KR20230026434A - 미처리된 c-말단 리신을 정확하게 측정하기 위한 중질 펩티드 접근법 - Google Patents
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Abstract
본 개시내용은 항체와 같은 단백질에서 번역후 변형을 정확하게 측정하는 방법을 제공한다. 특히, 상기 방법은 변형된 펩티드의 정확한 정량화를 허용하도록 보정 곡선을 생성하기 위한 중질 동위원소 표준물을 사용하는 것에 관한 것이다. 상기 방법은 질량 분광법을 사용하여 항체에서 C-말단 절두를 정확하게 정량화하는 데 사용될 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 6월 18일 출원된 미국 특허 가출원 번호 63/041,015의 우선권 및 이익을 주장하며 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 출원은 액체 크로마토그래피-질량 분광법 분석에서 중질 동위원소 표준물을 사용하여 관심 단백질에서 번역후 변형(PTM)을 식별하고 정량화하는 방법에 관한 것이다.
배경
치료용 단클론 항체(mAb) 및 이중특이적 항체(bsAb)는 많은 장애를 치료하는 데 핵심 역할을 한다. 광범위하게 다양한 분자 표적에 대한 높은 특이성 및 친화성을 포함한 이 약물 종류의 장점은 지속적인 개발을 보증하고 무엇보다도 천식, 류마티스성 관절염, 및 향상된 저밀도 지단백질 콜레스테롤과 같은 건강 상태의 치료에 대한 승인으로 이어졌다. 치료용 항체의 상업적이고 과학적인 성공은 전례가 없는 반면, 그들의 고유한 이점은 큰 크기, 복잡성, 및 화학적 이질성에 의해 완화되어, 안전성 및 효능을 평가하는 데 사용될 다양한 방법을 필요하게 만든다.
이들 방법의 상당한 부분은 종종 번역후 변형(PTM), 제품 품질 속성 및 질량 및 전하 이질성의 주요 원천을 평가하는 데 몰두한다. 고감도 질량 분광계 검출기와 계속 증가하는 수의 액체 크로마토그래피 칼럼 화학 및 효소적 처리 조건의 통합은 PTM 특성화 방법의 완성도를 초래하였다. 질량 분광법(MS)-기반 펩티드 맵핑 검정은 최적 조건 하에 예를 들어, 0.1% 미만의 검출 한계로 모든 관련 PTM의 식별화, 위치 결정, 및 정량화를 허용한다.
추출된 이온 크로마토그램(XIC)에 의한 PTM 정량화의 장점은 방법의 정확도 및 정밀도에 영향을 미치는 일부 문제를 동반한다. 대부분의 이러한 문제는 변형된 형태에 비해 비변형된 펩티드의 이온화 차이와 관련된다. 예를 들어, C-말단 K 절두(des-K) 값은 특히 이온화 효율의 차이 및 미처리된 형태(K, z = 2+)와 비교하여 1+로 펩티드의 우세한 전하 상태의 감소로 인해 영향을 받을 수 있다. 미처리된 C-말단 K의 상대 존재비는 전형적으로 K와 des-K의 합계와 관련하여 계산되지만, 이전 노력은 예를 들어, 펩티드 서열의 C-말단 상의 추가 K가 des-K 펩티드에 비해 이온화 효율을 증가시키기 때문에 펩티드 맵핑 정량화 동안 K의 백분율이 과대평가될 수 있음을 발견하였다.
이 오차를 최소화하려는 일부 시도는 가장 풍부한 전하 상태만을 사용하여 각 펩티드에 대한 XIC 곡선하 면적(AUC)를 계산하거나, 또는 동일한 몰량의 각 펩티드를 LC 칼럼에 주입하고 질량 분광계 반응을 측정함으로써 결정된 교정 계수를 사용하는 것을 포함한다. 그러나, 첫번째 방법은 미처리된 C-말단 K 값의 규모를 감소시킬 수 있지만, 이 값을 얼마나 많이 감소시켜야 하는지에 대한 경험적 지식이 없거나 또는 거의 없이 그렇게 한다. 교정 계수 방법은 교정 계수가 잠재적으로 동시 용출 펩티드의 존재 하에, 그리고 상이한 질량 분광계 중에서 미처리된 C-말단 K의 가능한 농도 범위에 걸쳐 정적으로 유지된다는 것을 가정한다. 이러한 계수의 변경은 정적 교정 계수를 사용할 때 보상되지 않을 수 있는 미처리된 C-말단 K에 비해 처리된 측정에서 더 큰 부정확성을 야기할 것이다.
따라서, 변형된 펩티드 및 비변형된 펩티드의 이온화 효율의 차이를 교정하는 관심 단백질에서 PTM의 존재를 정확하게 정량화하는 방법에 대한 요구가 존재한다.
요약
본 발명은 중질 펩티드 접근법을 사용하여 항체와 같은 단백질에서 PTM의 정확하고 정밀한 특성화 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 항체에서 미처리된 C-말단 리신(K)의 정량화 방법을 제공한다. 중질 펩티드 접근법을 사용하여 C-말단 K를 정량화하는 방법이 제공된다.
일부 예시적인 구현예에서, 상기 방법은 (a) 상기 관심 단백질을 포함하는 샘플을 소화 효소와 접촉시켜 펩티드 소화물을 수득하는 단계; (b) 상기 펩티드 소화물에 중질 펩티드 표준물 세트를 첨가하되, 여기서 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물은 상기 번역후 변형을 포함하고 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물은 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 것인, 단계; (c) 상기 펩티드 소화물과 상기 첨가된 중질 펩티드 표준물을 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 사용한 분석에 적용하여 펩티드 소화물 및 중질 펩티드 표준물의 각 펩티드에 상응하는 신호를 획득하는 단계; (d) 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물과 비교하여 상기 번역후 변형을 포함하는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물의 상대 신호를 사용하여 보정 곡선을 생성하는 단계; (e) 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 상기 관심 단백질로부터의 적어도 하나의 펩티드와 비교하여 상기 번역후 변형을 포함하는 상기 관심 단백질로부터의 적어도 하나의 펩티드의 상대 신호를 사용하여 상기 관심 단백질의 번역후 변형을 정량화하는 단계; 및 (f) (d)의 보정 곡선을 사용하여 (e)의 결과를 교정하여 상기 관심 단백질의 상기 번역후 변형을 추가로 정량화하는 단계를 포함한다.
일 측면에서, 관심 단백질은 치료용 단백질이다. 구체적 측면에서, 상기 치료용 단백질은 항체, 가용성 수용체, 항체-약물 접합체, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 측면에서, 상기 관심 단백질은 단클론 항체이다. 또 다른 측면에서, 상기 관심 단백질은 이중특이적 항체이다.
일 측면에서, 상기 번역후 변형은 미처리된 C-말단 리신의 존재이다.
일 측면에서, 상기 중질 펩티드 표준물은 적어도 하나의 다른 중질 펩티드 표준물에 비해 약 1:1 내지 약 1:1000의 몰비로 존재한다. 또 다른 측면에서, 상기 중질 펩티드 표준물은 약 1 내지 약 16개의 중질 동위원소를 포함한다. 추가 측면에서, 상기 중질 펩티드 표준물은 C13, N15, 또는 이의 조합을 포함한다.
일 측면에서, 상기 소화 효소는 트립신이다.
일 측면에서, 상기 액체 크로마토그래피 방법은 역상 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 또는 이의 조합을 포함한다.
일 측면에서, 상기 질량 분광계는 전기분무 이온화 질량 분광계, 나노-전기분무 이온화 질량 분광계, 예컨대 Orbitrap 질량 분광계, Q-TOF 질량 분광계 또는 삼중 사중극자 질량 분광계이며, 여기서 상기 질량 분광계는 상기 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링되고, 여기서 상기 질량 분광계는 LC-MS, LC-MRM-MS, 및/또는 LC-MS/MS 분석을 수행할 수 있다.
본 개시내용은 추가적으로 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 일부 예시적인 구현예에서, 키트는 번역후 변형을 포함하는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물을 포함하는 제1 조성물; 및 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물을 포함하는 제2 조성물을 포함하며, 여기서 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물과 비교하여 상기 번역후 변형을 포함하는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물의 상대 신호는 질량 분광법에 의해 분석될 때 보정 곡선을 생성하는 데 사용될 수 있고, 여기서 상기 보정 곡선은 관심 단백질의 번역후 변형을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
일 측면에서, 상기 번역후 변형은 미처리된 C-말단 리신의 존재이다.
일 측면에서, 상기 중질 펩티드 표준물은 적어도 하나의 다른 중질 펩티드 표준물에 비해 약 1:1 내지 약 1:1000의 몰비로 존재한다. 또 다른 측면에서, 상기 중질 펩티드 표준물은 약 1 내지 약 16개의 중질 동위원소를 포함한다. 추가 측면에서, 상기 중질 펩티드 표준물은 C13, N15, 또는 이의 조합을 포함한다.
일 측면에서, 키트는 적어도 하나의 경질 펩티드 표준물을 추가로 포함한다.
일 측면에서, 키트의 조성물은 수성 매질 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다.
일 측면에서, 조성물은 용기에 제공될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 다른 용기 수단을 포함할 것이며, 그 안에 성분이 배치될 수 있고, 바람직하게는 적합하게 분취될 수 있다. 또 다른 측면에서, 키트의 조성물은 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 및/또는 성분이 건조 분말로서 제공될 때, 분말은 적합한 용매를 첨가하여 재구성될 수 있다. 용매는 또한 또 다른 용기 수단에 제공될 수 있는 것으로 가정된다.
