつかの実施形態では、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのモノクローナル抗体。

いくつかの実施形態では、この方法は、サンプルを液体クロマトグラフィシステムに供給する前に、サンプル中のタンパク質の脱グリコシル化を必要としない。

いくつかの実施形態では、この方法は、高分子量および低分子量の不純物を特性評価するためのものである。

この方法のいくつかの実施形態では、脱溶媒和ガスを改質するためのシステムは、キャップを有する容器を含み、キャップは、入口ラインポートおよび出口ラインポートと、入口ラインポートにシースガスを提供するためのシースガス入口ラインと、改質された脱溶媒和ガス出口ラインであって、改質された脱溶媒和ガスの出口ラインポートをマルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタに接続することができる、改質された脱溶媒和ガス出口ラインと、を有する。

この方法のいくつかの実施形態では、容器は、有機溶媒および追加の化学成分を含む。

この方法のいくつかの実施形態では、追加の化学成分は、酸である。

この方法のいくつかの実施形態では、酸は、トリフルオロ酢酸である。

この方法のいくつかの実施形態では、追加の化学成分は、塩基である。

この方法のいくつかの実施形態では、塩基は、トリエチルアミンである。

この方法のいくつかの実施形態では、有機共溶媒は、アセトニトリルである。

この方法のいくつかの実施形態では、シースガスは、窒素である。

この方法のいくつかの実施形態では、シースガス入口ラインは、入口ラインポートに部分的に挿入されている。

この方法のいくつかの実施形態では、改質された脱溶媒和ガス出口ラインは、出口ラインポートに部分的に挿入されている。

この方法のいくつかの実施形態では、シースガスは、シースガス入口ラインから、有機溶媒を収容する容器を通って脱溶媒和ガス出口ラインに流れる。

この方法のいくつかの実施形態では、マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタは、８つのノズルを含む。

この方法のいくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィシステムは、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムを含む。

この方法のいくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィシステムは、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＸ）カラムを含む。

この方法のいくつかの実施形態では、この方法は、液体クロマトグラフから質量分析計への流量を調整するための分析フロースプリッタを使用することをさらに含む。

この方法のいくつかの実施形態では、分析フロースプリッタは、約１～５μＬ／分の溶媒流量でエレクトロスプレーを提供することができる。

この方法のいくつかの実施形態では、質量分析計は、オービトラップ質量分析器を含む。

様々な実施形態では、上記または本明細書で考察される実施形態の特徴または構成要素のうちのいずれかは組み合わせられ得、そのような組み合わせは本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で考察されるいずれの特定の値も、上記または本明細書で考察される別の関連値と組み合わされて、それらの値が範囲の上限および下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲およびかかる範囲内にあるすべての値は本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で考察される値の各々は、１％、５％、１０％または２０％の変動で表され得る。例えば、１０ｍＭの濃度は、１０ｍＭ±０．１ｍＭ（１％変動）、１０ｍＭ±０．５ｍＭ（５％変動）、１０ｍＭ±１ｍＭ（１０％変動）、または１０ｍＭ±２ｍＭとして表され得る（２０％変動）。他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から明らかとなるであろう。

高感度、堅牢かつ多用途天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームを提供する、本明細書に開示される天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームの例示的な実施形態の概略図を示す。 本明細書に開示される天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームの実施形態で利用される微細加工されたモノリシックマルチノズル（Ｍ３）エミッタを示す。 ＮＩＳＴｍＡｂ（１０μｇ）のＳＥＣ－ＭＳ分析によるプラットフォーム感度を示す。サンプル量の消費量が少ない、１０μｇのＮＩＳＴｍＡｂサンプルを注入すると、約Ｅ９ ＴＩＣ強度になる。ＩＰＡ改質された脱溶媒和ガスによって支援された効率的な脱溶媒和による優れたデータ品質。脱グリコシル化を必要とせずに、存在量の少ない種（ＨＭＷおよびＬＭＷ種など）の高感度検出。正確な質量測定により、これらの種の明確な識別が可能になる。 ＮＩＳＴｍＡｂの１０１回の連続した天然ＳＥＣ－ＭＳ実行によって示されるように、プラットフォームの堅牢性を示す。 ＮＩＳＴｍＡｂの１０１回の連続した天然ＳＥＣ－ＭＳ実行によって示されるように、プラットフォームの堅牢性を示す。 天然ＳＣＸ－ＭＳ分析中に脱溶媒和ガスを改質することで得られる電荷減少効果を示す。図５Ａは、電荷減少と関連するわずかなＴＩＣ強度の低下を示す。図５Ｂは、抗体Ｂによって示される電荷減少効果を示す。 天然ＳＣＸ－ＭＳ分析中に脱溶媒和ガスを改質することで得られる電荷減少効果を示す。図５Ａは、電荷減少と関連するわずかなＴＩＣ強度の低下を示す。図５Ｂは、抗体Ｂによって示される電荷減少効果を示す。 不均一および／または不安定な生体分子の電荷減少支援分析を示す。上のパネルは、電荷減少を伴うシステインＡＤＣ模倣物の天然ＳＥＣ－ＭＳ分析の結果を提供し、下のパネルは、電荷減少を伴わない場合を提供する。図示されているように、電荷減少は、空間分解能の向上により電荷状態が重なるのを防ぎ、質量の不均質性が高いサンプルの分析を可能にする。さらに、電荷減少は、イオン化プロセス中に不安定な生体分子（非共有結合）を維持することに役立ち、望ましくない解離イベントを最小限に抑えた。 本明細書に開示される実施形態によるｎＬＣ－ＭＳプラットフォームを示す。 異なる流量でのｍＡｂ１のＳＥＣ－ＭＳ分析の脱塩から生成されたＵＶおよびＴＩＣトレースを示す。 ０．８ｍＬ／分でのｍＡｂ２の９０回の脱塩ＳＥＣ－ＭＳの実行からのＴＩＣトレースを示す。各注入量（０．１、１、および１０μｇ）を３０回繰り返して分析した。挿入図は、４回の脱塩ＳＥＣ－ＭＳの実行を含むズームイン領域を示す。 ｍＡｂ１の脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析を示す。図９Ａは、移動相として１５０、３００、４５０、および６００ｍＭの酢酸アンモニウム（それぞれ３回の分析）を使用して達成されたＭＳシグナル強度（左のｙ軸）と質量精度（右のｙ軸）の比較である。図９Ｂは、６００ｍＭの酢酸アンモニウムを使用して取得したｍＡｂ１の生の質量スペクトルの例であり、ＦｃＮ－グリコシル化のマクロおよびミクロの不均質性に起因する異なるグリコフォームの検出に成功したことを示す。 ｍＡｂ１の脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析を示す。図９Ａは、移動相として１５０、３００、４５０、および６００ｍＭの酢酸アンモニウム（それぞれ３回の分析）を使用して達成されたＭＳシグナル強度（左のｙ軸）と質量精度（右のｙ軸）の比較である。図９Ｂは、６００ｍＭの酢酸アンモニウムを使用して取得したｍＡｂ１の生の質量スペクトルの例であり、ＦｃＮ－グリコシル化のマクロおよびミクロの不均質性に起因する異なるグリコフォームの検出に成功したことを示す。 異なる電荷減少条件下で得られたｍＡｂ５の代表的な天然質量スペクトルを示す。 ４ｍＡｂ混合物サンプルのｎＳＥＣ－ＭＳおよびｎＩＥＸ－ＭＳ分析を実行することにより、オンライン電荷減少能力のための異なる有機改質剤の評価を示す。各ｍＡｂ分子のＭＳ強度（左のｙ軸）と平均電荷状態（右のｙ軸）を３回測定し、各条件下でプロットする。 ４ｍＡｂ混合物サンプルのｎＳＥＣ－ＭＳおよびｎＩＥＸ－ＭＳ分析を実行することにより、オンライン電荷減少能力のための異なる有機改質剤の評価を示す。各ｍＡｂ分子のＭＳ強度（左のｙ軸）と平均電荷状態（右のｙ軸）を３回測定し、各条件下でプロットする。 デコンボリューションされた質量スペクトルを示す。 移動相流量０．１、０．２、０．４、０．６、および０．８ｍＬ／分を使用したｍＡｂ１の脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析からの天然質量スペクトルを示す。 移動相流量０．１、０．２、０．４、０．６、および０．８ｍＬ／分を使用したｍＡｂ１の脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析からの天然質量スペクトルを示す。 天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームでメイクアップスプリットフロー戦略を使用して、異なるｍＡｂの９つの連続天然ＨＩＣ－ＭＳ分析のＴＩＣを示す。 天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームでメイクアップスプリットフロー戦略を使用して、異なるｍＡｂの９つの連続天然ＨＩＣ－ＭＳ分析のＴＩＣを示す。 （図１４Ａ）ｎＩＥＸ－ＴＩＣ、（図１４Ｂ）各ｍＡｂのメインピークの生の質量スペクトル、および（図１４Ｃ）生の質量スペクトルからのｚ＝７でのズームイン、を示すｍＡｂ混合物のＡＣＮ／ＮＨ３支援ｎＩＥＸ－ＭＳ分析を示す。 （図１４Ａ）ｎＩＥＸ－ＴＩＣ、（図１４Ｂ）各ｍＡｂのメインピークの生の質量スペクトル、および（図１４Ｃ）生の質量スペクトルからのｚ＝７でのズームイン、を示すｍＡｂ混合物のＡＣＮ／ＮＨ３支援ｎＩＥＸ－ＭＳ分析を示す。 （図１４Ａ）ｎＩＥＸ－ＴＩＣ、（図１４Ｂ）各ｍＡｂのメインピークの生の質量スペクトル、および（図１４Ｃ）生の質量スペクトルからのｚ＝７でのズームイン、を示すｍＡｂ混合物のＡＣＮ／ＮＨ３支援ｎＩＥＸ－ＭＳ分析を示す。 未改質の脱溶媒和ガス（上のパネル）またはＩＰＡ改質された脱溶媒和ガス（下のパネル）を使用した長時間分析（２４時間超）後にｎＬＣ－ＭＳプラットフォームで取得されたｍＡｂ２の天然質量スペクトルを示す。 注入量１０μｇのＮＩＳＴｍＡｂの天然ＳＣＸ－ＭＳ分析を示す。 注入量１０μｇのＮＩＳＴｍＡｂの天然ＳＣＸ－ＭＳ分析を示す。 ｎＳＥＣ－ＭＳ（上の、２４分のデューティサイクル）またはｎＩＥＸ－ＭＳ（下の、３０分のデューティサイクル）をそれぞれ２４時間超で使用して連続分析を実行することにより、天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームの堅牢性の評価を示す。 １０μｇのＮＩＳＴｍＡｂ基準標準サンプルのｎＳＥＣ－ＭＳおよびｎＩＥＸ－ＭＳ分析から検出されたサイズと電荷の変異体の概要を示す。

本発明が記載される前に、記載される特定の方法および実験条件が異なり得るため、本発明がかかる方法および条件に限定されないことを、理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に包含される。

別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにそれらの間のすべての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。

本明細書に記載されるものと同様または同等のいずれの方法および材料も本発明の実施またはテストに使用され得るが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書で言及される特許、出願、および非特許刊行物はすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される略語
ＡＣＮ：アセトニトリル
Ａｓｎ：アスパラギン
ＣＱＡ：重要な品質属性
ＣＶ：変動係数
ＥＩＣ：抽出イオンクロマトグラフ
ＥＳＩ－ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＡ：ギ酸
ＦＤＡ：食品医薬品局
ＦＧ：完全にグリコシル化された
ＦＬＲ：蛍光検出
ＨＢＡ：４－ヒドロキシ安息香酸
ＨＣ：重鎖
ＨＩＣ：疎水性相互作用クロマトグラフィ
ＨＩＬＩＣ：親水性相互作用液体クロマトグラフィ
ＨＭＷ：高分子量
ＩＥＸ：イオン交換クロマトグラフィ
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＩＰＡ：イソプロパノール
ＬＣ：軽鎖
ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィ質量分析
ＬＭＷ：低分子量
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＳ：質量分析
ＭＷ：分子量
ＮＣＥ：正規化された衝突エネルギー
ＮＧ：非グリコシル化された
ｎＬＣ：天然液体クロマトグラフィ
ＰＡ：プロピオン酸
ＰＧ：部分的にグリコシル化された
ＰＫ：薬物動態
ＰＱＡ：製品品質属性
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＲＰ－ＬＣ：逆相液体クロマトグラフィ
ＳＰＥ：固相抽出
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィ
ＴＣＥＰ－ＨＣｌ：トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＭＴ：タンデム質量タグ
ＵＶ：紫外線

