CN115769056A - 用于定量抗体的高通量和基于质谱的方法 - Google Patents

Abstract

提供用于定量样品中的目标蛋白的无液相色谱方法。一个实施例提供一种用于定量样品中的目标抗体的无液相色谱方法，其包括以下步骤：用经标记的内标抗体对样品进行加标，消化样品中的抗体以产生肽，分级分离肽；以及使用含有一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器的直接输注MS²系统定量目标抗体，其中所述方法是无液相色谱的。

Description

用于定量抗体的高通量和基于质谱的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年6月9日提交的美国临时专利申请第63/036,679号的权益和优先权，该申请以全文引用的方式并入。

技术领域

本发明大体上涉及用于定量抗体的系统和方法。

序列表

本申请含有序列表，该序列表以ASCII格式以电子方式提交并特此以全文引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2021年6月2日，命名为064752_032PCT1_SL.txt，大小为622字节。

背景技术

为了开发基于抗体的治疗剂，对动物血清/血浆样品中的药物分子进行可靠的定量对于支持毒理动力学和药物动力学研究至关重要。液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)方法已越来越多地应用于定量复杂生物基质中的治疗性肽和蛋白质，因为该方法与配体结合分析法(LBA)相比，在方法开发时间、特异性、选择性、多路可行性和宽动态范围方面具有优势。然而，常规的基于LC-MS的分析法往往存在低通量的问题，例如，使用LC-MS每天仅可处理100个样品。

因此，本发明的一个目标是提供更有效且更灵敏的用于定量样品中的人类单克隆抗体(mAb)的系统和方法。

本发明的另一个目标是提供每天可对超过100个样品中的蛋白质浓度进行定量的系统和方法。

发明内容

提供用于定量样品中的目标蛋白的无液相色谱方法。一个实施例提供一种用于定量样品中的目标抗体的无液相色谱方法，其包括以下步骤：用经标记的内标抗体对样品进行加标，消化样品中的抗体以产生肽，分级分离肽；以及使用含有一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器的直接输注MS²系统定量目标抗体，其中该方法是无液相色谱的。在一些实施例中，该方法进一步包括在分级分离之前用经标记的Fc肽VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:1)对肽进行加标的步骤。在一个实施例中，肽是通过反相固相萃取来分级分离。经标记的内标抗体和经标记的Fc肽通常用重同位素标记。在一些实施例中，重同位素选自由¹³C、¹⁵N和²H组成的群组。在一个实施例中，目标抗体是人类单克隆抗体。

另一个实施例提供一种定量生物样品中的蛋白质药品的方法，其包括以下步骤：用已知量的具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的经重同位素标记的肽标准品对样品进行加标，将样品中的蛋白质药品消化成肽，在保留具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽的条件下分级分离肽，使用MS²系统分析含有蛋白质药品肽和肽标准品的样品中具有根据SEQID NO:1的氨基酸序列的肽的存在来校正系统，其中MS²系统包含一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器，并基于肽的存在定量样品中存在的蛋白质药品的量，其中该方法不利用液相色谱。蛋白质药品可以是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。在一些实施例中，用于定量药品离子和带质量标签的肽标准品离子的数据是在不同的MS²扫描中采集。如上文所述，使用反相固相萃取，使用15至25％乙腈作为洗涤液和20至30％乙腈洗脱液来分级分离肽。在一个实施例中，使用20％乙腈洗涤液和24％乙腈洗脱液。

