KR20220133942A

KR20220133942A - 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석용 플랫폼

Info

Publication number: KR20220133942A
Application number: KR1020227029432A
Authority: KR
Inventors: 순하이 왕; 유에티안 얀
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2020-01-30
Filing date: 2021-01-29
Publication date: 2022-10-05
Also published as: US11598756B2; WO2021155215A1; CA3166301A1; JP2023512521A; EP4097464A1; US20210239661A1; MX2022009356A; CN115210564A; BR112022015097A2; AU2021214764A1; US20230266286A1; IL294864A

Abstract

네이티브(native) 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템 및 사용 방법이 개시된다. 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템은, 샘플을 분리할 수 있는 액체 크로마토그래피 시스템; 및 상기 액체 크로마토그래피 시스템과 유체 연통하는 전자분무 이온화 질량 분석(ESI-MS) 시스템을 포함하며, 상기 ESI-MS 시스템은 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터, 탈용매화 가스를 변형하기 위한 시스템, 및 질량 분석계를 포함하고, 상기 질량 분석계는 이온을 수용신하고 이온의 질량 대 전하 비를 특성화하도록 구성된다.

Description

네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석용 플랫폼

본 발명은 단백질을 특성화하는 시스템 및 방법, 특히 단백질 바이오의약품(biopharmaceutical)과 같은 단백질 특성화를 위한 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MC) 플랫폼에 관한 것이다.

크로마토그래피 및 전기영동 분리 기술과 결합된 전자분무 이온화(ESI)-질량 분석(MS)은 단백질체학(proteomics)의 핵심 기술이다. 그것은 개발 및 규제 파일링(filing)을 지원하기 위해 분석 실험실에서 단백질 바이오의약품의 심층 특성화를 위한 중요한 도구가 되었다. 단백질 바이오의약품은 매우 높은 순도 기준을 충족해야 하며, 따라서 약물 개발 및 생산의 다양한 단계 동안 단백질을 모니터링하고 특성화하는 것은 중요하다.

단백질 바이오의약품의 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 기반 분석은 개선된 데이터 품질로부터 엄청난 이점을 얻을 수 있으며, 이는 결과적으로 더 높은 신뢰도 및 더 적은 모호성을 갖는 개선된 약물 특성화로 이어질 수 있다. 다양한 단백질 속성의 특성화를 제공하기 위해 매우 다양한 LC-MS 기반 분석을 수행할 수 있으며, 그 내에서는 펩티드 매핑 분석 및 온전한 질량 분석이 가장 일상적이고 광범위하게 적용된다. 분석의 신뢰도를 개선하고 데이터 해석과 관련된 모호성을 줄이기 위해, 최적화된 실험 절차, 미세 조정된 기기 파라미터 및 더욱 진보된 질량 분석계 사용을 포함하여 LC-MS 분석으로부터의 데이터 품질을 개선하기 위한 끊임없는 노력이 필요하다.

일 양태에서, 본 발명은 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템으로서, 샘플을 분리할 수 있는 액체 크로마토그래피 시스템; 및 상기 액체 크로마토그래피 시스템과 유체 연통하는 전자분무 이온화 질량 분석(ESI-MS) 시스템을 포함하며, 상기 ESI-MS 시스템은 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터, 탈용매화 가스를 변형(modifying)하기 위한 시스템, 및 질량 분석계를 포함하고, 상기 질량 분석계는 이온을 수용하고 이온의 질량 대 전하 비를 특성화하도록 구성된, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템을 제공한다.

일부 실시형태에서, 탈용매화 가스를 변형하기 위한 시스템은 캡을 갖는 용기를 포함하며, 상기 캡은 입구 라인 포트와 출구 라인 포트; 시스(sheath) 가스를 상기 입구 라인 포트에 제공하기 위한 시스 가스 입구 라인; 및 변형된 탈용매화 가스 출구 라인 포트를 상기 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터에 연결할 수 있는 변형된 탈용매화 가스 출구 라인을 갖는다.

일부 실시형태에서, 용기는 유기 용매 및 추가의 화학 성분을 포함한다.

일부 실시형태에서, 추가 화학 성분은 산이다.

일부 실시형태에서, 산은 트리플루오로아세트산이다.

일부 실시형태에서, 추가 화학 성분은 염기이다.

일부 실시형태에서, 염기는 트리에틸아민이다.

일부 실시형태에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.

일부 실시형태에서, 시스 가스는 질소이다.

일부 실시형태에서, 시스 가스 입구 라인은 입구 라인 포트 내에 부분적으로 삽입된다.

일부 실시형태에서, 변형된 탈용매화 가스 출구 라인은 출구 라인 포트에 부분적으로 삽입된다.

일부 실시형태에서, 시스 가스는 시스 가스 입구 라인으로부터 유기 용매를 함유하는 용기를 통해 탈용매화 가스 출구 라인으로 유동한다.

일부 실시형태에서, 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터는 8개의 노즐을 포함한다.

일부 실시형태에서, 액체 크로마토그래피 시스템은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 포함한다.

일부 실시형태에서, 액체 크로마토그래피 시스템은 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 컬럼을 포함한다.

일부 실시형태에서, 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템은 액체 크로마토그래피로부터 질량 분석계로의 유량을 조정하기 위한 분석 유동 분할기(analytical flow splitter)를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 분석 유동 분할기는 약 1 내지 5 μL/분의 용매 유량을 갖는 전자분무를 제공할 수 있다.

일부 실시형태에서, 질량 분석계는 오비트랩(orbitrap) 질량 분석기를 포함한다.

일부 실시형태에서, 샘플에서 단백질을 특성화하는 방법이 개시되는 바, 본 방법은 샘플 분리 및 단편화를 할 수 있는 액체 크로마토그래피 시스템에 샘플을 공급하는 단계; 및 상기 액체 크로마토그래피 시스템과 유체 연통하는 전자분무 이온화 질량 분석(ESI-MS) 시스템을 사용하여 단편화된 샘플을 분석하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 ESI-MS 시스템은 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터, 탈용매화 가스를 변형하기 위한 시스템, 및 질량 분석계를 포함하고, 상기 질량 분석계는 단백질의 성분을 식별하여 단백질을 특성화하기 위해 이온을 수용하고 이온의 질량 대 전하 비를 특성화하도록 구성된다.

일부 실시형태에서, 단백질은 항체, 융합 단백질, 재조합 단백질, 또는 이들의 조합이다.

일부 실시형태에서, 항체는 단클론(monoclonal) 항체이다.

일부 실시형태에서, 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합 아이소타입의 단클론 항체.

일부 실시형태에서, 방법은 샘플을 액체 크로마토그래피 시스템에 공급하기 전에 샘플에서 단백질의 탈당화(deglycosylation)를 필요로 하지 않는다.

일부 실시형태에서, 방법은 고분자량 및 저분자량 불순물을 특성화하기 위한 것이다.

방법의 일부 실시형태에서, 탈용매화 가스를 변형하기 위한 시스템은 캡을 갖는 용기를 포함하며, 상기 캡은 입구 라인 포트와 출구 라인 포트; 시스 가스를 상기 입구 라인 포트에 제공하기 위한 시스 가스 입구 라인; 및 변형된 탈용매화 가스 출구 라인 포트를 상기 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터에 연결할 수 있는 변형된 탈용매화 가스 출구 라인을 갖는다.

방법의 일부 실시형태에서, 용기는 유기 용매 및 추가의 화학 성분을 포함한다.

방법의 일부 실시형태에서, 추가 화학 성분은 산이다.

방법의 일부 실시형태에서, 산은 트리플루오로아세트산이다.

방법의 일부 실시형태에서, 추가 화학 성분은 염기이다.

방법의 일부 실시형태에서, 염기는 트리에틸아민이다.

방법의 일부 실시형태에서, 유기 용매는 아세토니트릴이다.

방법의 일부 실시형태에서, 시스 가스는 질소이다.

방법의 일부 실시형태에서, 시스 가스 입구 라인은 입구 라인 포트 내에 부분적으로 삽입된다.

방법의 일부 실시형태에서, 변형된 탈용매화 가스 출구 라인은 출구 라인 포트 내에 부분적으로 삽입된다.

방법의 일부 실시형태에서, 시스 가스는 시스 가스 입구 라인으로부터 유기 용매를 함유하는 용기를 통해 탈용매화 가스 출구 라인으로 유동한다.

방법의 일부 실시형태에서, 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터는 8개의 노즐을 포함한다.

방법의 일부 실시형태에서, 액체 크로마토그래피 시스템은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 포함한다.

방법의 일부 실시형태에서, 액체 크로마토그래피 시스템은 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 컬럼을 포함한다.

방법의 일부 실시형태에서, 방법은 액체 크로마토그래피로부터 질량 분석계로의 유량을 조정하기 위한 분석적 유동 분할기를 사용하는 것을 추가로 포함한다.

방법의 일부 실시형태에서, 분석 유동 분할기는 약 1 내지 5 μL/분의 용매 유량을 갖는 전자분무를 제공할 수 있다.

방법의 일부 실시형태에서, 질량 분석계는 오비트랩 질량 분석기를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 상기 또는 본원에서 논의된 실시형태의 임의의 특징 또는 요소들은 조합될 수 있고, 이러한 조합도 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 상기 또는 본원에서 논의된 특정 값은 상기 또는 본원에서 논의된 다른 관련 값과 조합되어 범위의 상한 값과 하한 값을 포함한 범위를 설명할 수 있고, 이러한 범위와 이러한 범위 내에 속하는 모든 값들은 본 개시내용의 범주 내에 포함된다. 상기 또는 본원에서 논의된 각각의 값은 1%, 5%, 10% 또는 20%의 편차를 두고 표현될 수 있다. 예를 들어, 10 mM의 농도는 10 mM ± 0.1 mM(1% 편차), 10 mM ± 0.5 mM(5% 편차), 10 mM ± 1 mM(10% 편차) 또는 10 mM ± 2 mM(20% 편차)로서 표현될 수 있다. 다른 실시형태는 이하의 상세한 설명에서 볼 때 자명할 것이다.

도 1은 민감하고 견고하며 다용성인 네이티브 LC-MS 플랫폼을 제공하는 본원에 개시된 네이티브 LC-MS 플랫폼의 예시적인 실시형태의 개략도이다.
도 2는 본원에 개시된 네이티브 LC-MS 플랫폼의 실시형태에서 사용되는 미세 제조된 모놀리식(monolithic) 다중노즐(M3) 이미터를 보여준다.
도 3은 NISTmAb(10 μg)의 SEC-MS 분석에 의한 플랫폼 감도를 보여준다. 샘플 양의 적은 소비, 10 μg의 NISTmAb 샘플 주입은 약 E9 TIC 강도로 이어진다. IPA-변형된 탈용매화 가스에 의해 지원되는 효율적인 탈용매화로 인한 우수한 데이터 품질. 탈당화의 필요 없이 낮은 존재비 종(low abundance species)(예를 들어, HMW 및 LMW 종)의 민감한 검출. 정확한 질량 측정은 이러한 종의 명확한 식별을 가능하게 한다.
도 4a 및 4b는 NISTmAb의 101회 연속 네이티브 SEC-MS 실행에 의해 입증된 플랫폼 견고성을 보여준다.
도 5a 및 5b는 네이티브 SCX-MS 분석 중에 탈용매화 가스를 변형함으로써 가능하게 된 전하 감소 효과를 보여준다. 도 5a는 전하 감소와 관련된 약간의 TIC 강도 저하를 보여준다. 도 5b는 항체 B에 의해 입증된 전하 감소 효과를 보여준다.
도 6은 이질적 및/또는 불안정한 생체 분자의 전하 감소 지원된 분석을 보여준다. 상단 패널은 전하 감소가 있는 시스테인 ADC 모사체의 네이티브 SEC-MS 분석 결과를 제공하고 하단 패널은 전하 감소가 없는 결과를 제공한다. 예시된 바와 같이, 전하 감소는 개선된 공간 분해능(resolution)으로 인해 전하 상태가 중첩되는 것을 방지하여 질량 이질성이 높은 샘플의 분석을 가능하게 한다. 또한, 전하 감소는 이온화 과정 동안 불안정한 생체 분자(비공유적으로 연결됨)를 보존하는 데 도움이 되었고 원하지 않는 해리 현상(dissociation event)을 최소화하였다.
도 7은 본원에 개시된 실시형태에 따른 nLC-MS 플랫폼을 보여준다.
도 8a는 다양한 유량에서 mAb1의 탈염 SEC-MS 분석으로부터 생성된 UV 및 TIC 추적(trace)을 보여주고;
도 8b는 0.8 mL/분에서 mAb2의 90회 탈염 SEC-MS 실행으로부터의 TIC 추적을 보여준다. 각 주입량(0.1, 1, 10 μg)을 30회 반복하여 분석하였다. 삽입된 부분은 4개의 탈염 SEC-MS 실행을 함유하는 확대 영역을 표시한다.
도 9a 및 9b는 mAb1의 탈염 SEC-MS 분석을 보여준다. 도 9a는 이동상으로서 150, 300, 450 및 600 mM의 암모늄 아세테이트를 사용하여 얻은 MS 신호 강도(왼쪽 y축)와 질량 정확도(오른쪽 y축)를 비교한 것이다(각각 3중 분석). 도 9b는 600 mM의 암모늄 아세테이트를 사용하여 획득한 mAb1의 원시(raw) 질량 스펙트럼의 예이며, Fc N-당화의 거대 및 미세 이질성으로 인한 다양한 글리코형(glycoform)의 성공적인 검출을 보여준다.
도 10a는 다양한 전하 감소 조건에서 얻은 mAb5의 대표적인 네이티브 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 10b 및 10c는 4개의 mAb 혼합물 샘플의 nSEC-MS 및 nIEX-MS 분석을 수행함으로써 온라인 전하 감소 능력에 대한 다양한 유기 변형제(modifier)의 평가를 보여준다. 각 mAb 분자의 MS 강도(왼쪽 y축) 및 평균 전하 상태(오른쪽 y축)를 3중으로 측정하고 각 조건에서 플로팅한다.
도 11은 디콘볼루션된(deconvoluted) 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 12a 및 12b는 0.1, 0.2, 0.4, 0.6 및 0.8 mL/분의 이동상 유량을 사용하여 mAb1의 탈염 SEC-MS 분석으로부터 네이티브 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 13a 및 13b는 네이티브 LC-MS 플랫폼에서 구성 분할 유동 전략(make-up splitting flow strategy)을 사용하여 다양한 mAb의 9개의 연속 네이티브 HIC-MS 분석의 TIC를 보여준다.
도 14a, 14b 및 14c는 (도 14a) nIEX-TIC, (도 14b) 각 mAb의 주요 피크의 원시 질량 스펙트럼 및 (도 14c) 원시 질량 스펙트럼으로부터 z=7의 확대 보기를 보여주는 mAb 혼합물의 ACN/NH3 지원된 nIEX-TIC 분석을 보여준다.
도 15는 변형되지 않은 탈용매화 가스(상단 패널) 또는 IPA-변형된 탈용매화 가스(하단 패널)를 사용한 장기간 분석(> 24시간) 후 nLC-MS 플랫폼에서 획득한 mAb2의 네이티브 질량 스펙트럼을 보여준다.
도 16-1 및 16-2는 주입량이 10 μg인 NISTmAb의 네이티브 SCX-MS 분석을 보여준다.
도 17은 각각 > 24시간 동안 nSEC-MS(상단, 24분 듀티 사이클(duty cycle)) 또는 nIEX-TIC(하단, 30분 듀티 사이클)를 사용하여 연속 분석을 수행함으로써 네이티브 LC-MS 플랫폼의 견고성에 대한 평가를 보여준다.
도 18은 10 μg의 NISTmAb 참조 표준 샘플의 nSEC-MS 및 nl EX-MS 분석으로부터 검출된 크기 및 전하 변이체의 요약을 보여준다.