定義
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、共有結合アミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、当該技術分野で一般に「ポリペプチド」として知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、およびペプチド結合を介して連結されたその合成非天然に存在する類似体、関連する天然に存在する構造変異体、およびそれらの合成非天然に存在する類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチドまたはポリペプチド」とは、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、自動化されたポリペプチドシンセサイザを使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が当業者に知られている。タンパク質は、単一の機能的生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質には、生物療法タンパク質、研究または治療で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、および二重特異性抗体のいずれかを含めることができる。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体フラグメント、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含むことができる。タンパク質は、昆虫バッキュロウイルス系、酵母系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、哺乳動物系（例えば、ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。生物療法タンパク質およびその産生について考察している最近のレビューについては、Ｇｈａｄｅｒｉ等、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ」（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．（２０１２）１４７－７５）を参照されたい。いくつかの実施形態では、タンパク質は、修飾物、付加物、および他の共有結合された部分を含む。これらの修飾物、付加物および部分には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ニューラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、および他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識および他の染料などが含まれる。タンパク質は、組成と溶解度に基づいて分類され得るため、球状タンパク質および繊維状タンパク質などの単純なタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、およびリポタンパク質などのコンジュゲートタンパク質、一次誘導タンパク質および二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質、を含めることができる。

本明細書で使用される「タンパク質変異体」または「タンパク質変異体」または「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって標的タンパク質とは異なるタンパク質を含むことができる。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコード化するアミノ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１～約１０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１～約５つのアミノ酸修飾を有する。本明細書のタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有するであろう。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、またはこれらの組み合わせであり得る。

本明細書で使用する「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合フラグメントを指すよう意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「Ｖ_Ｈ」）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインからなる）からなる。様々な実施形態では、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプであり得る。場合によっては、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。いくつかの実施形態では、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４のものであり、任意選択で、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「Ｖ_Ｌ」）および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化の両方の免疫グロブリンへの言及を含む。「抗体」という用語は、抗体を発現するためにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体等の組換え手段によって調製、発現、作成または単離された抗体分子を含む。抗体構造のレビューについては、Ｌｅｆｒａｎｃ等、ＩＭＧＴ ｕｎｉｑｕｅ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ Ｉｇ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ Ｖ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）、およびＭ．Ｐｏｔｔｅｒ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。

抗体という用語はまた、２つ以上の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む二重特異性抗体を含む。単一の重鎖と単一の軽鎖および６つのＣＤＲを含む、二重特異性抗体の半分は、１つの抗原またはエピトープに結合し、抗体の残りの半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。場合によっては、二重特異性抗体は、同じ抗原に結合することができるが、異なるエピトープまたは重複しないエピトープに結合する。場合によっては、二重特異性抗体の両方の半分が、二重特異性を保持しながら同一の軽鎖を有する。二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に一般的に記載されている。

抗体の「抗原結合部分」（または「抗体フラグメント」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単鎖のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ等の（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２４１：５４４－５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、および（ｖｉｉ）合成リンカによって結合されてＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価の分子を形成する単一のタンパク質鎖を形成する、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨからなるｓｃＦｖ、が含まれる。ダイアボディなどの他の形態の一本鎖抗体も「抗体」という用語に含まれる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ等、（１９９３）９０ ＰＮＡＳ Ｕ．Ｓ．Ａ．６４４４－６４４８、およびＰｏｌｊａｋ等の（１９９４）２ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１２１－１１２３を参照）。

さらに、抗体およびその抗原結合フラグメントは、当該技術分野で一般に知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得ることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９を参照）。トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法は、当該技術分野で知られている。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１，Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照）またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の既知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する所望の抗原に対する高親和性キメラ抗体がまず単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を産生するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。

「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へと移植されたｍＡｂを含むことは意図されない。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう意図されるものではない。

本明細書で使用されるとき、「対象」という用語は、疾患または障害の改善、予防、および／または治療を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。

本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、バイオ医薬品に存在する任意の望ましくないタンパク質を含むことができる。不純物には、プロセスおよび製品関連不純物が含まれ得る。不純物は、さらに既知の構造のもの、部分的に特徴付けられたもの、または同定されていないものとすることができる。プロセス関連不純物は、製造プロセスから誘導される可能性があり、細胞基質由来、細胞培養由来、および下流由来の３つの主要なカテゴリを含むことができる。細胞基質由来の不純物としては、宿主生物に由来するタンパク質および核酸（宿主細胞ゲノム、ベクター、または総ＤＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。細胞培養由来の不純物としては、誘導剤、抗生物質、血清、および他の培地成分が挙げられるが、これらに限定されない。下流由来の不純物としては、酵素、化学的および生化学的処理試薬（例えば、シアノゲンブロミド、グアニジン、酸化剤および還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、ならびに他の浸出性物質が挙げられるが、これらに限定されない。製品関連不純物（例えば、前駆体、特定の分解産物）は、活性、有効性、および安全性に関して所望の生成物のものと同等の特性を有しない、製造および／または保管中に生じる分子変異体であり得る。そのような変異体は、修飾の種類を同定するために、単離および特性評価におけるかなりの努力を必要とし得る。製品関連不純物には、短縮型、修飾型、および凝集体が含まれ得る。短縮型は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素または化学物質によって形成される。修飾型としては、脱アミド化、異性化、ミスマッチＳ－Ｓ結合、酸化、または変化したコンジュゲート形態（例えば、グリコシル化、リン酸化）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾型はまた、任意の翻訳後修飾形態を含み得る。凝集体には、二量体および目的の製品のより高い倍数が含まれる（Ｑ６Ｂ仕様：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。

「低分子量（ＬＭＷ）タンパク質薬物不純物」という用語には、限定されないが、前駆体、分解産物、短縮種、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃ、または重鎖フラグメントを含むタンパク質分解フラグメント、リガンドまたは受容体フラグメント、Ｈ２Ｌ（２つの重鎖と１つの軽鎖）、Ｈ２（２つの重鎖）、ＨＬ（１つの重鎖と１つの軽鎖）、ＨＣ（１つの重鎖）、およびＬＣ（１つの軽鎖）の種を含む。ＬＭＷタンパク質薬物不純物は、多量体タンパク質の１つ以上の成分など、タンパク質製品の不完全なバージョンである任意の変異体であり得る。タンパク質薬物不純物、薬物不純物または製品不純物は、本明細書全体で交換可能に使用され得る用語である。ＬＭＷ薬物または製品の不純物は、一般に、目的の薬物製品とは異なる可能性のある活性、有効性、安全性などの特性を有する分子変異体とみなされる。

タンパク質製品の分解は、細胞培養系でのタンパク質薬物製品の産生中に問題がある。例えば、タンパク質製品のタンパク質分解は、細胞培養培地中のプロテアーゼの放出のために起こり得る。メタロプロテアーゼを阻害するために添加された可溶性鉄源、またはセリンおよびシステインプロテアーゼ阻害剤などの培地添加物は、分解を防ぐために細胞培養に導入されている（Ｃｌｉｎｃｋｅ、Ｍ．－Ｆ．等のＢＭＣ Ｐｒｏｃ．２０１１，５，Ｐ１１５）。Ｃ末端フラグメントは、細胞培養におけるカルボキシルペプチダーゼのために、産生中に切断され得る（Ｄｉｃｋ、ＬＷ等のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００８；１００：１１３２－４３）。

「高分子量（ＨＭＷ）タンパク質薬物不純物」という用語には、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体が含まれるが、これらに限定されない。ＨＭＷ種は、１）余分な軽鎖を有するモノマー（Ｈ２Ｌ３およびＨ２Ｌ４種）、および２）モノマーとＦａｂフラグメントの複合体、という２つのグループに分けることができる。さらに、ＩｄｅＳ酵素消化で処理した後、異なる二量体化フラグメント（Ｆａｂ２－Ｆａｂ２、Ｆｃ－Ｆｃ、およびＦａｂ２－Ｆｃ）を形成する。

「翻訳後修飾」（ＰＴＭ）とは、タンパク質生合成後のタンパク質の共有結合修飾を指す。翻訳後修飾は、アミノ酸側鎖またはタンパク質のＣ末端もしくはＮ末端で発生する可能性がある。ＰＴＭは、概して、特定の酵素または酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（例えば、シグネチャー配列）の部位で発生する。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は、常に、タンパク質の構造または機能のいくつかの態様に影響を及ぼす（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．「Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾としては、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（ビオチンによるリジン残基のアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨード化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（通常、タンパク質のＮ末端でのアセチル基の付加）、アルキル化（通常、リジンまたはアルギニン残基でのアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間の共有結合、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリンおよびリジンヒドロキシル化およびカルボキシ末端アミド化）、γ－カルボキシグルタミン酸（ｇｌｕ残基）の形成をもたらすビタミンＫがグルタミン酸残基のカルボキシ化における補助因子であるビタミンＫ依存性修飾、グルタミン酸化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（グリシン残基の共有結合）、グリコシル化（糖タンパク質をもたらす、アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリン、またはトレオニンのいずれかへのグリコシル基の付加）、イソプレニル化（ファルネソールおよびゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポ酸官能性の付加）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、およびロイシン生合成の場合のように、補酵素Ａからの４’－ホスホパンテテイニル部分の付加）、リン酸化（通常、セリン、チロシン、スレオニン、またはヒスチジンへのリン酸基の付加）、ならびに硫酸化（通常はチロシン残基への硫酸基の付加）が挙げられるが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾としては、シトルリン化（例えば、脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、および脱アミド化（例えば、グルタミンからグルタミン酸またはアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が挙げられるが、これらに限定されない。構造変化を伴う翻訳後修飾としては、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）およびタンパク質分解切断（ペプチド結合でのタンパク質の切断）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の翻訳後修飾は、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン刺激遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質（低分子ユビキチン様修飾因子）への共有結合）、およびユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）などの他のタンパク質またはペプチドの付加を伴う。ＵｎｉＰｒｏｔによってキュレーションされたＰＴＭのより詳細な統制語彙については、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔを参照されたい。

本明細書で使用される用語「糖ペプチド／糖タンパク質」は、それらの合成中または合成後に、共有結合した炭水化物またはグリカンを有する修飾ペプチド／タンパク質である。特定の実施形態では、糖ペプチドは、モノクローナル抗体から、例えば、モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化物から得られる。

本明細書で使用される用語「グリカン」は、一般にグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、およびＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）を含む１つ以上の糖単位を含む化合物である（Ｆｒａｎｋ Ｋｊｅｌｄｓｅｎ等、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．２００３，７５，２３５５－２３６１）。モノクローナル抗体などの糖タンパク質のグリカン部分は、その機能または細胞内位置を特定するための重要な特性である。例えば、特定のモノクローナル抗体は、特定のグリカン部分で修飾されている。

本明細書で使用される「サンプル」という用語は、本発明の方法に従った操作、例えば、分離、分析、抽出、濃縮、またはプロファイリングを含むものに供される、少なくとも分析物分子、例えば、モノクローナル抗体から得られるような糖ペプチドを含む分子の混合物を指す。

本明細書で使用される「分析」または「分析する」という用語は交換可能に使用され、目的の分子（例えば、ペプチド）を分離、検出、単離、精製、可溶化、検出および／または特性評価する様々な方法のいずれかを指す。例としては、固相抽出、固相マイクロ抽出、電気泳動、質量分析、例えば、ＥＳＩ－ＭＳ、ＳＰＥ ＨＩＬＩＣ、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳ、液体クロマトグラフィ、例えば、高性能、例えば、逆相、順相、またはサイズ排除、イオンペア液体クロマトグラフィ、液体－液体抽出、例えば、加速流体抽出、超臨界流体抽出、マイクロ波支援抽出、膜抽出、ソックスレット抽出、沈殿、清澄化、電気化学検出、染色、元素分析、エドマンド分解、核磁気共鳴、赤外線分析、フロー注入分析、キャピラリエレクトロクロマトグラフィ、紫外線検出、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「プロファイリング」という用語は、サンプル中のペプチドなどのタンパク質の含有量、組成、または特徴的な比率を提供するために組み合わせて使用される分析の様々な方法のいずれかを指す。

本明細書で使用される「接触する」は、溶液または固相で少なくとも２つの物質を一緒にすることを含む。

本明細書で使用される「インタクト質量分析」は、タンパク質が無傷のタンパク質として特性評価されるトップダウン実験を含む。インタクト質量分析により、サンプルの調製を最小限に抑え、複数のＰＴＭの接続性など、他のプロテオミクス戦略で失われる可能性のある情報を保持することができる。

本明細書で使用される「ペプチドマッピング分析」は、タンパク質が消化され、続いて得られるペプチドの分離およびそれらの分析を、好ましくはＬＣ－ＭＳを使用して行う実験を含む。いくつかの例示的な実施形態では、ペプチドマッピング分析を適用して、タンパク質生物医薬品の一次配列を確認することができ、タンパク質分子を最初に加水分解剤を使用して小さいペプチドフラグメントに加水分解し、次に各ペプチドフラグメントのアミノ酸配列を、ｃＤＮＡの予測配列と使用するプロテアーゼの特異性を考慮したＬＣ－ＭＳ分析によって決定することができる。ペプチドマッピング分析からのデータは、翻訳後修飾を特定および定量化し、ジスルフィド結合連結を確認し、非常に低いレベル（０．１％未満）で存在するアミノ酸置換イベントを検出するためにも利用することができる（Ｚｅｃｋ等、ＰｌｏＳ ｏｎｅ ２０１２、７、ｅ４０３２８）。タンパク質バイオ医薬品のペプチドマッピング分析では、ＬＣ－ＭＳを紫外線（ＵＶ）検出と組み合わせて実行し、いわゆるＵＶフィンガープリントを生成することがよくあり、これは、品質管理（ＱＣ）および薬物放出中の同定アッセイとして単独で使用することができる。