在一个实施例中，该方法进一步包括在消化样品之前用经重同位素标记的蛋白质药品对蛋白质药品的样品进行加标的步骤。

在一些实施例中，样品含有血液或血清。血液或血清可以是人类或非人类的。在一个实施例中，血清是猴血清。

在一个实施例中，所公开的方法的动态范围为1至1000μm/mL且定量下限(LLOQ)为1-2μg/mL。

在另一个实施例中，所公开的方法是自动化高通量方法。

附图说明

图1是本文所公开的示例性方法的工作流程的示意图。

图2A-2C是显示本文所公开的示例性方法的工作流程的图。

图3A-3F是显示内源性和内标(IST)肽的顺序平行反应监测(PRM)采集的示例性图。

图4A-4C是显示PRM的内源性和IST肽的宽范围共分离的示例性图。

图5A-5E是显示2路PRM采集的示例性图。

图6A是使用宽分离PRM在1μg/mL下采集的内源性和加标肽y14++的质谱图。图6B是使用2路PRM在1μg/mL下采集的内源性和加标肽y14++的质谱图。

图7A是显示图7B-7D中测试的产物离子的表格。图7B-7E是空白样品或10μg/mL感兴趣的mAb样品中的内源性和加标y8+和y14++产物离子的质谱。

图8A是本文所公开的示例性方法的逐步乙腈(ACN)梯度洗脱的示意图。图8B是显示跨ACN逐步梯度的VVSV肽分布百分比的图。图8C是显示使用不同ACN洗脱窗口(18％洗涤，24％洗脱；18％洗涤，26％洗脱；20％洗涤，24％洗脱；20％洗涤，26％洗脱)的VVSV肽强度的图。

图9A-9B是质谱图，显示用18％ACN洗涤并用24％ACN洗脱的Oasis SPE板(图9A)和用20％ACN洗涤并用24％ACN洗脱的Strata X-SPE板中y14++产物离子的相对丰度。

图10A-10B是校准曲线，显示不同浓度的重肽的重肽信号强度。将数据拟合为具有1/x加权的线性回归模型。

图11A-11B是校准曲线，显示加标重mAb内标的样品在不同蛋白质浓度下的标准化反应。数据是使用具有1/x加权的线性回归模型拟合。

图12是显示使用所公开的方法检测抗体浓度的QC样品分析的表格。

图13A-13B是质谱图，显示血清空白(图13A)和血清+内标mAb(图13B)中内源性和SIL肽的相对丰度。

图14是显示使用不同批次的猴血清测定LLOQ的表格。

图15A-15B是校准曲线，显示猴血清中不同浓度的mAb1的相对反应(图15A)和强度(图15B)。图15C是显示QC样品分析结果的表格。

图16是显示增加的洗涤体积提高LLOQ的条形图。X轴代表洗涤体积而Y轴代表1μg/mL mAb的反应/空白。

具体实施方式

I.定义

应了解，本公开不限于本文所述的组合物和方法以及所述的实验条件，因而可变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述某些实施例的目的而并不旨在限制，因为本公开的范畴将仅由随附权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管类似或等效于本文所述的组合物、方法和材料的任何组合物、方法和材料可用于实践或测试本发明。所提及的所有出版物均以全文引用的方式并入本文中。

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述当前所主张的发明的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)使用术语“一(a)”、“一(an)”、“该”和相似指示物均应解释为涵盖单数和复数两者。

除非本文另有说明，否则本文中对数值范围的引述仅旨在充当单独提及属于该范围内的各单独数值的速记方法，并且各单独数值并入本说明书中，如同其在本文中单独引述一般。

术语“约”的使用旨在描述高于或低于所述值的约+/-10％的范围内的值；在其他实施例中，值可在高于或低于所述值的约+/-5％的范围内的值范围内；在其他实施例中，值可在高于或低于所述值的约+/-2％的范围内的值范围内；在其他实施例中，值可在高于或低于所述值的约+/-1％的范围内的值范围内。前述范围旨在通过上下文变得清楚，并且不隐含进一步的限制。除非本文另有说明或与上下文有明显矛盾，否则本文所述的所有方法可按任何适合的顺序进行。除非另外主张，否则使用本文所提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)仅旨在更好地阐明本发明而不对本发明的范围构成限制。本说明书中的语言不应理解为指示任何未要求的要素对于实践本发明而言必不可少。

“蛋白质”是指包含通过肽键彼此接合的两个或更多个氨基酸残基的分子。蛋白质包括多肽和肽，并且还可包括修饰，诸如糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、烷基化、羟基化和ADP核糖基化。蛋白质可具有科学或商业利益，包括基于蛋白质的药物，并且蛋白质尤其包括酶、配体、受体、抗体和嵌合或融合蛋白。蛋白质是由各种类型的重组细胞使用众所周知的细胞培养方法产生，并且一般通过基因工程技术(例如，诸如编码嵌合蛋白的序列，或密码子优化序列，无内含子序列等)引入细胞中，其可作为附加体驻留在细胞中或整合至细胞的基因组中。