본 발명에 대해 설명하기 전에, 본 발명은 본원에 기재된 특정 방법과 실험 조건에 제한되지 않으며, 이러한 방법과 조건은 바뀔 수 있다고 이해되어야 한다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하는 목적을 위한 것이며 제한하려는 의도는 아님이 이해되어야 한다. 임의의 실시형태 또는 실시형태의 특징은 서로 조합될 수 있고, 이러한 조합은 본 발명의 범위 내에 명시적으로 포함된다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 숙련자가 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 나열된 특정 수치에 대한 언급에서 사용되는 경우 그 값이 나열된 값과 1% 이하로 달라질 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 본원에서 사용되는 경우, 표현 "약 100"은 99와 101 및 그 사이의 모든 값(예를 들어, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "포함한다(include)", "포함하다" 및 "포함하는"은 비제한적인 것을 의미하며 각각 "포함한다(comprise)", "포함하다" 및 "포함하는"을 의미하는 것으로 이해된다.

본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 이제 설명된다. 본 명세서에서 언급된 모든 특허, 출원 및 비-특허 간행물은 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.

본원에 사용된 약어

ACN: 아세토니트릴

Asn: 아스파라긴

CQA: 중요한 품질 속성

CV: 변동 계수

EIC: 추출된 이온 크로마토그래프

ESI-MS: 전자분무 이온화 질량 분석법

FA: 포름산

FDA: 식품 의약국

FG: 완전 당화

FLR: 형광 검출

HBA: 4-하이드록시벤조산

HC: 중쇄

HIC: 소수성 상호작용 크로마토그래피

HILIC: 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피

HMW: 고분자량

IEX: 이온 교환 크로마토그래피

IgG: 면역글로불린 G

IPA: 이소프로판올

LC: 경쇄

LC-MS: 액체 크로마토그래피-질량 분석법

LMW: 저분자량

mAb: 단클론 항체

MS: 질량 분석법

MW: 분자량

NCE: 정규화된 충돌 에너지

NG: 비-당화

nLC: 네이티브 액체 크로마토그래피

PA: 프로피온산

PG: 부분적 당화

PK: 약동학

PQA: 제품 품질 속성

PTM: 번역 후 변형

RP-LC: 역상 액체 크로마토그래피

SPE: 고체 상 추출

SEC: 크기 배제 크로마토그래피

TCEP-HCl: 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀 염산염

TFA: 트리플루오로아세트산

TMT: 탠덤 매스 태그(Tandem Mass Tag)

UV: 자외선

정의

본원에 사용되는 용어 "단백질"은 공유적으로 연결된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은 당업계에서 일반적으로 "폴리펩티드"로 알려진 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩티드"는 아미노산 잔기, 관련된 자연 발생 구조 변이체, 및 펩티드 결합을 통해 연결된 이의 합성 비-자연 발생 유사체, 관련된 자연 발생 구조 변이체, 및 이의 합성 비-자연 발생 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드"는 비-자연적으로 발생하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어 자동화된 폴리펩티드 합성기(synthesizer)를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고체 상 펩티드 합성 방법이 당업자에게 알려져 있다. 단백질은 단일 기능 생체분자를 형성하기 위해 하나 또는 다수의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 단백질은 생물-치료 단백질, 연구 또는 치료에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 기타 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단클론 항체, 다중클론 항체, 인간 항체 및 이중특이적 항체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 다른 예시적인 양태에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디(nanobody), 재조합 항체 키메라, 시토카인, 케모카인, 펩티드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 단백질은 재조합 세포 기반 생산 시스템, 예컨대 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템(예를 들어, Pichia sp.), 포유동물 시스템(예를 들어, CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 유도체)을 사용하여 생산될 수 있다. 생물치료 단백질 및 이의 생산을 논의하는 최근 검토에 대해 문헌[Ghaderi et al., "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," (Biotechnol. Genet. Eng. Rev. (2012) 147-75)]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 단백질은 변형, 부가물 및 기타 공유 연결된 모이어티를 포함한다. 이러한 변형, 부가물 및 모이어티는 예를 들어 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 글리칸(예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코스, 만노스 및 기타 단당류), PEG, 폴리히스티딘, FLAGtag, 말토스 결합 단백질(MBP), 키틴 결합 단백질(CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) myc-에피토프, 형광 표지 및 기타 염료 등을 포함한다. 단백질은 조성 및 용해도를 기준으로 분류될 수 있으며, 따라서 구형 단백질 및 섬유질 단백질과 같은 단순 단백질; 핵단백질, 당단백질, 뮤코단백질, 발색단백질, 인단백질, 금속단백질 및 지단백질과 같은 복합 단백질; 및 1차 유도 단백질 및 2차 유도 단백질과 같은 유도 단백질을 포함할 수 있다.

본원에 사용되는 "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체", 또는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 표적 단백질과 상이한 단백질을 포함할 수 있다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 단백질을 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 아미노 서열을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 변이체는 모 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어 모체와 비교하여 약 1 내지 약 10개의 아미노산 변형, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 변형을 갖는다. 본원에서 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 모 단백질 서열과 적어도 약 80% 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90% 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 약 95% 상동성을 가질 것이다. 일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 단클론 항체, 또는 이들의 조합일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 2개의 중(H) 사슬 및 2개의 경(L) 사슬로 구성된 면역글로불린 분자(즉, "완전 항체 분자"), 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어 IgM) 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭하도록 의도된다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역("HCVR" 또는 "V_H") 및 중쇄 불변 영역(C_H1, C_H2 및 C_H3 도메인으로 구성됨)으로 구성된다. 다양한 실시형태에서, 중쇄는 IgG 아이소타입일 수 있다. 일부 경우에, 중쇄는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중에서 선택된다. 일부 실시형태에서, 중쇄는 아이소타입 IgG1 또는 IgG4이고, 선택적으로 아이소타입 IgG1/IgG2 또는 IgG4/IgG2의 키메라 힌지 영역을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역("LCVR" 또는"V_L") 및 경쇄 불변 영역(C_L)으로 구성된다. V_H 영역 및 V_L 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 명명되는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각 V_H 및 V_L은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 당화된 및 비-당화된 면역글로불린 둘 모두에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체 분자를 포함한다. 항체 구조에 대한 검토에 대해 문헌[Lefranc et al., IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains, 27(1) Dev. Comp. Immunol. 55-77 (2003)]; 및 문헌[M. Potter, Structural correlates of immunoglobulin diversity, 2(1) Surv. Immunol. Res. 27-42 (1983)]을 참조한다.

용어 항체는 또한 하나 초과의 상이한 에피토프에 결합할 수 있는 이종사량체 면역글로불린을 포함하는 "이중특이적 항체"를 포함한다. 단일 중쇄 및 단일 경쇄 및 6개의 CDR을 포함하는 이중특이적 항체의 절반은 하나의 항원 또는 에피토프에 결합하고, 항체의 나머지 절반은 상이한 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 경우에, 이중특이적 항체는 동일한 항원에 결합할 수 있지만 상이한 에피토프 또는 비-중첩 에피토프에서 결합할 수 있다. 일부 경우에, 이중특이적 항체의 양쪽 절반은 이중특이성을 유지하면서 동일한 경쇄를 갖는다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허출원 공개 제2010/0331527호(2010년 12월 30일)에 기재되어 있다.

항체의 "항원-결합 부분"(또는 "항체 단편")이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편(문헌[Ward et al. (1989) Nature 241:544-546]), (vi) 단리된 CDR, 및 (vii) 합성 링커에 의해 결합되어 단일 단백질 사슬을 형성하는 Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH로 구성되고 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하는 scFv를 포함한다. 디아바디(diabody)와 같은 다른 형태의 단일 사슬 항체가 또한 "항체"라는 용어에 포함된다(예를 들어, 문헌[Holliger et al. (1993) 90 PNAS U.S.A. 6444-6448]; 및 문헌[Poljak et al. (1994) 2 Structure 1121-1123] 참조).

또한, 항체 및 이의 항원-결합 단편은 당업계에 일반적으로 알려진 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 얻을 수 있다(문헌[Sambrook et al., 1989] 참조). 형질전환 마우스(transgenic mouse)에서 인간 항체를 생성하는 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, VELOCIMMUNE® 기술(예를 들어, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE® 참조) 또는 단클론 항체를 생성하기 위한 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여, 원하는 항원에 대한 높은 친화성 키메라 항체는 초기에 단리되어 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는다. VELOCIMMUNE® 기술은, 마우스가 항원 자극에 반응하여 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 항체를 생성하도록 내인성 마우스 불변 영역 유전자좌에 작동 가능하게 연결된 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스의 생성을 포함한다. 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 단리되고, 인간 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 그 다음 DNA는 완전한 인간 항체를 발현할 수 있는 세포에서 발현된다.

용어 "인간 항체"는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에서 유래된 가변 영역 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 mAb는 예를 들어 CDR, 특히 CDR3에서 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이생성 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "인간 항체"는 다른 포유동물 종(예를 들어 마우스)의 생식계열에서 유래된 CDR 서열이 인간 FR 서열 상에 이식되었던 mAb를 포함하도록 의도되지 않는다. 상기 용어는 비-인간 포유류에서 또는 비-인간 포유류의 세포에서 재조합적으로 생성된 항체를 포함한다. 상기 용어는 인간 대상체로부터 단리되거나 인간 대상체에서 생성된 항체를 포함하려고 의도하지 않는다.

본원에 사용되는 용어 "대상체"는 예를 들어 질병 또는 장애의 개선, 예방 및/또는 치료가 필요한 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 지칭한다.

본원에 사용되는 용어 "불순물"은 바이오의약품 제품에 존재하는 임의의 바람직하지 않은 단백질을 포함할 수 있다. 불순물은 공정 및 제품 관련 불순물을 포함할 수 있다. 불순물은 또한 알려진 구조, 부분적으로 특성화되거나 식별되지 않은 것일 수 있다. 공정 관련 불순물은 제조 공정에서 유래할 수 있으며 세포 기질 유래, 세포 배양 유래 및 다운스트림 유래의 세 가지 주요 범주를 포함할 수 있다. 세포 기질 유래 불순물은 숙주 유기체 및 핵산(숙주 세포 게놈, 벡터 또는 전체 DNA)에서 유래된 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포 배양 유래 불순물은 유도제, 항생제, 혈청 및 기타 배지 성분을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다운스트림 유래 불순물은 효소, 화학 및 생화학적 처리 시약(예를 들어, 브롬화 시아노겐, 구아니딘, 산화제 및 환원제), 무기 염(예를 들어, 중금속, 비소, 비금속 이온), 용매, 담체, 리간드(예를 들어, 단클론 항체) 및 기타 침출물(leachable)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 제품 관련 불순물(예를 들어, 전구체, 특정 분해 생성물)은 활성, 효능 및 안전성과 관련하여 원하는 제품과 유사한 특성을 갖지 않는 제조 및/또는 보관 중에 발생하는 분자 변이체일 수 있다. 이러한 변이체는 변형(들) 유형을 식별하기 위해 단리 및 특성화에 상당한 노력을 필요로 할 수 있다. 제품 관련 불순물은 잘린(truncated) 형태, 변형된 형태 및 응집체를 포함할 수 있다. 잘린 형태는 펩티드 결합의 절단을 촉매하는 가수분해 효소 또는 화학물질에 의해 형성된다. 변형된 형태는 탈아미드화, 이성질화, 불일치 S-S 연결, 산화 또는 변경된 접합 형태(예를 들어, 당화, 인산화)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 형태는 또한 번역 후 변형 형태를 포함할 수 있다. 응집체는 원하는 제품의 이량체 및 더 높은 다량체를 포함한다(Q6B 사양: 생명공학/생물학적 제품에 대한 테스트 절차 및 허용 기준, ICH 1999년 8월, 미국 보건복지부).

용어 "저분자량(LMW) 단백질 약물 불순물"은 전구체, 분해 생성물, 잘린 종, Fab 단편, Fc 또는 중쇄 단편을 포함하는 단백질 분해 단편, 리간드 또는 수용체 단편, H2L(2개의 중쇄 및 1개의 경쇄), H2(2개의 중쇄), HL(1개의 중쇄 및 1개의 경쇄), HC(1개의 중쇄) 및 LC(1개의 경쇄) 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. LMW 단백질 약물 불순물은 다량체 단백질의 하나 이상의 성분과 같은 불완전한 버전의 단백질 제품인 임의의 변이체일 수 있다. 단백질 약물 불순물, 약물 불순물 또는 제품 불순물은 명세서 전반에 걸쳐 혼용될 수 있는 용어이다. LMW 약물 또는 제품 불순물은 일반적으로 원하는 약물 제품과 상이할 수 있는 활성, 효능 및 안전성과 같은 특성을 가진 분자 변이체로 간주된다.

단백질 제품의 분해는 세포 배양 시스템에서 단백질 약물 제품의 생산 동안 문제가 된다. 예를 들어, 단백질 제품의 단백질 분해는 세포 배양 배지에서 프로테아제의 방출로 인해 발생할 수 있다. 배지 첨가제, 예컨대 메탈로프로테아제를 억제하기 위해 첨가된 가용성 철 소스, 또는 세린 및 시스테인 프로테아제 억제제는 분해를 방지하기 위해 세포 배양에서 구현되었다(문헌[Clincke, M.-F., et al, BMC Proc. 2011, 5, P115]). C-말단 단편은 세포 배양에서 카르복실 펩티다제로 인해 생산 중에 절단될 수 있다(문헌[Dick, LW et al, Biotechnol Bioeng 2008; 100:1132-43]).

용어 "고분자량(HMW) 단백질 약물 불순물"은 mAb 삼량체 및 mAb 이량체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. HMW 종은 1) 여분 경쇄를 갖는 단량체(H2L3 및 H2L4 종) 및 2) 단량체 + Fab 단편 복합체의 두 그룹으로 나눌 수 있다. 또한, IdeS 효소 소화로 처리한 후, 상이한 이량체화된 단편(Fab2-Fab2, Fc-Fc 및 Fab2-Fc)이 형성된다.