본 발명의 이러한 측면, 및 다른 측면은 하기 설명 및 첨부된 도면과 함께 고려될 때 더 잘 인식되고 이해될 것이다. 하기 설명은, 다양한 구현예 및 이의 다수의 구체적 세부사항을 나타내면서, 제한이 아니라 예시로 주어진다. 많은 치환, 변형, 첨가, 또는 재배열이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다.
도 1a는 예시적인 구현예에 따른 본 발명의 검정의 개략도를 도시한다. "클립핑" 펩티드(C-말단 리신이 결여된 단백질의 C-말단에 상응)는 4개의 "비클립핑" 펩티드(C-말단 리신이 있는 단백질의 C-말단에 상응)와 혼합되어 반응 곡선(보정 곡선) 펩티드 믹스를 형성한다. 그런 다음 이 반응 곡선 펩티드 믹스는 잠재적 항체 제조 샘플(mAb 소화물)을 나타내는 샘플과 혼합되어 항체 샘플에 존재하는 C-말단 리신의 양을 정확하게 정량화한다.
도 1b는 예시적인 구현예에 따른, 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 적용될 때 펩티드 종 각각에 대해 관찰된 분석 피크를 도시한다.
도 2a-2e는 예시적인 구현예에 따른, 13C 및 15N 동위원소(
로 표시됨)를 함유하는 4개의 SLSLSLGK (서열번호: 1) "비클립핑" 중질 펩티드 표준물의 구조를 도시한다. 도 2a-2d에 제시된 동위원소 중쇄(HC) C-말단 펩티드 표준물은 각각 Δ4, Δ8, Δ12, 및 Δ16 K 펩티드이다. 도 2e는 13C 및 15N 동위원소(
로 표시됨)를 함유하는 중질 SLSLSLG (서열번호: 1) 표준물 Δ4 des-K를 예시한다.
도 3은 예시적인 구현예에 따른 "클립핑" 펩티드와 "비클립핑" 펩티드 사이의 비례 관계를 나타내는 보정 곡선(CC)을 도시한다.
도 4는 예시적인 구현예에 따른 중쇄(HC) C-말단 펩티드를 사용한 예시적인 반응 곡선을 도시한다.
도 5a는 예시적인 구현예에 따른 "비클립핑" SLSLPGK (서열번호: 4) 및 "클립핑" SLSLSPG (서열번호: 3)의 등몰 혼합물의 UV 크로마토그램을 도시한다.
도 5b는 예시적인 구현예에 따른 SLSLPGK (서열번호: 4) 및 SLSLSPG (서열번호: 3) 시약 세트의 등몰량의 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 도시한다.
도 1b는 예시적인 구현예에 따른, 액체 크로마토그래피-질량 분광법에 적용될 때 펩티드 종 각각에 대해 관찰된 분석 피크를 도시한다.
도 2a-2e는 예시적인 구현예에 따른, 13C 및 15N 동위원소(
도 3은 예시적인 구현예에 따른 "클립핑" 펩티드와 "비클립핑" 펩티드 사이의 비례 관계를 나타내는 보정 곡선(CC)을 도시한다.
도 4는 예시적인 구현예에 따른 중쇄(HC) C-말단 펩티드를 사용한 예시적인 반응 곡선을 도시한다.
도 5a는 예시적인 구현예에 따른 "비클립핑" SLSLPGK (서열번호: 4) 및 "클립핑" SLSLSPG (서열번호: 3)의 등몰 혼합물의 UV 크로마토그램을 도시한다.
도 5b는 예시적인 구현예에 따른 SLSLPGK (서열번호: 4) 및 SLSLSPG (서열번호: 3) 시약 세트의 등몰량의 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 도시한다.
치료용 단클론 항체(mAb) 및 이중특이적 항체(bsAb)는 많은 장애를 치료하는 데 핵심 역할을 한다. 광범위하게 다양한 분자 표적에 대한 높은 특이성 및 친화성을 포함한 이 약물 종류의 장점은 지속적인 개발을 보증하고 무엇보다도 천식, 류마티스성 관절염, 및 향상된 저밀도 지단백질 콜레스테롤과 같은 건강 상태의 치료에 대한 승인으로 이어졌다. 치료용 항체의 상업적이고 과학적인 성공은 전례가 없는 반면, 그들의 고유한 이점은 큰 크기, 복잡성, 및 화학적 이질성에 의해 완화되어, 안전성 및 효능을 평가하는 데 사용될 다양한 방법을 필요하게 만든다.
이들 방법의 상당한 부분은 PTM, 제품 품질 속성 및 질량 및 전하 이질성의 주요 원천을 평가하는 데 몰두한다. 단일 항체의 PTM 보체는 다양하지만, C-말단 리신 절두, 글리코실화, N-말단 파이로-Glu 형성, 산화, 아미드화, 탈아미드화, 숙신이미드 중간체 형성, 당화, 이성질화, 시스테이닐화, 및 트리술파이드 결합과 같은 공통 변형이 거의 모든 mAb 및 bsAb 중에서 공유된다.
이러한 PTM 수준의 세심한 모니터링은 미리 정의된 허용 기준을 통한 제어를 가능하게 할 수 있고 2가지 뚜렷한 이유로 공통 정략이 되었다. 첫째로, 수많은 보고서는 PTM이 특히, 상보성 결정 영역(CDR)에 위치할 때, 항체의 안정성 및 생체활성에 영향을 미칠 수 있음을 나타내었다. 둘째로, PTM 수준의 변동성은 프로세스 제어의 결여를 나타낼 수 있다.
번역후 변형은 크기 배제 크로마토그래피 다중 각 레이저 광 스캐닝(SEC-MALLS), 모세관 전기영동 나트륨 도데실 술페이트(CE-SDS), 영상화 모세관 등전점 포커싱(iCIEF), 및 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)와 같은 방법을 포함하는 크로마토그래피 및 전기영동 기술로 포괄적 수준에서 검정된다. 이러한 방법은 널리 수용되었지만, 전형적으로 아미노산 서열 내의 특정 위치를 결정하지 않고 가장 풍부한 변형만을 식별한다.
예를 들어, CEX 크로마토그램에서 산성 종은 탈아미드화, 당화, 및 시스테이닐화와 같은 PTM을 함유할 가능성이 가장 높을 것이고, 염기성 종은 미처리된 C-말단 K, 산화, 및 이성질화와 같은 변형으로 구성될 것이다. 그러나, 이러한 PTM의 아미노산 위치는 포괄적 분석에서 확인할 수 없으므로, 이들이 CDR에 위치하는지, 어느 정도 풍부한지를 결정하는 것은 어렵다.
고감도 질량 분광계 검출기와 계속 증가하는 수의 액체 크로마토그래피 칼럼 화학 및 효소적 처리 조건의 통합은 PTM 특성화 방법의 완성도를 초래하였다. 액체 크로마토그래피 질량 분광법(LC-MS)을 통한 항체의 온전한 질량 분석은 부위-특이적 PTM 데이터를 산출하지 않지만, 최소한의 샘플 제조를 필요로 하고 질량 식별의 추가적인 이익과 함께 더 큰 PTM의 분석을 제공할 수 있다.
IdeS, 파파인, GingisKHAN®, 및 FabALACTICA®과 같은 효소를 사용한 디술피드 결합 감소 및/또는 제한된 소화는 샘플 제조 시간을 미미하게 증가시키지만, 전자 이동 해리(ETD) 또는 또 다른 탠덤 질량 분광법(MS/MS 또는 MS2) 접근법을 사용하여 각 소단위를 단편화함으로써 추가로 증가될 수 있는 PTM 위치 결정의 소단위 수준 분해능을 가능하게 한다. 그러나, 넓은 동적 범위에 걸친 PTM의 부위-특이적 위치 결정 및 정량화는 펩티드 맵핑이라 불리는 기술을 사용하여 "상향식"으로 가장 흔히 수행된다.
펩티드 맵핑 방법은 항체의 효소적 소화를 필요로 하며, 액체 크로마토그래피에 의해 분리하고 자외선/가시광선(UV/Vis) 흡광도에 의해 검출된 후 이온화되고 질량 분광계에 주입되는 펩티드 혼합물을 산출한다. 전체 MS 스펙트럼을 획득하고, 펩티드를 선택하고 단편화하여 펩티드의 정체성을 검증하거나 또는 하나 초과의 잠재적인 변형 부위를 함유하는 펩티드에서 PTM의 위치를 결정하는 데 사용되는 MS/MS 스펙트럼을 생산한다. 펩티드 맵핑은 잠재적으로 항체 서열에 대한 제조-관련 인공물에 기여할 수 있고 실험 시간 및 복잡성을 상당히 증가시킬 수 있지만, 일반적으로 부위 특이적일 뿐만 아니라 가장 민감한 PTM 특성화 방법이다.
각 변형의 정량화는 UV를 사용하거나, 또는 질량 분광법으로부터 추출된 이온 크로마토그램(XIC)을 사용하여 수행될 수 있다. UV 정량화는 동시 용출 펩티드에 의해 애매모호하게 되고 본질적으로 현대 질량 분광계보다 덜 민감하다. 이 때문에, XIC-기반 정량화는 정기적으로 수행되고, MS-기반 펩티드 맵핑 검정은 최적 조건 하에 약 0.1% 미만의 검출 한계로 모든 관련 PTM의 식별화, 위치 결정, 및 정량화를 허용한다.