“抗体”是指由四条多肽链，即两条重(H)链和两条轻(L)链通过二硫键相互连接组成的免疫球蛋白分子。各重链具有重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区含有三个域，CH1、CH2和CH3。各轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个域(CL)组成。VH和VL区可进一步细分成高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有更保守的区域，称为框架区(FR)。各VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包括指代任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体分子，诸如从经转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体还包括双特异性抗体，其包括可与超过一个不同表位结合的异四聚免疫球蛋白。双特异性抗体一般描述于美国专利案第8,586,713号中，其以引用的方式并入本申请中。

“Fc融合蛋白”包含两种或更多种蛋白质的部分或全部，其中之一为免疫球蛋白分子的Fc部分，所述蛋白质原本在自然界中不一起存在。包含某些异源多肽与抗体衍生多肽的不同部分(包括Fc域)融合的融合蛋白的制备已由例如Rath,T.等人,Crit Rev Biotech,35(2):235-254(2015),Levin,D等人,Trends Biotechnol,33(1):27-34(2015))所述。“受体Fc融合蛋白”包含与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外域，其在一些实施例中包含铰链区，随后是免疫球蛋白的CH2和CH3域。在一些实施例中，Fc融合蛋白包含与一个或多个配体结合的两条或更多条不同的受体链。举例而言，Fc融合蛋白是捕获剂，诸如IL-1捕获剂或VEGF捕获剂。

术语“无液相色谱”意谓在所公开的方法和系统中不使用液相色谱技术。

II.用于定量抗体的高通量和基于质谱的方法

本文公开用于定量样品(例如非人类基质)中的蛋白质药品的系统和方法。在一个实施例中，蛋白质药品是抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白。抗体通常是单克隆抗体。在基于蛋白质和基于抗体的治疗剂的开发过程中，对动物血清/血浆样品中的蛋白质药品分子进行准确和可靠的定量对于支持毒理动力学和药物动力学研究至关重要。另一个实施例提供高通量系统和方法，包括无液相色谱仪(无LC)、基于平行反应监测(PRM)的质谱(MS)方法，用于定量样品中的mAb，通常是人类抗体(图1)。另一个实施例提供一种利用基于纳米喷雾的直接输注进行高通量分析(<1分钟/样品，零交叉运行污染)和来自Fc区的通用替代肽(VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:1))作为内部对照的方法，用于样品中的总人类mAb定量。

一种示例性无液相色谱方法包括将蛋白质样品消化成肽，用具有替代肽的氨基酸序列诸如SEQ ID NO:1的经重同位素标记的肽标准品进行加标，分级分离样品，以及使用含有一个或多个离子阱、两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器的直接输注MS系统分析样品(图2A)。

另一个实施例提供一种用于定量样品中的抗体浓度的无液相色谱方法，其包括以下步骤：用内标(例如经标记的抗体)对样品进行加标，消化样品中的抗体以产生肽，分离肽(例如使用固相萃取)，以及使用直接输注MS系统定量样品中抗体的量。在一个实施例中，直接输注MS系统包括一个或多个离子阱、两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器(图2B)。

另一个实施例提供一种用于定量样品中的目标抗体的无液相色谱方法，其包括以下步骤：用经标记的标准抗体对样品进行加标，消化样品中的抗体以产生肽，分级分离肽，以及使用含有一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器的直接输注MS系统定量目标抗体(图2C)。

方法和系统的其他细节提供于以下部分中。

A.消化

在一个实施例中，感兴趣的蛋白质或蛋白质药品，例如抗体或其抗原结合片段、融合蛋白或重组蛋白，通常在96孔板中消化成肽。在一个实施例中，将经标记的内标肽，例如SEQ ID NO:1，加标至含有目标抗体的样品中，且随后对样品进行蛋白质消化。在另一个实施例中，含有目标抗体的样品用经标记的标准抗体进行加标，并且随后进行消化。