"번역 후 변형"(PTM)은 단백질 생합성 후 단백질의 공유 변형을 지칭한다. 번역 후 변형은 아미노산 측쇄 또는 단백질의 C- 또는 N- 말단에서 발생할 수 있다. PTM은 일반적으로 특정 효소 또는 효소 경로에 의해 도입된다. 많은 것이 단백질 골격 내의 특정의 특징적인 단백질 서열(예를 들어, 시그니처 서열)의 부위에서 발생한다. 수백 개의 PTM이 기록되었으며 이러한 변형은 단백질의 구조 또는 기능의 일부 측면에 변함없이 영향을 미친다(문헌[Walsh, G. "Proteins" (2014) second edition, published by Wiley and Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853]). 다양한 번역 후 변형은 절단, N-말단 연장, 단백질 분해, N-말단의 아실화, 비오틴화(비오틴에 의한 라이신 잔기의 아실화), C-말단의 아미드화, 당화, 요오드화, 보결기(prosthetic group)의 공유 부착, 아세틸화(일반적으로 단백질의 N-말단에서 아세틸기 첨가), 알킬화(보통 라이신 또는 아르기닌 잔기에서 알킬기(예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필)의 첨가), 메틸화, 아데닐화, ADP-리보실화, 폴리펩티드 사슬 내 또는 그 사이의 공유 가교 결합, 설폰화, 프레닐화, 비타민 C 의존 변형(프롤린 및 라이신 하이드록실화 및 카르복시 말단 아미드화), 비타민 K 의존 변형(여기서 비타민 K는 γ-카르복시글루타메이트(글루 잔기) 형성을 초래하는 글루탐산 잔기의 카르복실화에서 보조인자임), 글루타밀화(글루타민산 잔기의 공유 결합), 글리실화(공유 결합 글리신 잔기), 당화(당단백질을 초래하는, 아스파라긴, 하이드록실리신, 세린 또는 트레오닌에 글리코실기의 첨가), 이소프레닐화(파르네솔 및 제라닐게라니올과 같은 이소프레노이드 기의 첨가), 리포일화(리포에이트 작용기의 부착), 포스포판테테이닐화(지방산, 폴리케타이드, 비-리보솜 펩티드 및 류신 생합성에서와 같이 조효소 A로부터 4'-포스포판테테이닐 모이어티 첨가), 인산화(일반적으로 세린, 티로신, 트레오닌 또는 히스티딘에 포스페이트 기의 첨가) 및 황산화(일반적으로 티로신 잔기에 설페이트 기의 첨가)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 아미노산의 화학적 성질을 변화시키는 번역 후 변형은 시트룰린화(예를 들어, 탈이민화(deimination)에 의한 아르기닌의 시트룰린으로의 전환) 및 탈아미드화(예를 들어, 글루타민에서 글루탐산으로 또는 아스파라긴에서 아스파르트산으로의 전환)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 구조적 변화를 수반하는 번역 후 변형은 이황화 가교의 형성(2개의 시스테인 아미노산의 공유 결합) 및 단백질 분해 절단(펩티드 결합에서 단백질의 절단)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 번역 후 변형은 ISG화(ISGylation)(ISG15 단백질(Interferon-Stimulated Gene)에 대한 공유 결합), SUMO화(SUMOylation)(SUMO 단백질(Small Ubiquitin-related MOdifier)에 대한 공유 결합) 및 유비퀴틴화(ubiquitination)(단백질 유비퀴틴에 대한 공유 결합)와 같은 다른 단백질 또는 펩티드의 첨가를 포함한다. UniProt에 의해 체계화된(curated) PTM에 대한 보다 자세한 제어 어휘는 www.uniprot.org/docs/ptmlist를 참조한다.

본원에 사용되는 용어 "당펩티드/당단백질"은 공유 결합된 탄수화물 또는 글리칸을 갖는 합성 동안 또는 합성 후의 변형된 펩티드/단백질이다. 특정 실시형태에서, 당펩티드는 단클론 항체, 예를 들어 단클론 항체의 프로테아제 소화물로부터 수득된다.

본원에 사용되는 용어 "글리칸"은 일반적으로 글루코스(Glc), 갈락토스(Gal), 만노스(Man), 푸코스(Fuc), N-아세틸갈락토사민(GalNAc), N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 N-아세틸뉴라민산(NeuNAc)을 포함하는 당 단위들 중 하나 이상을 포함하는 화합물이다(문헌[Frank Kjeldsen, et al. Anal. Chem. 2003, 75, 2355-2361]). 단클론 항체와 같은 당단백질의 글리칸 모이어티는 그 기능이나 세포 위치를 식별하는 중요한 특성이다. 예를 들어, 특정 단클론 항체는 특정 글리칸 모이어티로 변형된다.

본원에 사용되는 용어 "샘플"은 예를 들어 분리, 분석, 추출, 농축 또는 프로파일링을 포함하는 본 발명의 방법에 따른 조작이 수행되는, 단클론 항체로부터 수득된 것과 같은 적어도 분석물 분자, 예를 들어 당펩티드를 포함하는 분자의 혼합물을 지칭한다.

본원에 사용되는 용어 "분석" 또는 "분석함"은 상호교환적으로 사용되며 관심 분자(예를 들어, 펩티드)를 분리, 검출, 단리, 정제, 가용화, 검출 및/또는 특성화하는 다양한 방법 중 임의의 것을 지칭한다. 예로는 고체 상 추출, 고체 상 미세 추출, 전기영동, 질량 분석법, 예를 들어, ESI-MS, SPE HILIC 또는 MALDI-MS, 액체 크로마토그래피, 예를 들어 고성능, 예를 들어 역상, 순상 또는 크기 배제, 이온쌍 액체 크로마토그래피, 액체-액체 추출, 예를 들어 가속 유체 추출, 초임계 유체 추출, 마이크로파 지원 추출, 멤브레인 추출, 속실렛 추출, 침전, 정화, 전기화학적 검출, 염색, 원소 분석, 에드먼드 분해, 핵자기 공명, 적외선 분석, 유동 주입 분석, 모세관 전기크로마토그래피, 자외선 검출 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용되는 용어 "프로파일링"은 샘플에서의 펩티드와 같은 단백질의 함량, 조성 또는 특징적인 비율을 제공하기 위해 조합되어 사용되는 다양한 분석 방법들 중 임의의 것을 지칭한다.

본원에 사용된 "접촉함"은 용액 또는 고체 상에서 적어도 2개의 물질을 함께 모이게 하는 것을 포함한다.

본원에 사용되는 "온전한 질량 분석"은 단백질이 온전한 단백질로서 특징지어지는 하향식(top-down) 실험을 포함한다. 온전한 질량 분석은 샘플 준비를 최소한으로 줄이고 다수의 PTM의 연결과 같은 다른 단백질체학 전략에서 때때로 손실될 수 있는 정보를 보존할 수 있다.

본원에 사용되는 "펩티드 매핑 분석"은 단백질이 소화된 후 생성된 펩티드의 분리 및 바람직하게는 LC-MS를 사용하는 이의 분석을 겪는 실험을 포함한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 펩티드 맵핑 분석을 적용하여 단백질 바이오의약품의 1차 서열을 확인할 수 있으며, 여기서 단백질 분자는 먼저 가수분해제를 사용하여 작은 펩티드 단편으로 가수분해될 수 있고, 그 다음 각 펩티드 단편의 아미노산 서열은 cDNA 예측 서열 및 사용된 프로테아제의 특이성을 고려하여 LC-MS 분석에 의해 결정된다. 펩티드 매핑 분석으로부터의 데이터는 또한 번역 후 변형을 식별 및 정량화하고, 이황화 결합 연결을 확인하고, 심지어 매우 낮은 수준(< 0.1%)으로 존재하는 아미노산 치환 현상을 검출하는 데 사용될 수 있다(문헌[Zeck et al. PloS one 2012, 7, e40328]). 단백질 바이오의약품의 펩티드 매핑 분석 동안에 LC-MS는 종종 자외선(UV) 검출과 함께 수행되어 소위 UV 지문을 생성할 수 있으며, 이는 단독으로 품질 관리(QC) 및 약물 방출 동안 식별 분석으로서 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "소화"는 단백질의 하나 이상의 펩티드 결합의 가수분해를 지칭한다. 적절한 가수분해제, 예를 들어 효소 소화 또는 비-효소 소화를 사용하여 샘플에서 단백질의 소화를 수행하는 몇 가지 접근법이 있다. 본원에 사용되는 용어 "가수분해제"는 단백질의 소화를 수행할 수 있는 다수의 상이한 약제 중 임의의 하나 또는 이들의 조합을 지칭한다. 효소 소화를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적 예는 트립신, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Asp-N, 엔도프로테이나제 Glu-C, 외부 멤브레인 프로테아제 T(OmpT), 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린-분해 효소(IdeS), 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus Saitoi)의 키모트립신, 펩신, 써모리신, 파파인, 프로나제 및 프로테아제를 포함한다. 비-효소 소화를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적인 예는 고온, 마이크로파, 초음파, 고압, 적외선, 용매(비제한적인 예는 에탄올 및 아세토니트릴임), 고정화 효소 소화(IMER), 자성 입자 고정화 효소, 및 온-칩(on-chip) 고정화 효소의 사용을 포함한다. 단백질 소화에 이용 가능한 기술을 논의하는 최근 검토에 대해 문헌[Switazar et al., "Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments" (J. Proteome Research 2013, 12, 1067-1077)]을 참조한다. 가수분해제들 중 하나 또는 조합은 서열-특이적 방식으로 단백질 또는 폴리펩티드에서의 펩티드 결합을 절단하여 예측 가능한 더 짧은 펩티드 수집을 생성할 수 있다.

단백질을 소화하는 데 사용될 수 있는 여러 접근법이 있다. 샘플에서 단백질을 소화하기 위해 널리 인정되는 방법 중 하나는 프로테아제의 사용을 포함한다. 많은 프로테아제를 이용 가능하며 그들 각각은 특이성, 효율성 및 최적의 소화 조건의 측면에서 고유한 특성을 가지고 있다. 프로테아제는 펩티드 내의 비-말단 또는 말단 아미노산을 절단하는 프로테아제의 능력에 기초하여 분류되는 엔도펩티다제 및 엑소펩티다제 둘 다를 지칭한다. 대안적으로, 프로테아제는 또한 촉매 작용 메커니즘에 따라 분류되는 6개의 별개의 부류 - 아스파르트산, 글루탐산 및 메탈로프로테아제, 시스테인, 세린 및 트레오닌 프로테아제를 지칭한다. 용어 "프로테아제" 및 "펩티다제"는 펩티드 결합을 가수분해하는 효소를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 프로테아제는 또한 특이적 및 비-특이적 프로테아제로 분류될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "특이적 프로테아제"는 펩티드의 특정 아미노산 측쇄에서 펩티드 기질을 절단하는 능력을 갖는 프로테아제를 지칭한다. 본원에 사용되는 용어 "비-특이적 프로테아제"는 펩티드의 특정 아미노산 측쇄에서 펩티드 기질을 절단하는 능력이 감소된 프로테아제를 지칭한다. 절단 선호도는 단백질 서열에서 절단된 아미노산의 총 수에 대한 절단 부위로서의 특정 아미노산의 수의 비에 기초하여 결정될 수 있다.

단백질은 특성화하기 전에 선택적으로 제조될 수 있다. 일부 예시적인 실시형태에서, 단백질 제제는 단백질 소화 단계를 포함한다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 단백질 제제는 단백질 소화 단계를 포함하며, 여기서 단백질 소화는 트립신을 사용하여 수행될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질 제제는 단백질 소화 단계 전에 단백질을 변성, 단백질을 환원, 단백질을 완충 및/또는 샘플을 탈염시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 단계는 원하는 대로 적절한 방식으로 수행될 수 있다.

펩티드 매핑 분석 또는 온전한 질량 분석을 사용하여 다양한 단백질 속성의 특성화를 제공하기 위해, 매우 다양한 LC-MS 기반 분석이 수행될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "액체 크로마토그래피"는 액체에 의해 운반되는 화학 혼합물이 정지된 액체 또는 고체 상 주위 또는 위로 유동할 때 화학 물질의 차등 분포의 결과로서 성분으로 분리될 수 있는 공정을 지칭한다. 액체 크로마토그래피의 비제한적 예는 역상 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "질량 분석계"는 특정 분자 종을 검출하고 그 질량을 정확하게 측정할 수 있는 장치를 지칭한다. 상기 용어는 검출 및/또는 특성화를 위해 폴리펩티드 또는 펩티드가 용출될 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하도록 의도될 수 있다. 질량 분석계는 이온 소스, 질량 분석기 및 검출기의 세 가지 주요 부분으로 구성된다. 이온 소스의 역할은 기체 상 이온을 생성하는 것이다. 분석물 원자, 분자 또는 클러스터는 기체 상으로 이동되고 동시에 이온화될 수 있다(전자분무 이온화에서와 같이). 이온 소스의 선택은 적용에 따라 다르다.

본원에 사용되는 용어 "전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 용액에서의 양이온 또는 음이온이 용액을 포함하는 전자분무 이미터 바늘의 팁(tip)과 상대 전극 사이에 전위차를 적용함으로써 초래되는 고도로 하전된 액적의 스트림의 대기압에서 형성 및 탈용매화를 통해 기체 상으로 이동되는 분무 이온화 공정을 지칭한다. 용액에서의 전해질 이온으로부터 기체-상 이온을 생성하는 데에는 세 가지 주요 단계가 있다. 이들은 (a) ES 주입 팁에서 하전된 액적의 생성; (b) 용매 증발에 의한 하전된 액적의 수축 및 기체-상 이온을 생성할 수 있는 작은 고도로 하전된 액적으로 이어지는 반복되는 액적 붕괴; 및 (c) 기체-상 이온이 매우 작고 고도로 하전된 액적으로부터 생성되는 메커니즘. 단계 (a) 내지 (c)는 일반적으로 장치의 대기압 영역에서 발생한다.

본원에 사용되는 용어 "전자분무 이온화 소스"는 단백질의 질량 분석에 사용되는 질량 분석계와 상용적일 수 있는 전자분무 이온화 시스템을 지칭한다.

네이티브 MS는 비변성 용매로부터 생물학적 분석물이 분무되는 전자분무 이온화를 기반으로 하는 특정 접근법이다. 그것은 큰 생체 분자와 같은 생체 분자 및 이들의 복합체가 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)의 공정을 통해 응축된 액체 상에서의 3차원 기능적 존재로부터 기체 상으로 이동될 수 있는 공정으로서 정의된다.

본원에 사용되는 용어 "나노전자분무" 또는 "나노분무"는 종종 외부 용매 전달을 사용하지 않고 샘플 용액의 매우 낮은 용매 유량, 전형적으로 분당 수백 나노리터 이하에서의 전자분무 이온화를 지칭한다.

본원에서 사용되는 "질량 분석기"는 그의 질량에 따라 종, 즉 원자, 분자 또는 클러스터를 분리할 수 있는 장치를 지칭한다. 빠른 단백질 시퀀싱에 사용될 수 있는 질량 분석기의 비제한적인 예는 TOF(Time-of-Flight), 자기/전기 섹터, 4중극자 질량 필터(Q), 4중극자 이온 트랩(QIT), 오비트랩(orbitrap), 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명(FTCR) 및 가속기 질량 분석(AMS) 기술이다.

본원에 사용되는 "질량 대 전하 비" 또는 "m/z"는 통합 원자 질량 단위의 이온 질량을 그 전하 수(부호에 관계없이)로 나눔으로써 형성된 무차원 양을 나타내는 데 사용된다. 일반적으로, 전하 상태는 이온화 방법(전자분무 이온화(ESI)는 MALDI에서 흔하지는 않은 다중 이온화를 촉진하는 경향이 있기 때문에), 펩티드 길이(더 긴 펩티드는 추가 양성자가 부착될 수 있는 더 많은 기(염기성 잔기)를 가지기 때문에), 펩티드 서열(일부 아미노산(예를 들어, Arg 또는 Lys)은 다른 아미노산보다 이온화에 더 민감하기 때문에), 기기 설정, 용매 pH 및 용매 조성에 따라 다르다.