XIC에 의한 PTM 정량화의 장점은 방법의 정확도 및 정밀도에 영향을 미치는 일부 고유한 문제를 동반한다. 대부분의 이러한 문제는 다수의 잠재적인 이유로 인해 변형된 형태에 비해 비변형된 펩티드의 이온화 차이와 관련된다. 동시 용출 펩티드 피크로부터 하나 또는 두 펩티드 형태의 이온 억제가 있을 수 있다. 별도의 체류 시간에서 용출하는 2개의 펩티드 형태 사이의 용매 환경에서 차이가 있을 수 있다. 비변형된 펩티드에 비해 변형된 펩티드 사이에 이온 효율의 차이가 있을 수 있다. 그리고, 마지막으로, 질량 분광계 사이에 변동성이 있을 수 있다. 모든 PTM의 펩티드 맵핑 정량화는 이러한 인자에 영향을 받지만, C-말단 K 절두(des-K) 정량화는 특히 이온화 효율의 차이 및 2+의 우세한 전하 상태를 갖는 미처리된 형태(K)와 비교하여 1+로 펩티드의 우세한 전하 상태의 감소로 인해 영향을 받을 수 있다.
C-말단 K 절두는 포유류 조직 배양 세포로부터 생산하는 동안 카르복시펩티다제 활성으로 인해 용이하게 발생한다. 결과적으로, 재조합 mAb 또는 bsAb에서 우세한 형태는 des-K이다. 미처리된 C-말단 K의 상대 존재비는 전형적으로 K와 des-K의 합계와 관련하여 계산된다. 미처리된 C-말단 K는 CDR에 없고 주사 시 대략 1시간의 반감기로 빠르게 소실되는 것으로 나타났으므로 항체에서 효능 또는 안전성 우려인 것으로 생각되지 않는다. 그러나, 이 PTM의 신중한 모니터링은 프로세스 제어를 입증하고, 보다 염기성 pI 값을 갖는 항체가 또한 조직 흡수 및 혈액 제거를 증가시킬 수 있는 것으로 보고되었다.
이러한 이유로, 미처리된 C-말단 K 측정은 여전히 중요하며, 이전 노력은 펩티드 서열의 C-말단 상의 추가의 K가 des-K 펩티드에 비해 이온화 효율을 증가시키기 때문에 펩티드 맵핑 정량화 동안 K의 백분율이 과대평가될 수 있음을 발견하였다.
이 오차를 최소화하려는 일부 시도는 가장 풍부한 전하 상태만을 사용하여 각 펩티드에 대한 XIC 곡선하 면적(AUC)를 계산하거나, 또는 동일한 몰량의 각 펩티드를 LC 칼럼에 주입하고 질량 분광계 반응을 측정함으로써 결정된 교정 계수를 사용하는 것을 포함한다. 그러나, 첫번째 방법은 미처리된 C-말단 K 값의 규모를 감소시키지만, 이 값을 얼마나 많이 감소시켜야 하는지에 대한 경험적 지식이 없거나 또는 거의 없이 그렇게 한다. 교정 계수 방법은 교정 계수가 잠재적으로 동시 용출 펩티드의 존재 하에, 그리고 상이한 질량 분광계 중에서 미처리된 C-말단 K의 가능한 농도 범위에 걸쳐 정적으로 유지된다는 것을 가정한다. 이러한 계수의 변동은 정적 교정 계수를 사용할 때 보상되지 않을 수 있는 미처리된 C-말단 K에 비해 처리된 측정에서 더 큰 부정확성을 야기할 것이다.
재조합 단백질에서 PTM, 예를 들어 재조합 항체의 미처리된 C-말단 리신을 정확하게 정량화하는 문제를 해결하기 위해, 본원에는 변형된 펩티드와 비변형된 펩티드 사이의 검출 차이를 정규화하도록 보정 곡선을 생성하기 위한 중질 동위원소 펩티드 표준물을 사용하는 방법 및 키트가 기재된다.
본 발명의 예시적인 구현예는 도 1a 및 도 1b에 예시되어 있으며, 여기서 5개의 중질 펩티드가 항체 소화물의 존재 하에 공동배양되어 검출가능한 신호를 생산한다. 검출가능한 신호는 "클립핑" 및 "비클립핑" C-말단 리신(K)의 정확한 측정치를 나타낼 수 있다.
중질 펩티드의 신규 세트 및 분석용 화학법(예를 들어, 액체 크로마토그래피 및 질량 분광법)을 사용하는 본 발명의 검정은 고도로 정확한 측정을 제공하도록 보정될 수 있다. 이 검정 충실도는 복잡한 단백질 분자, 예를 들어, 인간 환자에게 도입되도록 설계된 치료용 항체의 제조에 핵심이다.
본 발명은 또한 본 발명의 검정을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 예시적인 구현예에서, PTM, 예를 들어, C-말단 리신(K)의 존재에 대한 정확하고 진정한 측정치를 결정하기 위한 검정에서 핵심 단계는 적절한 표준물 및 샘플과 혼합될 때, 판독가능한 신호를 제공하도록 충분한 복수의 하나 이상의 중질 펩티드를 사용하는 것이다. 신호는 전형적으로 분석 화학법, 예를 들어, 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS)을 사용하여 측정된다.
따라서, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트의 예시적인 성분은 관심 PTM이 없는 표준 펩티드, 예를 들어, C-말단 리신의 "클립핑"; 관심 PTM이 있는 표준 펩티드, 예를 들어, "비클립핑"; 예를 들어, 본원에 개시된 하기 예시적인 펩티드 중 하나 이상을 포함하는 표준 중질 펩티드("클립핑" 및 "비클립핑"); 및 예를 들어, 보정, 데이터 추출, 분석, 및 해석을 위한 지침을 포함하는 사용 지침을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 중요한 항체 제조 화학법, 제조, 및 제어(CMC) 종점을 개선하기 위한 편리한 테스트 키트 및 지침을 제공한다.
본 발명은 치료용 항체와 같은 치료용 단백질의 미세 구조 및 정확한 아미노산 서열의 정확한 결정을 제공하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 치료용 항체와 같은 임의의 상업적으로 생산된 치료용 단백질의 CMC(화학합성,공장생산, 및 품질관리(Chemistry, Manufacturing, and Controls))를 보완하고 개선한다.
예를 들어, 본 발명은 다수의 항체 요법의 제조 및 산업보호를 개선시킨다. 이러한 항체 요법은 다음을 포함한다: 압식시맙, 아달리무맙, 아달리무맙-atto, ado-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 카나키누맙, 카프로맙 펜데티드, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙(제나팍스(Zenapax)), 다클리주맙(진브리타(Zinbryta)), 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두필루맙, 두르발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에볼로쿠맙, 골리무맙, 골리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 인플릭시맙, 인플릭시맙-abda, 인플릭시맙-dyyb, 이필리무맙 익세키주맙, 메폴리주맙, 나탈리주맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 오빌톡삭시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레슬리주맙, 리툭시맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 토실리주맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 베돌리주맙, 사릴루맙, 리툭시맙, 히알루로니다제구셀쿠맙, 이노투주맙 오조가미신, 아달리무맙-adbm, 겜투주맙 오조가미신, 베바시주맙-awwb, 벤랄리주맙, 에미시주맙-kxwh, 트라스투주맙-dkst, 인플릭시맙-qbtx, 이발리주맙-uiyk, 틸드라키주맙-asmn, 부로수맙-twza, 및 에레누맙-aooe.
본 발명에 따른 다양한 적응증에 대한 다른 관심 치료용 항체는 다음을 포함한다: 눈 장애를 치료하기 위한 아플리바셉트; 실명 및 전이성 결장직장암을 치료하기 위한 릴로나셉트; 가족성 고콜레스테롤혈증 또는 임상적 아테롬성동맥경화 심혈관 질환(ASCVD)을 치료하기 위한 알리로쿠맙; 아토피성 피부염을 치료하기 위한 두필루맙; 류마티스성 관절염 및 COVID-19를 치료하기 위한 사릴루맙; PD-1 관련 질환을 치료하기 위한 세미플리맙; 및 에볼라를 치료하기 위한 항체.
달리 기재되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 당업자에게 알려진 본원에 기재된 것들과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 재료는 본원에 기재된 특정 구현예의 실행에 사용될 수 있다. 언급된 모든 간행물은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
단수형 용어는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하고 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 표준 변경을 허용하는 것으로 이해되어야 하며 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다(include)," "포함한다(includes)," 및 "포함하는(including)"은 비제한적임을 의미하고, 각각 "포함하다(comprise)," "포함한다(comprises)," 및 "포함하는(comprising)"을 의미하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질" 또는 "관심 단백질"은 공유 결합된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함할 수 있다. 단백질은 일반적으로 "폴리펩티드"로 당업계에서 알려진 하나 이상의 아미노산 중합체 쇄를 포함한다. "폴리펩티드"는 아미노산 잔기, 관련된 자연 발생 구조적 변이체, 및 펩티드 결합을 통해 연결된 이의 합성 비-자연 발생 유사체, 관련 자연 발생 구조적 변이체, 및 이의 합성 비-자연 발생 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드"는 비-자연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는 예를 들어, 자동화 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고체 상 펩티드 합성 방법이 당업자에게 알려져 있다. 단백질은 단일 기능 생체분자를 형성하기 위한 하나 또는 다중 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 측면에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디(nanobody), 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 펩티드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 관심 단백질은 생물치료용 단백질, 연구 및 요법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩(trap) 단백질 및 다른 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단클론 항체, 다클론 항체, 인간 항체, 및 이중특이적 항체 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 단백질은 곤충 배큘로바이러스 시스템, 효모 시스템(예를 들어, 피키아 종(Pichia sp.)), 또는 포유류 시스템(예를 들어, CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 유도체)과 같은 재조합 세포-기반 생산 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 생물치료용 단백질 및 그의 생산을 논의하는 최근 리뷰에 대해, Ghaderi 등, "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," (Darius Ghaderi 등, Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28 BIOTECHNOLOGY AND GENETIC ENGINEERING REVIEWS 147-176 (2012), 전체 교시가 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 단백질은 조성 및 용해도에 기초하여 분류될 수 있고 따라서 구형 단백질 및 섬유 단백질과 같은 단순 단백질; 핵단백질, 당단백질, 점액단백질, 발색단백질, 인단백질, 금속단백질, 및 지단백질과 같은 접합 단백질; 및 1차 유래 단백질 및 2차 유래 단백질과 같은 유래 단백질을 포함할 수 있다.