消化蛋白质的方法是所属技术领域中已知的。蛋白质可通过用蛋白水解酶进行酶消化或通过用化学品进行非酶消化来消化。用于消化蛋白质的示例性蛋白水解酶包括但不限于胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、Arg-C、Asp-N、Glu-C、Lys-C和Lys-N。可使用蛋白水解酶的组合来确保完全消化。用于消化蛋白质的示例性化学品包括但不限于甲酸、盐酸、乙酸、溴化氰、2-硝基-5-硫氰基苯甲酸盐和羟胺。

在一个实施例中，该方法的消化步骤是在Beckman Coulter的

FXP自动化工作站中使用96孔板来进行，该工作站提供对当今研究环境至关重要的速度和性能。灵活的平台有单和双移液头型号，结合多通道(96或384)和Span-8吸移，是高通量工作流程的理想选择。

在一个实施例中，样品用8M尿素稀释，在还原条件下以1比10的比率经胰蛋白酶处理过夜。示例性还原剂包括2-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)。在一个实施例中，样品用10mMDTT还原。

B.分级分离

消化后，对样品进行分级分离以分离经消化的肽。在一个实施例中，样品在允许保留内标肽(VVSVLTVLHQDWLNGK；(SEQ ID NO:1))和去除大部分其他干扰以提高方法灵敏度的条件下进行分级分离。在一个实施例中，分级分离是使用固相萃取，尤其反相固相萃取在96孔板中进行。

1.固相萃取

通过比较数种市售SPE产品，包括Oasis HLB反相30mg板、Oasis HLB反相10mg板、Strata-X反相10mg板、Strata-X反相2mg板、Strata-XC强阳离子交换混合模式板和Strata-XA强阴离子交换混合模式板来探索固相萃取(SPE)参数。

使用12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％乙腈(ACN)对市售板上的经消化样品进行洗涤和洗脱参数的研究(图8A)。图8B显示逐步洗脱概况。图8C显示在指定的ACN洗涤和洗脱浓度下，通过质谱分析确定的内部对照肽强度。20％ACN洗涤与24％ACN洗脱被确定是最佳的。

还进行Oasis HLB反相10mg 96板(图9A)与Strata-X反相10mg板(图9B)之间的洗脱概况比较。数据显示，2mg Strata-X反相板提供6.31E3的最强信号(图9B)。表1显示用于分级分离经消化样品的示例性SPE参数。

表1：示例性SPE条件

C.质谱分析

在一个实施例中，使用质谱系统对经分级分离的肽进行定量，该系统含有一个或多个离子阱和一个或多个配备有电喷雾离子化器的混合四极质量过滤器。示例性质谱分析系统包括但不限于在PRM模式下的Thermo Q Exactive^TM Plus质谱仪，其配备有用于启动纳米喷雾离子化的TriVersa

系统。这种系统具有先进的四极技术(AQT)，改善前体选择和传输，以更准确地定量复杂基质中的低丰度分析物。该系统还具有复杂的数据独立采集(DIA)和平行反应监测(PRM)，以提供具有完全定性置信度的可重复定量。最后，该系统具有先进的有源光束导引器(AABG)，其减少噪音并延长维护间隔。

在一个实施例中，定量数据是使用内源性和IST肽的顺序PRM采集来采集。在一些实施例中，使用2路PRM采集。用于定量产物离子的数据是在不同的MS²扫描中采集的。

1.内标肽

MS²使用经重同位素标记的内标肽VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:1)进行校准。在一些实施例中，内标肽用¹³C、¹⁵N和²H标记，例如一个或多个Lys残基可用同位素标记。SEQ IDNO:1存在于所有人类IgG同种型中，并且可通过酶消化可靠地产生。该序列在任何其他动物物种中均找不到，并且具有良好的MS离子化效率。在一些实施例中，内标肽在样品中的蛋白质消化之前或同时加标至待分析的样品中。

图10A和10B显示使用SEQ ID NO:1的校准曲线。使用经重同位素标记的内标肽对MS²分析的HCD碰撞能量进行校准，以获得旨在用于定量用途的片段离子的最佳信号强度。

2.内标抗体

在一些实施例中，MS²系统是使用经重同位素或质量标签标记的抗体进行校准。在一些实施例中，重同位素选自由¹³C、¹⁵N和²H组成的群组。示例性内标抗体在一个或多个Lys残基上经C¹³和N¹⁵标记。在一个实施例中，可使用SILu^TMMAB稳定同位素标记的通用单克隆抗体标准品(人类)。

