JP2023536681A - 抗体を定量化するためのハイスループット及び質量分析ベースの方法 - Google Patents

Abstract

試料中の標的タンパク質を定量化するための液体クロマトグラフィーフリーの方法が提供される。一実施形態は、試料中の標的抗体を定量化するための液体クロマトグラフィーフリーの方法であって、試料に標識内部標準抗体をスパイクするステップと、試料中の抗体を消化して、ペプチドを生成するステップと、ペプチドを分画するステップと、標的抗体を、１つ以上のイオントラップ及び２つ以上の四重極質量フィルタ及びエレクトロスプレーイオナイザーを含有する直接注入ＭＳ２システムを使用して定量化するステップと、を含み、方法が、液体クロマトグラフィーフリーである、方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により組み込まれる、２０２０年６月９日に出願された米国仮特許出願第６３／０３６，６７９号の利益及び優先権を主張する。

本発明は、概して、抗体を定量化するためのシステム及び方法に関する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。２０２１年６月２日に作成された、当該ＡＳＣＩＩコピーは、０６４７５２＿０３２ＰＣＴ１＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが６２２バイトである。

抗体ベースの治療薬の開発のためには、動物血清／血漿試料中の薬物分子の信頼性のある定量化が、毒物動態学的及び薬物動態学的研究を支持するために重要である。液体クロマトグラフィー連結タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）方法は、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）と比較して、方法開発時間、特異性、選択性、多重化の実現可能性、及び広いダイナミックレンジにおけるその利点に起因して、複合的な生物学的マトリックス中の治療用ペプチド及びタンパク質を定量化するためにますます適用されている。しかしながら、従来のＬＣ－ＭＳベースのアッセイはしばしば低いスループットに悩まされており、例えば、ＬＣ－ＭＳを使用して１日当たり１００個のみの試料が処理され得る。

したがって、本発明の目的は、試料中のヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を定量化するためのより効率的で高感度のシステム及び方法を提供することである。

本発明の別の目的は、１日当たり１００個超の試料中のタンパク質濃度を定量化し得るシステム及び方法を提供することである。

試料中の標的タンパク質を定量化するための液体クロマトグラフィーフリーの方法が提供される。一実施形態は、試料中の標的抗体を定量化するための液体クロマトグラフィーフリーの方法であって、試料に、標識内部標準抗体をスパイクするステップと、試料中の抗体を消化して、ペプチドを生成するステップと、ペプチドを分画するステップと、標的抗体を、１つ以上のイオントラップ及び２つ以上の四重極質量フィルタ及びエレクトロスプレーイオナイザーを含有する直接注入ＭＳ^２システムを使用して定量化するステップとを含み、方法が、液体クロマトグラフィーフリーである、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、分画の前に、ペプチドに、標識ＦｃペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）をスパイクするステップを更に含む。一実施形態では、ペプチドは、逆相固相抽出によって分画される。標識内部標準抗体及び標識Ｆｃペプチドは、典型的には、重同位体で標識される。いくつかの実施形態では、重同位体は、^１３Ｃ、^１５Ｎ、及び^２Ｈからなる群から選択される。一実施形態では、標的抗体は、ヒトモノクローナル抗体である。

更に別の実施形態は、生体試料中のタンパク質薬物生成物を定量化する方法であって、試料に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する既知量の重同位体標識ペプチド標準をスパイクするステップと、試料中のタンパク質薬物生成物をペプチドに消化するステップと、ペプチドを、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを保持する条件下で分画するステップと、タンパク質薬物生成物ペプチド及びペプチド標準を含有する試料を、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドの存在について、ＭＳ^２システムを使用して分析して、システムを較正するステップであって、ＭＳ^２システムが、１つ以上のイオントラップ及び２つ以上の四重極質量フィルタ及びエレクトロスプレーイオナイザーを含む、分析するステップと、試料中に存在するタンパク質薬物生成物の量を、ペプチドの存在に基づいて定量化するステップと、を含み、方法が、液体クロマトグラフィーを利用しない、方法を提供する。タンパク質薬物生成物は、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、又は組換えタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、薬物生成物イオン及び質量タグ付きペプチド標準イオンを定量化するためのデータは、異なるＭＳ^２スキャンにおいて取得される。上記のように、ペプチドは、洗浄としての１５～２５％アセトニトリル及び２０～３０％アセトニトリル溶出を使用する逆相固相抽出を使用して分画される。一実施形態では、２０％アセトニトリル洗浄及び２４％アセトニトリル溶出が使用される。