일부 예시적인 구현예에서, 관심 단백질은 재조합 단백질, 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 단클론 항체, 융합 단백질, scFv 및 이의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 단백질"은 적합한 숙주 세포에 도입된 재조합 발현 벡터 상에 운반된 유전자의 전사 및 번역의 결과로서 생산된 단백질을 지칭한다. 특정 예시적인 구현예에서, 재조합 단백질은 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화, 또는 완전 인간 항체일 수 있다. 특정 예시적인 구현예에서, 재조합 단백질은 IgG, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE로 이루어진 군으로부터 선택된 이소형의 항체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩티드 쇄, 뿐만 아니라 이의 다량체(예를 들어, IgM)를 포함하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3인 3개의 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 CL1인 하나의 도메인을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 다음 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 본 발명의 상이한 구현예에서, 항-big-ET-1 항체(또는 이의 항원-결합 부분)의 FR은 인간 생식계열 서열과 동일할 수 있거나 또는 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 2개 이상의 CDR의 병렬 분석에 기반하여 정의될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은 예를 들어, 단백질분해 소화와 같은 임의의 적합한 표준 기술 또는 항체 가변 및 임의적으로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전자 조작 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 알려져 있고/있거나 예를 들어, 상업적 공급처, DNA 라이브러리(예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 용이하게 이용가능하거나, 또는 합성될 수 있다. DNA는 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성으로 배열하거나, 또는 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산을 변형시키거나, 첨가하거나 또는 결실시키기 위해 등 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 서열분석되고 조작될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체 단편"은 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디(diabody), dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR) 영역, 뿐만 아니라 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 조합이며, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 쇄 폴리펩티드 분자이다. 일부 예시적인 구현예에서, 항체 단편은 모 항체가 그러하듯이 동일한 항원에 결합하는 단편인 모 항체의 충분한 아미노산 서열을 포함하며; 일부 예시적인 구현예에서, 단편은 모 항체의 것과 필적할만한 친화성을 갖는 항원에 결합하고/하거나 항원에 대한 결합에 대해 모 항체와 경쟁한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있고/있거나 부분적 항체 서열을 암호화하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 항체 단편은 임의적으로 단일 쇄 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 항체 단편은 예를 들어, 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 다중 쇄를 포함할 수 있다. 항체 단편는 임의적으로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개 아미노산을 포함하고 보다 전형적으로 적어도 약 200개 아미노산을 포함한다.
용어 "이중특이적 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 2개의 상이한 중쇄를 포함하며 각각의 중쇄는 2개의 상이한 분자(예를 들어, 항원) 또는 동일한 분자(예를 들어, 동일한 항원) 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체가 2개의 상이한 에피토프(첫번째 에피토프 및 두번째 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 첫번째 에피토프에 대한 첫번째 중쇄의 친화성은 일반적으로 두번째 에피토프에 대한 첫번째 중쇄의 친화성보다 적어도 1 내지 2, 3, 4 자릿수 더 낮을 것이며, 반대의 경우도 마찬가지이다. 이중특이적 항체는 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다.
전형적인 이중특이적 항체는 각각이 3개의 중쇄 CDR을 갖는 2개의 중쇄, 이어서 CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인, 및 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각 중쇄와 회합할 수 있거나, 또는 각 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 또는 각 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 중 하나 또는 둘 다가 하나 또는 두 에피토프에 결합하게 할 수 있는 면역글로불린 경쇄를 갖는다. BsAb는 Fc 영역(IgG-유사)을 보유하는 것 및 Fc 영역이 결여된 것의 2가지 주요 부류로 나눠질 수 있으며, 후자는 정상적으로 Fc를 포함하는 IgG 및 IgG-유사 이중특이적 분자보다 더 작다. IgG-유사 bsAb는 트리오맙(triomab), 놉 인투 홀(knobs into holes) IgG(kih IgG), 크로스맵(crossMab), orth-Fab IgG, 이중-가변 도메인 Ig(DVD-Ig), 투 인 원(two-in-one) 또는 이중 작용 Fab(DAF), IgG-단일 쇄 Fv(IgG-scFv), 또는 κλ-바디와 같으나 이에 제한되지 않는 상이한 형식을 가질 수 있다. 비-IgG-유사 상이한 형식은 탠덤 scFv, 디아바디 형식, 단일 쇄 디아바디, 탠덤 디아바디(TandAb), 이중-친화성 재표적화 분자(DART), DART-Fc, 나노바디, 또는 결합 및 잠금(DNL) 방법에 의해 생산된 항체를 포함한다(Gaowei Fan, Zujian Wang & Mingju Hao, Bispecific antibodies and their applications, 8 JOURNAL OF HEMATOLOGY & ONCOLOGY 130; 
& Roland E. Kontermann, Bispecific Antibodies, HANDBOOK OF THERAPEUTIC ANTIBODIES 265-310 (2014), 전체 교시가 본원에 참조로 포함됨). bsAb를 생산하는 방법은 2개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합, 화학적 가교-링커를 수반하는 화학적 접합, 및 재조합 DNA 기술을 활용하는 유전적 접근법에 기반한 쿼드로마 기술에 제한되지 않는다. bsAb의 예는 하기 특허 출원에 개시된 것들을 포함하며, 이들은 본원에 참조로 포함된다: 2010년 6월 25일 출원된 미국 일련 번호 12/823838; 2012년 6월 5일 출원된 미국 일련 번호 13/ 488628; 2013년 9월 19일 출원된 미국 일련 번호 14/031075; 2015년 7월 24일 출원된 미국 일련 번호 14/808171; 2017년 9월 22일 출원된 미국 일련 번호 15/713574; 2017년 9월 22일 출원된 미국 일련 번호 15/713569; 2016년 12월 21일 출원된 미국 일련 번호 15/386453; 2016년 12월 21일 출원된 미국 일련 번호 15/386443; 2016년 7월 29일 출원된 미국 일련 번호 15/22343; 및 2017년 11월 15일 출원된 미국 일련 번호 15814095. 낮은 수준의 동종이량체 불순물은 이중특이적 항체의 제조 동안 여러 단계에서 존재할 수 있다. 이러한 동종이량체 불순물의 검출은 동종이량체 불순물의 낮은 존재비 및 정규 액체 크로마토그래피 방법을 사용하여 수행될 때 이러한 불순물과 주요 종의 동시 용출로 인해 혼전한 질량 분석을 사용하여 수행될 때 어려울 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 분자는 정상적으로 2개의 항원에만 결합할 것이지만(즉, 이중특이적 항체, bsAb), 삼중특이적 항체 및 KIH 삼중특이성과 같은 추가의 특이성을 갖는 항체가 또한 본원에 개시된 시스템 및 방법에 의해 다뤄질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "단클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 단클론 항체는 당업계에서 이용가능하거나 또는 알려진 임의의 수단에 의해, 임의의 진핵생물, 원핵생물, 또는 파지 클론을 포함하여 단일 클론으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 단클론 항체는 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이의 조합의 사용을 포함하여 당업계에 알려진 매우 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
어구 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 관심 단백질을 코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 이러한 용어는 특정 대상체 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 것을 의도됨이 이해되어야 한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손을 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 바와 같은 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 구현예에서, 숙주 세포는 생명계 중 임의의 것으로부터 선택된 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함한다. 일 측면에서, 진핵생물 세포는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포를 포함한다. 추가 측면에서, 숙주 세포는 식물 및/또는 동물 세포와 같은 진핵생물 세포를 포함한다. 세포는 포유류 세포, 어류 세포, 곤충 세포, 양서류 세포 또는 조류 세포일 수 있다. 특정 측면에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 배양물에서 성장하기에 적합한 다양한 포유류 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(버지니아주 머내서스) 및 다른 보관소 뿐만 아니라 상업적 공급처로부터 이용가능하다. 