本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用してサンプル中のタンパク質の消化、例えば、酵素消化または非酵素消化を実行するには、いくつかのアプローチがある。本明細書で使用される場合、「加水分解剤」という用語は、タンパク質の消化を実行することができる多数の異なる薬剤のうちの任意の１つまたは組み合わせを指す。酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＩｄｅＳ）の免疫グロブリン分解酵素、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉのキモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、およびプロテアーゼが挙げられる。非酵素的消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例はエタノールおよびアセトニトリル）、固定化酵素消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、およびオンチップ固定化酵素が挙げられる。タンパク質消化に利用可能な技術について考察している最近のレビューについては、Ｓｗｉｔａｚａｒ等、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ」（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３、１２、１０６７－１０７７）を参照されたい。加水分解剤のうちの１つまたは組み合わせは、配列別の様式でタンパク質またはポリペプチドのペプチド結合を切断し、より短いペプチドの予測可能なコレクションを生成することができる。

タンパク質を消化するために使用することができるいくつかのアプローチが利用可能である。サンプル中のタンパク質を消化するために広く受け入れられている方法の１つは、プロテアーゼの使用を含む。多くのプロテアーゼが利用可能であり、それらの各々は、特異性、効率、および最適な消化条件の点で独自の特徴を有する。プロテアーゼは、ペプチド内の非末端または末端アミノ酸で切断するプロテアーゼの能力に基づいて分類されるように、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼの両方を指す。代替的に、プロテアーゼは、触媒作用のメカニズムに分類されるものとして、６つの別個のクラス（アスパラギン酸、グルタミン酸、およびメタロプロテアーゼ、システイン、セリン、およびスレオニンプロテアーゼ）も指す。「プロテアーゼ」および「ペプチダーゼ」という用語は、ペプチド結合を加水分解する酵素を指すために交換可能に使用される。プロテアーゼは、特異的プロテアーゼと非特異的プロテアーゼに分類することもできる。本明細書で使用される場合、「特異的プロテアーゼ」という用語は、ペプチドの特定のアミノ酸側鎖でペプチド基質を切断する能力を有するプロテアーゼを指す。本明細書で使用される場合、「非特異的プロテアーゼ」という用語は、ペプチドの特定のアミノ酸側鎖でペプチド基質を切断する能力が低下したプロテアーゼを指す。切断優先度は、タンパク質配列中の切断されたアミノ酸の総数に対する切断部位としての特定のアミノ酸の数の比率に基づいて決定され得る。

タンパク質は、特性評価する前に任意選択で調製することができる。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質の調製は、タンパク質消化のステップを含む。いくつかの特定の例示的な実施形態では、タンパク質の調製は、タンパク質消化のステップを含み、タンパク質消化は、トリプシンを使用して実施することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質の調製は、タンパク質消化のステップの前に、タンパク質を変性させ、タンパク質を還元し、タンパク質を緩衝し、および／またはサンプルを脱塩するためのステップを含むことができる。これらのステップは、必要に応じて任意の好適な様式で達成することができる。

ペプチドマッピング分析またはインタクト質量分析のいずれかを使用して異なるタンパク質属性の特性評価を提供するために、多種多様なＬＣ－ＭＳベースのアッセイを実行することができる。

本明細書で使用される場合、「液体クロマトグラフィ」という用語は、液体によって担持される化学混合物が、静止液体または固相の周囲または上を流れる化学物質の差分分布の結果として成分に分離され得るプロセスを指す。液体クロマトグラフィの非限定的な例には、逆相液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、および疎水性クロマトグラフィが含まれる。

本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を検出し、それらの質量を正確に測定することができるデバイスを指す。この用語は、検出および／または特性評価のためにポリペプチドまたはペプチドが溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味することができる。質量分析計は、イオン源、質量分析器、および検出器の３つの主要な部分からなる。イオン源の役割は、気相イオンを作ることである。分析物の原子、分子、またはクラスターは、気相に移され、同時にいずれかをイオン化することができる（エレクトロスプレーイオン化のように）。イオン源の選択は、用途に依存する。

本明細書で使用される場合、「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」という用語は、溶液中のカチオンまたはアニオンのいずれかが、溶液を含むエレクトロスプレーエミッタニードルの先端と対電極との間の電位差を印加することから生じる高電荷液滴の流れの大気圧での形成および脱溶媒和を介して気相に移される、スプレーイオン化のプロセスを指す。溶液中の電解質イオンからの気相イオンの産生には３つの主要なステップがある。これらは、（ａ）ＥＳ注入先端での荷電液滴の産生、（ｂ）気相イオンを産生することができる小さい高荷電液滴をもたらす溶媒蒸発および反復液滴崩壊による荷電液滴の収縮、ならびに（ｃ）非常に小さい高荷電液滴から気相イオンが産生されるメカニズムである。段階（ａ）～（ｃ）は、一般的に装置の大気圧領域で発生する。

本明細書で使用される場合、「エレクトロスプレーイオン化源」という用語は、タンパク質の質量分析に使用される質量分析計と適合性があり得るエレクトロスプレーイオン化システムを指す。

天然ＭＳは、生体分析物を、非変性溶媒からスプレーするというエレクトロスプレーイオン化に基づく特定のアプローチである。これは、大きい生体分子などの生体分子とその複合体を、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）のプロセスを介して、凝縮液相の三次元の機能的存在から気相に移すことができるプロセスとして定義される。

本明細書で使用される場合、「ナノエレクトロスプレー」または「ナノスプレー」という用語は、多くの場合、外部溶媒送達を使用せずに、典型的にはサンプル溶液１分当たり数百ナノリットル以下の非常に低い溶媒流速でのエレクトロスプレーイオン化を指す。

本明細書で使用される場合、「質量分析器」は、種、すなわち、原子、分子、またはクラスターを、それらの質量に従って分離することができるデバイスを指す。高速タンパク質配列決定に用いられ得る質量分析器の非限定的な例は、飛行時間（ＴＯＦ）、磁気電気セクタ、四重極質量フィルタ（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、ならびに加速器質量分析（ＡＭＳ）の技術である。

本明細書で使用される場合、「質量電荷比」または「ｍ／ｚ」は、統一された原子質量単位でのイオンの質量をその電荷数で割ることによって形成される無次元量を表すために使用される（符号に関係なく）。一般に、電荷状態は、イオン化の方法（エレクトロスプレーイオン化として、ＥＳＩは複数のイオン化を促進する傾向があり、これはＭＡＬＤＩではそれほど頻繁ではない）、ペプチドの長さ（ペプチドが長いほど、追加のプロトンを結合することができるグループが増えるため（塩基性残基））、ペプチド配列（一部のアミノ酸（例えば、ＡｒｇまたはＬｙｓ）は他のアミノ酸よりもイオン化の影響を受けやすいため）、機器の設定、溶媒のｐＨ、および溶媒の組成によって異なる。

本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、質量選択および質量分離の複数の段階を使用することによってサンプル分子に関する構造情報を取得することができる技術を指す。前提条件は、サンプル分子を気相に移して無傷でイオン化することができることと、最初の質量選択ステップの後に、予測可能かつ制御可能な方法でサンプル分子が崩壊するように誘導することができることである。マルチステージＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎは、意味のある情報を取得することができるか、フラグメントイオン信号が検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ２）を選択して単離し、それをフラグメント化し、一次フラグメントイオン（ＭＳ３）を単離し、それをフラグメント化し、二次フラグメント（ＭＳ４）を単離するなどして実行することができる。タンデムＭＳは、多種多様な分析器の組み合わせで正常に実行されている。特定の用途のために組み合わせる分析器は、感度、選択性、速度だけでなく、サイズ、コスト、可用性など、多くの異なる要因によって決定することができる。タンデムＭＳ方法の２つの主要なカテゴリは、タンデムインスペースとタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器が空間内またはタンデムインスペース分析器と結合されているハイブリッドもある。

タンデムインスペース質量分析計は、イオン源、前駆体イオン活性化デバイス、および少なくとも２つの非トラッピング質量分析計で構成されている。特定のｍ／ｚ分離関数は、機器の１つのセクションでイオンが選択され、中間領域で解離され、生成物イオンがｍ／ｚ分離とデータ取得のために別の分析器に送信されるように設計することができる。

タンデムインタイム質量分析計では、イオン源で産生されたイオンを、同じ物理デバイス内でトラップ、単離、フラグメント化、およびｍ／ｚ分離することができる。

本明細書で使用される「標的質量分析」は、特定の質量（ｍ／ｚ）のイオンに対して特定の時間にタンデム質量分析（ｎ＝２または３のＭＳｎ）の複数の段階を使用する質量分析技術である。ｍ／ｚと時間の値は、以前の分析から導出された包含リストで定義される。

本明細書で使用される場合、「四重極－オービトラップハイブリッド質量分析計」という用語は、四重極質量分析計をオービトラップ質量分析計に結合することによって作製されたハイブリッドシステムを指す。四重極－オービトラップハイブリッド質量分析計を使用したタンデムインタイム実験は、四重極質量分析計から選択された狭いｍ／ｚ範囲内のイオンを除くすべてのイオンの放出から始まる。選択したイオンは、オービトラップに挿入され、ほとんどの場合、低エネルギーＣＩＤによってフラグメント化することができる。トラップのｍ／ｚ許容範囲内のフラグメントは、トラップ内にとどまる必要があり、ＭＳ－ＭＳスペクトルを取得することができる。同様のハイブリッドシステムは、ＱＩＴ－ＦＴＩＣＲおよびＱｑ－ＦＴＩＣＲなどの高速タンパク質配列決定に使用され得るが、これらに限定されない。

本明細書で使用される場合、「タンパク質デノボ配列決定」という用語は、他の情報源から得られた情報に依存することなく、ペプチドのアミノ酸配列を決定するための手順を指す。質量分析の感度が高いため、この手法は、従来の配列決定方法の能力を超えることが多い重要な情報を提供することができる。

本明細書で使用される場合、「タンパク質配列カバレッジ」という用語は、同定されたペプチドによってカバーされるタンパク質配列のパーセンテージを指す。カバー率は、検出されたすべてのペプチドのアミノ酸数をタンパク質配列全体のアミノ酸の総数で割ることで計算することができる。

本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、データベース内のすべての可能な配列に対して未解釈のＭＳ－ＭＳスペクトルを検索する可能性を提供するバイオインフォマティックツールを指す。このようなツールの非限定的な例には、Ｍａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｗｗｗ．ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）またはＳｅｑｕｅｓｔ（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）がある。

一般的な説明
前述のことから、タンパク質の特性評価を改善するための改善された方法およびシステムの必要性が存在することが理解されよう。開示された発明はその必要性を満たす。
本明細書に開示されているのは、性能が改善されたＬＣ－ＭＳプラットフォームである。実施形態では、天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームは、エミッタを複数のノズルと統合し、脱溶媒和ガスを改質することにより、より堅牢なプラットフォームを産生する。

本明細書に開示される実施形態は、サンプル中のタンパク質の迅速で高感度の特性評価のためのシステムおよび方法を提供する。

いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、（ｉ）液体クロマトグラフィデバイスと、（ｉｉｉ）エレクトロスプレーイオン化源と、（ｉｉｉ）質量分析デバイスと、を備える液体クロマトグラフィ質量分析システムを提供する。

いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、（ｉ）容器１１０と、（ｉｉ）シースガス入口ライン１１２と、（ｉｉｉ）複数のノズル１０８を備えたエレクトロスプレーイオン化エミッタに供給される改質された脱溶媒和ガス出口ライン１１４と、を備える、改質剤システム１０６を提供する。いくつかの実施形態では、エレクトロスプレーイオン化エミッタは、Ｍ３エミッタ（Ｎｅｗｏｍｉｃｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）などの市販のエミッタである。

いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、（ｉ）エレクトロスプレーイオン化源の入口にサンプルを供給することと、（ｉｉ）エレクトロスプレーイオン化源の出口でサンプル中のタンパク質の成分のイオンを生成することと、（ｉｉｉ）質量分析計を使用してイオンを分析し、タンパク質の成分を識別してタンパク質を特性評価することと、を含む、サンプル中のタンパク質を特性評価する方法を提供する。

図１を参照すると、堅牢な信号を提供する例示的な天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームが開示されている。図１に示されるように、天然ＬＣ－ＭＳプラットフォーム１００は、分析カラム１０２、スプリッタ１０４、改質剤システム１０６、エレクトロスプレーイオン化エミッタ１０８、および質量分析デバイス１１８を含む。