图11A和11B显示使用经标记的内标抗体的校准曲线。图13A是对空白的扫描，并且13B显示对空白中内标的扫描。对于图13A，一批次的猴血清通过胰蛋白酶消化，并随后进行离线SPE净化。随后使用PRM方法进行MS分析。内标的信号极低(4.27E2)。对于图13B，将10μg/mL的内标加标至猴血清中，随后通过胰蛋白酶消化并接着进行离线SPE净化。随后使用PRM方法进行MS分析。如您所见，内标信号是1.97E4。此实验表明空白猴血清对内标没有干扰。

3.精确度和准确度

图12描述从质量控制分析获得的数据。将4个级别的NISTmAb，即人源化IgG1k单克隆抗体(Sigma-Aldrich)以1至600μg/mL加标至猴血清中。对于各级别，独立地制备6个样品。所有样品均通过胰蛋白酶消化并通过SPE净化。所有样品均通过MS分析。基于校准曲线，计算检测浓度。准确度是通过使用平均检测浓度除以标称浓度来计算。精确度是使用各级别的6个样品的相对标准差(RSD)％来计算。

4.选择性分析

图14显示使用不同批次的猴血液测定定量下限(LLOQ)。进行此实验以评估此方法的基质效应。购买六个不同批次的猴血清，且随后将1μg/mL和2μg/mL NIST mAb分别加标至各批次的猴血清中。还检测无NIST mAb(空白)的各批次猴血清的信号。随后计算1μg/mL和2μg/mL的信号与空白样品的信号的比率。基于FDA的方法检核要求，该比率应至少为5。还使用检测浓度除以标称浓度来计算准确度。基于美国食品药物管理局(FDA)的方法检核要求，LLOD的准确度应在80-120％内。

5.通用适用性评估

图15A显示在此方法中产生的校准曲线。将1μg/mL至1000μg/mL的不同浓度的NISTmAb加标至猴血清中，且各样品随后用10μg/mL的内标进行加标，并接着进行胰蛋白酶消化和SPE净化。所有样品均通过MS分析。各样品的强度使用IS标准化并随后用标称浓度作图。图15B显示1μg/mL至50μg/mL的放大区域。如图所示，在低浓度范围内，曲线很好地拟合所有点。图15C显示与图12类似的数据。唯一的区别是此处使用mAb1代替NISTmAb。mAb1是IgG4，而NISTmAb是IgG1。数据显示此方法对IgG1和IgG4均适用。

图16是显示增加的洗涤体积提高LLOQ的条形图。X轴代表洗涤体积而Y轴代表1μg/mL mAb的反应/空白。数据显示，在SPE期间增加洗涤体积可提高LLOD。将1μg/mL NISTmAb加标至猴血清中并用胰蛋白酶消化样品。在SPE步骤期间，用不同体积的洗涤缓冲液洗涤板，同时保持其他程序不变。当洗涤体积从100μL增加至600μL时，样品中的反应与空白相比的比率从低于4增加至超过6。基于FDA的方法检核要求，LLOD的比率应至少为5。因此，通过增加洗涤体积，LLOD提高至1μg/mL。

D.感兴趣的蛋白质

在一个实施例中，感兴趣的蛋白质是蛋白质药品或是适合在原核或真核细胞中表达的感兴趣的蛋白质。举例而言，蛋白质可以是抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、ScFv或其片段、Fc融合蛋白或其片段、生长因子或其片段、细胞因子或其片段、或细胞表面受体的胞外域或其片段。复合物中的蛋白质可以是由单一亚基组成的简单多肽或包含两个或更多个亚基的复杂多亚基蛋白质。感兴趣的蛋白质可以是生物医药产品、食品添加剂或防腐剂，或任何符合纯化和质量标准的蛋白质产品。