본 발명의 과정에 사용될 수 있는 세포는 MK2.7 세포, PER-C6 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 예컨대 CHO-K1(ATCC CCL-61), DG44(Chasin 등, 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar 등, 1997, Biochemistry, 36: 10901-10909; 및 WO 01/92337 A2), 디하이드로폴레이트 환원효소 음성 CHO 세포(CHO/-DHFR, Urlaub 및 Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), 및 dp12.CHO 세포(미국 특허 번호 5,721,121); 원숭이 신장 세포(CV1, ATCC CCL-70); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS 세포, COS-7, ATCC CRL-1651); HEK 293 세포, 및 Sp2/0 세포, 5L8 하이브리도마 세포, Daudi 세포, EL4 세포, HeLa 세포, HL-60 세포, K562 세포, Jurkat 세포, THP-1 세포, Sp2/0 세포, 1차 상피 세포(예를 들어, 각질세포, 자궁경부 상피 세포, 기관지 상피 세포, 기관 상피 세포, 신장 상피 세포 및 망막 상피 세포) 및 확립된 세포주 및 그들의 균주(예를 들어, 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 293 세포, 또는 현탁 배양물에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham 등, 1977, J. Gen. Virol., 36:59); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL-10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23:243-251); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL-2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL-34); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL-75); 인간 간종양 세포(HEP-G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL-51); 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL-1442); TRI 세포(Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383:44-68); MCR 5 세포; FS4 세포; PER-C6 망막 세포, MDBK(NBL-1) 세포, 911 세포, CRFK 세포, MDCK 세포, BeWo 세포, Chang 세포, Detroit 562 세포, HeLa 229 세포, HeLa S3 세포, Hep-2 세포, KB 세포, LS 180 세포, LS 174T 세포, NCI-H-548 세포, RPMI 2650 세포, SW-13 세포, T24 세포, WI-28 VA13, 2RA 세포, WISH 세포, BS-C-I 세포, LLC-MK2 세포, 클론 M-3 세포, 1-10 세포, RAG 세포, TCMK-1 세포, Y-1 세포, LLC-PK1 세포, PK(15) 세포, GH1 세포, GH3 세포, L2 세포, LLC-RC 256 세포, MH1C1 세포, XC 세포, MDOK 세포, VSW 세포, 및 TH-I, B1 세포, 또는 이의 유도체), 임의의 조직 또는 기관으로부터의 섬유모세포 세포(간, 신장, 결장, 장, 식도, 위, 신경 조직(뇌, 척수), 폐, 혈관 조직(동맥, 정맥, 모세혈관), 림프 조직(림프선, 아데노이드, 편도선, 골수, 및 혈액), 비장, 및 섬유모세포 및 섬유모세포-유사 세포주(예를 들어, TRG-2 세포, IMR-33 세포, Don 세포, GHK-21 세포, 시트룰린혈증 세포, Dempsey 세포, Detroit 551 세포, Detroit 510 세포, Detroit 525 세포, Detroit 529 세포, Detroit 532 세포, Detroit 539 세포, Detroit 548 세포, Detroit 573 세포, HEL 299 세포, IMR-90 세포, MRC-5 세포, WI-38 세포, WI-26 세포, MiCl1 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, COS-3 세포, COS-7 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); DBS-FrhL-2 세포, BALB/3T3 세포, F9 세포, SV-T2 세포, M-MSV-BALB/3T3 세포, K-BALB 세포, BLO-11 세포, NOR-10 세포, C3H/IOTI/2 세포, HSDM1C3 세포, KLN205 세포, McCoy 세포, 마우스 L 세포, 균주 2071(마우스 L) 세포, L-M 균주(마우스 L) 세포, L-MTK(마우스 L) 세포, NCTC 클론 2472 및 2555, SCC-PSA1 세포, Swiss/3T3 세포, 인도 문착 세포, SIRC 세포, CII 세포, 및 Jensen 세포, 또는 이의 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않음) 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 세포 유형을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료용 단백질"은 질환 또는 장애의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다. 치료용 단백질은 약리학적 효과를 갖는 임의의 단백질, 예를 들어, 항체, 가용성 수용체, 항체-약물 접합체, 또는 효소일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "액체 크로마토그래피"는 액체에 의해 운반되는 생물학적/화학적 혼합물이 정지된 액체 또는 고체 상을 통해(또는 내로) 흐를 때 성분의 차등 분포 결과로서 성분으로 분리될 수 있는 프로세스를 지칭한다. 액체 크로마토그래피의 비제한적인 예는 역상 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "질량 분광계"는 특이적 분자 종을 식별하고 그들의 정확한 질량을 측정할 수 있는 장치를 포함한다. 상기 용어는 폴리펩티드 또는 펩티드가 특성화될 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하는 것을 의미한다. 질량 분광계는 이온 소스, 질량 분석기, 및 검출기의 3가지 주요 부분을 포함할 수 있다. 이온 소스의 역할을 기체 상 이온을 생성하는 것이다. 분석물 원자, 분자, 또는 클러스터는 기체 상으로 옮겨지고 동시에(전기분무 이온화에서와 같이) 또는 개별 프로세스를 통해 이온화될 수 있다. 이온 소스의 선택은 적용에 따라 다르다.
일부 예시적인 구현예에서, 질량 분광계는 탠덤 질량 분광계일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "탠덤 질량 분광법"은 샘플 분자에 대한 구조적 정보가 질량 선택 및 질량 분리의 다중 단계를 사용하여 수득되는 기술을 포함한다. 전제 조건은 첫번째 질량 선택 단계 후 단편이 예측가능하고 제어가능한 방식으로 형성되도록 샘플 분자가 기체 상 내로 변환되고 이온화되는 것이다. 다중단계 MS/MS, 또는 MSn은 유의미한 정보를 수득할 수 있거나, 또는 단편 이온 신호가 검출가능할 수 있는 한, 먼저 전구체 이온(MS2)을 선택 및 단리하고, 이를 단편화하고, 1차 단편 이온(MS3)을 단리하고, 이를 단편화하고, 2차 단편(MS4)을 단리하는 등으로 수행될 수 있다. 탠덤 MS는 매우 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 특정 적용을 위해 조합하는 어떤 분석기는 민감도, 선택성, 및 속도, 뿐만 아니라 크기, 비용, 및 이용가능성과 같은 많은 상이한 인자에 의해 결정될 수 있다. 탠덤 MS 방법의 2가지 주요 범주는 탠덤 공간(tandem-in-space) 및 탠덤 시간(tandem-in-time)이지만, 탠덤 시간 분석기가 공간에서 또는 탠덤 공간 분석기와 커플링되는 하이브리드도 있다. 탠덤 공간 질량 분광계는 이온 소스, 전구체 이온 활성화 장치, 및 적어도 2개의 비-포획 질량 분석기를 포함한다. 특이적 m/z 분리 기능은 기기의 하나의 섹션에서 이온이 선택되고, 중간 영역에서 해리된 다음, 생성 이온이 m/z 분리 및 데이터 획득을 위한 또 다른 분석기로 전송되도록 설계될 수 있다. 탠덤 시간에서, 이온 소스에서 생산된 질량 분광계 이온은 동일한 물리적 장치에서 포획, 단리, 단편화, m/z 분리될 수 있다. 질량 분광계에 의해 식별된 펩티드는 온전한 단백질 및 그들의 번역후 변형의 대리 대표자로서 사용될 수 있다. 이들은 실험적 및 이론적 MS/MS 데이터를 연관시켜 단백질 특성화에 사용될 수 있으며, 후자는 단백질 서열 데이터베이스에서 가능한 펩티드로부터 생성된다. 특성화는 단백질 단편의 아미노산 서열분석, 단백질 서열분석 결정, 단백질 드 노보(de novo) 서열분석 결정, 번역후 변형 위치 찾기, 또는 번역후 변형, 또는 비교가능성 분석 식별, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "데이터베이스"는 예를 들어 FASTA 형식의 파일 형태로 샘플에 존재할 가능성이 있는 단백질 서열의 컴파일된 콜렉션을 지칭한다. 관련 단백질 서열은 연구 중인 종의 cDNA 서열로부터 유래될 수 있다. 관련 단백질 서열을 검색하는 데 사용될 수 있는 공개 데이터베이스는 예를 들어, Uniprot 또는 Swiss-prot에 의해 호스팅된 데이터베이스를 포함한다. 데이터베이스는 본원에서 "생물정보학 도구"로 지칭되는 것을 사용하여 검색될 수 있다. 생물정보학 도구는 데이터베이스(들)의 모든 가능한 서열에 대한 해석되지 않은 MS/MS 스펙트럼을 검색하는 능력을 제공하고, 해석된(주석이 달린) MS/MS 스펙트럼을 출력으로 제공한다. 이러한 도구의 비제한적인 예는 Mascot(www.matrixscience.com), Spectrum Mill(www.chem.agilent.com), PLGS(www.waters.com), PEAKS(www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot(download. appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx(www.phenyx-ms.com), Sorcerer(www.sagenresearch.com), OMSSA(www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/), X!Tandem(www.thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector(prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm), Byonic(www.proteinmetrics.com/products/byonic) 또는 Sequest(fields.scripps.edu/sequest)이다.
일부 예시적인 구현예에서, 질량 분광계는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링될 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 질량 분광계는 액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링 시스템에 커플링될 수 있다. 보다 일반적으로, 질량 분광계는 연속 반응 모니터링(CRM) 및 병렬 반응 모니터링(PRM)을 포함한 선택된 반응 모니터링(SRM)에 의해 분석할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "다중 반응 모니터링" 또는 "MRM"은 높은 민감도, 특이성 및 넓은 동적 범위를 갖는 복잡한 매트릭스 내의 소분자, 펩티드, 및 단백질을 정확하게 정량화할 수 있는 질량 분광법-기반 기술을 지칭한다(Paola Picotti & Ruedi Aebersold, Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions, 9 NATURE METHODS 555-566 (2012)). MRM은 전형적으로 삼중 사중극자 질량 분광계로 수행될 수 있으며 여기서 선택된 소분자/펩티드에 상응하는 전구체 이온은 첫번째 사중극자에서 선택되고 전구체 이온의 단편 이온은 세번째 사중극자에서 모니터링하기 위해 선택되었다(Yong Seok Choi 등, Targeted human cerebrospinal fluid proteomics for the validation of multiple Alzheimers disease biomarker candidates, 930 JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B 129-135 (2013)).