実施形態では、分析カラム１０２は、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）分離カラムである。液体クロマトグラフィデバイスの非限定的な例には、逆相液体クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、親水性相互作用クロマトグラフィ、および疎水性クロマトグラフィが含まれ得る。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィは、モノクローナル抗体を含むペプチドを分析するのに使用することができる。陰イオン交換クロマトグラフィ、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィ、高速陰イオン交換クロマトグラフィ、およびＮＰ－ＨＰＬＣを含む順相（ＮＰ）クロマトグラフィを含む、液体クロマトグラフィの様々な形態（例えば、Ａｌｐｅｒｔ等、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、Ａ ６７６：１９１－２０２（１９９４）を参照）を、これらの構造を調査するのに使用することができる。親水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＬＩＣ）は、部分的に水性の移動相で実行され得るＮＰ－ＨＰＬＣの変形であり、ペプチド、炭水化物、核酸、および多くのタンパク質の順相分離を可能にする。ＨＩＬＩＣの溶出順序は、極性が最も低いものから極性が最も高いものに向かい、逆相ＨＰＬＣの場合とは逆である。ＨＰＬＣは、例えば、ＷａｔｅｒｓのＨＰＬＣシステム（例えば、Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ Ａｌｌｉａｎｃｅ ＨＰＬＣ ｓｙｓｔｅｍ）、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｇｉｌｓｏｎなどで実施することができる。

いくつかの実施形態では、ＬＣ分析は、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣペプチドＢＥＨ Ｃ１８カラムを使用することによって実行される。カラム温度は、例えば市販のカラムヒータを使用して、クロマトグラフィの実行全体を通して一定の温度に維持することができる。いくつかの実施形態では、カラムは、約１８℃～約７０℃、例えば、約３０℃～約６０℃、約４０℃～約５０℃、例えば、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、または約７０℃の温度に維持される。いくつかの実施形態では、カラム温度は、約４０℃である。いくつかの実施形態では、実行時間は、約１５～約２４０分、例えば、約２０～約７０分、約３０～約６０分、約４０～約９０分、約５０分～約１００分、約６０～約１２０分、約５０分～約８０分とすることができる。

いくつかの実施形態では、ＬＣ分析は、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラム、または天然質量分析システムと流体連通するイオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＸ）システムを含む。カラムは、脱グリコシル化されたタンパク質での使用に好適である。一実施形態では、ＳＥＣカラムは、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ（登録商標）ＳＥＣカラム（４．６×３００ｍｍ）である。一実施形態では、ＩＥＸカラムは、強陽イオン交換カラムである。

ＳＥＣまたはＩＥＸカラムなどのカラムは、質量分析計への流量を調整することができる分析フロースプリッタ１０４を介して質量分析計と流体連通している。

いくつかの実施形態では、移動相は、水性移動相である。代表的な水性移動相には、１４０ｍＭの酢酸ナトリウムと１０ｍＭの重炭酸アンモニウムが含まれている。ＵＶトレースは、典型的には、２１５および２８０ｎｍで記録される。

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質を溶出するために使用される移動相は、質量分析計と適合性があり得る移動相であり得る。

いくつかの例示的な実施形態では、液体クロマトグラフィデバイスで使用される移動相は、水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸、ギ酸、またはそれらの組み合わせを含むことができる。

いくつかの例示的な実施形態では、移動相は、液体クロマトグラフィデバイスにおいて、約０．１ｍｌ／分～約０．８ｍｌ／分、例えば、約０．１ｍｌ／分～約０．４ｍｌ／分の間の流速を有することができる。一態様では、液体クロマトグラフィデバイスにおける移動相の流速は、約０．１ｍｌ／分、約０．１５ｍｌ／分、約０．２０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分、約０．３０ｍｌ／分、約０．３５ｍｌ／分、約０．４ｍｌ／分、約０．４５ｍｌ／分、約０．５０ｍｌ／分、約０．５５ｍｌ／分、約０．６０ｍｌ／分、約０．６５ｍｌ／分、約０．７０ｍｌ／分、約０．７５ｍｌ／分、または約０．８０ｍｌ／分とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、移動相は、約６００ｍＭまでの塩濃度を可能にする。一態様では、塩濃度は、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５５０ｍＭまたは約６００ｍＭである。

システムは、前述のタンパク質、不純物、移動相、質量分析計、有機溶媒、酸、塩基、またはクロマトグラフィカラムのいずれにも限定されないことが理解される。

一実施形態では、サイズ排除分離は、０．２ｍＬ／分のアイソクラティックフローを２４分間使用して、室温で達成される。

一実施形態では、エレクトロスプレー用の電圧は、エミッタの直前の液間電位差ティーを通して印加される。

いくつかの例示的な実施形態では、図１に示されるように、改質剤システム１０６は、容器１１０、シースガス入口ライン１１２、シースガス出口ライン１１４、およびキャップ１１６を含む。

いくつかの例示的な実施形態では、シースガス入口ライン１１２は、テフロン管とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、シースガス入口ライン１１２は、可撓性のステンレス鋼管とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、シースガス入口ライン１１２は、ポリエーテルケトンを使用して作製された管とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、改質された脱溶媒和ガス出口ライン１１４は、テフロン管とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、改質された脱溶媒和ガス出口ライン１１４は、可撓性のステンレス鋼管とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、改質された脱溶媒和ガス出口ライン１１４は、ポリエーテルケトンを使用して作製された管とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、キャップ１１６を備えることができる。キャップ１１６は、移動相で安全に使用することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、キャップ１１６を備えることができ、キャップ１１０は、キャップ１１６と容器１１０との間に気密シールを形成することを可能にすることができる。使用できるキャップの非限定的な例としては、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＳａｌｅｓのＣａｎａｒｙ－Ｓａｆｅキャップ、ＲｅｓｔｅｋのＥｃｏ－ｃａｐボトルトップ、ＲｅｓｔｅｋのＯｐｔｉ－ｃａｐボトルトップ、およびＶＷＲの不活性移動相ボトルキャップが挙げられる。

いくつかの例示的な実施形態では、キャップ１１６は、スクリューキャップからなることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、キャップ１１６は、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）材料で作製することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、キャップ１１６は、キャップと容器との間の気密シールを確実にするために、Ｏリングからさらになることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０内のキャップ１１６は、配管用の少なくとも１つのポートを有することができる。一態様では、容器１１０内のキャップ１１６は、配管用の２つのポートを有することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器内のキャップ１１６は、少なくとも１つの入口ポート１６０を有することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０内のキャップ１１６は、少なくとも１つの出口ポートを有することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化エミッタ１０８は、シースガス出口ライン１１４に結合されている。

いくつかの例示的な実施形態では、改質剤システム１０６は、入口ラインポートおよび出口ラインポートを備えたキャップ１１６と、入口ラインポートにシースガスを提供することができるシースガス入口ライン１１２と、を有する容器１１０を備えることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、改質剤システム１０６は、入口ラインポートおよび出口ラインポートを備えたキャップ１１６と、出口ラインポートをエレクトロスプレーイオン化エミッタ１０８に接続することができる改質脱溶媒和ガス出口ライン１１４とを有する容器１１０を含むことができる。

いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化エミッタ１０８は、複数のエミッタノズル、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つのエミッタノズル、例えば２、３、４、５、６、７、または８つのエミッタノズルを含む。

いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化エミッタ１０８は、８つのエミッタノズルを含むＮｅｗｏｍｉｃｓ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ）のＭ３エミッタである。

いくつかの例示的な実施形態では、シースガスは、シースガス源によって、シースガス入口ライン１１２を通って入口ラインポートを備えたキャップ１１６を有する容器１１０に提供することができる。シースガスの非限定的な例には、空気、窒素、ＩＰＡ、ＡＣＮ、および／またはＡＣＮ／ＮＨ_３が含まれる。

いくつかの例示的な実施形態では、シースガス源によって、シースガス入口ライン１１２を通って入口ラインポートを備えたキャップを有する容器に提供することができるシースガスは、窒素ガスとすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化エミッタ１０８は、サンプル吸引、サンプル分配、サンプル送達を実行するために、および／またはサンプルをスプレーするために自動化することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、入口ラインポートおよびシースガス入口ライン１１２を備えたキャップ１１６を有する容器１１０であり、シースガス入口ライン１１２は、入口ラインポートに部分的に挿入することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、出口ラインポートおよび改質された脱溶媒和ガス出口ライン１１４を備えたキャップ１１６において、改質された脱溶媒和ガス出口ライン１１４は、出口ラインポートに部分的に挿入することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、改質剤システム１０６は、シースガス入口ライン１１２から容器１１０を通って脱溶媒和ガス出口ライン１１４へのシースガスの流れを可能にするように構成することができ、例えば、シースガスは窒素である。

いくつかの例示的な実施形態では、容器は、第２の容器によって囲まれ得る。いくつかの特定の例示的な実施形態では、第２の容器は、ポリエチレンから作製することができる。一態様では、第２の容器は、ガラス瓶に飛散防止保護を提供することを可能にすることができる。別の態様では、第２の容器は、上部に開口部を有することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、ホウケイ酸ガラス材料を形成するように作製することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０の容量は、約１０ｍｌ～約５０００ｍｌの範囲とすることができる。一態様では、容器１１０の容量は、約１０ｍｌ、約２０ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ、約５０ｍｌ、約６０ｍｌ、約７０ｍｌ、約８０ｍｌ、約９０ｍｌ、約１００ｍｌ、約１１０ｍｌ、約１２０ｍｌ、約１３０ｍｌ、約１４０ｍｌ、約１５０ｍｌ、約１６０ｍｌ、約１７０ｍｌ、約１８０ｍｌ、約１９０ｍｌ、約２００ｍｌ、約２１０ｍｌ、約２２０ｍｌ、約２３０ｍｌ、約２４０ｍｌ、約２５０ｍｌ、約２６０ｍｌ、約２７０ｍｌ、約２８０ｍｌ、約２９０ｍｌ、約３００ｍｌ、約３１０ｍｌ、約３２０ｍｌ、約３３０ｍｌ、約３４０ｍｌ、約３５０ｍｌ、約３６０ｍｌ、約３７０ｍｌ、約３８０ｍｌ、約３９０ｍｌ、約４００ｍｌ、約４１０ｍｌ、約４２０ｍｌ、約４３０ｍｌ、約４４０ｍｌ、約４５０ｍｌ、約４６０ｍｌ、約４７０ｍｌ、約４８０ｍｌ、約４９０ｍｌ、約１０００ｍｌ、約１１００ｍｌ、約１２００ｍｌ、約１３００ｍｌ、約１４００ｍｌ、約１５００ｍｌ、約１６００ｍｌ、約１７００ｍｌ、約１８００ｍｌ、約１９００ｍｌ、約２０００ｍｌ、約２５００ｍｌ、約３０００ｍｌ、約３５００ｍｌ、約４０００ｍｌ、約４５００ｍｌ、または約５０００ｍｌとすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、耐圧容器とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、少なくとも約０．５バールゲージの耐圧を有することができる。一態様では、容器１１０は、少なくとも約０．５バールゲージ、少なくとも約０．６バールゲージ、少なくとも約０．７バールゲージ、少なくとも約０．８バールゲージ、少なくとも約０．９バールゲージ、少なくとも約１バールゲージ、少なくとも約１．１バールゲージ、少なくとも約１．２バールゲージ、少なくとも約１．３バールゲージ、少なくとも約１．４バールゲージ、少なくとも約１．５バールゲージ、少なくとも約１．６バールゲージ、少なくとも約１．７バールゲージ、少なくとも約１．８バールゲージ、少なくとも約１．９バールゲージ、または少なくとも約２．０バールゲージの耐圧を有することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、少なくとも１つの有機溶媒で満たすことを可能にすることができる。有機溶媒の非限定的な例には、アセトニトリル、プロパノール、イソプロパノール、水、およびメタノールが含まれる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、少なくとも１つの酸で満たすことを可能にすることができる。酸の非限定的な例には、酢酸、プロピオン酸、およびギ酸が含まれる。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、少なくとも１つの塩基で満たすことが可能である。塩基の非限定的な例には、アンモニア、ジエチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、およびピペリジンが含まれる。いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、少なくとも１つの有機溶媒および少なくとも１つの酸で満たすことが可能である。

いくつかの例示的な実施形態では、容器１１０は、少なくとも１つの有機溶媒および少なくとも１つの塩基で満たすことが可能である。

いくつかの例示的な実施形態では、改質剤システムは、シースガス入口ライン１１２から、有機溶媒および追加の化学成分で充填することが可能な容器１１０を通って脱溶媒和ガス出口ライン１１４へのシースガスの流れを可能にするように構成することができる。

いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化源は、約１～５μＬ／分超の溶媒流量を有するエレクトロスプレーを提供することを可能にすることができる。一態様では、エレクトロスプレーイオン化源は、約１μＬ／分超、約２μＬ／分超、約３μＬ／分超、約４μＬ／分超、約５μＬ／分超、約６μＬ／分超、約７μＬ／分超、約８μＬ／分超、約９μＬ／分超、約１０μＬ／分超、約１１μＬ／分超、約１２μＬ／分超、約１３μＬ／分超、約１４μＬ／分超、約１５μＬ／分超、約１６μＬ／分超、約１７μＬ／分超、約１８μＬ／分超、約１９μＬ／分超、約２０μＬ／分超、約２５μＬ／分超、約３０μＬ／分超、約３５μＬ／分、約４０μＬ／分超、約４５μＬ／分超、約５０μＬ／分超、約５５μＬ／分超、約６０μＬ／分超、約６５μＬ超／分、約７０μＬ／分超、約７５μＬ／分超、約８０μＬ／分超、約８５μＬ／分超、約９０μＬ／分超、約９５μＬ／分超、約１００μＬ／分超、約１１０μＬ／分超、約１２０μＬ／分超、約１３０μＬ／分超、約１４０μＬ／分超、約１５０μＬ／分超、約１６０μＬ／超分、約１７０μＬ／分超、約１８０μＬ／分超、約１９０μＬ／分超、約２００μＬ／分超、約２２５μＬ／分超、約２５０μＬ／分超、約２７５μＬ／分超、約３００μＬ／分超、約３２５μＬ／分超、約３５０μＬ／分超、約３７５μＬ／分超、約７００μＬ／分超、約４２５μＬ／分超、約４５０μＬ／分超、または約５００μＬ／分超の溶媒流量を有するエレクトロスプレーを提供することを可能にすることができる。

いくつかの実施形態では、分析スケール分離で使用される広範囲の流量（０．１～０．８ｍＬ／分）に対応するために、ポストカラム分割戦略を適用して、流量を１０μＬ／分未満、例えば、ＮＳＩ用のＭ３エミッタなどのマルチノズルエミッタで容易に対応することができる、１μＬ／分未満、０．１μＬ／分未満、または０．０１μＬ／分未満の範囲に減少させる（図７を参照）。いくつかの実施形態では、分割比は、ステンレス鋼ティーなどのティーに接続された、異なる寸法の２つのバイパー管などの、異なる寸法の２つの固定管によって制御される。いくつかの実施形態では、ステンレス鋼ティーは、異なる寸法（２０μｍ×１５ｃｍおよび１００μｍ×６５ｃｍ）の２つのバイパー管を接続するポストカラムに位置付けられ、天然ＭＳ検出に対して、異なる分析フロー（０．８ｍＬ／分以下）をマイクロフロー範囲（サブμＬ／分）に減少させ、ＵＶ検出（２８０ｎｍなど）に対して、残りの高流量を迂回させる。

いくつかの例示的な実施形態では、天然質量分析計１１８は、タンパク質の成分を同定してタンパク質を特性評価することを可能にすることができる。天然質量分析システムは、天然ＥＳＩ質量分析システムとすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１１８は、四重極－オービトラップハイブリッド質量分析計とすることができる。四重極－オービトラップハイブリッド質量分析計は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｆｏｃｕｓ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｐｌａｔｆｏｒｍ、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＵＨＭＲ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）ＨＦ－Ｘ Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計、およびＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｈｙｂｒｉｄ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ（商標）質量分析計とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析システムは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＥＭＲ質量分析計である。質量分析システムはまた、紫外線検出器を含むことができる。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１１８は、ＱＩＴ－ＦＴＩＣＲとすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１１８は、Ｑｑ－ＦＴＩＣＲとすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１１８は、タンデム質量分析計とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１１８は、タンデムインタイム質量分析計とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１１８は、タンデムインスペース質量分析計とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１１８は、タンデムインタイム分析器を空間内またはタンデムインスペース分析器と結合することができるハイブリッドとすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、サンプル中のタンパク質を特性評価する方法は、サンプル中のタンパク質を検出または定量化することを含むことができる。

１つの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、抗体フラグメント、または多重特異性抗体を含むことができる。

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、治療用抗体とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、免疫グロブリンタンパク質とすることができる。

１つの例示的な実施形態では、免疫グロブリンタンパク質は、ＩｇＧ１とすることができる。

１つの例示的な実施形態では、免疫グロブリンタンパク質は、ＩｇＧ４とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、二重特異性抗体とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体の消化時に形成される抗体フラグメントとすることができる。

１つの例示的な実施形態では、タンパク質は、タンパク質変異体とすることができる。

１つの例示的な実施形態では、タンパク質は、翻訳後修飾されたタンパク質とすることができる。

１つの例示的な実施形態では、翻訳後修飾タンパク質は、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化、Ｃ末端のアミド化、酸化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化、アルキル化、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間の共有架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾、ビタミンＫ依存性修飾、グルタミル化、グリコシル化、グリコシル化、脱グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイニル化、リン酸化、硫酸化、シトルリン化、脱アミド化、ジスルフィド架橋の形成、タンパク質分解性切断、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化またはユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）によって形成することができる。

１つの例示的な実施形態では、翻訳後修飾されたタンパク質は、タンパク質の酸化時に形成することができる。

別の例示的な実施形態では、分解産物は、治療用タンパク質の翻訳後修飾を含むことができる。

別の例示的な実施形態では、タンパク質は、タンパク質の分解産物であり得る。

さらに別の例示的な実施形態では、タンパク質は、バイオ医薬品に見られる不純物とすることができる。

別の例示的な実施形態では、タンパク質は、バイオ医薬品の製造中に見られる不純物とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有するタンパク質とすることができる。一態様では、タンパク質は、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＩを有するタンパク質とすることができる。

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、生成物関連の不純物とすることができる。生成物に関連する不純物は、分子変異体、前駆体、分解産物、断片化されたタンパク質、消化された生成物、凝集体、翻訳後修飾形態またはそれらの組み合わせとすることができる。

いくつかの特定の例示的な実施形態では、タンパク質は、プロセス関連の不純物とすることができる。プロセス関連の不純物には、製造プロセスに由来する不純物、例えば、核酸および宿主細胞タンパク質、抗生物質、血清、他の培地成分、酵素、化学的および生化学的処理試薬、無機塩、溶媒、担体、リガンド、および製造プロセスで使用される他の浸出物が挙げられる。

いくつかの特定の例示的な実施形態では、タンパク質は、不純物とすることができる。例示的な一実施形態では、サンプル中の不純物の数は、少なくとも２つとすることができる。

開示されたシステムおよび方法は、サイズ変異体、電荷変異体、抗体－抗原結合、ＰＴＭ特性評価、部分的に還元およびアルキル化されたｍＡｂの特性評価、共製剤化された薬物の二量体特性評価、ＩｇＧ４ Ｆａｂ交換特性評価、および電荷減少を使用する高度に不均一なサンプル特性評価に使用することができる。酸性変異体に寄与する、検出および同定され得る例示的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）には、糖化、グルクロニル化、カルボキシメチル化、シアル化、Ｆａｂ領域での非コンセンサスグリコシル化が含まれるが、これらに限定されない。基本的な変異体に寄与する検出および同定され得るＰＴＭには、スクシンイミド形成、Ｎ末端グルタミン（ピログルタミン酸に変換されない）、Ｃ末端Ｌｙｓ、および非／部分グリコシル化種が含まれるが、これらに限定されない。

１．サイズ変異体
一実施形態は、タンパク質薬物製品不純物のサイズ変異体を特性評価するための方法であって、水性移動相を使用する天然ＳＥＣクロマトグラフィによるタンパク質薬物製品サンプルのタンパク質成分を分離することと、質量分析によって、分離されたタンパク質成分を分析して、開示されたプラットフォームを使用した、タンパク質薬物製品サンプル中のタンパク質薬物製品不純物の高分子量種、低分子量種、および中高分子量を特性評価することと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムを含む。開示されたプラットフォームを使用すると、分離および分析の前にタンパク質薬物製品サンプルを脱グリコシル化する必要がなくなる。

一実施形態では、タンパク質薬物製品サンプルは、供給バッチ細胞培養、連続細胞培養、または灌流細胞培養から採取または精製される。

例示的なタンパク質薬物製品には、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

例示的な低分子量タンパク質薬物製品不純物には、前駆体、分解産物、短縮種、Ｆａｂを含むタンパク質分解フラグメント、リガンドもしくは受容体フラグメントまたは重鎖フラグメント、遊離軽鎖、半抗体、Ｈ２Ｌ、Ｈ２、ＨＬ、ＨＣ、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。

例示的なＨＭＷ不純物には、ｍＡｂ三量体およびｍＡｂ二量体が含まれるが、これらに限定されない。

例示的な中間体ＨＭＷには、余分な軽鎖を有するモノマー（Ｈ２Ｌ３種およびＨ２Ｌ４種）、モノマーとＦａｂフラグメントの複合体、Ｆａｂ２－Ｆａｂ２、Ｆｃ－Ｆｃ、およびＦａｂ２－Ｆｃが含まれるが、これらに限定されない。

２．電荷変異体の特性評価
一実施形態は、タンパク質薬物製品不純物の電荷変異体を特性評価するための方法であって、任意選択でタンパク質薬物製品サンプルを脱グリコシル化するステップと、任意選択でＳｔｒｅｐｔｏｃｏｏｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからＩｄｅＳでサンプルを処理するステップと、水性移動相を使用する天然強陽イオン交換クロマトグラフィによってタンパク質薬物製品サンプルのタンパク質成分を分離するステップと、質量分析によって、分離されたタンパク質成分を分析して、タンパク質薬物製品サンプル中のタンパク質薬物製品不純物の電荷変異種を特性評価するステップと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウムおよび重炭酸アンモニウムを含む。開示されたプラットフォームを使用すると、特性評価の前にタンパク質薬物製品サンプルを脱グリコシル化する必要がなくなる。

一実施形態では、タンパク質薬物製品サンプルは、供給バッチ細胞培養、連続細胞培養、または灌流細胞培養から採取または精製される。

例示的な電荷変異体には、Ｆａｂ領域での糖化、グルクロニル化、カルボキシメチル化、シアル化、非コンセンサスグリコシル化が含まれるが、これらに限定されない。基本的な変異体に寄与する検出および同定され得るＰＴＭには、スクシンイミド形成、Ｎ末端グルタミン（ピログルタミン酸に変換されない）、Ｃ末端Ｌｙｓ、および非／部分グリコシル化種が含まれるが、これらに限定されない。

また、高純度タンパク質薬物製品の製造方法も開示する。いくつかの実施形態は、抗体を産生する方法であって、例えば、供給バッチ培養において、抗体を産生する細胞を培養するステップと、細胞培養からサンプルを取得するステップと、本明細書に開示されるシステムおよび方法を使用し、サンプル中の低分子量、高分子量、および中間分子量の不純物を特性評価および定量化するステップと、細胞培養の１つ以上の培養条件を変更して、抗体の細胞培養中に産生される特性評価された低分子タンパク質薬物不純物の量を減らすステップと、を含む、方法を提供する。典型的には、条件は、０．０５％～３０．０％、好ましくは０．０５％～１５％、０．０５％～１０％、０．０５％～５％、または０．０５％～２％（ｗ／ｗ）の範囲のタンパク質薬物不純物を有するように変更される。

低分子量タンパク質薬物不純物の量を減らすために変更される細胞培養の１つ以上の条件は、温度、ｐＨ、細胞密度、アミノ酸濃度、浸透圧、成長因子濃度、撹拌、ガス部分圧、界面活性剤、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、抗体を産生する細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である。他の実施形態では、細胞は、ハイブリドーマ細胞である。

別の実施形態は、本明細書で提供される方法に従って産生された抗体が、１～５％、５～１０％、１０～１５％、１５～２０％のタンパク質薬物不純物を有することを提供する。

以下の実施例は、本発明の方法をどのように達成するかおよび使用するかに関する完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されており、本発明者らが本発明とみなすことの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはそれに近い。

実施例１：材料および方法
サンプル調製。ＮＩＳＴｍＡｂストックサンプルを１０μｇ／μＬの濃度で使用した。

天然ＳＥＣ ＬＣ－ＭＳ分析。ＮＩＳＴｍＡｂの天然ＳＥＣ ＬＣ－ＭＳ分析では、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＵＨＭＲ質量分析計でのオンラインＬＣ－ＭＳ分析用のＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ（２００Å、１．７μｍ、４．６ｍｍ×３００ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して１０μｇのＮＩＳＴｍＡｂを分離した。その分離のために、移動相は、水中の１５０ｍＭ酢酸アンモニウムであった。詳細なＬＣ勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）およびＭＳパラメータは、それぞれ表１と表２に含まれている。

天然ＳＣＸ ＬＣ－ＭＳ分析。ＮＩＳＴｍＡｂの天然ＳＣＸ ＬＣ－ＭＳ分析では、Ｑ－ＥｘａｃｔｉｖｅＵＨＭＲ質量分析計でのオンラインＬＣ－ＭＳ分析用のＹＭＣ ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳＦ ４．６×１００ｍｍ（ＹＭＣ、日本）を使用して１０μｇのＮＩＳＴｍＡｂを分離した。その分離のために、移動相Ａは、ｐＨ５．６の水中の２０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂは、水中の１５０ｍＭ酢酸アンモニウムであった。詳細なＬＣ勾配条件は、表３に含まれており、ＭＳパラメータは、天然ＳＥＣ－ＭＳ分析と同じである。