在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗原结合抗体片段、单链抗体、双功能抗体、三功能抗体或四功能抗体、双特异性四价免疫球蛋白G样分子(称为双可变域免疫球蛋白(DVD-IG))、IgD抗体、IgE抗体、IgM抗体、IgG抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。在一个实施例中，抗体是IgG1抗体。在一个实施例中，抗体是IgG2抗体。在一个实施例中，抗体是IgG4抗体。在另一个实施例中，抗体包含嵌合铰链。在其他实施例中，抗体包含嵌合Fc。在一个实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG4抗体。在一个实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG1抗体。在一个实施例中，抗体是嵌合IgG2/IgG1/IgG4抗体。

在一些实施例中，抗体选自由以下组成的群组：抗程序性细胞死亡1抗体(例如，如美国专利申请公开第US2015/0203579A1号中所述的抗PD1抗体)、抗程序性细胞死亡配体1(例如，如美国专利申请公开第US2015/0203580A1号中所述的抗PD-L1抗体)、抗DLL4抗体、抗血管生成素2抗体(例如，如美国专利第9,402,898号中所述的抗ANG2抗体)、抗类血管生成素3抗体(例如，如美国专利第9,018,356号中所述的抗AngPtl3抗体)、抗血小板衍生生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,265,827号中所述的抗PDGFR抗体)、抗Erb3抗体、抗催乳素受体抗体(例如，如美国专利第9,302,015号中所述的抗PRLR抗体)、抗补体5抗体(例如，如美国专利申请公开第US2015/0313194A1号中所述的抗C5抗体)、抗TNF抗体、抗表皮生长因子受体抗体(例如，如美国专利第9,132,192号中所述的抗EGFR抗体或如美国专利申请公开第US2015/0259423A1号中所述的抗EGFRvIII抗体)、抗前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶Kexin-9抗体(例如，如美国专利第8,062,640号或如美国专利第9,540,449号中所述的抗PCSK9抗体)、抗生长和分化因子8抗体(例如，抗GDF8抗体，也称为抗肌肉抑制素抗体，如美国专利第8,871,209号或第9,260,515号中所述)、抗胰高血糖素受体(例如，如美国专利申请公开第US2015/0337045A1号或第US2016/0075778A1号中所述的抗GCGR抗体)、抗VEGF抗体、抗IL1R抗体、白介素4受体抗体(例如，如美国专利申请公开第US2014/0271681A1号或美国专利第8,735,095号或第8,945,559号中所述的抗IL4R抗体)、抗白介素6受体抗体(例如，如美国专利第7,582,298号、第8,043,617号或第9,173,880号中所述的抗IL6R抗体)、抗IL1抗体、抗IL2抗体、抗IL3抗体、抗IL4抗体、抗IL5抗体、抗IL6抗体、抗IL7抗体、抗白介素33(例如，如美国专利第9,453,072号或第9,637、535号中所述的抗IL33抗体)、抗呼吸道合胞病毒抗体(例如，如美国专利申请公开第9,447,173号中所述的抗RSV抗体)、抗分化簇3(例如抗CD3抗体，如美国专利第9,447,173号和第9,447,173号和美国申请第62/222,605号中所述)、抗分化簇20(例如，如美国专利第9,657,102号和第US20150266966A1号和美国专利第7,879,984号中所述的抗CD20抗体)、抗CD19抗体、抗CD28抗体、抗分化簇48(例如，如美国专利第9,228,014号中所述的抗CD48抗体)、抗Fel d1抗体(例如，如美国专利第9,079,948号中所述)、抗中东呼吸道综合征病毒(例如，如美国专利申请公开第US2015/0337029A1号中所述的抗MERS抗体)、抗埃博拉病毒抗体(例如，如美国专利申请公开第US2016/0215040号中所述)、抗寨卡病毒抗体、抗淋巴细胞活化基因3抗体(例如抗LAG3抗体或抗CD223抗体)、抗神经生长因子抗体(例如，如美国专利申请公开第US2016/0017029号和美国专利第8,309,088号和第9,353,176号中所述的抗NGF抗体)和抗蛋白质Y抗体。在一些实施例中，双特异性抗体选自由以下组成的群组：抗CD3×抗CD20双特异性抗体(如美国专利申请公开第US2014/0088295A1号和第US20150266966A1号中所述)、抗CD3×抗粘蛋白16双特异性抗体(例如抗CD3×抗Muc16双特异性抗体)和抗CD3×抗前列腺特异性膜抗原双特异性抗体(例如抗CD3×抗PSMA双特异性抗体)。在一些实施例中，感兴趣的蛋白质选自由以下组成的群组：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿达木单抗-atto(adalimumab-atto)、阿多曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿利库单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利单抗(belimumab)、苯拉组单抗(benralizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝佐洛单抗(bezlotoxumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin)、布罗达单抗(brodalumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromab pendetide)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗(cetuximab)、德诺单抗(denosumab)、迪奴图单抗(dinutuximab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、艾库组单抗(eculizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾美赛珠单抗-kxwh(emicizumab-kxwh)、阿利人單抗艾坦辛(emtansinealirocumab)、恩维纳单抗(evinacumab)、依伏库单抗(evolocumab)、法神单抗(fasinumab)、戈利木单抗(golimumab)、古赛库单抗(guselkumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、英利昔单抗(infliximab)、英利昔单抗-abda(infliximab-abda)、英利昔单抗-dyyb(infliximab-dyyb)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊科奇单抗(ixekizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莱西单抗(necitumumab)、内斯瓦库单抗(nesvacumab)、纳武单抗(nivolumab)、奥托昔单抗(obiltoxaximab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥克珠单抗(ocrelizumab)、奥伐木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、兰比珠单抗(ranibizumab)、兰希班单抗(raxibacumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利奴单抗(rinucumab)、利妥昔单抗(rituximab)、赛瑞单抗(sarilumab)、塞库金单抗(secukinumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、托西利单抗(tocilizumab)、托西利单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、特里沃单抗(trevogrumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)和维多珠单抗(vedolizumab)。