일부 측면에서, 본 출원의 방법 또는 시스템에서 질량 분광계는 전기분무 이온화 질량 분광계, 나노-전기분무 이온화 질량 분광계, 또는 삼중 사중극자 질량 분광계일 수 있으며, 여기서 질량 분광계는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링될 수 있고, 여기서 질량 분광계는 LC-MS(액체 크로마토그래피-질량 분광법) 또는 LC-MRM-MS(액체 크로마토그래피-다중 반응 모니터링-질량 분광법) 분석을 수행할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소화"는 단백질의 하나 이상의 펩티드 결합의 가수분해를 지칭한다. 적절한 가수분해제를 사용하여 샘플 내 단백질의 소화, 예를 들어, 효소적 소화 또는 비-효소적 소화를 수행하는 여러 접근법이 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소화 효소"는 단백질의 소화를 수행할 수 있는 다수의 상이한 제제 중 임의의 것을 지칭한다. 효소적 소화를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적인 예는 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus Saitoi)로부터의 프로테아제, 엘라스타제, 서브틸리신, 프로테아제 XIII, 펩신, 트립신, Tryp-N, 키모트립신, 아스페르길로펩신 I, LysN 프로테아제(Lys-N), LysC 엔도프로테이나제(Lys-C), 엔도프로테이나제 Asp-N(Asp-N), 엔도프로테이나제 Arg-C(Arg-C), 엔도프로테이나제 Glu-C(Glu-C) 또는 외부 막 단백질 T(OmpT), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 면역글로불린-분해 효소(IdeS), 써모리신, 파파인, 프로나제, V8 프로테아제 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 상동체 또는 이의 조합을 포함한다. 단백질 소화를 위해 이용가능한 기술을 논의하는 최근 리뷰에 대해 Switazar 등, "Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments" (Linda Switzar, Martin Giera & Wilfried M. A. Niessen, Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments, 12 JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH 1067-1077 (2013))를 참조한다.
소화 효소의 양 및 소화에 필요한 시간은 적절하게 선택될 수 있다. 효소 대 기질 비율이 부적절하게 높은 경우, 상응하는 높은 소화율은 펩티드가 질량 분광계에 의해 분석될 충분한 시간을 허용하지 않을 것이며, 서열 적용범위가 손상될 것이다. 반면에, 낮은 효소 대 기질 비율은 긴 소화 시간 및 이에 따른 긴 데이터 획득 시간을 요구할 것이다. 효소 대 기질 비율은 약 1:0.5 내지 약 1:200 범위일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 일반 용어 "번역후 변형" 또는 "PTM"은 리보솜 합성 동안(공동 번역 변형) 또는 후(번역후 변형) 폴리펩티드가 겪는 공유 변형을 지칭한다. PTM은 일반적으로 특이적 효소 또는 효소 경로에 의해 도입된다. 대다수가 단백질 백본 내의 특이적 특성의 단백질 서열(시그니처 서열)의 부위에서 발생한다. 수백개의 PTM이 기록되었고, 이러한 변형은 단백질의 구조 또는 기능의 일부 측면에 변함없이 영향을 미친다(Walsh, G. "Proteins" (2014) 제2 판형, Wiley and Sons, Ltd.에 의해 공개됨, ISBN: 9780470669853). 다양한 번역후 변형은 절단, N-말단 확장, 단백질 분해, N-말단의 아실화, 비오티닐화(비오틴으로 리신 잔기의 아실화), C-말단의 아미드화, 글리코실화, 요오드화, 보결 기의 공유 부착, 아세틸화(일반적으로 단백질의 N-말단에서 아세틸 기의 첨가), 알킬화(일반적으로 리신 또는 아르기닌 잔기에서 알킬 기(예를 들어 메틸, 에틸, 프로필)의 첨가), 메틸화, 아데닐화, ADP-리보실화, 폴리펩티드 쇄 내, 또는 사이에 공유 가교 결합, 술포닐화, 프레닐화, 비타민 C 의존적 변형(프롤린 및 리신 하이드록실화 및 카르복시 말단 아미드화), 비타민 K 의존적 변형 여기서 비타민 K는 γ-카르복시글루타메이트의 형성을 초래하는 글루탐산 잔기(glu 잔기)의 카르복실화의 보조인자임, 글루타밀화(글루탐산 잔기의 공유 결합), 글리실화(공유 결합 글리신 잔기), 글리코실화(당단백질을 초래하는, 아스파라긴, 하이드록시리신, 세린, 또는 트레오닌에 글리코실 기의 첨가), 이소프레닐화(파르네솔 및 게라닐게라니올과 같은 이소프레노이드 기의 첨가), 리포일화(리포에이트 작용기의 부착), 포스포판테테이닐화(지방산, 폴리케티드, 비-리보솜 펩티드 및 류신 생합성에서와 같이, 보조효소 A로부터의 4-포스포판테테이닐 모이어티의 첨가), 인산화(일반적으로 세린, 티로신, 트레오닌 또는 히스티딘에 포스페이트 기의 첨가), 및 황산화(일반적으로 티로신 잔기에 술페이트 기의 첨가)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 아미노산의 화학적 성질을 변화시키는 번역후 변형은 시트룰린화(탈이민화에 의해 아르기닌에서 시트룰린으로의 전환), 및 탈아미드화(글루타민에서 글루탐산으로의 전환 또는 아스파라긴에서 아스파르트산으로의 전환)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 구조적 변화를 수반하는 번역후 변형은 디술피드 가교 형성(2개의 시스테인 아미노산의 공유 결합) 및 단백질분해 절단(펩티드 결합에서 단백질의 절단)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 구현예에서, 번역후 변형은 단백질 C-말단에서 리신의 절단이다. 특정 번역후 변형은 ISG화(ISG15 단백질(인터페론-자극 유전자)에 공유 결합), SUMO화(SUMO 단백질(작은 유비퀴틴-관련 조절제)에 공유 결합) 및 유비퀴틴화(단백질 유비퀴틴에 공유 결합)와 같은 다른 단백질 또는 펩티드의 첨가를 수반한다. UniProt에 의해 엄선된 PTM의 보다 상세하게 제어된 어휘에 대해 European Bioinformatics InstituteProtein Information ResourceSIB Swiss Institute of Bioinformatics, European Bioinformatics Institute Drs - Drosomycin precursor - Drosophila melanogaster (Fruit fly) - Drs gene & PROTEIN, http://www.uniprot.org/docs/ptmlist를 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "C 말단 리신(K)" 또는 "K 펩티드"는 아미노산 서열의 단부에 존재하거나 또는 부재할 수 있는 아미노산 리신 잔기 또는 "K" 잔기를 지칭한다. 예시적인 구현예에서, C 말단 리신은 항체의 중쇄 상에 있다. 용어 "절두된 펩티드" 또는 "(des-K)"는 C-말단 리신(K)이 누락된 C-말단 아미노산 서열을 갖는 단백질의 대표적인 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비클립핑"은 C-말단 서열이 말단 리신(K) 아미노산 잔기를 갖는 단백질 C-말단 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "클립핑"은 C-말단 서열에 말단 리신(K) 아미노산 잔기가 누락된 단백질 C-말단 서열을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "K 펩티드의 백분율을 분석하고 정량화하는"은 단백질 서열의 C-말단 리신의 상대적 존재 또는 부재를 확인하기에 충분한 제1 및 제2 검정 신호 사이의 차이를 비교하는 것을 지칭한다. 예시적인 구현예에서, 단백질 서열은 항체 중쇄이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중질 펩티드"는 펩티드의 적어도 하나 이상의 탄소 또는 질소 원자가 이의 중질 동위원소, 예를 들어, 13C 및 15N 동위원소인, 본 발명의 임의의 펩티드, 또는 이의 등가물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "펩티드 소화물"은 단백질을 단백질 서열을 소화할 수 있는 하나 이상의 효소와 접촉시킴으로써 생성된 펩티드의 믹스를 지칭한다. 예시적인 구현예에서, 펩티드 소화물은 소화된 단백질의 C-말단을 나타내는 폴리펩티드 서열을 포함한다.
본 발명은 상술된 관심 단백질(들), 치료용 단백질(들), 재조합 단백질(들), 재조합 숙주 세포(들), 항체(들), 액체 크로마토그래피 시스템(들), 질량 분광계(들), 데이터베이스(들), 생물정보학 도구(들), 소화 효소(들), 번역후 변형(들), 또는 중질 펩티드(들) 중 임의의 것에 제한되지 않고, 임의의 관심 단백질(들), 치료용 단백질(들), 재조합 단백질(들), 재조합 숙주 세포(들), 항체(들), 액체 크로마토그래피 시스템(들), 질량 분광계(들), 데이터베이스(들), 생물정보학 도구(들), 소화 효소(들), 번역후 변형(들), 또는 중질 펩티드(들)가 임의의 적합한 수단에 의해 선택될 수 있음이 이해된다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해될 것이다. 그러나, 이들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
재료 및 방법. 본 발명은, 당업자에 의해 실행될 때, 예를 들어, Sambrook 등 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd ed. 2001; Ausubel 등 "Short Protocols in Molecular Biology", 5th ed. 1995; "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc.; MacPherson, Hames and Taylor (eds.). "PCR 2: A practical approach", 1995; "Harlow and Lane (eds.) "Antibodies, a Laboratory Manual" 1988; Freshney (ed.) "Culture of Animal Cells", 4th ed. 2000; "Methods in Molecular Biology" vol. 149 (John Crowther의 "The ELISA Guidebook") Humana Press 2001, 및 이들 논문의 이후 판형(예를 들어, Michael Green의 "Molecular Cloning"(4th Ed. 2012) 및 Freshney의 "Culture of Animal Cells"(7th Ed., 2015), 뿐만 아니라 현재 전자 버전에 기재된 바와 같이, 약제학적 화학, 면역학, 분자 생물학, 세포 생물학, 재조합 DNA 기술, 및 검정 기술 분야의 통상정인 기술을 사용할 수 있다.
단백질에서 PTM을 정량화하고 분석하는 데 유용한 방법이 본 개시내용 내에 제공된다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 단백질, 예를 들어, 항체에서 C-말단 리신(K)을 정량화하고 분석하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 중질 C-말단 펩티드 표준물의 세트를 소화된 단백질에 적용하는 것을 포함한다. 단백질은 트립신 및 다른 적합한 효소와 같은 프로테아제에 의해 소화될 수 있다.