脱溶媒和ガスの改質。シースガスの流れは、１／８インチのテフロン管を使用して、Ｃａｎａｒｙ－Ｓａｆｅ Ｃａｐ（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｌｅｓ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｆｌａｎｄｅｒ、ＮＪ）を介してＤｕｒａｎ圧力プラスボトル（ＳＣＨＯＴＴ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＮＹ）に向けられた（図１を参照）。次に、ボトルから出ている管を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｏｎ Ｍａｘイオン源のＮｅｗｏｍｉｃｓ Ｍ３エミッタに直接接続した。天然インタクトＭＳ分析では、２００ｍＬのイソプロパノール（ＩＰＡ）をボトルに移した。

実施例２：天然ＳＥＣ－ＭＳプラットフォームの感度と堅牢性
実施例１に記載された方法および材料を使用して、開示されたプラットフォームの感度は、ＮＩＳＴｍＡｂの天然ＳＥＣ－ＭＳ分析を実行することによって実証された。天然ＳＥＣ－ＭＳ分析は、１０μｇのＮＩＳＴｍＡｂで実行した。図３に示すように、１０μｇのＮＩＳＴｍＡｂサンプルの注入により、約Ｅ９ ＴＩＣ強度が得られた。これは、開示されたプラットフォームでのサンプル量の消費量が少ないことを実証している。開示されたプラットフォームでは、ＩＰＡ改質された脱溶媒和ガスによって支援された効率的な脱溶媒和による優れたデータ品質も観察された。少量の種（例えば、ＨＭＷおよびＬＭＷ種）の高感度検出が、脱グリコシル化を必要とすることなく実証された。正確な質量測定により、これらの種の明確な特定が可能になった。さらに、図４Ａおよび４Ｂは、ＮＩＳＴｍＡｂの１０１回の連続した天然ＳＥＣ－ＭＳ実行によって実証されるプラットフォームの堅牢性を示しており、相対的な存在量は最初の実行と１０１^回目の実行との間でほぼ同じあった。

実施例３：電荷減少のための効果的な脱溶媒和ガスの改質
天然ＳＣＸ－ＭＳ分析中に脱溶媒和ガスを変更する効果を決定するための調査を行った。図５Ａおよび５Ｂに示すように、脱溶媒和ガスをＩＰＡ、ＡＣＮ、またはＡＣＮ／ＮＨ３で改質した場合、ＴＩＣ強度のわずかな低下が電荷減少と関連していた。図６に示すように、電荷減少は、不均一および／または不安定な生体分子の分析を支援した。図６の上のパネルは、電荷減少を伴うシステインＡＤＣ模倣物の天然ＳＥＣ－ＭＳ分析を示しており、下のパネルは、減少を伴わない場合を示している。電荷減少は、空間分解能の向上により電荷状態が重なるのを防ぎ、質量の不均質一性が高いサンプルの分析が可能になる。電荷減少は、空間分解能の向上により電荷状態が重なるのを防ぎ、質量の不均質性が高いサンプルの分析が可能になる。さらに、電荷減少は、イオン化プロセス中に不安定な生体分子（非共有結合）を維持するのに役立ち、望ましくない解離イベントを最小限に抑えた。

実施例４：インタクトなタンパク質質量分析のための多用途、高感度かつ堅牢な天然ＬＣ－ＭＳプラットフォーム
本明細書に開示される実施形態による、多用途、高感度かつ堅牢な天然ＬＣ－ＭＳプラットフォームの追加の例を以下に提供する。

過去数年間、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＸ）、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）などの天然（非変性）液体クロマトグラフィ（ｎＬＣ）方法と質量分析（ＭＳ）とのハイフネーションは、タンパク質薬物製品のサイズ、電荷、および構造の不均質性の研究に多くの関心を集めている。多種多様なｎＬＣ－ＭＳ方法が利用可能であるにもかかわらず、異なるアプリケーションに対応することができる統合プラットフォームがまだ不足している。この実施例では、異なるｎＬＣ－ＭＳアプリケーションを容易に有効にし、優れた汎用性、感度、および堅牢性を備えた新しいｎＬＣ－ＭＳプラットフォームの開発について説明する。特に、開発されたプラットフォームは、異なるｎＬＣ方法に対応する際に達成される汎用性の鍵となる、広範囲のＬＣ流量と高塩濃度に耐えることができる。さらに、このプラットフォームを使用してドーパント改質された脱溶媒和ガスを容易に適用し、不均一な生体分子と不安定な生体分子との両方の特性評価を改善するために、電荷減少の天然ＭＳを実現することができる。最後に、このｎＬＣ－ＭＳプラットフォームは高感度で堅牢であり、タンパク質薬物の特性評価に日常的に適用することができることが実証されている。

材料。脱イオン水を、ＭｉｌｌｉＰａｋ Ｅｘｐｒｅｓｓ ２０フィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）を備えたＭｉｌｌｉＱ一体型浄水システムによって提供した。ＮＩＳＴ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌ ８６７１（ＮＩＳＴ－ｍＡｂ、ヒト化ＩｇＧ１κモノクローナル抗体）を、米国国立標準技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入した。酢酸アンモニウム（ＬＣ／ＭＳグレード）およびＳｉｇｍａＭＡｂ ＳｉｇｍａＭＡｂ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ （ＡＤＣ） Ｍｉｍｉｃを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ペプチドＮ－グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から購入した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵｌｔｒａＰｕｒｅ １ Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファ、ｐＨ７．５を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から入手した。アセトニトリル（ＡＣＮ）（Ｏｐｔｉｍａ ＬＣ／ＭＳグレード）を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から購入し、水酸化アンモニウム（ＮＨ３）（３０％）を、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）から購入した。２－プロパノール（ＩＰＡ）（ＨＰＬＣグレード）を、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ（Ｍｕｓｋｅｇｏｎ、ＭＩ）から購入した。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４サブクラスの両方を含む他のすべてのモノクローナル抗体を、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）で産生した。

サンプル調製。ｍＡｂ混合物サンプルは、各ｍＡｂに対して５ｍｇ／ｍＬの最終濃度で４つの社内ｍＡｂを混合することによって調製した。混合物の１つのアリコートを、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析の前に、４５℃で１時間、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中のＰＮＧａｓｅ Ｆ（１０μｇのタンパク質当たり１ＩＵＢミリユニット）で処理した。別のアリコートを、サンプル処理なしで直接ｎＩＥＸ－ＭＳ分析にかけた。ＳｉｇｍａＭＡｂ ＡＤＣ模倣物を含むすべての他のｍＡｂサンプルを、ｎＬＣ－ＭＳ分析に投入する前に、水で２～５ｍｇ／ｍＬに希釈した。

ｎＬＣ－ＭＳ方法。すべてのＬＣ分離は、ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＵＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実行した。ｎＳＥＣ－ＭＳ分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（４．６×３００ｍｍ、１．７μｍ、２００Å）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を室温で使用し、０．２ｍＬ／分で１５０ｍＭの酢酸アンモニウムをアイソクラティック溶出した。ｎＩＥＸ－ＭＳ分析では、ＢｉｏＰｒｏ ＩＥＸ ＳＦカラム（４．６ｍｍ×１００ｍｍ、５μｍ）（ＹＭＣ Ｃｏ．，ＬＴＤ．、京都、日本）を４５℃で、２０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ５．６、酢酸で調整）から１５０ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．８）までの線形勾配を伴って、０．４ｍＬ／分で１６分間使用した。脱塩ＳＥＣ－ＭＳ分析では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ２００ ＳＥＣガードカラム（４．６×３０ｍｍ、１．７μｍ、２００Å）（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を室温で、１５０ｍＭの酢酸アンモニウムのアイソクラティック溶出を伴って、次の流量：０．１ｍＬ／分、０．２ｍＬ／分、０．４ｍＬ／分、０．６ｍＬ／分、または０．８ｍＬ／分で使用した。オンライン天然ＭＳ検出を可能にするために、異なる寸法（２０μｍ×１５ｃｍおよび１００μｍ×６５ｃｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ））の２つのＶｉｐｅｒ管を接続するポストカラムにステンレス鋼のティーを適用して、天然ＭＳ検出に対して、異なる分析フローをマイクロフロー範囲（サブμＬ／分）に減少させ（０．８ｍＬ／分以下）、ＵＶ検出（２８０ｎｍ）に対して、残りの高いフローを迂回させた。Ｎａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ（商標）イオン源（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒｅｍｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えたＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＵＨＭＲまたはＥｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ ＥＭＲ質量分析計を天然ＭＳ分析に使用した。マイクロフローを伴うナノエレクトロスプレー（ＮＳＩ）を実現するために、Ｎｅｗｏｍｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｍｕｌｔｉ－ｎｏｚｚｌｅ（Ｍ３）エミッタ（Ｂｅｒｋｌｅｙ、ＣＡ）を適用した。電荷減少天然ＭＳを実現するために、２００ｍＬの様々な改質剤（ＩＰＡ、ＡＣＮ、またはＡＣＮ中の５％アンモニアなど）を含有するＤＵＲＡＮ圧力プラスボトル（１Ｌ）（ＳＣＨＯＴＴ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｉｎｃ．、Ｅｌｍｓｆｏｒｄ、ＮＹ）のヘッドスペースにガスフローを通過させることによって達成される、ドーパント改質された脱溶媒和ガス（２Ｌ／分、窒素）を適用して、ＮＳＩを支援した（図７）。この実施例のすべての実験は、特に指定がない限り、ＩＰＡ支援の天然ＭＳ分析を使用して実行された。ＭＳ分解能は、１２，５００（ＵＨＭＲ）または１７，５００（ＥＭＲ）に設定し、キャピラリスプレー電圧は、３．０ｋＶに設定し、キャピラリ温度は、３５０℃に設定し、ＳレンズＲＦレベルは、２００に設定し、ソース内フラグメンテーションエネルギーは、１００（ＡＤＣ模倣物分析の場合は５０）に設定し、ＨＣＤトラップガス圧力は、３に設定した。質量スペクトルは、２０００～１５０００のｍ／ｚ範囲ウィンドウで取得した。

統合されたｎＬＣ－ＭＳプラットフォーム。ｎＬＣ－ＭＳによるタンパク質薬物の特性評価のために、多くの利点があることから、分析スケールカラム（２．１ｍｍまたは４．６ｍｍのＩ．Ｄ．）を使用した。まず、キャピラリカラムフォーマットと比較して、分析スケールカラムの選択肢がはるかに豊富であるため、特にこれらの困難な分子の方法開発が容易になる。さらに、分析スケールカラムは堅牢性とスループットに優れており、品質管理（ＱＣ）アッセイの光学的検出で広く使用されている。同一の分析カラムでｎＬＣ－ＭＳ分析を実行することにより、移動相の条件は異なるが、キャピラリカラムを使用する場合と比較して、ＱＣアッセイと同等の結果が得られる可能性が高くなる。分析スケール分離で使用される広範囲の流量（０．１～０．８ｍＬ／分）に対処するために、ポストカラム分割戦略を適用して、流量を、ＮＳＩ用のマルチノズルエミッタ（Ｍ３）で容易に対応することができる範囲（１０μＬ／分未満）に減少させた（図７）。分割比は、主に、ステンレス鋼のティーに接続された異なる寸法の２つの固定Ｖｉｐｅｒ管によって制御され（図７）、この調査でテストされたすべてのｎＬＣ方法に対して変更されないようにした。注目に値するのは、Ｍ３エミッタのマルチノズル設計は、サブマイクロフローをＮＳＩの前に８つのノズルに分割することによって流量をさらに減少させるため、サブマイクロ流量でＮＳＩを実行することの成功に関連していることである。一方、ＮＳＩを適用すると、ソフトイオン化のソース条件の厳しさが軽減されるだけでなく、ＭＳ感度が大幅に向上し、多種多様なｎＬＣ方法（例：ＳＥＣ、ＩＥＸ、ＨＩＣ）に対応するための鍵となる高塩濃度に対する耐性が向上する。さらに、他の大多数のＮＳＩセットアップとは異なり、このＭ３エミッタベースのアプローチでは、内蔵の脱溶媒和ガスラインを介して脱溶媒和ガスをスプレーエミッタに適用することを可能にし（図７）、これは、スプレー安定性と脱溶媒和効率の向上に役立つ。さらに、これはまた、脱溶媒和ガスの改質を通じてプラットフォームの汎用性をさらに拡大する機会を提供した。例えば、脱溶媒和ガスに、電荷減少能力を備えた揮発性有機改質剤をドープするだけで（図７）、天然ＭＳ分析でオンライン電荷減少を簡単に実現することができる。このプラットフォームは、カスタマイズなしですべて簡単にアクセス可能な部品で構築されていたため、一貫したパフォーマンスのために簡単に保守することができる。次の段落では、このｎＬＣ－ＭＳプラットフォームの汎用性、感度、および堅牢性を実証するために、広範な評価を実行した。