본원에 사용되는 용어 "탠덤 질량 분석법"은 질량 선택 및 질량 분리의 다중 단계를 사용함으로써 샘플 분자에 대한 구조적 정보가 얻어질 수 있는 기술을 지칭한다. 전제 조건은 샘플 분자가 기체 상으로 이동되어 온전하게 이온화될 수 있고 첫 번째 질량 선택 단계 후에 예측 가능하고 제어 가능한 방식으로 분해되도록 유도될 수 있다는 것이다. 의미 있는 정보를 얻을 수 있거나 단편 이온 신호가 감지 가능한 한, 다단계 MS/MS 또는 MSn은 먼저 전구체 이온(MS2)을 선택 및 단리하고, 이를 단편화하고, 1차 단편 이온(MS3)을 단리하고, 이를 단편화하고, 2차 단편(MS4)을 단리하는 등에 의해 수행될 수 있다. 탠덤 MS는 매우 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 특정 적용에 무슨 분석기를 조합할 것인가는 감도, 선택성, 속도뿐 아니라 크기, 비용 및 가용성과 같은 많은 다양한 요인에 의해 결정될 수 있다. 탠덤 MS 방법의 두 가지 주요 범주는 탠덤-인-스페이스(tandem-in-space) 및 탠덤-인-타임(tandem-in-time)이지만, 탠덤-인-타임 분석기가 공간에서 또는 탠덤-인-스페이스 분석기와 결합되는 하이브리드도 있다.

탠덤-인-스페이스 질량 분석계는 이온 소스, 전구체 이온 활성화 장치 및 적어도 2개의 비-포획 질량 분석기로 구성된다. 특정 m/z 분리 기능은 기기의 한 섹션에서 이온이 선택되고 중간 영역에서 해리된 다음 생성물 이온이 m/z 분리 및 데이터 수집을 위해 다른 분석기로 전송되도록 설계될 수 있다.

탠덤-인-타임 질량 분석계에서 이온 소스에서 생성된 이온은 동일한 물리적 장치에서 포획, 단리, 단편화 및 m/z 분리될 수 있다.

본원에 사용되는 "목표 질량 분석법"은 특정 시간에 특정 질량(m/z)의 이온에 대해 다중 단계의 탠덤 질량 분석법(n=2 또는 3인 MSn)을 사용하는 질량 분석법 기술이다. m/z 및 시간의 값은 이전 분석으로부터 유도된 포함 목록에 정의되어 있다.

본원에 사용되는 "4중극자-오비트랩 하이브리드 질량분석계"라는 용어는 4중극자 질량 분석계를 오비트랩 질량 분석계에 결합하여 제조된 하이브리드 시스템을 지칭한다. 4중극자-오비트랩 하이브리드 질량 분석계를 사용하는 탠덤-인-타임 실험은 4중극자 질량 분석계로부터 선택된 좁은 m/z 범위 내의 이온을 제외한 모든 이온의 방출로 시작된다. 선택된 이온은 오비트랩에 삽입될 수 있고 저에너지 CID에 의해 가장 자주 단편화될 수 있다. 트랩의 m/z 허용 범위 내의 단편은 트랩에 남아 있어야 하며 MS-MS 스펙트럼이 얻어질 수 있다. QIT-FTICR 및 Qq-FTICR과 같지만 이에 제한되지 않은 유사한 하이브리드 시스템이 빠른 단백질 시퀀싱에 사용될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "단백질 드노보(de novo) 시퀀싱"은 다른 소스로부터 얻은 정보에 의존하지 않고 펩티드의 아미노산 서열을 결정하기 위한 절차를 지칭한다. 질량 분석법의 높은 감도로 인해, 이 기술은 종종 통상적인 시퀀싱 방법의 능력을 넘어서는 중요한 정보를 제공할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "단백질 서열 커버리지"는 식별된 펩티드에 의해 커버된 단백질 서열의 백분율을 지칭한다. 퍼센트 커버리지는 발견된 모든 펩티드에서의 아미노산 수를 전체 단백질 서열에서의 총 아미노산 수로 나눔으로써 계산될 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "데이터베이스"는 데이터베이스(들)에서의 모든 가능한 서열에 대해 해석되지 않은 MS-MS 스펙트럼을 검색할 가능성을 제공하는 생물정보학 도구를 지칭한다. 이러한 도구의 비제한적인 예는 Mascot (www.matrixscience.com), Spectrum Mill (www.chem.agilent.com), PLGS (www.waters.com), PEAKS (www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot (download.appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx (www.phenyx-ms.com), Sorcerer (www.sagenresearch.com), OMSSA (www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/), X!Tandem (www.thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector (www.prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm), Byonic (www.proteinmetrics.com/products/byonic) 또는 Sequest (fields.scripps.edu/sequest)이다.

일반적인 설명

전술한 내용으로부터 단백질 특성화를 개선하기 위한 개선된 방법 및 시스템에 대한 필요성이 존재함이 이해될 것이다. 개시되는 본 발명은 그러한 요구를 충족시킨다.

본원에는 개선된 성능을 갖는 LC-MS 플랫폼이 개시된다. 실시형태에서, 네이티브 LC-MS 플랫폼은 다수의 노즐을 갖는 이미터 및 탈용매화 가스의 변형을 통합하여 더 견고한 플랫폼을 생성한다.

본원에 개시되는 실시형태는 샘플에서 단백질의 신속하고 고감도의 특성화를 위한 시스템 및 방법을 제공한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 액체 크로마토그래피 장치, (iii) 전자분무 이온화 소스, 및 (iii) 질량 분석 장치를 포함하는 액체 크로마토그래피 질량 분석 시스템을 제공한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 용기(110), (ii) 시스 가스 입구 라인(112), 및 (iii) 다수의 노즐(108)을 갖는 전자분무 이온화 이미터로 공급되는 변형된 탈용매화 가스 출구 라인(114)을 포함하는 변형제 시스템(106)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 전자분무 이온화 이미터는 M3 이미터(Newomics, 캘리포니아주 버클리)와 같은 상업적으로 입수 가능한 이미터이다.

일부 예시적인 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 전자분무 이온화 소스의 입구에 샘플을 공급하는 단계, (ii) 전자분무 이온화 소스의 출구에서 샘플에서의 단백질 성분의 이온을 생성하는 단계, 및 (iii) 단백질의 성분을 식별하여 단백질을 특성화하기 위해 질량 분석계를 사용하여 이온을 분석하는 단계를 포함하는, 샘플에서의 단백질을 특성화하는 방법을 제공한다.

도 1을 참조하면, 견고한 신호를 제공하는 예시적인 네이티브 LC-MS 플랫폼이 개시된다. 도 1에 예시된 바와 같이, 네이티브 LC-MS 플랫폼(100)은 분석 컬럼(102), 분할기(104), 변형제 시스템(106), 전자분무 이온화 이미터(108) 및 질량 분석 장치(118)를 포함한다.

실시형태에서, 분석 컬럼(102)은 액체 크로마토그래피(LC) 분리 컬럼이다. 액체 크로마토그래피 장치의 비제한적 예는 역상 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 친수성-상호작용 크로마토그래피 및 소수성 크로마토그래피를 포함할 수 있다. HPLC를 포함한 액체 크로마토그래피를 사용하여 단클론 항체를 포함하는 펩티드를 분석할 수 있다. 음이온-교환 크로마토그래피, 역상 HPLC, 크기-배제 크로마토그래피, 고성능 음이온-교환 크로마토그래피, 및 NP-HPLC를 포함한 순상(NP) 크로마토그래피를 포함하는 다양한 형태의 액체 크로마토그래피를 사용하여 이러한 구조들을 연구할 수 있다(예를 들어 문헌[Alpert et al., J. Chromatogr. A 676:191-202 (1994)] 참조). 친수성 상호작용 크로마토그래피(HILIC)는 부분적으로 수성의 이동상으로 수행될 수 있는 NP-HPLC의 변이체이며, 펩티드, 탄수화물, 핵산 및 많은 단백질의 순상 분리를 허용한다. HILIC의 용출 순서는 최저 극성에서 최대 극성으로, 역상 HPLC에서와 반대이다. HPLC는 예를 들어 Waters(예를 들어, Waters 2695 Alliance HPLC 시스템), Agilent, Perkin Elmer, Gilson 등의 HPLC 시스템에서 수행될 수 있다.

일부 실시형태에서, LC 분석은 ACQUITY UPLC 펩티드 BEH C18 컬럼을 사용하여 수행된다. 컬럼 온도는 예를 들어 상업적 컬럼 히터를 사용하여 크로마토그래피 실행 전체에 걸쳐 일정한 온도로 유지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 컬럼은 약 18℃ 내지 약 70℃, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 60℃, 약 40℃ 내지 약 50℃, 예를 들어 약 20℃, 약 25℃, 약 30℃, 약 35℃, 약 40℃, 약 45℃, 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 또는 약 70℃의 온도에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 컬럼 온도는 약 40℃이다. 일부 실시형태에서, 실행 시간은 약 15 내지 약 240분, 예를 들어, 약 20 내지 약 70분, 약 30 내지 약 60분, 약 40 내지 약 90분, 약 50분 내지 약 100분, 약 60분 약 120까지 분, 약 50분 내지 약 80분일 수 있다.

일부 실시형태에서, LC 분석은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼, 또는 네이티브 질량 분석 시스템과 유체 연통하는 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 시스템을 포함한다. 컬럼은 탈당화된 단백질과 함께 사용하기에 적합하다. 일 실시형태에서, SEC 컬럼은 Waters BEH^® SEC column(4.6 × 300 mm)이다. 일 실시형태에서, IEX 컬럼은 강한 양이온 교환 컬럼이다.

SEC 또는 IEX 컬럼과 같은 컬럼은 질량 분석계에 대한 유량을 조정할 수 있는 분석적 유동 분할기(104)를 통해 질량 분석계와 유체 연통한다.

일부 실시형태에서, 이동상은 수성 이동상이다. 대표적인 수성 이동상은 140 mM 아세트산나트륨 및 10 mM 중탄산암모늄을 포함한다. UV 추적은 전형적으로 215 및 280 nm에서 기록된다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질을 용출하기 위해 사용되는 이동상은 질량 분석계와 상용적일 수 있는 이동상일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 액체 크로마토그래피 장치에 사용되는 이동상은 물, 아세토니트릴, 트리플루오로아세트산, 포름산, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 이동상은 액체 크로마토그래피 장치에서 약 0.1 ml/분 내지 약 0.8 ml/분, 예컨대 약 0.1 ml/분 내지 약 0.4 ml/분의 유량을 가질 수 있다. 일 양태에서, 액체 크로마토그래피 장치에서 이동상의 유량은 약 0.1 ml/분, 약 0.15 ml/분, 약 0.20 ml/분, 약 0.25 ml/분, 약 0.30 ml/분, 약 0.35 ml/분, 약 0.4 ml/분, 약 0.45 ml/분, 약 0.50 ml/분, 약 0.55 ml/분, 약 0.60 ml/분, 약 0.65 ml/분, 약 0.70 ml/분, 약 0.75 ml/분, 또는 약 0.80 ml/분일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 이동상은 최대 약 600 mM의 염 농도를 가질 수 있다. 일 양태에서, 염 농도는 약 100 mM, 약 150 mM, 약 200 mM, 250 mM, 약 300 mM, 약 350 mM, 약 400 mM, 약 450 mM, 약 500 mM, 약 550 mM 또는 약 600 mM이다.

시스템은 전술한 단백질, 불순물, 이동상, 질량 분석계, 유기 용매, 산, 염기 또는 크로마토그래피 컬럼에 제한되지 않는 것으로 이해된다.

일 실시형태에서, 크기 배제 분리는 24분 동안 0.2 ml/분의 등용매 유동을 사용하여 실온에서 달성된다.

일 실시형태에서, 전자분무를 위한 전압은 이미터 직전에 액체 접합 티(tee)를 통해 인가된다.

일부 예시적인 실시형태에서, 도 1에 예시된 바와 같이, 변형제 시스템(106)은 용기(110), 시스 가스 입구 라인(112), 시스 가스 출구 라인(114) 및 캡(116)을 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 시스 가스 입구 라인(112)은 테플론 튜브일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 시스 가스 입구 라인(112)은 가요성 스테인리스 강 배관일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 시스 가스 입구 라인(112)은 폴리 에테르 케톤을 사용하여 제조된 튜브일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 변형된 탈용매화 가스 출구 라인(114)은 테플론 튜브일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 변형된 탈용매화 가스 출구 라인(114)은 가요성 스테인리스 강 배관일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 변형된 탈용매화 가스 출구 라인(114)은 폴리 에테르 케톤을 사용하여 제조된 튜브일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 캡(116)을 포함할 수 있다. 캡(116)은 이동상과 함께 사용하기에 안전할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 캡(116)을 포함할 수 있고, 여기서 캡(110)은 캡(116)과 용기(110) 사이에 기밀 밀봉을 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 캡의 비제한적인 예로는 Analytical Sales의 Canary-Safe Cap, Restek의 Eco-cap 병 뚜껑, Restek의 Opti-cap 병 뚜껑 및 VWR의 불활성 이동상 병 뚜껑을 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 캡(116)은 스크류 캡을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 캡(116)은 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 재료로 제조될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 캡(116)은 캡과 용기 사이의 기밀 밀봉을 보장하기 위해 O-링을 더 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)의 캡(116)은 배관을 위한 적어도 하나의 포트를 가질 수 있다. 일 양태에서, 용기(110)의 캡(116)은 배관을 위한 2개의 포트를 가질 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기의 캡(116)은 적어도 하나의 입구 포트(160)를 가질 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)의 캡(116)은 적어도 하나의 출구 포트를 가질 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 전기분무 이온화 이미터(108)는 시스 가스 출구 라인(114)에 결합된다.

일부 예시적인 실시형태에서, 변형제 시스템(106)은 입구 라인 포트 및 출구 라인 포트를 갖는 캡(116) 및 입구 라인 포트에 시스 가스를 제공할 수 있는 시스 가스 입구 라인(112)을 갖는 용기(110)를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 변형제 시스템(106)은 입구 라인 포트 및 출구 라인 포트를 갖는 캡(116) 및 출구 라인 포트를 전자분무 이온화 이미터(108)에 연결할 수 있는 변형된 탈용매화 가스 출구 라인(114)을 갖는 용기(110)를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 전자분무 이온화 이미터(108)는 다수의 이미터 노즐, 예컨대 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개의 이미터 노즐, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 이미터 노즐을 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 전자분무 이온화 이미터(108)는 8개의 이미터 노즐을 포함하는 Newomics(미국 캘리포니아주 버클리 소재)의 M3 이미터이다.