在一些实施例中，感兴趣的蛋白质是含有Fc部分和另一域的重组蛋白(例如Fc融合蛋白)。在一些实施例中，Fc融合蛋白是受体Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的受体的一个或多个胞外域。在一些实施例中，Fc部分包含铰链区，随后是IgG的CH2和CH3域。在一些实施例中，受体Fc融合蛋白含有两条或更多条不同的受体链，其与单个配体或多个配体结合。举例而言，Fc融合蛋白是TRAP蛋白，诸如IL-1捕获剂(例如利洛西普(rilonacept)，其含有IL-1RAcP配体结合区与II-1R1胞外区与hIgG1的Fc的融合体；参见美国专利第6,927,004号，其以全文引用的方式并入本文中)或VEGF捕获剂(例如阿柏西普(aflibercept)或塞维-阿柏西普(ziv-aflibercept)，其包含VEGF受体Flt1的Ig域2与VEGF受体Flk1的Ig域3与hIgG1的Fc的融合体；参见美国专利第7,087,411号和第7,279,159号)。在其他实施例中，Fc融合蛋白是ScFv-Fc融合蛋白，其含有与Fc部分偶联的抗体的一个或多个抗原结合域中的一个或多个，诸如可变重链片段和可变轻链片段。

实例

实例1.

材料和方法：

校准标准品(1、2.5、5、10、25、50、100、250、500和1000μg/mL)和质量控制(QC)(1、3、60和600μg/mL)是由NISTmAb的储备溶液(10mg/mL)通过用对照猴血清连续稀释来制备。对于选择性分析，通过加标1μg/mL和2μg/mL NISTmAb(一种人源化IgG1k单克隆抗体)，为六个不同批次的空白猴血清各制备两个实验室质量控制(LQC)样品。在进行胰蛋白酶消化之前，20μL各标准样品用200ng经重同位素标记的mAb(IS-mAb)进行加标。使各样品变性、还原并用胰蛋白酶消化过夜，随后使用96孔固相萃取(SPE)板进行净化。优化SPE洗涤和洗脱条件以保留目标肽(VVSVLTVLHQDWLNGK；(SEQ ID NO:1))并去除大部分其他干扰，从而提高方法灵敏度。将各样品引入PRM模式下的Thermo Q Exactive Plus质谱仪上进行MS分析，该质谱仪配备有用于启动纳米喷雾离子化的TriVersa NanoMate系统。使用多路PRM方法采集各样品的数据持续45秒。