ｎＬＣ統合のためのプラットフォームの汎用性。ｎＬＣ－ＭＳ分析に異なるｎＬＣ方法（ＳＥＣ、ＩＥＸ、ＨＩＣなど）を採用する場合、最高のクロマトグラフィ性能を実現するには、移動相で使用される揮発性塩濃度およびＬＣ流量を最適化する必要がある。したがって、開発されたｎＬＣ－ＭＳプラットフォームは、異なるｎＬＣ－ＭＳ用途に対応するために、広範囲のＬＣ流量と塩濃度を処理することができることが望ましい。異なる流量および塩濃度に対するこのｎＬＣ－ＭＳプラットフォームの耐性を評価するために、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣガードカラム（４．６ｍｍ×３０ｍｍ）を使用した迅速なオンライン脱塩ステップ後にｍＡｂ１サンプルの天然ＭＳ分析を実行することにより、２つのテストを実施した。まず、移動相として１５０ｍＭ酢酸アンモニウムを使用し、注入量を１０μｇとして、０．１～０．８ｍＬ／分の範囲の５つの異なる流量をテストした。スプリット設定またはＭＳソースパラメータを変更せずに、５つの流量から生成されたトータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）はすべて、良好なシグナル強度、スプレー安定性、および対応するＵＶプロファイルとの高い類似性を示した（図８Ａ）。特に、ＵＶピークとＴＩＣピークの相対強度は、一般に異なる流量で相互に相関しており、脱溶媒和が不十分なために、より高い流量でのＮＳＩ－ＭＳ感度が損なわれなかったことを示している。さらに、これら５つの条件下で得られた平均生ＭＳスペクトルはすべて、対称性の高いｍ／ｚピークと優れた信号対雑音比を示し（図１２Ａおよび１２Ｂ）、テストした最速の流量（０．８ｍＬ／分）でも十分な脱溶媒和を示している。これらの観察結果は、この開発されたｎＬＣ－ＭＳプラットフォームが０．１～０．８ｍＬ／分のＬＣ流量に十分耐えることができることを示しており、これは、ｎＬＣ－ＭＳ用途の大部分で十分なはずである。さらに、このプラットフォームで高速かつ効率的な脱塩を行うために、短いＳＥＣカラムで高流量を操作することに成功したことで、天然ＭＳベースのハイスループットスクリーニング用途に大きい期待が寄せられたことは注目に値する。概念実証として、３つの異なる濃度（０．０５、０．５、および５μｇ／μＬ）の２μＬのｍＡｂ２サンプルをそれぞれ３０回繰り返して注入し、０．８ｍＬ／分で分析し、その結果のＴＩＣを図８Ｂに示した。適用される高流量のため、注入間のデューティサイクルは、４２秒と短く、これは１日当たり約２，０５０サンプルのスループットに相当する。一部の直接注入ベースのＭＳプラットフォームと比較した場合、達成されるスループットはそれほど高くないが、このＳＥＣ－ＭＳベースのアプローチは、最小限のサンプル処理で普及し、ベンチワーク時間を節約するだけでなく、サンプル調製によって誘発されるアーティファクトを導入するリスクも軽減する。さらに、３０回の繰り返し分析では、変動係数の値が低いことから明らかなように（０．１、１、および１０μｇの注入量でそれぞれ、１７％、５％、および４％のＣＶ）、優れたＭＳ感度と再現性の両方が示された。０．１μｇ注入の分析でＣＶが高くなったのは、繰り返し注入による針の吸着によるサンプル損失の結果として、ストックタンパク質濃度が徐々に低下した（０．０５μｇ／μＬ）ためである可能性があった。

２番目のテストでは、流量を０．４ｍＬ／分に維持し、移動相の酢酸アンモニウム濃度を変更することにより、同じ脱塩ＳＥＣ－ＭＳ方法を使用してプラットフォームの塩濃度に対する耐性も評価した。実用的な考慮事項として、１５０ｍＭ～６００ｍＭの範囲の酢酸アンモニウム濃度をＭＳ感度とスペクトル品質との両方への影響について調査した。図９Ａに示すように、高いＭＳ強度は、各塩濃度（１５０、３００、４５０、および６００ｍＭ）でのｍＡｂ１の３回の分析で一貫して達成された。おそらく塩濃度が高いとイオン化の効率が低下するため、塩濃度の増加とともにＭＳ強度の顕著な低下が観察されたが、ほとんどのｎＬＣ－ＭＳ用途ではＭＳシグナル全体で十分であると考えられた。さらに、６００ｍＭの塩濃度で取得したｍＡｂ１の天然ＭＳスペクトルを詳しく調べると、対称性の高いｍ／ｚピークと良好な信号対雑音比を備えた、優れたスペクトル品質が実証された（図９Ｂ）。Ｆｃ Ｎ－グリコシル化のマクロおよびミクロの不均質性に起因する異なるグリコフォームは、十分に分離され、高い質量精度で確実に割り当てることができる。最後に、評価された酢酸アンモニウム濃度範囲（１５０～６００ｍＭ）は、ｎＩＥＸ－ＭＳおよびｎＳＥＣ－ＭＳなどのほとんどのｎＬＣ－ＭＳ用途を可能にするのに十分であり、そのほとんどは、２０～２００ｍＭのアンモニウム系塩を含有する移動相を使用して開発および報告されたことは注目に値する。テストされた範囲内の塩濃度を使用してｎＨＩＣ－ＭＳ分析を可能にするために、我々のグループによって最近導入されたメイクアップおよび分割フロー戦略３４を適用することができる。簡単に説明すると、ポストカラムに希釈液フロー（水）を導入することにより、ＨＩＣ移動相（最大３Ｍ酢酸アンモニウム）を天然ＭＳ検出の前に６倍（最大５００ｍＭ）に希釈することができる。この戦略を適用して、複数のｍＡｂサンプルのｎＨＩＣ－ＭＳ分析がこのプラットフォームで実行され、高品質のデータが一貫して取得された（図１３Ａおよび１３Ｂ）。したがって、開発されたｎＬＣ－ＭＳプラットフォームは、ほとんどのｎＬＣ－ＭＳ用途をサポートするために多用途に適用することができる。

オンライン電荷減少天然ＭＳ分析のためのプラットフォームの汎用性。電荷減少は、不安定なタンパク質複合体または高度に不均一なタンパク質サンプルの天然ＭＳ分析を容易にするために頻繁に使用される戦略である。電荷減少により、タンパク質複合体に存在する非共有相互作用は、クーロンの反発力が減少するため、天然ＭＳ分析中に保存されやすくなる。さらに、電荷状態エンベロープをより高いｍ／ｚ領域にシフトすることにより、隣接する電荷状態間の空間分解能を大幅に向上させることができるため、スペクトルの複雑さが軽減される。電荷減少天然ＭＳを可能にする最も一般的なアプローチは、ＥＳＩの前に、イミダゾールまたはトリエチルアミン（ＴＥＡ）などの電荷減少試薬をバルク分析物溶液に添加することである。この開発されたｎＬＣ－ＭＳプラットフォームを使用すると、脱溶媒和ガスに様々な有機改質剤をドープすることにより、電荷減少天然ＭＳをオンラインで簡単に実現することができる。３つの異なる改質剤（ＩＰＡ、ＡＣＮ、およびＡＣＮ中の５％（ｖ／ｖ）アンモニア）の電荷減少効果を評価するために、６．８～８．５の範囲のｐＩを有する４つの異なるｍＡｂの混合物を、ドーパント改質された脱溶媒和ガスを使用してｎＳＥＣ－ＭＳ分析とｎＩＥＸ－ＭＳ分析の両方で分析した。続いて、各電荷減少条件下での各ｍＡｂの平均電荷状態を計算し、脱溶媒和ガスとして未修飾窒素を使用して実行した対照実験の平均電荷状態と比較した（図１０Ａ～１０Ｃ）。この調査では、ｍＡｂ分析物（例：ｐＩが異なる）、ＮＳＩの溶媒条件（例：ＩＥＸ勾配からのｐＨおよび塩濃度が異なる）、またはｎＬＣ方法（例：ＳＥＣとＩＥＸ）に関係なく、一貫した順序の電荷減少能力が観察され、ＡＣＮ／ＮＨ３（ＡＣＮ中の５％アンモニア）が最大の電荷減少（約９．５電荷）をもたらし、次にＡＣＮ（約８電荷）およびＩＰＡ（約５電荷）が続いた。

電荷減少はまた、全体的なＭＳ強度の対応する減少につながり（図１０Ａ～１０Ｃ）、これは、オービトラップ機器によるより大きいｍ／ｚイオンの効率の低い透過と検出に起因する可能性があった。それにもかかわらず、ＡＣＮ／ＮＨ３改質された脱溶媒和ガスによって達成される、最大の電荷減少条件下でも、５μｇのｍＡｂサンプルの分析からの全体的なＭＳ強度は、高品質のＭＳスペクトルでＥ８レベルに達する可能性がある（図１４Ａ～１４Ｃ）。一度ＭＳ機器に導入されると除去が困難なＴＥＡとは異なり、このアプローチによる電荷減少は、完全に汚染がないとみなされることは注目に値する。興味深いことに、脱溶媒和ガスをＩＰＡまたはＡＣＮで改質すると、ＮＳＩ中の脱溶媒効率も向上し、これにより、長時間の分析で形成される傾向のある付加物の形成が最小限に抑えられ、その結果、スペクトル品質が向上し（図１５）、長期的なスプレー安定性が向上することがわかった。このため、このプラットフォーム上のすべてのｎＬＣ－ＭＳ用途には、デフォルトで最も穏やかな電荷減少改質剤ＩＰＡを適用した。

オンライン電荷減少天然ＭＳを実現する能力は、不安定なおよび／または不均一なタンパク質薬物の分析に役立つ。例えば、Ｃｙｓ結合抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、鎖間ジスルフィド結合の欠如による気相での不安定性、および異なる数のペイロードから生じる高い質量の不均質性のために、インタクトなタンパク質分析に課題を提示することがよくある。モデルシステムとしてＳｉｇｍａＭａｂ ＡＤＣ模倣物を使用して、Ｃｙｓ結合ＡＤＣの天然ＭＳ分析にオンライン電荷減少を適用することの利点を評価した（図６および１１）。このＡＤＣ模倣物は、ＩｇＧ１ ｍＡｂから鎖間ジスルフィド結合Ｃｙｓ残基にコンジュゲートした０～４ペアのペイロード（約６６８Ｄａ）を有する薬物負荷種の混合物からなる。分子からＦｃ Ｎ－グリコシル化を除去せずに、オンライン電荷減少の有無にかかわらず、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析を実行した。電荷減少なしに分析すると、最小のソース内エネルギー（ＳＩＤ＝５０ｅＶ）を適用しても、非共有ＡＤＣ複合体の解離が容易に観察され、高電荷の軽鎖（ＬＣ）種および電荷ストライプのＨ２Ｌ種（図６）が形成されることにつながる。対照的に、ＡＣＮ／ＮＨ_３支援電荷減少が適用された場合、そのような解離イベントは、より高いソース内エネルギーが適用された場合でも劇的に削減された（ＳＩＤ＝１００ｅＶ、効率的な脱溶媒和に最適化）（図６）。インタクトなＡＤＣに対するＬＣの相対ＭＳ強度を計算することにより、この解離傾向は、電荷減少時に８．３％～０．４％に減少すると推定された。気相でのＡＤＣ複合体のこの安定性の向上は、低電荷状態でのクーロン反発の減少、および蒸発冷却によるイオンの内部エネルギーの減少（電荷減少試薬による）に起因する可能性がある。さらに、異なる数のペイロードによって導入された質量の不均質性の増加により、電荷減少なしで、異なるＤＡＲ（薬物対抗体比）種の電荷状態エンベロープが特定のｍ／ｚ領域で重なった。例えば、ＤＡＲ８種の＋３０、＋２９、および＋２８の電荷状態は、それぞれ、ＤＡＲ０種の＋２９、＋２８、および＋２７の電荷状態と同様のｍ／ｚ領域に現れた（図６）。このようなｍ／ｚの重なりは、スペクトルのデコンボリューションを困難にする可能性があり、その場合、デコンボリューション後にＤＡＲ０種は検出されなかった（図１１、下のパネル）。対照的に、ＡＣＮ／ＮＨ_３支援電荷減少では、電荷状態エンベロープ全体がより高いｍ／ｚ領域にシフトし、隣接する電荷状態間の空間分解能が大幅に向上した。その結果、異なるＤＡＲ種の電荷状態間（例えば、ＤＡＲ８のｚ＝＋２０とＤＡＲ０のｚ＝＋１９）の重なりは観察されず（図６）、確実なスペクトルデコンボリューションが容易になった（図１１、上のパネル）。Ｃｙｓ結合ＡＤＣの場合、平均ＤＡＲを正確に測定し、ペイロード分布を特性評価するために、望ましくない鎖の解離とスペクトルの重なりの両方を最小限に抑えることが重要である。気相での鎖の解離は、高ＤＡＲ種の優先的な解離のために、平均ＤＡＲの過小評価につながる可能性がある。スペクトルの重なりは、デコンボリューション中にあいまいさまたは情報の損失につながる可能性がある。この実施例では、２つの条件下で得られた平均ＤＡＲ値は同等であったが（電荷減少法のＤＡＲ＝４．３と制御法のＤＡＲ＝４．２）、ペイロードの分布は異なっていた。電荷減少がなければ、ＤＡＲ０種はデコンボリューション後に観察されなかったが、高ＤＡＲ種の相対的な存在量は、それらの優先的な解離のために過小評価された。これらの２つの原因は、反対方向の平均ＤＡＲ計算に影響を与え、同等の平均ＤＡＲにつながった。ただし、電荷減少条件下でのみ、このＣｙｓ－ＡＤＣ模倣物の平均ＤＡＲとペイロード分布の両方が正確に特性評価された。