일부 예시적인 실시형태에서, 시스 가스는 시스 가스 입구 라인(112)을 통한 입구 라인 포트를 갖는 캡(116)을 갖는 용기(110)에 시스 가스 소스에 의해 제공될 수 있다. 시스 가스의 비제한적인 예는 공기, 질소, IPA, ACN 및/또는 ACN/NH₃를 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 시스 가스 입구 라인(112)을 통해 입구 라인 포트를 갖는 캡을 갖는 용기에 시스 가스 소스에 의해 제공될 수 있는 시스 가스는 질소 가스일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 전자분무 이온화 이미터(108)는 샘플 흡인, 샘플 분배, 샘플 전달 및/또는 샘플 분무를 수행하도록 자동화될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 입구 라인 포트 및 시스 가스 입구 라인(112)을 갖는 캡(116)을 가지며, 여기서 시스 가스 입구 라인(112)은 입구 라인 포트 내로 부분적으로 삽입될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 캡(116)은 출구 라인 포트 및 변형된 탈용매화 가스 출구 라인(114)을 가지며 , 여기서 변형된 탈용매화 가스 출구 라인(114)은 출구 라인 포트 내로 부분적으로 삽입될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 변형제 시스템(106)은 시스 가스 입구 라인(112)으로부터 용기(110)를 통해 탈용매화 가스 출구 라인(114)으로의 시스 가스의 유동을 허용하도록 구성될 수 있으며, 시스 가스는 질소이다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기는 제2 용기에 의해 둘러싸일 수 있다. 일부 특정 예시적인 실시형태에서, 제2 용기는 폴리에틸렌으로 만들어질 수 있다. 일 양태에서, 제2 용기는 유리병에 대한 파편(shatter) 방지 보호를 제공할 수 있다. 다른 양태에서, 제2 용기는 상부에 개구를 가질 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 붕규산염 유리 재료로 만들어질 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)의 부피는 약 10 ml 내지 약 5000 ml의 범위일 수 있다. 일 양태에서, 용기(110)의 부피는 약 10 ml, 약 20 ml, 약 30 ml, 약 40 ml, 약 50 ml, 약 60 ml, 약 70 ml, 약 80 ml, 약 90 ml, 약 100 ml, 약 110 ml, 약 120 ml, 약 130 ml, 약 140 ml, 약 150 ml, 약 160 ml, 약 170 ml, 약 180 ml, 약 190 ml, 약 200 ml, 약 210 ml, 약 220 ml, 약 230 ml, 약 240 ml, 약 250 ml, 약 260 ml, 약 270 ml, 약 280 ml, 약 290 ml, 약 300 ml, 약 310 ml, 약 320 ml, 약 330 ml, 약 340 ml, 약 350 ml, 약 360 ml, 약 370 ml, 약 380 ml, 약 390 ml, 약 400 ml, 약 410 ml, 약 420 ml, 약 430 ml, 약 440 ml, 약 450 ml, 약 460 ml, 약 470 ml, 약 480 ml, 약 490 ml, 약 1000 ml, 약 1100 ml, 약 1200 ml, 약 1300 ml, 약 1400 ml, 약 1500 ml, 약 1600 ml, 약 1700 ml, 약 1800 ml, 약 1900 ml, 약 2000 ml, 약 2500 ml, 약 3000 ml, 약 3500 ml, 약 4000 ml, 약 4500 ml, 또는 약 5000 ml일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 압력 내성 용기일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 적어도 약 0.5 bar 게이지의 압력 내성을 가질 수 있다. 일 양태에서, 용기(110)는 적어도 약 0.5 bar 게이지, 적어도 약 0.6 bar 게이지, 적어도 약 0.7 bar 게이지, 적어도 약 0.8 bar 게이지, 적어도 약 0.9 bar 게이지, 적어도 약 1 bar 게이지, 적어도 약 1.1 bar 게이지, 적어도 약 1.2 bar 게이지, 적어도 약 1.3 bar 게이지, 적어도 약 1.4 bar 게이지, 적어도 약 1.5 bar 게이지, 적어도 약 1.6 bar 게이지, 적어도 약 1.7 bar 게이지, 적어도 약 1.8 bar 게이지, 적어도 약 1.9 bar 게이지, 또는 적어도 약 2.0 bar 게이지의 압력 내성을 가질 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 적어도 하나의 유기 용매로 채워질 수 있다. 유기 용매의 비제한적 예는 아세토니트릴, 프로판올, 이소프로판올, 물 및 메탄올을 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 적어도 하나의 산으로 채워질 수 있다. 산의 비제한적인 예는 아세트산, 프로피온산 및 포름산을 포함한다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 적어도 하나의 염기로 채워질 수 있다. 염기의 비제한적인 예는 암모니아, 디에틸아민, 트리에틸아민, N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA), 및 피페리딘을 포함한다. 일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 적어도 하나의 유기 용매 및 적어도 하나의 산으로 채워질 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 용기(110)는 적어도 하나의 유기 용매 및 적어도 하나의 염기로 채워질 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 변형제 시스템은 시스 가스 입구 라인(112)으로부터 유기 용매 및 추가의 화학 성분으로 채워질 수 있는 용기(110)를 통해 탈용매화 가스 출구 라인(114) 내로의 시스 가스의 유동을 허용하도록 구성될 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 전기분무 이온화 소스는 약 1-5 μL/분 초과의 용매 유량을 갖는 전기분무를 제공할 수 있다. 일 양태에서, 전기분무 이온화 소스는 약 1 μL/분 초과, 약 2 μL/분 초과, 약 3 μL/분 초과, 약 4 μL/분 초과, 약 5 μL/분 초과, 약 6 μL/분 초과, 약 7 μL/분 초과, 약 8 μL/분 초과, 약 9 μL/분 초과, 약 10 μL/분 초과, 약 11 μL/분 초과, 약 12 μL/분 초과, 약 13 μL/분 초과, 약 14 μL/분 초과, 약 15 μL/분 초과, 약 16 μL/분 초과, 약 17 μL/분 초과, 약 18 μL/분 초과, 약 19 μL/분 초과, 약 20 μL/분 초과, 약 25μL/분 초과, 약 30 μL/분 초과, 약 35 μL/분 초과, 약 40 μL/분 초과, 약 45 μL/분 초과, 약 50 μL/분 초과, 약 55 μL/분 초과, 약 60 μL/분 초과, 약 65 μL/분 초과, 약 70 μL/분 초과, 약 75 μL/분 초과, 약 80 μL/분 초과, 약 85 μL/분, 약 90 μL/분 초과, 약 95 μL/분 초과, 약 100 μL/분 초과, 약 110 μL/분 초과, 약 120 μL/분 초과, 약 130 μL/분 초과, 약 140 μL/분 초과, 약 150 μL/분, 약 160 μL/분 초과, 약 170 μL/분 초과, 약 180 μL/분 초과, 약 190 μL/분 초과, 약 200 μL/분 초과, 약 225 μL/분 초과, 약 250 μL/분 초과, 약 275 μL/분 초과, 약 300 μL/분 초과, 약 325 μL/분 초과, 약 350 μL/분 초과, 약 375 μL/분 초과 분, 약 700 μL/분 초과, 약 425 μL/분 초과, 약 450 μL/분 초과, 또는 약 500 μL/분 초과의 용매 유량을 갖는 전기분무를 제공할 수 있다.

일부 실시형태에서, 분석 규모 분리에 사용되는 광범위한 유량(0.1 내지 0.8 ml/분)을 수용하기 위해, 컬럼 후 분할 전략이 적용되어 유량을 10 μL/분 미만, 예컨대 1 μL/분 미만, 0.1 μL/분 미만 또는 0.01μL/분 미만의 범위로 감소시키며, 이는 NSI용 M3 이미터와 같은 다중-노즐 이미터에 의해 쉽게 수용될 수 있다(도 7 참조). 일부 실시형태에서, 분할 비는 스테인리스 강 티와 같은 티에 연결된 서로 상이한 치수의 2개의 바이퍼(Viper) 배관과 같은 상이한 치수의 2개의 고정된 배관에 의해 제어된다. 일부 실시형태에서, 스테인리스 강 티는 상이한 치수(20 μm × 15 cm 및 100 μm × 65 cm)를 갖는 2개의 바이퍼 배관을 연결하는 컬럼 후에 위치하여 상이한 분석 유량(≤ 0.8 mL/분)을 네이티브 MS 검출을 위해 마이크로유동 범위(서브(sub) μL/분)로 줄이고 UV 검출을 위해 나머지 고 유동(예컨대 280 nm에서)을 전환시킨다.

일부 예시적인 실시형태에서, 네이티브 질량 분석계(118)는 단백질을 특성화하기 위해 단백질의 성분을 식별할 수 있다. 네이티브 질량 분석 시스템은 네이티브 ESI 질량 분석 시스템일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석계(118)는 4중극자-Orbitrap 하이브리드 질량 분석계일 수 있다. 4중극자-Orbitrap 하이브리드 질량 분석계는Q Exactive™ Focus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분석계, Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분석계, Q Exactive™ BioPharma 플랫폼, Q Exactive™ UHMR Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분석계, Q Exactive™ HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분석계, Q Exactive™ HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분석계, 및 Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ 질량 분석계일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석 시스템은 Thermo Exactive EMR 질량 분석계이다. 질량 분석 시스템은 또한 자외선 검출기를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석계(118)는 QIT-FTICR일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석계(118)는 Qq-FTICR일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석계(118)는 탠덤 질량 분석계일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석계(118)는 탠덤-인-타임 질량 분석계일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석계(118)는 탠덤-인-스페이스 질량 분석계일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 질량 분석계(118)는 탠덤-인-타임 분석기가 공간에서 또는 탠덤-인-스페이스 분석기와 결합될 수 있는 하이브리드일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 샘플에서 단백질을 특성화하는 방법은 샘플에서 단백질을 검출하거나 정량하는 것을 포함할 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편 또는 다중특이적 항체를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 치료 항체일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 면역글로불린 단백질일 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 면역글로불린 단백질은 IgG1일 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 면역글로불린 단백질은 IgG4일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 이중특이적 항체일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 항체의 소화시에 형성된 항체 단편일 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 단백질은 단백질 변이체일 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 단백질은 번역 후 변형된 단백질일 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 번역 후 변형된 단백질은 절단, N-말단 연장, 단백질 분해, N-말단의 아실화, 비오틴화, C-말단의 아미드화, 산화, 당화, 요오드화, 보결기의 공유 부착, 아세틸화, 알킬화, 메틸화, 아데닐화, ADP-리보실화, 폴리펩티드 사슬 내 또는 사이의 공유 가교결합, 설폰화, 프레닐화, 비타민 C 의존 변형, 비타민 K 의존 변형, 글루타밀화, 글리실화, 당화, 탈당화, 이소프레닐화, 지질화, 포스포판테테이닐화, 인산화, 황산화, 시트룰린화, 탈아미드화, 이황화 가교 형성, 단백질 분해 절단, ISG화, SUMO화 또는 유비퀴틴화(단백질 유비퀴틴에 대한 공유 결합)에 의해 형성될 수 있다.

하나의 예시적인 실시형태에서, 번역 후 변형된 단백질은 단백질의 산화시 형성될 수 있다.

다른 예시적인 실시형태에서, 분해 생성물은 치료 단백질의 번역 후 변형을 포함할 수 있다.

다른 예시적인 실시형태에서, 단백질은 단백질의 분해 생성물일 수 있다.

또 다른 예시적인 실시형태에서, 단백질은 바이오의약품 제품에서 발견되는 불순물일 수 있다.

다른 예시적인 실시형태에서, 단백질은 생물제약 제품의 제조 동안 발견되는 불순물일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 약 4.5 내지 약 9.0 범위의 pI를 갖는 단백질일 수 있다. 일 양태에서, 단백질은 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 또는 약 9.0의 pI를 갖는 단백질일 수 있다.

일부 예시적인 실시형태에서, 단백질은 생성물-관련 불순물일 수 있다. 생성물 관련 불순물은 분자 변이체, 전구체, 분해 생성물, 단편화된 단백질, 소화된 생성물, 응집체, 번역 후 변형 형태 또는 이들의 조합일 수 있다.

일부 특정 예시적인 실시형태에서, 단백질은 공정-관련 불순물일 수 있다. 공정 관련 불순물은 제조 공정에서 유도된 불순물, 예를 들어 핵산 및 숙주 세포 단백질, 항생제, 혈청, 기타 배지 성분, 효소, 화학 및 생화학적 처리 시약, 무기 염, 용매, 담체, 리간드, 및 제조 공정에서 사용되는 기타 침출물을 포함할 수 있다.

일부 특정 예시적인 실시형태에서, 단백질은 불순물일 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 샘플에서의 불순물의 수는 적어도 2개일 수 있다.

개시되는 시스템 및 방법은 크기 변이체, 전하 변이체, 항체-항원 결합, PTM 특성화, 부분적으로 환원되고 알킬화된 mAb의 특성화, 공-제제화된 약물에 대한 이량체 특성화, IgG4 Fab 교환 특성화, 및 전하 감소를 사용하는 고도로 이질적인 샘플 특성화를 특성화하는 데 사용될 수 있다. 산성 변이체에 기여하는 검출 및 식별될 수 있는 예시적인 번역 후 변형(PTM)은 Fab 영역에서의 당화, 글루쿠로닐화, 카르복시메틸화, 시알릴화, 비-합의(non-consensus) 당화를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 기본 변이체에 기여하는 검출 및 식별될 수 있는 PTM은 석신이미드 형성, N-말단 글루타민(피로글루타메이트로 전환되지 않음), C-말단 Lys 및 비-/부분-당화된 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

1. 크기 변이체

일 실시형태는 단백질 약물 제품 불순물의 크기 변이체를 특성화하는 방법으로서, 수성 이동상을 사용하여 네이티브 SEC 크로마토그래피에 의해 단백질 약물 제품 샘플의 단백질 성분을 분리하는 단계, 및 개시된 플랫폼을 사용하여 단백질 약물 제품 샘플에서 단백질 약물 제품 불순물의 고분자량 종, 저분자량 종, 및 중간 고 중량 종을 특성화하기 위해 질량 분석법에 의해 분리된 단백질 성분을 분석하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 이동상은 아세트산암모늄 및 중탄산암모늄을 포함한다. 개시된 플랫폼을 사용하면 분리 및 분석 전에 단백질 약물 제품 샘플을 탈당화할 필요가 없다.

일 실시형태에서, 단백질 약물 제품 샘플은 유가식(fed-batch) 세포 배양물, 연속 세포 배양물 또는 관류(perfusion) 세포 배양물로부터 채취되거나 정제된다.

예시적인 단백질 약물 제품에는 항체, 융합 단백질, 재조합 단백질 또는 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.

예시적인 저분자량 단백질 약물 제품 불순물은 전구체, 분해 생성물, 잘린 종, Fab를 포함한 단백질 분해 단편, 리간드 또는 수용체 단편 또는 중쇄 단편, 유리 경쇄, 반 항체(half antibody), H2L, H2, HL, HC, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

예시적인 HMW 불순물은 mAb 삼량체 및 mAb 이량체를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

예시적인 중간 HMW는 여분의 경쇄를 갖는 단량체(H2L3 및 H2L4 종), 단량체 + Fab 단편 복합체, Fab2-Fab2, Fc-Fc, 및 Fab2-Fc를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

2. 전하 변이체 특성화

일 실시형태는 단백질 약물 제품 불순물의 전하 변이체를 특성화하는 방법으로서, 선택적으로 단백질 약물 제품 샘플을 탈당화하는 단계, 선택적으로 샘플을 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptocoocus pyogenes)로부터의 IdeS로 처리하는 단계, 수성 이동상을 사용하여 네이티브 강 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 단백질 약물 제품 샘플의 단백질 성분을 분리하는 단계, 및 단백질 약물 제품 샘플에서 단백질 약물 제품 불순물의 전하 변이체 종을 특성화하기 위해 질량 분석법에 의해 분리된 단백질 성분을 분석하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 이동상은 아세트산암모늄 및 중탄산암모늄을 포함한다. 개시된 플랫폼을 사용하면 특성화 전에 단백질 약물 제품 샘플을 탈당화할 필요가 없다.