본 발명의 방법은 보정 곡선을 항체 소화물에 스파이킹하고 대략 등몰량의 중질 des-K 펩티드를 각 LC-MS/MS 실행에서 칼럼의 소화된 des-K 펩티드에 주입하는 것을 수반할 수 있다. 미처리된 C-말단 K는 단일 LC-MS/MS 펩티드 맵핑 실험에서 정량화될 수 있다.
본 발명의 방법은 약 1:1000-1:1 K 대 des-K 펩티드의 비율 범위에 걸쳐 있는 보정 곡선을 생성하는 것을 수반할 수 있다. 보정 곡선은 약 10% 미만, 약 9% 미만, 또는 약 8% 미만의 오차를 가질 수 있다.
질량 스펙트럼은 예를 들어, Thermo Q-Exactive Plus 3, Q-Exactive Plus 4 또는 Orbitrap Fusion Lumos 질량 분광계와 같은 다양한 분광계를 사용하여 정량화될 수 있다.
하기 작업 실시예는 재조합 단백질에서 PTM을 식별하고 정량화하기 위한 예시적인 방법을 입증한다.
실시예 1. 보정을 위한 검정 설계 및 방법
이 실시예는 PTM으로 변형된 펩티드 및 상기 PTM이 없는 동일한 펩티드의 비율을 정확하게 평가하도록 보정 곡선을 생성하기 위한 본 발명의 검정의 실험 설계를 보여준다.
모든 경질 및 중질 동위원소 펩티드 표준물은 New England Peptide(매사추세츠주 가드너)로부터 구입하였다. 트리플루오로아세트산(TFA), 포름산(FA), 트리스 [2-카르복실에틸] 포스핀 하이드로클로라이드(TCEP-HCl), 및 Optima LC/MS 등급 아세토니트릴(ACN)은 Thermo Fisher Scientific(일리노이주 록퍼드)으로부터 수득한 반면 빙초산 및 요오도아세트아미드(IAM)는 Sigma-Aldrich(미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. 서열분석 등급 변형된 트립신, 초순수 우레아, 및 초순수 1 M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(Tris-HCl)는 각각 Promega(위스콘신주 매디슨), Alfa Aesar(매사추세츠주 헤이브릴), 및 Invitrogen(캘리포니아주 칼즈배드)으로부터 구입하였다. Milli-Q 물은 Millipore Milli-Q Advantage A10 정수 시스템에 의해 정제하였다.
동위원소 HC C-말단 펩티드 표준물을 사용하여 상응하는 경질 미처리된 펩티드와 처리된 펩티드 사이의 질량 분광계 반응을 정규화하였다. 펩티드 표준물은 SLSLSLG (서열번호: 1), SLSLSLGK (서열번호: 2), SLSLSPG (서열번호: 3) 및 SLSLSPGK (서열번호: 4)를 포함하였다.
중질 동위원소 SLSLSLGK (서열번호: 2) 표준물은 도 1에 제시되어 있다. 13C 및 15N은 
로 표시된다. Δ4(예를 들어, 탄소 또는 질소의 4개의 중질 동위원소 포함), Δ8, Δ12, 및 Δ16 K 펩티드는 각각 도 1a, 1b, 1c 및 1d에 제시되어 있다. 중질 동위원소 SLSLSLG (서열번호: 1) 표준물인 Δ4 des-K는 도 2에 제시되어 있다. 13C 및 15N은 
로 표시된다.
펩티드 표준물을 10% ACN, 0.1% TFA에 용해시키고 C-말단 서열에 따라 2개의 보정 곡선 세트로 조합하였다(LGK 또는 PGK). 각 세트는 등몰 농도의 Δ4 des-K 및 K 펩티드 뿐만 아니라 Δ8, Δ12, 및 Δ16 K 펩티드를 각각 1:10, 1:100, 및 1:1000 K 대 des-K의 몰비로 함유하였다. 혼합물을 도 3에 제시된 바와 같이 XIC로 분석하였다.
SLSLSPGK (서열번호: 4) 및 SLSLSPG (서열번호: 3)의 등몰 혼합물을 도 4a에 제시된 바와 같이, UV 크로마토그래피로 정량화하였다. PGK 펩티드에 대한 상응하는 K AUC/des-K AUC 값은 1.08이었다. 유사하게, LGK 펩티드에 대한 K AUC/des-K AUC 값은 1.07이었다. 등몰량의 SLSLSPGK (서열번호: 4) 및 SLSLSPG (서열번호: 3) 시약 세트를 도 4b에 제시된 바와 같이, XIC로 정량화하였다. PGK 및 LGK 펩티드에 대한 중질 AUC/경질 AUC 값은 표 1에 제시되어 있다.
표 1.
표 1에 제시된 바와 같이, 중질 펩티드의 신호는 상응하는 경질 펩티드와 거의 동일하였으며, 이는 경질 펩티드에 적용될 수 있는 보정 곡선을 생성하는 데 있어서 중질 펩티드의 사용을 검증하였다.
방법의 정확도를 결정하기 위해, 알려진 양의 경질 des-K 및 K를 1:10 - 1:1000 K 대 des-K 펩티드 비율 범위에 걸쳐 시약 세트에 스파이킹하고 보정 곡선 교정 방법을 사용하여 측정하였다. 표 2에 제시된 바와 같이, 보정 곡선 교정된 값(또는 "정규화된" 값)은 예상된 리신 퍼센트와 밀접하게 정렬되었다.
표 2.
실시예 2. mAb의 미처리된 C-말단 리신 정량화
이 실시예는 재조합 단백질의 C-말단 리신(K)의 정확한 정량화를 위한 본 발명의 검정의 실험 설계를 나타낸다.
항체 분석을 위해, 보정 곡선을 항체 소화물에 스파이킹하여 소화된 des-K 펩티드에 대한 중질 des-K 펩티드의 대략 등몰량이 각 LC- MS/MS 실행에서 칼럼에 주입되도록 하였다.
항체 소화. 동일한 중량의 5개의 IgG4 mAb 샘플을 5 mM 아세트산 및 5 mM TCEP-HCl로 완충제를 교환한 후 80℃에서 10분 동안 변성 및 환원시켰다. 샘플을 4 M 우레아/0.1 M Tris-HCl, pH 7.5에서 추가로 변성시키고, 암실에서 30분 동안 실온에서 5 mM IAM으로 알킬화하였다. 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4를 첨가하여 우레아 농도를 1 M로 낮추고, 항체를 37℃에서 4시간 동안 1:20 항체 대 트립신 비율에서 소화시켰다. 샘플을 0.2% TFA에서 샘플을 산성화하여 효소적 활성을 제지하였다.
LC-MS 및 LC-MS/MS 매개변수. 5 μg의 항체 소화물의 분취액을 1.7 μm 입자가 있는 2.1 mm x 150 mm Waters Acquity 초 성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 하전된 표면 하이브리드(CSH) C18 칼럼에 주입하였다. 펩티드를 250 μL/분의 유속 및 40℃의 칼럼 온도로 설정된 Waters Acquity I-Class UPLC를 사용하여 이 칼럼 상에서 분리하였다. 구배는 95분에 걸쳐 물 및 0.1% FA에 비해 유기 이동상(ACN 및 0.1% FA)의 0.1 - 35% 증가로 이루어진다.
질량 데이터는 QE Plus 3 및 4 시스템 및/또는 Orbitrap Fusion Lumos 질량 분광계를 를 사용하는 Thermo Q-Exactive Plus를 사용하여 획득하였다. 전체 질량 스캔은 Q-Exactive Plus에서 수행하여 1 x 106로 설정된 자동 이득 제어(AGC) 표적 또는 50 ms의 최대 이온 주입 시간(max IT)에 의해 제한된 이온 집단에 대해 140,000 분해능(m/z 200)에서 300 - 2000의 m/z 범위를 획득하였다.
데이터 의존적 획득(DDA)에 의한 MS/MS 식별이 필요한 실험의 경우, 단일 dd-MS/MS 루프는 30의 정규화된 충돌 에너지에서 더 높은 에너티 충돌 해리(HCD)를 사용하여 1.5 Th 창으로 5개의 가장 강렬한 펩티드 이온을 각각 단리 및 단편화함으로써 시작하였다.
단편 이온 집단 데이터를 1 x 105의 AGC 표적 또는 100 ms의 max IT를 사용하여 수집한 다음 17,500 분해능으로 스캐닝하였으며, 이 시점에서 샘플링된 전구체는 덜 강렬한 이온의 분석을 보장하기 10초 동안 제외 목록에 놓였다.
MS 획득을 위한 Orbitrap Fusion Lumos 매개변수는, 분해능이 120,000(m/z 200)으로 설정되고 ACG 표적이 5 x 105인 것을 제외하고, QE-Plus에 대해 동일하였다. MS/MS 설정의 차이는 다음과 같았다: 전구체 수 대신에 1초의 사이클 시간으로 DDA 제한; 2 x 104로 AGC 표적 설정; 50 ms로 max IT를 제어하지만 병렬화가능한 시간이 이용가능한 경우 계속 주입 허용; 및 15,000 분해능(m/z 200)에서 스캐닝.