结果：

在寻找用于定量分析的通用替代肽时，选择Fc肽VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:1)，因为它具有良好的MS灵敏度，存在于抗体治疗剂中常用的两种人类IgG亚类(IgG1和IgG4)中，并且在所有常用动物物种的非人类IgG中不存在。在方法开发过程中，胰蛋白酶消化条件、SPE条件、PRM参数和片段离子选择均被优化。SPE条件对于去除大部分干扰同时保留大部分替代肽至关重要。PRM参数和片段离子选择是获得良好数据准确性和方法灵敏度的关键。

使用NISTmAb(IgG1亚类)和内部mAb4(IgG4亚类)作为测试物品，在1-1000μg/mL的测试范围内可实现校准曲线的良好线性。使用六个不同批次的猴血清评估此方法的选择性，并确定不同猴血清中的定量下限(LLOQ)为1-2μg/mL。另外，在四个不同的QC水平(1、3、60和600μg/mL)下测试此方法的精确度和准确度，准确度为95％-105％且CV<6％。最后，由于每个样品的分析速度<1分钟且零交叉运行污染，此方法可容易地应用于高通量环境。

经由方法评估，这种无LC的基于PRM-MS的方法已证明适用于动物血清中人源化治疗性mAb的高通量和通用定量，定量范围为2-1000μg/mL。

尽管在前述说明书中，本发明已就其某些实施例进行描述，并已出于说明的目的阐述许多细节，但本领域的技术人员将显而易见，本发明易受其他实施例影响并且本文所述的某些细节可在不背离本发明的基本原理的情况下进行相当大的变化。

本文所引用的所有参考文献均以全文引用的方式并入。本发明可在不背离其精神或基本属性的情况下以其他特定形式实施，且因此，应参考随附权利要求书而非前述说明书来指示本发明的范围。

Claims (19)

1.一种用于定量样品中的目标抗体的无液相色谱方法，其包含：

用经标记的内标抗体对所述样品进行加标；

消化所述样品中的所述抗体以产生肽；

分级分离所述肽；以及

使用含有一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器的直接输注MS²系统定量所述目标抗体，其中所述方法是无液相色谱的。

2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含在分级分离之前用经标记、带标签的Fc肽VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:1)对所述肽进行加标的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述肽是通过固相萃取来分级分离。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述固相萃取是反相固相萃取。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中经标记的内标抗体和所述带质量标签的Fc肽用重同位素标记。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述重同位素选自由¹³C、¹⁵N和²H组成的群组。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述目标抗体是人类单克隆抗体。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述质谱系统是串联质谱系统。

9.一种定量生物样品中的蛋白质药品的方法，其包含：

用已知量的具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的带重质量标签的肽标准品对所述样品进行加标；

将所述样品中的蛋白质药品消化成肽；

在保留具有根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽的条件下分级分离所述肽；

使用MS²系统分析含有所述蛋白质药品肽和所述肽标准品的所述样品中具有根据SEQID NO:1的氨基酸序列的所述肽的存在来校正所述系统，其中所述MS²系统包含一个或多个离子阱和两个或更多个四极质量过滤器和电喷雾离子化器；以及

基于所述肽的存在定量所述样品中存在的蛋白质药品的量，其中所述方法不利用液相色谱。

10.根据权利要求9所述的方法，其中用于定量药品离子和带质量标签的肽标准品离子的数据是在不同的MS²扫描中采集。

11.根据权利要求9所述的方法，其中所述肽是使用反相固相萃取来分级分离。

12.根据权利要求4或11所述的方法，其中所述反相固相萃取使用15至25％乙腈作为洗涤液和20至30％乙腈洗脱液。

13.根据权利要求9所述的方法，其进一步包含在消化所述样品之前用经重同位素标记的蛋白质药品对蛋白质药品的所述样品进行加标。

14.根据权利要求1或9所述的方法，其中所述蛋白质药品包含抗体或其抗原结合片段、重组蛋白、融合蛋白或其组合。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述样品包含血清。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法的动态范围为1至1000μm/mL。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法的定量下限(LLOQ)为1-2μg/mL。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法是自动化高通量方法。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法的分析速度为每个样品小于1分钟。

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