일 실시형태에서, 단백질 약물 제품 샘플은 유가식 세포 배양물, 연속 세포 배양물 또는 관류 세포 배양물로부터 채취되거나 정제된다.

예시적인 전하 변이체는 Fab 영역에서의 당화, 글루쿠로닐화, 카르복시메틸화, 시알릴화, 비-합의 당화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 기본 변이체에 기여하는 검출 및 식별될 수 있는 PTM은 석신이미드 형성, N-말단 글루타민(피로글루타메이트로 전환되지 않음), C-말단 Lys 및 비-/부분-당화된 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

또한 고순도 단백질 약물 제품을 제조하는 방법이 개시된다. 일부 실시형태는 항체를 생산하는 방법으로서, 예를 들어 유가식 배양에서 항체를 생산하는 세포를 배양하는 단계, 세포 배양물로부터 샘플을 얻는 단계, 본원에 개시된 시스템 및 방법을 사용하여 샘플에서 저분자량, 고분자량 및 중간 분자량 불순물을 특성화하고 정량화하는 단계, 및 항체의 세포 배양 동안 생성된 특성화된 저분자 단백질 약물 불순물의 양을 감소시키기 위해 세포 배양의 하나 이상의 배양 조건을 변형시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 전형적으로, 조건은 0.05% 내지 30.0%, 바람직하게는 0.05% 내지 15%, 0.05% 내지 10%, 0.05% 내지 5%, 또는 0.05% 내지 2%(w/w) 범위의 단백질 약물 불순물을 갖도록 변경된다.

저분자량 단백질 약물 불순물의 양을 감소시키기 위해 변경되는 세포 배양의 하나 이상의 조건은 온도, pH, 세포 밀도, 아미노산 농도, 삼투압, 성장 인자 농도, 교반, 가스 분압, 계면활성제, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, 항체를 생산하는 세포는 중국 햄스터 난소 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 하이브리도마 세포이다.

다른 실시형태는 1 내지 5%, 5 내지 10%, 10 내지 15%, 15 내지 20% 단백질 약물 불순물을 갖는 본원에 제공된 방법에 따라 생산된 항체를 제공한다.

실시예

이하의 실시예는 당업계의 통상의 숙련자에게 본 발명의 방법을 어떻게 제조하고 사용하는지에 대한 완전한 개시내용 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명자들이 본 발명으로서 간주하는 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 수치(예를 들어, 양, 온도 등)에 대해 정확성을 보장하기 위해 노력했지만, 일부 실험 오류와 편차가 고려되어야 한다. 달리 명시하지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 실온은 약 25℃이고, 압력은 대기압 또는 이의 부근이다.

실시예 1: 재료 및 방법

샘플 제조. NISTmAb 스톡 샘플이 10 μg/μL의 농도로 사용되었다.

네이티브 SEC LC-MS 분석. NISTmAb의 네이티브 SEC LC-MS 분석의 경우, Q-Exactive UHMR 질량 분석계에서 온라인 LC-MS 분석을 위해 ACQUITY UPLC 단백질 BEH C18 컬럼(200Å, 1.7 μm, 4.6 mm x 300 mm)(Waters, 미국 매사추세츠주 밀포드)을 사용하여 10 μg의 NISTmAb를 분리했다. 분리를 위해 이동상은 수 중 150 mM 암모늄 아세테이트였다. 자세한 LC 구배 및 MS 파라미터는 각각 표 1 및 2에 포함되어 있다.

네이티브 SCX LC-MS 분석. NISTmAb의 네이티브 SCX LC-MS 분석의 경우, Q-Exactive UHMR 질량 분석계에서 온라인 LC-MS 분석을 위해 YMC BioPro IEX SF 4.6 x 100 mm(YMC, 일본)를 사용하여 10 μg의 NISTmAb를 분리했다. 분리를 위해, 이동상 A는 pH 5.6의 수 중 20 mM 암모늄 아세테이트였고, 이동상 B는 수 중 150 mM 암모늄 아세테이트였다. 자세한 LC 구배 조건은 표 3에 포함되어 있으며 MS 파라미터는 네이티브 SEC-MS 분석과 동일하다.

탈용매화 가스의 변형. 시스 가스 유동은 1/8" TEFLON 배관을 사용하여 Canary-Safe Cap(Analytical Sales and Services, Inc., 미국 뉴저지주 플랜더)을 통해 Duran 압력 플러스 병(SCHOTT North America, Inc., 미국 뉴욕주 엘름스포드)으로 향했다(도 1 참조). 그 다음, 병으로부터 나가는 배관을 Thermo Scientific Ion Max 이온 소스의 Newomics M3 Emitter에 직접 연결했다. 네이티브 온전한 MS 분석을 위해 200 mL의 이소프로판올(IPA)을 병으로 옮겼다.

실시예 2: 네이티브 SEC-MS 플랫폼 감도 및 견고성

실시예 1에 기재된 방법 및 재료를 사용하여, NISTmAb의 네이티브 SEC-MS 분석을 수행함으로써 개시된 플랫폼의 감도를 입증하였다. 10 μg의 NISTmAb에 대해 네이티브 SEC-MS 분석을 수행했다. 도 3에 예시된 바와 같이, 10 μg의 NISTmAb 샘플의 주입은 약 E9 TIC 강도로 이어졌으며, 이는 개시된 플랫폼으로 샘플 양의 낮은 소비를 입증한다. IPA-변형된 탈용매화 가스에 의해 지원되는 효율적인 탈용매화로 인한 우수한 데이터 품질이 또한 개시된 플랫폼에서 관찰되었다. 낮은 존재비 종(예를 들어, HMW 및 LMW 종)의 민감한 검출은 탈당화의 필요 없이 입증되었다. 정확한 질량 측정은 이러한 종의 명확한 식별을 가능하게 했다. 또한, 도 4a 및 4b는 NISTmAb의 101개의 연속된 네이티브 SEC-MS 실행에 의해 입증된 플랫폼 견고성을 보여주며 상대적 존재비는 첫 번째와 101번째 실행 사이에서 거의 동일했다.

실시예 3: 전하 감소를 위한 효과적인 탈용매화 가스 변형

네이티브 SCX-MS 분석 동안 탈용매화 가스 변형의 효과를 결정하기 위해 연구를 수행하였다. 도 5a 및 5b에 예시된 바와 같이, 탈용매화 가스가 IPA, ACN 또는 ACN/NH3로 변형될 때 약간의 TIC 강도 강하는 전하 감소와 관련되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, 전하 감소는 이질적 및/또는 불안정한 생체 분자의 분석을 지원하였다. 도 6의 상단 패널은 전하 감소가 있는 시스테인 ADC 모사체의 네이티브 SEC-MS 분석을 보여주는 반면, 하단 패널은 감소가 없다. 전하 감소는 개선된 공간 분해능으로 인해 전하 상태가 중첩되는 것을 방지하여 질량 이질성이 높은 샘플의 분석을 가능하게 한다. 전하 감소는 개선된 공간 분해능으로 인해 전하 상태가 중첩되는 것을 방지하여 질량 이질성이 높은 샘플의 분석을 가능하게 한다. 더구나, 전하 감소는 이온화 과정 동안 불안정한 생체 분자(비공유적으로 연결됨)를 보존하는 데 도움이 되었고 원치 않는 해리 현상을 최소화하였다.

실시예 4: 온전한 단백질 질량 분석을 위한 다용성이고 민감하며 견고한 네이티브 LC-MS 플랫폼

본원에 개시된 실시형태에 따른 다용성이고 민감하며 견고한 네이티브 LC-MS 플랫폼의 추가 실시예가 아래에 제공된다.

지난 몇 년 동안, 질량 분석법(MS)에 의한 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)와 같은 네이티브(비-변성) 액체 크로마토그래피(nLC) 방법의 하이픈 연결(hyphenation)은 단백질 약물 제품의 크기, 전하 및 구조적 이질성을 연구하는 데 많은 관심을 갖게 하였다. 매우 다양한 nLC-MS 분석법의 이용 가능성에도 불구하고 다양한 적용을 수용할 수 있는 통합 플랫폼은 여전히 부족하다. 본 실시예에서는 다양한 nLC-MS 적용을 쉽게 가능하게 할 수 있고 뛰어난 다용성, 감도 및 견고성을 특징으로 하는 새로운 nLC-MS 플랫폼의 개발이 설명된다. 특히, 개발된 플랫폼은 다양한 nLC 방법을 수용하는 데 다용성 달성에 핵심인 광범위한 LC 유량과 높은 염 농도를 견딜 수 있다. 또한, 이 플랫폼을 사용하여 도펀트-변형된 탈용매화 가스를 쉽게 적용하여 이질적이고 불안정한 생체 분자의 특성화를 개선하기 위해 전하-감소 네이티브 MS를 달성할 수 있었다. 마지막으로, 이 nLC-MS 플랫폼은 단백질 약물 특성화에 일상적으로 적용될 수 있는 매우 민감하고 견고하다는 것이 입증된다.

재료. 탈이온수는 MilliPak Express 20 필터(Millipore Sigma, 미국 매사추세츠주 벌링턴)가 설치된 MilliQ 통합 정수 시스템에 의해 제공되었다. NIST 단클론 항체 참조 재료 8671(NIST-mAb, 인간화 IgG1κ 단클론 항체)은 국립 표준 기술 연구소(미국 메릴랜드주 게이더스버그)로부터 구입했다. 암모늄 아세테이트(LC/MS 등급) 및 SigmaMAb 항체 약물 접합체(ADC) 모사체는 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스)에서 구입했다. 펩티드 N-글리코시다제 F(PNGase F)는 New England Biolabs Inc(미국 매사추세츠주 입스위치)에서 구입했다. Invitrogen UltraPure 1 M Tris-HCl 완충액, pH 7.5는 Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)에서 구입했다. 아세토니트릴(ACN)(Optima LC/MS 등급)은 Thermo Fisher Scientific(미국 매사추세츠주 월섬)에서 구입했으며 수산화암모늄(NH3)(30%)은 J.T. 베이커(미국 펜실베이니아주 센터 밸리)에서 구입했다. 2-프로판올(IPA)(HPLC 등급)은 Honeywell(미국 미시간주 머스키건)에서 구입했다. IgG1 및 IgG4 서브클래스를 모두 포함하는 다른 모든 단클론 항체는 Regeneron(미국 뉴욕주 태리타운)에서 생산되었다.

샘플 제조. mAb 혼합물 샘플은 4개의 사내 mAb를 각 mAb에 대해 5 mg/ml의 최종 농도로 혼합함으로써 제조되었다. 혼합물의 일 분취량을 nSEC-MS 분석에 앞서 1시간 동안 45℃에서 100 mM Tris-HCl(pH 7.5) 중 PNGase F(단백질 10 μg당 1 IUB 밀리단위)로 처리했다. 다른 분취량은 샘플 처리 없이 직접 nIEX-MS 분석이 수행되었다. SigmaMAb ADC 모방체를 포함한 다른 모든 mAb 샘플은 nLC-MS 분석에 주입하기 전에 물로 2 내지 5 mg/ml로 희석되었다.

nLC-MS 방법. 모든 LC 분리는 UltiMate 3000 UHPLC 시스템(Thermo Fisher Scientific, 독일 브레멘)에서 수행되었다. nSEC-MS 분석의 경우, Acquity BEH200 SEC 컬럼(4.6 × 300 mm, 1.7 μm, 200 Å)(Waters, 미국 매사추세츠주 밀포드)을 실온에서 0.2 mL/분의 암모늄 아세테이트 150 mM의 등용매 용출로 사용했다. nIEX-MS 분석의 경우, BioPro IEX SF 컬럼(4.6 mm × 100 mm, 5 μm)(YMC Co., LTD., 일본 교토)이 45℃에서 0.4 ml/분에서 16분 내에 20 mM의 암모늄 아세테이트(pH 5.6, 아세트산으로 조정)로부터150 mM의 암모늄 아세테이트(pH 6.8)로의 선형 구배로 사용되었다. 탈염 SEC-MS 분석의 경우, Acquity BEH200 SEC 보호 컬럼(4.6 × 30 mm, 1.7 μm, 200 Å)(Waters, 미국 매사추세츠주 밀포드)을 실온에서 다음의 유량으로 150 mM의 아세트산 암모늄의 등용매 용출로 사용했다: 0.1 mL/분, 0.2 mL/분, 0.4 mL/분, 0.6 mL/분 또는 0.8 mL/분. 온라인 네이티브 MS 검출을 가능하게 하기 위해, 스테인리스 강 티가 상이한 치수(20 μm × 15 cm 및 100 μm × 65 cm)를 갖는 2개의 바이퍼 배관을 연결하는 컬럼(Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 월섬) 후에 적용되어 상이한 분석 유량(≤ 0.8 mL/분)을 네이티브 MS 검출을 위해 마이크로유동 범위(서브 μL/분)로 줄이고 UV 검출을 위해 나머지 고 유동(280 nm)을 전환시켰다. Nanospray Flex™ 이온 소스(Thermo Fisher Scientific, 독일 브레멘)가 장착된 Thermo O Exactive UHMR 또는 Exactive 플러스 EMR 질량 분석계를 네이티브 MS 분석에 사용했다. 마이크로유동을 갖는 나노전기분무(NSI)를 달성하기 위해, Newomics 미세제조 모놀리식 다중-노즐(M3) 이미터(Newomics Microfabricated Monolithic Multi-nozzle(M3) emitter)(미국 캘리포니아주 버클리)가 적용되었다. 전하 감소 네이티브 MS를 달성하기 위해, 200 mL의 다양한 변형제(예를 들어, IPA, ACN 또는 ACN 중 5% 암모니아)를 함유하는 DURAN 압력 플러스 병(1 L)(SCHOTT North America, Inc., 미국 뉴욕주 엘름스포드)의 헤드스페이스를 통해 가스 유동을 통과시킴으로써 달성되는 도펀트-변형된 탈용매화 가스(2 L/분, 질소)가 적용되어 NSI를 지원하였다(도 7). 이 실시예에서 모든 실험은 달리 명시되지 않는 한 IPA-지원 네이티브 MS 분석으로 수행되었다. MS 분해능은 12,500(UHMR) 또는 17,500(EMR)에서, 모세관 분무 전압은 3.0 kV에서, 모세관 온도는 350℃에서, S-렌즈 RF 수준은 200에서, 인-소스(in-source) 단편화 에너지는 100(또는 ADC 모사체 분석의 경우 50)에서, HCD 포획 가스 압력은 3에서 설정되었다. 질량 스펙트럼은 2000 내지 15000의 m/z 범위 창으로 획득되었다.