プラットフォームの感度およびダイナミックレンジ。タンパク質薬物の不均質性の詳細な特性評価には、分析方法からの高感度と広いダイナミックレンジの両方が必要である。前者は、最小限のサンプル消費で特性評価を達成することを可能にし、後者は、それらの少量の変異体の特定を可能にする。開発したｎＬＣ－ＭＳプラットフォームの感度とダイナミックレンジを評価するために、ＮＩＳＴｍＡｂリファレンススタンダードをテスト項目として使用して、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析とｎＩＥＸ－ＭＳ分析の両方を行った。サンプル処理を行わずに、１０μｇのＮＩＳＴｍＡｂをＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（４．６ｍｍ×３００ｍｍ）に注入した後、ＩＰＡ支援天然ＭＳ分析を行った。ｎＳＥＣ－ＭＳ分析のＴＩＣにより、メインピークから分離または部分的に分離された２つの高分子量（ＨＭＷ）ピークと２つの低分子量（ＬＭＷ）ピークが明らかになった（図３）。約１Ｅ９の総イオン強度で検出されたメインピークは、ＮＩＳＴｍＡｂモノマーに起因していた。ＵＶベースの定量化に基づいてそれぞれ約０．１％と約１．３％で存在するＨＭＷピーク１とＨＭＷピーク２は、両方ともＮＩＳＴｍＡｂの二量体型として割り当てられ、これらは、異なるコンフォメーションのためにＳＥＣによって分離されたと考えられた。特に、このような低レベルでも、これら２つの二量体種について高品質のＭＳデータが得られ、デコンボリューション後にグリコフォーム分解された質量ピークを示した（図３、挿入図）。さらに、２つのＬＭＷピークも優れたスペクトル品質を示し、上側のヒンジ領域で発生する一連のクリッピングイベントに起因する２つの相補フラグメントとして明確に特定された（図３、挿入図）。続いて、報告されている強陽イオン交換法をこのｎＬＣ－ＭＳプラットフォームに採用することにより、１０μｇの未処理のＮＩＳＴｍＡｂのｎＩＥＸ－ＭＳ分析を実施した。同じ短縮されたｍＡｂフラグメントを含む、非常に異なるレベルで存在する複数の電荷変異体種はすべて、高品質のＭＳデータに基づいて確実に特定された（図１６－１および１６－２）。最後に、これら２つのｎＬＣ－ＭＳ方法によって特定されたＮＩＳＴｍＡｂのサイズと電荷の変異体はすべて、対応するＵＶピークによって定量化された相対存在量とともに図１８にまとめた。マイナー種は、約０．０２％までのレベルで容易に検出することができるため、この開発されたｎＬＣ－ＭＳプラットフォームにｎＳＥＣ－ＭＳ方法とｎＩＥＸ－ＭＳ方法の両方を適用し、注入量を１０μｇＮＩＳＴｍＡｂにすることで、約４桁のダイナミックレンジを実現することができる。最後に、１０μｇの注入からのマイナー種の０．０２％がカラムでの絶対量２ｎｇを表すため、このプラットフォームも高感度であるとみなされ、ＭＳベースの生体分析用途に役立つ可能性がある。

プラットフォームの堅牢性。堅牢性は、工業ラボでの日常的な用途の分析方法を開発する際のもう１つの主要な考慮事項である。特に、ｎＬＣ－ＭＳ方法は、ＭＳイオン源に塩水溶液を継続的に導入するため、分析時間を延長してもスプレー安定性と信号強度を維持することが困難になる。開発したｎＬＣ－ＭＳプラットフォームを連続分析に適用することができるかどうか、およびスプレー安定性と方法感度を長期間維持することができるかどうかを評価するために、ｍＡｂ分子のｎＳＥＣ－ＭＳ分析とｎＩＥＸ－ＭＳ分析の両方を２４時間にわたって繰り返し実行し、それぞれ５０回超の実行をなす。図１７に示すように、２４時間にわたって良好な信号強度と安定性が達成され、ｎＳＥＣ－ＭＳ分析とｎＩＥＸ－ＭＳ分析のＣＶ値はそれぞれ６．０％と４．１％であった。このｎＬＣ－ＭＳプラットフォームによって達成された高い堅牢性は、マルチノズルエミッタとＩＰＡ支援天然ＭＳとの両方の用途に起因する可能性がある。前者は、ＮＳＩに導入される液滴のサイズを縮小するだけでなく、タンパク質の沈殿と蓄積による目詰まりのリスクを軽減する。ＩＰＡ支援天然ＭＳは、おそらく液滴の表面張力を低下させることにより、脱溶媒和効率をさらに向上させる。

結論
タンパク質薬物の特性評価に様々なｎＬＣ－ＭＳ方法を適用することへの関心と需要が高まっているため、産業ラボ用途に好適なｎＬＣ－ＭＳプラットフォームの開発は、バイオ医薬品コミュニティにとって非常に興味深いものである。この実施例では、様々なｎＬＣ方法と簡単に統合することができ、優れた汎用性、感度、および堅牢性を備えた新しいｎＬＣ－ＭＳプラットフォームの開発について説明する。革新的な設計により、開発されたプラットフォームは、広範囲のＬＣ流量（０．１～０．８ｍＬ／分）を処理し、高塩濃度（移動相で最大６００ｍＭ）に耐えることができ、それと同時に様々なｎＬＣ方法に対応する点で達成された汎用性に寄与することが実証された。次に、このプラットフォームでオンライン電荷減少天然ＭＳを実現するために、異なるドーパント改質された脱溶媒和ガスを検討した。続いて、Ｃｙｓ結合ＡＤＣ模倣物のケーススタディは、不安定なおよび／または不均一なタンパク質分子を特性評価するために電荷減少天然ＭＳを適用することの適合性と利点を示した。さらに、ＮＩＳＴｍＡｂのサイズと電荷の不均質性の詳細な特性評価は、このプラットフォームを使用したｎＳＥＣ－ＭＳ分析とｎＩＥＸ－ＭＳ分析の両方によって達成され、広いダイナミックレンジと優れた感度を示した。さらに、このｎＬＣ－ＭＳプラットフォームは、非常に堅牢であることが証明されているため、長時間（２４時間超）にわたる連続分析に好適である。最後に、現在のプラットフォームはすべて市販部品で構築されていたため、一貫したパフォーマンスを実現するために他のラボで簡単に実装することができる。

全体として、異なるケーススタディでのモノクローナル抗体サンプルの分析について本明細書に実証されているように、開発されたアプローチは、従来のアプローチと比較してより効率的な方式を提供し、薬剤開発の異なる段階でのモノクローナル抗体の特性評価に対するますます高まる要求をより適切にサポートする。

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な変更は、前述の記載および添付の図から当業者には明らかであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (41)

1. 天然液体クロマトグラフィ質量分析システムであって、
   サンプルを分離することができる液体クロマトグラフィシステムと、
   前記液体クロマトグラフィシステムと流体連通するエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）システムと、を備え、前記ＥＳＩ－ＭＳシステムが、マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタと、脱溶媒和ガスを改質するためのシステムと、質量分析計と、を備え、前記質量分析計が、イオンを受け取り、イオンの質量対電荷比を特性評価するように構成されている、天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
2. 脱溶媒和ガスを改質するための前記システムが、キャップを有する容器を備え、前記キャップが、入口ラインポートおよび出口ラインポートと、前記入口ラインポートにシースガスを供給するためのシースガス入口ラインと、改質された脱溶媒和ガス出口ラインであって、前記改質された脱溶媒和ガスの出口ラインポートを前記マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタに接続することができる、改質された脱溶媒和ガス出口ラインと、を有する、請求項１に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
3. 前記容器が、有機溶媒および追加の化学成分を含む、請求項２に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
4. 前記追加の化学成分が、酸である、請求項３に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
5. 前記酸が、トリフルオロ酢酸である、請求項４に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
6. 前記追加の化学成分が、塩基である、請求項３に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
7. 前記塩基が、トリエチルアミンである、請求項６に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
8. 前記有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項３～７のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
9. 前記シースガスが、窒素である、請求項２～８のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
10. 前記シースガス入口ラインが、前記入口ラインポートに部分的に挿入されている、請求項２～９のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
11. 前記改質された脱溶媒和ガス出口ラインが、前記出口ラインポートに部分的に挿入されている、請求項２～１０のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
12. 前記シースガスが、前記シースガス入口ラインから、有機溶媒を収容する前記容器を通って前記脱溶媒和ガス出口ラインに流れる、請求項２～１１のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
13. 前記マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタが、８つのノズルを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
14. 前記液体クロマトグラフィシステムが、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムを備える、請求項１～１３のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
15. 前記液体クロマトグラフィシステムが、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＸ）カラムを備える、請求項１～１３のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
16. 前記液体クロマトグラフィ質量分析システムが、前記液体クロマトグラフから前記質量分析計への流量を調整するための分析フロースプリッタをさらに備える、請求項１～１５のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
17. 前記分析フロースプリッタが、約１～５μＬ／分の溶媒流量でエレクトロスプレーを提供することができる、請求項１６に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
18. 前記質量分析計が、オービトラップ質量分析計を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の天然液体クロマトグラフィ質量分析システム。
19. サンプル中のタンパク質を特性評価する方法であって、
    サンプルの分離および断片化が可能な液体クロマトグラフィシステムに前記サンプルを供給することと、
    前記液体クロマトグラフィシステムと流体連通するエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）システムを使用して、前記断片化されたサンプルを分析することと、を含み、前記ＥＳＩ－ＭＳシステムが、マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタと、脱溶媒和ガスを改質するためのシステムと、質量分析計と、を備え、前記質量分析計が、イオンを受け取り、イオンの質量対電荷比を特性評価し、前記タンパク質の成分を識別して前記タンパク質を特性評価するように構成されている、方法。
20. 前記タンパク質が、抗体、融合タンパク質、組換えタンパク質、またはこれらの組み合わせである、請求項１９に記載の方法。
21. 前記抗体が、モノクロ－ナル抗体である、請求項２１に記載の方法。
22. アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプの前記モノクローナル抗体、請求項２２に記載の方法。
23. 前記方法が、前記サンプルを前記液体クロマトグラフィシステムに供給する前に、前記サンプル中の前記タンパク質の脱グリコシル化を必要としない、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記方法が、高分子量および低分子量の不純物を特性評価するためのものである、請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法。
25. 脱溶媒和ガスを改質するための前記システムが、キャップを有する容器を備え、前記キャップが、入口ラインポートおよび出口ラインポートと、前記入口ラインポートにシースガスを供給するためのシースガス入口ラインと、改質された脱溶媒和ガス出口ラインであって、前記改質された脱溶媒和ガスの出口ラインポートを前記マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタに接続することができる、改質された脱溶媒和ガス出口ラインと、を有する、請求項１９～２５のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記容器が、有機溶媒および追加の化学成分を含む、請求項２６に記載の方法。
27. 前記追加の化学成分が、酸である、請求項２７に記載の方法。
28. 前記酸が、トリフルオロ酢酸である、請求項２８に記載の方法。
29. 前記追加の化学成分が、塩基である、請求項２７に記載の方法。
30. 前記塩基が、トリエチルアミンである、請求項３０に記載の方法。
31. 前記有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記シースガスが、窒素である、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記シースガス入口ラインが、前記入口ラインポートに部分的に挿入されている、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
34. 前記改質された脱溶媒和ガス出口ラインが、前記出口ラインポートに部分的に挿入されている、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記シースガスが、前記シースガス入口ラインから、有機溶媒を収容する前記容器を通って前記脱溶媒和ガス出口ラインに流れる、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の方法。
36. 前記マルチノズルエレクトロスプレーイオン化エミッタが、８つのノズルを含む、請求項２６～３６のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記液体クロマトグラフィシステムが、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラムを備える、請求項１９～３７のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記液体クロマトグラフィシステムが、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＸ）カラムを備える、請求項１９～３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記液体クロマトグラフから前記質量分析計への流量を調整するための分析フロースプリッタをさらに備える、請求項２９～３９のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記分析フロースプリッタが、約１～５μＬ／分の溶媒流量でエレクトロスプレーを提供することができる、請求項４０に記載の方法。
41. 前記質量分析計が、オービトラップ質量分析器を含む、請求項１９～４１のいずれか一項に記載の方法。

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