관련 LC-MS/MS 미가공 파일을 다음 매개변수에 따라 각 항체에 대한 맞춤형 fasta 파일을 사용하여 Byonic 3.0으로 분석하였다: (1) 절단 부위: R, K; (2) 절단면: C-말단; (3) 소화 특이성: 완전히 특이적; (4) 전구체 질량 허용오차: 10 ppm; (5) 단편화 유형: QTOF/HCD; (6) 단편 질량 허용오차: 20 ppm; (7) 고정 및 가변 변형: 고정 C 카르바미도메틸, 가변 M 산화, 가변 E/Q에서 pE로, 및 가변 C-말단 K 상실; 및 (8) 글리칸 변형: 50개의 공통 비안테나리 N-글리칸. 경질 및 중질 C-말단 펩티드의 1+ 및 2+ 전하 상태에 대한 이온 크로마토그램은 10 ppm m/z 허용오차로 설정된 Genesis 알고리즘에 의해 Thermo Xcalibur 3.1에서 추출하였다. 정량적 AUC 측정은 Microsoft Excel로 내보냈으며, 여기서 1:1000 - 1:1 K 대 des-K 범위의 보정 곡선을 구축하여 각 샘플에서 미처리된 C-말단 K의 백분율을 계산하였다.
표 3은 정상적인 비교정된 펩티드 맵핑과 비교하여 보정 곡선 교정 방법을 사용하여 수득된 결과를 보여준다. 표 3에 제시된 바와 같이, C-말단 리신의 백분율은 본 개시내용의 보정 곡선(CC) 교정 방법과 비교하여 비교정된 펩티드 맵핑을 사용한 펩티드 정량화 동안 과대평가된다. 따라서, 본 발명의 방법은 재조합 단백질 PTM, 예를 들어, 항체의 C-말단 리신의 정량화를 위한 중요한 교정을 제공한다.
표 3.
실시예 3. 이중특이적 항체(BsAb)의 미처리된 C-말단 리신 정량화
이 실시예는 이중특이적 항체(bsAb)의 PTM을 정확하게 정량화하기 위한 본 발명의 검정의 실험 설계를 나타낸다.
SLSLSLGK (서열번호: 2) 및 SLSLSPGK (서열번호: 4) C-말단 서열을 둘 다 함유하는 7개의 IgG4-기반 bsAb를 상기 기재된 바와 같이 소화시켰다. 보정 곡선을 항체 소화물에 스파이킹하고 소화된 des-K 펩티드에 대한 중질 des-K 펩티드의 대략 등몰량을 각 LC-MS/MS 실행에서 칼럼에 주입하였다. 대조군 bsAb 소화물은 기존의 비교정된 펩티드 맵핑에 적용하였다.
표 4는 PGK C-말단 서열의 정상적인 비교정된 펩티드 맵핑과 비교하여 보정 곡선 교정 방법을 사용하여 수득된 결과를 보여준다. 표 4에 제시된 바와 같이, C-말단 리신의 백분율은 본 개시내용의 CC 교정 방법과 비교하여 비교정된 펩티드 맵핑을 사용하여 펩티드 정량화 동안 상당히 과대평가된다.
표 4.
표 5는 LGK C-말단 서열의 비교정된 펩티드 맵핑과 비교하여 보정 곡선 교정 방법을 사용하여 수득된 결과를 보여준다. 표 5에 제시된 바와 같이, C-말단 리신의 백분율은 본 개시내용의 CC 교정 방법과 비교하여 비교정된 펩티드 맵핑을 사용하여 펩티드 정량화 동안 상당히 과대평가된다.
표 5.
본 발명의 방법을 이용할 때 기기 사이의 정량화 변동을 조사하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 5개의 IgG4 mAb 및 1개의 IgG1 mAb를 상기 기재된 바와 같이 소화시켰다. 보정 곡선을 항체 소화물에 스파이킹하고 소화된 des-K 펩티드에 대한 중질 des-K 펩티드의 대략 등몰량을 각 LC-MS/MS 실행에서 칼럼에 주입하였다. 대조군 mAb 소화물은 기존의 비교정된 펩티드 맵핑에 적용하였다. 질량 데이터는 Thermo Q-Exactive Plus 및 Orbitrap Fusion Lumos 질량 분광계를 사용하여 획득하였다.
표 6에 제시된 바와 같이, CC 교정 방법을 사용하는 경우, QE-Plus 또는 융합 질량 분광계를 사용하여 정량화할 때 리신 퍼센트의 차이는 0 내지 거의 없었다. 그러나, 비교정된 펩티드 맵핑이 사용된 경우 기기에 걸쳐 리신 퍼센트의 더 큰 변동성이 보였다.
표 6.
bsAb에 적용될 때 본 발명의 방법을 사용하는 기기로 인한 신호 변동성을 조사하기 위해 추가 실험을 수행하였다. 7개의 IgG4-기반 bsAb(SLSLSLGK (서열번호: 2) 및 SLSLSPGK (서열번호: 4) C-말단 서열 둘 다 함유)를 상기 기재된 바와 같이 소화시켰다. 보정 곡선을 항체 소화물에 스파이킹하고 소화된 des-K 펩티드에 대한 중질 des-K 펩티드의 대략 등몰량을 각 LC- MS/MS 실행에서 칼럼에 주입하였다. 대조군 bsAb 소화물은 기존의 비교정된 펩티드 맵핑에 적용하였다.
질량 데이터는 Thermo Q-Exactive Plus 및 Orbitrap Fusion Lumos 질량 분광계를 사용하여 획득하였다. 표 7에 제시된 바와 같이, CC 교정 방법을 사용하는 경우, QE-Plus 또는 융합 질량 분광계를 사용하여 정량화할 때 리신 퍼센트의 차이는 0 내지 거의 없었다. 그러나, 비교정된 펩티드 맵핑이 사용된 경우 기기에 걸쳐 리신 퍼세트의 더 큰 변동성이 보였다.
표 7.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> HEAVY PEPTIDE APPROACH TO ACCURATELY MEASURE UNPROCESSED
C-TERMINAL LYSINE
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Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1 5
Claims (18)
- 관심 단백질의 번역후 변형을 정량화하는 방법으로서,
(a) 상기 관심 단백질을 포함하는 샘플을 소화 효소와 접촉시켜 펩티드 소화물을 수득하는 단계;
(b) 상기 펩티드 소화물에 중질 펩티드 표준물 세트를 첨가하되, 여기서 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물은 상기 번역후 변형을 포함하고 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물은 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 것인, 단계;
(c) 상기 펩티드 소화물과 상기 첨가된 중질 펩티드 표준물을 액체 크로마토그래피-질량 분광법을 사용한 분석에 적용하여 펩티드 소화물 및 중질 펩티드 표준물의 각 펩티드에 상응하는 신호를 획득하는 단계;
(d) 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물과 비교하여 상기 번역후 변형을 포함하는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물의 상대 신호를 사용하여 보정 곡선을 생성하는 단계;
(e) 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 상기 관심 단백질로부터의 적어도 하나의 펩티드와 비교하여 상기 번역후 변형을 포함하는 상기 관심 단백질로부터의 적어도 하나의 펩티드의 상대 신호를 사용하여 상기 관심 단백질의 번역후 변형을 정량화하는 단계; 및
(f) (d)의 보정 곡선을 사용하여 (e)의 결과를 정규화하여 상기 관심 단백질의 상기 번역후 변형을 추가로 정량화하는 단계를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 관심 단백질이 치료용 단백질인, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 치료용 단백질이 항체, 가용성 수용체, 항체-약물 접합체, 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 관심 단백질이 단클론 항체인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 관심 단백질이 이중특이적 항체인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 번역후 변형이 미처리된 C-말단 리신의 존재인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중질 펩티드 표준물이 적어도 하나의 다른 중질 펩티드 표준물에 비해 약 1:1 내지 약 1:1000의 몰비로 존재하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중질 펩티드 표준물이 약 1 내지 약 16개의 중질 동위원소를 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 중질 펩티드 표준물이 C13, N15, 또는 이의 조합을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 소화 효소가 트립신인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 방법이 역상 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드 크로마토그래피, 또는 이의 조합을 포함하는 것인, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 질량 분광계가 전기분무 이온화 질량 분광계, 나노-전기분무 이온화 질량 분광계, 예컨대 Orbitrap 질량 분광계, Q-TOF 질량 분광계 또는 삼중 사중극자 질량 분광계이고, 상기 질량 분광계가 상기 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링되고, 상기 질량 분광계가 LC-MS, LC-MRM-MS, 및/또는 LC-MS/MS 분석을 수행할 수 있는 것인, 방법.
- 관심 단백질의 번역후 변형을 정량화하기 위한 키트로서,
(a) 번역후 변형을 포함하는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물을 포함하는 제1 조성물; 및
(b) 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물을 포함하는 제2 조성물을 포함하되,
상기 제1 및 제2 조성물은 펩티드 소화물에 첨가될 수 있고, 상기 번역후 변형을 포함하지 않는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물과 비교하여 상기 번역후 변형을 포함하는 적어도 하나의 중질 펩티드 표준물의 상대 신호는 질량 분광법에 의해 분석될 때 보정 곡선을 생성하는 데 사용될 수 있고, 상기 보정 곡선은 관심 단백질의 번역후 변형을 정량화하는 데 사용될 수 있는 것인, 키트. - 제13항에 있어서, 상기 번역후 변형이 미처리된 C-말단 리신의 존재인, 키트.
- 제13항에 있어서, 상기 중질 펩티드 표준물이 적어도 하나의 다른 중질 펩티드 표준물에 비해 약 1:1 내지 약 1:1000의 몰비로 존재하는 것인, 키트.
- 제13항에 있어서, 상기 중질 펩티드 표준물이 약 1 내지 약 16개의 중질 동위원소를 포함하는 것인, 키트.
- 제13항에 있어서, 상기 중질 펩티드 표준물이 C13, N15, 또는 이의 조합을 포함하는 것인, 키트.
- 제13항에 있어서, 적어도 하나의 경질 펩티드 표준물을 추가로 포함하는, 키트.
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