통합 nLC-MS 플랫폼. nLC-MS에 의한 단백질 약물의 특성화를 위해, 분석 규모 컬럼(2.1 mm 또는 4.6 mm I.D.)은 많은 장점이 있기 때문에 사용되었다. 첫째, 모세관 컬럼 형식과 비교하여, 분석 규모 컬럼의 훨씬 더 광범위한 선택이 쉽게 이용 가능하므로, 특히 까다로운 분자에 대한 방법 개발이 용이하다. 또한, 분석 규모 컬럼은 견고성 및 처리량 면에서 우세하며 품질 관리(QC) 분석에서 광학 검출과 함께 널리 사용된다. 이동상 조건은 상이하지만 동일한 분석 컬럼에서 nLC-MS 분석을 수행함으로써, 모세관 컬럼을 사용하는 것과 비교하여 QC 분석과 유사한 결과를 생성할 가능성이 여전히 더 높다. 분석 규모 분리에 사용되는 광범위한 유량(0.1 내지 0.8 mL/분)에 대처하기 위해, 컬럼후 분할 전략을 적용하여 NSI용 다중-노즐 이미터(M3)에 의해 쉽게 수용될 수 있는 범위(< 10 μL/분)로 유량을 줄였다. 분할 비는 주로 스테인리스 강 티에 연결된 상이한 치수의 2개의 고정 바이퍼 배관에 의해 제어되었으며(도 7) 이 연구에서 시험된 모든 nLC 방법에 대해 변경되지 않은 상태로 유지되었다. 주목할만한 것은 M3 이미터의 다중-노즐 설계가 NSI 이전에 서브 마이크로유동을 8개의 노즐로 분할함으로써 유량을 더욱 감소시키기 때문에 서브-마이크로 유량에서 NSI를 수행하는 성공과 관련이 있다는 것이다. 한편, NSI의 적용은 소프트 이온화를 위한 소스 조건의 가혹함을 감소시킬 뿐만 아니라, 다양한 nLC 방법(예를 들어, SEC, IEX 및 HIC)을 수용하는 데 핵심적인 특징인 MS 감도와 높은 염 농도에 대한 내성을 크게 증가시킨다. 또한, 대부분의 다른 NSI 설정과 달리, 이 M3 이미터 기반 접근법은 탈용매화 가스가 내장된 탈용매화 가스 라인을 통해 분무 이미터에 적용되도록 하며(도 7), 이는 개선된 분무 안정성과 탈용매화 효율성을 달성하는 데 유용하다. 또한, 이것은 탈용매화 가스 변형을 통해 플랫폼의 다용성을 더욱 확장할 수 있는 기회를 제공하기도 했다. 예를 들어, 전하 감소 능력이 있는 휘발성 유기 변형제로 탈용매화 가스를 단순히 도핑함으로써(도 7), 네이티브 MS 분석을 위해 온라인 전하 감소가 쉽게 달성될 수 있다. 이 플랫폼은 임의의 맞춤화(customization) 없이 쉽게 접근 가능한 모든 부품으로 구축되었으므로 일관된 성능을 위해 쉽게 유지 관리될 수 있다. 다음 단락에서는 이 nLC-MS 플랫폼의 다용성, 감도 및 견고성을 입증하기 위해 광범위한 평가를 수행했다.

nLC 통합을 위한 플랫폼 다용성. 다양한 nLC 방법(예를 들어, SEC, IEX 및 HIC)이 nLC-MS 분석에 채택되는 경우, 이동상에 사용되는 휘발성 염 농도 및/또는 LC 유량을 최적화하여 최상의 크로마토그래피 성능을 달성해야 하는 경우가 많다. 따라서, 개발된 nLC-MS 플랫폼은 다양한 nLC-MS 적용을 수용하기 위해 광범위한 LC 유량 및 염 농도를 취급할 수 있는 것이 바람직하다. 다양한 유량 및 염 농도에 대한 이 nLC-MS 플랫폼의 내성을 평가하기 위하여, Waters BEH200 SEC 보호 컬럼(4.6 mm × 30 mm)을 사용하여 신속한 온라인 탈염 단계 후 mAb1 샘플의 네이티브 MS 분석을 수행함으로써 두 가지 시험을 수행했다. 먼저, 이동상으로서 150 mM 암모늄 아세테이트 및 10 μg의 주입량을 사용하여 0.1 내지 0.8 mL/분 범위의 5가지 다른 유량을 시험했다. 분할 설정이나 MS 소스 파라미터를 변경함이 없이, 5가지 유량에서 생성된 총 이온 크로마토그램(TIC)은 모두 양호한 신호 강도, 분무 안정성 및 대응 UV 프로파일과의 높은 유사성을 나타냈다(도 8a). 특히, UV 및 TIC 피크의 상대 강도는 일반적으로 상이한 유량에서 서로 상관관계가 있으며, 이는 더 높은 유량에서 NSI-MS 감도가 덜 충분한 탈용매화로 인해 손상되지 않았음을 나타낸다. 또한, 이러한 5가지 조건에서 얻은 평균 원시 MS 스펙트럼은 모두 고도로 대칭적인 m/z 피크 및 우수한 신호 대 잡음 비를 나타냈으며(도 12a 및 12b), 이는 시험된 가장 빠른 유량(0.8 mL/분)에서도 충분한 탈용매화를 나타낸다. 이러한 관찰은 이 개발된 nLC-MS 플랫폼이 대부분의 nLC-MS 적용을 충족시켜야 하는 0.1 내지 0.8 mL/분의 LC 유량을 잘 견딜 수 있음을 나타낸다. 또한, 이 플랫폼에서 빠르고 효율적인 탈염을 위해 짧은 SEC 컬럼에서 높은 유량을 성공적으로 작동하는 것이 네이티브 MS 기반 고처리량 스크리닝 적용에서 큰 유망성을 제시했다는 점은 주목할 가치가 있다. 개념 증명으로서, 3가지 상이한 농도(0.05, 0.5 및 5 μg/μL)에서의 mAb2 샘플 2 μL을 각각 30회 반복 주입하고 0.8 mL/분에서 분석하고 그 결과의 TIC를 도 8b에 제시했다. 높은 유량이 적용되었기 때문에, 주입들 사이의 듀티 사이클은 42초로 짧았으며, 이는 하루 약 2,050개 샘플의 처리량에 해당한다. 달성된 처리량은 일부 직접 주입 기반 MS 플랫폼과 비교할 때 높지 않지만, 이 SEC-MS 기반 접근법은 최소 시료 처리에서 우세하여, 벤치워크 시간을 절약할 뿐만 아니라 샘플-제조 유도 인공물(artifact)을 도입할 위험을 감소시킨다. 또한, 30회 반복 분석은 낮은 변동 계수 값(0.1, 1 및 10 μg 주입량에 대해 각각 17%, 5% 및 4%의 CV)에 의해 입증되는 바와 같이 우수한 MS 감도 및 반복성을 입증했다. 0.1 μg 주입 분석에 대한 더 높은 CV는 반복 주입으로 인한 바늘 흡착 유도 샘플 손실의 결과로서 스톡 단백질 농도(0.05 μg/μL)의 점진적인 감소에서 기인한 것 같았다.

두 번째 시험에서는, 유량을 0.4 mL/분으로 유지하고 이동상에서의 암모늄 아세테이트 농도를 변경함으로써, 염 농도에 대한 플랫폼의 내성이 또한 동일한 탈염 SEC-MS 방법을 사용하여 평가되었다. 실용적인 고려 사항을 위해, 150 mM 내지 600 mM 범위의 암모늄 아세테이트 농도가 MS 감도와 스펙트럼 품질 모두에 미치는 영향에 대해 연구되었다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, 높은 MS 강도는 각각의 염 농도(150, 300, 450, 및 600 mM)에서 mAb1의 3중 분석에 걸쳐 일관되게 달성되었다. 아마도 더 높은 염 농도에서 덜 효율적인 이온화로 인해, 염 농도의 증가와 함께 MS 강도의 현저한 감소가 관찰되었지만, 전체 MS 신호는 여전히 대부분의 nLC-MS 적용에 충분한 것으로 고려되었다. 또한, 600 mM 염 농도에서 획득한 mAb1의 네이티브 MS 스펙트럼을 정밀히 조사한 결과 매우 대칭적인 m/z 피크와 양호한 신호 대 잡음 비로 우수한 스펙트럼 품질을 보여주었다(도 9b). Fc N-당화의 거시적 및 미시적 이질성으로 인해 발생하는 다양한 글리코형은 잘 분해되고(resolved) 양호한 질량 정확도로 확실하게 할당될 수 있다. 마지막으로, 평가된 암모늄 아세테이트 농도 범위(150 내지 600 mM)는 nIEX-MS 및 nSEC-MS와 같은 대부분의 nLC-MS 적용을 가능하게 하는 데 충분하며, 이들 대부분은 20 내지 200 mM의 암모늄 기반 염을 포함하는 이동상을 사용하여 개발 및 보고되었다. 시험된 범위 내에서 염 농도를 사용하여 nHIC-MS 분석을 가능하게 하기 위해, 최근 우리 그룹 34에서 도입한 구성 및 분할 유동 전략이 적용될 수 있었다. 간단히 말해서, 컬럼 후 희석제 유동(물)을 도입함으로써 HIC 이동상(최대 3 M 암모늄 아세테이트)을 네이티브 MS 검출 전에 6배(최대 500 mM)로 희석될 수 있다. 이 전략을 적용하여 여러 mAb 샘플의 nHIC-MS 분석이 이 플랫폼에서 수행되었으며, 고품질 데이터가 일관되게 얻어졌다(도 13a 및 13b). 따라서 개발된 nLC-MS 플랫폼은 대부분의 nLC-MS 적용을 지원하기 위해 다용도로 적용될 수 있다.

온라인 전하 감소 네이티브 MS 분석을 위한 플랫폼 다용성. 전하 감소는 불안정한 단백질 복합체 또는 매우 이질적인 단백질 샘플의 네이티브 MS 분석을 용이하게 하기 위해 자주 사용되는 전략이다. 전하 감소를 통해, 단백질 복합체에 존재하는 비-공유적 상호작용은 감소된 쿨롱 반발로 인해 네이티브 MS 분석 동안 더 잘 보존될 수 있다. 또한, 전하 상태 엔벨로프를 더 높은 m/z 영역으로 이동함으로써 인접한 전하 상태들 사이의 공간 분해능이 크게 개선될 수 있으므로 스펙트럼 복잡성을 줄일 수 있다. 전하 감소 네이티브 MS를 가능하게 하는 가장 일반적인 접근법은 ESI 전에 이미다졸 또는 트리에틸아민(TEA)과 같은 전하 감소 시약을 벌크 분석물 용액에 첨가하는 것이다. 이 개발된 nLC-MS 플랫폼을 사용하여 탈용매화 가스를 다양한 유기 변형제로 도핑함으로써 전하 감소 네이티브 MS를 온라인으로 쉽게 달성할 수 있다. 3가지 다른 변형제(IPA, ACN 및 ACN 중 5%(v/v) 암모니아)의 전하 감소 효과를 평가하기 위해, 6.8 내지 8.5 범위의 pI를 갖는 4가지 다른 mAb의 혼합물이 도펀트-변형된 탈용매화 가스로 nSEC-MS 및 nIEX-MS 모두에 의해 분석되었다. 이어서, 각 전하 감소 조건 하의 각 mAb의 평균 전하 상태를 계산하고 탈용매화 가스로서 변형되지 않은 질소를 사용하여 수행된 대조 실험과 비교했다(도 10a 내지 10c). 이 연구는 mAb 분석물(예를 들어, 다른 pI), NSI에 대한 용매 조건(예를 들어, IEX 구배와 다른 pH 및 염 농도) 또는 nLC 방법(예를 들어, SEC 대 IEX)에 관계없이, 전하 감소 능력의 일관된 순서가 관찰되었는 바, ACN/NH3(ACN 중 5% 암모니아)가 전하 감소의 가장 큰 범위(약 9.5 전하)를 초래하였고 ACN(약 8 전하) 및 IPA(약 5 전하)가 그 뒤를 이었다.

전하 감소는 또한 전체 MS 강도의 상응하는 감소로 이어졌는데(도 10a 내지 10c), 이는 오비트랩 기기에 의한 더 큰 m/z 이온의 덜 효율적인 전송 및 검출에서 기인한 것 같았다. 그럼에도 불구하고, ACN/NH3-변형된 탈용매화 가스에 의해 달성된 가장 큰 전하 감소 조건 하에서도, 5 μg의 mAb 샘플의 분석으로부터의 전체 MS 강도는 여전히 고품질 MS 스펙트럼으로 E8 수준에 도달할 수 있었다(도 14a 내지 14c). MS 기기에 일단 도입되면 제거하기 어려운 TEA와는 달리, 이 접근법에 의한 전하 감소는 완전히 오염이 없는 것으로 고려된다. 흥미롭게도, IPA 또는 ACN으로 탈용매화 가스를 변형시키면 NSI 동안 탈용매화 효율이 또한 개선될 수 있으므로, 연장된 분석에 걸쳐 형성되는 경향이 있는 부가물 형성이 최소화되어, 스펙트럼 품질이 개선되고(도 15) 장기 분무 안정성이 향상된다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 가장 온화한 전하 감소 변형제인 IPA가 본 플랫폼에 모든 nLC-MS 적용을 위한 디폴트(default)에 의해 적용되었다.

온라인 전하 감소 네이티브 MS를 달성하는 능력은 불안정하고/하거나 이질적인 단백질 약물의 분석에 유용하다. 예를 들어, Cys-연결된 항체-약물 접합체(ADC)는 사슬간 이황화 결합의 부족으로 인한 기체 상의 불안정성, 및 다양한 수의 페이로드(payload)로 발생하는 높은 질량 이질성 때문에 온전한 단백질 분석에 종종 문제를 나타낸다. SigmaMab ADC 모사체를 모델 시스템으로서 사용하여, Cys-연결된 ADC의 네이티브 MS 분석을 위해 온라인 전하 감소를 적용하는 이점이 평가되었다(도 6 및 11). 이 ADC 모사체는 IgG1 mAb로부터의 사슬간 이황화 결합 Cys 잔기에서 접합된 0 내지 4쌍의 페이로드(약 668 Da)를 갖는 약물-로딩된 종의 혼합물로 구성된다. 분자로부터 Fc N-당화를 제거함이 없이, nSEC-MS 분석이 온라인 전하 감소 유무로 수행되었다. 전하 감소 없이 분석했을 때, 비-공유적 ADC 복합체의 해리는 최소의 인-소스(in-source) 에너지(SID = 50 eV)의 적용으로도 쉽게 관찰되어, 고도로 하전된 경쇄(LC) 종 및 전하-제거된(charge-striped) H2L 종의 형성으로 이어지는 것으로 나타났다(도 6). 대조적으로, ACN/NH₃-지원된 전하 감소가 적용될 때, 이러한 해리 현상은 더 높은 인-소스 에너지 적용(SID = 100 eV, 효율적인 탈용매화에 최적화됨)으로도 극적으로 감소되었다(도 6). 온전한 ADC에 대한 LC의 상대 MS 강도를 계산함으로써, 이 해리 성향은 전하 감소 시 8.3%에서 0.4%로 감소되는 것으로 추정되었다. 기체 상에서 ADC 복합체의 이러한 증가된 안정성은 낮은 전하 상태에서 감소된 쿨롱 반발, 그리고 증발 냉각(전하 감소 시약에 의한)을 통한 이온의 감소된 내부 에너지에서 기인한 것 같다. 게다가, 전하 감소 없이 상이한 수의 페이로드에 의해 도입된 증가된 질량 이질성 때문에, 상이한 DAR(약물 대 항체 비) 종의 전하 상태 엔벨로프는 특정 m/z 영역에서 중첩되었다. 예를 들어, DAR8 종으로부터의 +30, +29 및 +28의 전하 상태는 각각 DAR0 종으로부터의 +29, +28 및 +27의 전하 상태와 유사한 m/z 영역에서 나타났다(도 6). 이러한 m/z 중첩은 스펙트럼 디콘볼루션에 어려움을 유발할 수 있으며, 이 경우 DAR0 종은 디콘볼루션 후에 검출되지 감지되지 않았다(도 11, 하단 패널). 대조적으로, ACN/NH₃-지원된 전하 감소에 의해, 전체 전하 상태 엔벨로프는 인접한 전하 상태들 사이의 공간 분해능이 크게 개선되는 더 높은 m/z 영역으로 이동되었다. 그 결과, 상이한 DAR 종(예를 들어, DAR8로부터의 z = +20 및 DAR0으로부터의 z = +19)으로부터의 전하 상태들 간에 중첩이 관찰되지 않아(도 6), 확신 있는 스펙트럼 디콘볼루션을 용이하게 하였다(도 11, 상단 패널). Cys-연결된 ADC의 경우, 평균 DAR을 정확하게 측정하고 페이로드 분포를 특성화하기 위해, 원하지 않는 사슬 해리와 스펙트럼 중첩을 최소화하는 것이 모두 중요하다. 기체 상에서의 사슬 해리는 높은 DAR 종의 우선적인 해리로 인해 평균 DAR의 과소평가로 이어질 가능성이 높다. 스펙트럼 중첩은 디콘볼루션 동안에 정보의 모호성 또는 심지어 손실로 이어질 것이다. 이 실시예에서는, 두 조건에서 얻은 평균 DAR 값이 비슷했지만(전하 감소 방법으로부터의 DAR = 4.3 대 대조 방법으로부터의 DAR = 4.2), 페이로드 분포는 상이했다. 전하 감소가 없으면 DAR0 종은 디콘볼루션 후에 관찰되지 않은 반면, 높은 DAR 종의 상대적 존재비는 그의 우선적인 해리로 인해 과소평가되었다. 이 두 가지 원인은 반대 방향으로 평균 DAR 계산에 영향을 미치고 비슷한 평균 DAR로 이어졌다. 그러나, 전하 감소 조건에서만 이 Cys-ADC 모사체의 평균 DAR과 페이로드 분포 모두가 정확하게 특성화되었다.

플랫폼 감도 및 동적 범위. 단백질 약물 이질성의 심층적인 특성화는 분석 방법에서 높은 감도와 넓은 동적 범위를 모두 필요로 한다. 전자는 최소의 샘플 소비로 특성화가 달성될 수 있도록 하는 한편, 후자는 그러한 저-존재비 변이체의 식별을 가능하게 한다. 개발된 nLC-MS 플랫폼의 감도와 동적 범위를 평가하기 위해, NISTmAb 참조 표준이 시험 물품으로서 사용되어 nSEC-MS 및 nIEX-MS 분석이 모두 수행되었다. 임의의 샘플 처리 없이 10 μg의 NISTmAb가 Waters BEH200 SEC 컬럼(4.6 mm × 300 mm)에 주입된 후 IPA-지원 네이티브 MS 분석이 수행되었다. nSEC-MS 분석으로부터의 TIC는 주요 피크로부터 분리되거나 부분적으로 분리된 2개의 고분자량(HMW) 피크 및 2개의 저분자량(LMW) 피크를 나타냈다(도 3). 약 1E9의 총 이온 강도에서 검출된 주요 피크는 NISTmAb 단량체에서 기인하였다. UV 기반 정량화에 기초하여 각각 약 0.1% 및 약 1.3%로 존재하는 HMW 피크 1 및 HMW 피크 2는 모두 NISTmAb의 이량체 형태로서 지정되었으며, 이는 그의 상이한 형태로 인해 SEC에 의해 분리된 것으로 추정되었다. 특히, 이러한 낮은 수준에서도, 이들 2개의 이량체 종에 대해 고품질 MS 데이터가 얻어졌으며, 이는 디콘볼루션 후 글리코형-분해된 질량 피크를 나타낸다(도 3, 삽입 도면). 또한, 2개의 LMW 피크는 또한 우수한 스펙트럼 품질을 나타내었고 상부 힌지 영역에서 발생하는 일련의 클리핑 현상으로부터 초래되는 2개의 상보적 단편으로서 명확하게 식별되었다(도 3, 삽입 도면). 이어서, 이 nLC-MS 플랫폼에 보고된 강한 양이온 교환 방법을 채택함으로써 처리되지 않은 NISTmAb 10 μg의 nIEX-TIC 분석을 수행했다. 동일한 잘린 mAb 단편을 포함하여 매우 상이한 수준에 존재하는 다수의 전하 변이체는 고품질 MS 데이터에 기초하여 모두 확실하게 식별되었다(도 16-1 및 16-2). 마지막으로, 이들 두 가지 nLC-MS 방법으로 식별된 NISTmAb에서의 크기 및 전하 변이체는 모두 도 18에 요약되어 있으며, 상대적 존재비는 대응하는 UV 피크에 의해 정량화되었다. 약 0.02% 이하의 수준에서 소수 종이 쉽게 검출될 수 있으므로, 10 μg NISTmAb 주입량을 갖는 상기 개발된 nLC-MS 플랫폼에 nSEC-MS 및 nIEX-MS 방법을 모두 적용함으로써 약 4배 정도의 동적 범위가 달성될 수 있었다. 마지막으로, 10 μg 주입으로부터의 소수 종의 0.02%가 컬럼에서 2 ng의 절대량을 나타내었으므로, 이 플랫폼도 매우 민감한 것으로 간주되었고 MS 기반 생분석 적용에 유용할 수 있다.

플랫폼 견고성. 견고성은 산업적 실험실에서 일상적인 적용을 위한 분석 방법을 개발할 때 다른 주요 고려 사항이다. 특히, nLC-MS 방법은 염 수용액을 MS 이온 소스에 연속적으로 도입하여 연장된 분석 시간에 걸쳐 분무 안정성 및 신호 강도를 유지하는 데 어려움으로 이어진다. 개발된 nLC-MS 플랫폼을 연속 분석에 적용할 수 있는지, 그리고 분무 안정성 및 방법 감도가 장기간에 걸쳐 유지될 수 있는지를 평가하기 위해, mAb 분자의 nSEC-MS와 nIEX-TIC 분석을 모두 24시간에 걸쳐 반복적으로 수행하여, 각각 50 초과의 실행을 생성하였다. 도 17에 도시된 바와 같이, nSEC-MS 및 nIEX-MS 분석에 대해 각각6.0% 및 4.1%의 CV 값으로 24시간에 걸쳐 양호한 신호 강도 및 안정성이 달성되었다. 이 nLC-MS 플랫폼에 의해 달성된 높은 견고성은 다중-노즐 이미터와 IPA-지원 네이티브 MS 모두의 적용에 기인한 것 같다. 전자는 NSI에 도입된 액적의 크기를 줄일 뿐만 아니라 단백질 침전 및 축적으로 인한 막힘 위험을 완화한다. IPA-지원 네이티브 MS는 아마도 액적의 표면 장력을 줄임으로써 탈용매화 효율을 더욱 향상시킨다.

결론

산업적 실험실 적용에 적합한 nLC-MS 플랫폼을 개발하는 것은 단백질 약물 특성화를 위한 다양한 nLC-MS 방법을 적용함에 있어서 증가하는 관심과 수요로 인해 바이오의약품 커뮤니티에서 큰 관심을 받고 있다. 본 실시예에서, 다양한 nLC 방법과 쉽게 통합될 수 있고 뛰어난 다용성, 감도 및 견고성을 특징으로 하는 신규한 nLC-MS 플랫폼의 개발이 개시된다. 혁신적인 설계를 통해, 개발된 플랫폼이 넣은 범위의 LC 유량(0.1 내지 0.8 mL/분)을 처리하고 높은 염 농도(이동상에서 최대 600 mM)를 견딜 수 있으며, 이는 함께 다양한 nLC 방법을 수용하는 데 있어 달성된 다용성에 기여했음이 입증되었다. 그 다음 이 플랫폼에서 온라인 전하 감소 네이티브 MS를 달성하기 위해 다양한 도펀트-변형된 탈용매화 가스를 탐색했다. 이어서, Cys-연결된 ADC 모사체의 사례 연구는 불안정하고/하거나 이질적인 단백질 분자를 특성화하기 위해 전하 감소 네이티브 MS를 적용하는 것의 적합성과 이점을 보여주었다. 또한, NISTmAb의 크기 및 전하 이질성에 대한 심층적인 특성화는 본 플랫폼을 사용하는 nSEC-MS 및 nIEX-TIC 분석에 의해 달성되었으며 넓은 동적 범위와 뛰어난 감도를 입증했다. 더구나, 본 nLC-MS 플랫폼은 또한 매우 견고하여 장기간(> 24시간)에 걸쳐 연속적인 분석에 적합한 것으로 입증되었다. 마지막으로, 본 플랫폼은 상업적으로 이용 가능한 모든 부품으로 구축되었으므로 일관된 성능을 위해 다른 실험실에서 쉽게 구현될 수 있다.

전반적으로, 다양한 사례 연구에서 단클론 항체 샘플의 분석을 위해 여기에서 입증된 바와 같이, 개발된 접근법은 약물 개발의 다양한 단계에서 단클론 항체 특성화에 대한 계속 증가하는 요구를 더 잘 지원하기 위해 통상적인 접근법에 비해 더 효율적인 방법을 제공한다.

본 발명은 본원에 설명된 특정 실시형태에 의해 범위가 제한되어서는 안 된다. 실제로, 본원에 설명된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형들은 첨부된 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.

Claims

샘플을 분리할 수 있는 액체 크로마토그래피 시스템; 및
상기 액체 크로마토그래피 시스템과 유체 연통하는 전자분무 이온화 질량 분석(ESI-MS) 시스템을 포함하는 네이티브(native) 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템으로서, 상기 ESI-MS 시스템은 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터, 탈용매화 가스를 변형하기 위한 시스템, 및 질량 분석계를 포함하고, 상기 질량 분석계는 이온을 수용하고 이온의 질량 대 전하 비를 특성화하도록 구성된, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제1항에 있어서, 상기 탈용매화 가스를 변형하기 위한 시스템은 캡을 갖는 용기를 포함하고, 상기 캡은 입구 라인 포트와 출구 라인 포트; 시스(sheath) 가스를 상기 입구 라인 포트에 제공하기 위한 시스 가스 입구 라인; 및 상기 변형된 탈용매화 가스 출구 라인 포트를 상기 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터에 연결할 수 있는 변형된 탈용매화 가스 출구 라인을 갖는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제2항에 있어서, 상기 용기는 유기 용매 및 추가의 화학 성분을 포함하는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제3항에 있어서, 상기 추가 화학 성분은 산인, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제4항에 있어서, 상기 산은 트리플루오로아세트산인, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제3항에 있어서, 상기 추가 화학 성분은 염기인, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제6항에 있어서, 상기 염기는 트리에틸아민인, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세토니트릴인, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스 가스는 질소인, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스 가스 입구 라인은 상기 입구 라인 포트 내에 부분적으로 삽입되는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 탈용매화 가스 출구 라인은 상기 출구 라인 포트 내에 부분적으로 삽입되는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스 가스는 상기 시스 가스 입구 라인으로부터 유기 용매를 함유하는 상기 용기를 통해 상기 탈용매화 가스 출구 라인으로 유동하는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터는 8개의 노즐을 포함하는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 포함하는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템은 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 컬럼을 포함하는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템은 상기 액체 크로마토그래피로부터 상기 질량 분석계로의 유량을 조정하기 위한 분석 유동 분할기를 추가로 포함하는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제16항에 있어서, 상기 분석 유동 분할기는 약 1 내지 5 μL/분의 용매 유량을 갖는 전자분무를 제공할 수 있는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석계는 오비트랩 질량 분석기(orbitrap mass analyzer)를 포함하는, 네이티브 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템.
샘플에서 단백질을 특성화하는 방법으로서,
샘플 분리 및 단편화를 할 수 있는 액체 크로마토그래피 시스템에 상기 샘플을 공급하는 단계; 및
상기 액체 크로마토그래피 시스템과 유체 연통하는 전자분무 이온화 질량 분석(ESI-MS) 시스템을 사용하여 단편화된 샘플을 분석하는 단계를 포함하며, 상기 ESI-MS 시스템은 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터, 탈용매화 가스를 변형하기 위한 시스템, 및 질량 분석계를 포함하고, 상기 질량 분석계는 단백질의 성분을 식별하여 단백질을 특성화하기 위해 이온을 수용하고 이온의 질량 대 전하 비를 특성화하도록 구성된 것인, 방법.
제19항에 있어서, 상기 단백질은 항체, 융합 단백질, 재조합 단백질, 또는 이들의 조합인, 방법.
[누락]
제21항에 있어서, 상기 항체는 단클론 항체인, 방법.
제22항에 있어서, 상기 단클론 항체는 아이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 또는 혼합 아이소타입인, 방법.
제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 샘플을 액체 크로마토그래피 시스템에 공급하기 전에 샘플에서 단백질의 탈당화를 필요로 하지 않는, 방법.
제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 고분자량 및 저분자량 불순물을 특성화하기 위한 것인, 방법.
제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탈용매화 가스를 변형하기 위한 시스템은 캡을 갖는 용기를 포함하고, 상기 캡은 입구 라인 포트와 출구 라인 포트; 시스 가스를 상기 입구 라인 포트에 제공하기 위한 시스 가스 입구 라인; 및 변형된 탈용매화 가스 출구 라인 포트를 상기 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터에 연결할 수 있는 변형된 탈용매화 가스 출구 라인을 갖는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 용기는 유기 용매 및 추가의 화학 성분을 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 상기 추가 화학 성분은 산인, 방법.
제28항에 있어서, 상기 산은 트리플루오로아세트산인, 방법.
제27항에 있어서, 상기 추가 화학 성분은 염기인, 방법.
제30항에 있어서, 상기 염기는 트리에틸아민인, 방법.
제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세토니트릴인, 방법.
제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스 가스는 질소인, 방법.
제27항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스 가스 입구 라인은 상기 입구 라인 포트 내에 부분적으로 삽입되는, 방법.
제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 탈용매화 가스 출구 라인은 상기 출구 라인 포트 내에 부분적으로 삽입되는, 방법.
제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스 가스는 상기 시스 가스 입구 라인으로부터 유기 용매를 함유하는 상기 용기를 통해 상기 탈용매화 가스 출구 라인으로 유동하는, 방법.
제26항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-노즐 전자분무 이온화 이미터는 8개의 노즐을 포함하는, 방법.
제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼을 포함하는, 방법.
제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템은 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 컬럼을 포함하는, 방법.
제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피로부터 상기 질량 분석계로의 유량을 조정하기 위한 분석 유동 분할기를 추가로 포함하는, 방법.
제40항에 있어서, 상기 분석 유동 분할기는 약 1 내지 5 μL/분의 용매 유량을 갖는 전자분무를 제공할 수 있는, 방법.
제19항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질량 분석계는 오비트랩 질량 분석기를 포함하는, 방법.