一実施形態では、方法は、試料を消化する前に、タンパク質薬物生成物の試料に、重同位体標識タンパク質薬物生成物をスパイクするステップを更に含む。

いくつかの実施形態では、試料は、血液又は血清を含有する。血液又は血清は、ヒト又は非ヒトであり得る。一実施形態では、血清は、サル血清である。

一実施形態では、開示される方法は、１～１０００μｍ／ｍＬのダイナミックレンジ及び１～２μｇ／ｍＬの定量化下限（ＬＬＯＱ）を有する。

更に別の実施形態では、開示される方法は、自動化ハイスループット方法である。

本明細書に開示される例示的な方法のワークフローの模式図である。 本明細書に開示される例示的な方法のワークフローを示す図である。 内在性及び内部標準（ＩＳＴ）ペプチドの連続的並列反応モニタリング（ＰＲＭ）取得を示す例示的なグラフである。 ＰＲＭのための内在性及びＩＳＴペプチドの広範囲同時単離を示す例示的なグラフである。 ２重化（２－ｐｌｅｘｅｄ）ＰＲＭ取得を示す例示的なグラフである。 １μｇ／ｍＬでの広範単離ＰＲＭを使用して取得した内在性及びスパイクインした（ｓｐｉｋｅｄ－ｉｎ）ペプチドｙ１４＋＋の質量スペクトルグラフである。 １μｇ／ｍＬでの２重化ＰＲＭを使用して取得した内在性及びスパイクインしたペプチドｙ１４＋＋の質量スペクトルグラフである。 図７Ｂ～７Ｄにおいて試験した生成物イオンを示す表である。 ブランク試料又は目的のｍＡｂの１０μｇ／ｍＬ試料中の内在性並びにスパイクインしたｙ８＋及びｙ１４＋＋生成物イオンの質量スペクトルである。 ブランク試料又は目的のｍＡｂの１０μｇ／ｍＬ試料中の内在性並びにスパイクインしたｙ８＋及びｙ１４＋＋生成物イオンの質量スペクトルである。 本明細書に開示される例示的な方法からの段階的アセトニトリル（ＡＣＮ）勾配溶出の模式図である。 ＡＣＮ段階的勾配にわたるＶＶＳＶペプチド分布パーセントを示すグラフである。 様々なＡＣＮ溶出ウィンドウ（１８％洗浄、２４％溶出；１８％洗浄、２６％溶出；２０％洗浄、２４％溶出；２０％洗浄、２６％溶出）を使用してＶＶＳＶペプチド強度を示すグラフである。 １８％ＡＣＮで洗浄し、２４％ＡＣＮで溶出したＯａｓｉｓ ＳＰＥプレートにおける（図９Ａ）、及び２０％ＡＣＮで洗浄し、２４％ＡＣＮで溶出したＳｔｒａｔａ Ｘ－ＳＰＥプレートにおけるｙ１４＋＋生成物イオンの相対的存在量を示す質量スペクトルグラフである。 種々の濃度の重ペプチドにわたる重ペプチドシグナルの強度を示す較正曲線である。データを、１／ｘの重み付けでの線形回帰モデルとして当てはめた。 重ｍＡｂ内部標準をスパイクした試料についての種々のタンパク質濃度にわたる正規化された応答を示す較正曲線である。データを、１／ｘの重み付けでの線形回帰モデルを使用して当てはめた。 抗体濃度を検出するための開示される方法を使用したＱＣ試料分析を示す表である。 血清ブランク（図１３Ａ）及び血清＋内部標準ｍＡｂ（図１３Ｂ）中の内在性及びＳＩＬペプチドの相対的存在量を示す質量スペクトルグラフである。 様々なロットのサル血清を使用してＬＬＯＱの決定を示す表である。 サル血清中の種々の濃度のｍＡｂ１にわたる相対的応答（図１５Ａ）及び強度（図１５Ｂ）を示す較正曲線である。 ＱＣ試料分析の結果を示す表である。 洗浄体積の増加がＬＬＯＱを改善することを示す棒グラフである。Ｘ軸は洗浄体積を表し、Ｙ軸は１μｇ／ｍＬ ｍＡｂでの応答／ブランクを表す。

Ｉ．定義
本開示は、それ自体が変動し得る、本明細書に記載される組成物及び方法並びに記載される実験条件に限定されないことを理解されたい。また、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、限定することを意図するものではないことを理解されたい。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の任意の組成物、方法及び材料は、本発明の実行又は試験において使用され得るが。言及される全ての刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに相反しない限り、特許請求される本発明の説明の文脈における（特に特許請求の範囲の文脈における）「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、及び同様の指示物の使用は、単数及び複数の両方をカバーすると解釈される。

本明細書における値の範囲の記載は、本明細書において別段の指示がない限り、単に、範囲内に入る各別個の値を個別に指す省略法として作用することが意図されており、各別個の値は、それが本明細書において個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。

「約」という用語の使用は、およそ＋／－１０％の範囲の記述された値の上又は下のいずれかの値を記載することが意図され、他の実施形態では、値は、およそ＋／－５％の範囲の記述された値の上又は下のいずれかの値の範囲であり得、他の実施形態では、値は、およそ＋／２％の範囲の記述された値の上又は下のいずれかの値の範囲であり得、他の実施形態では、値は、およそ＋／－１％の範囲の記述された値の上又は下のいずれかの値の範囲であり得る。先の範囲は、文脈によって明らかにされることが意図され、更なる限定を意味することはない。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに相反しない限り、任意の好適な順序で行われ得る。本明細書で提供される任意の及び全ての例、又は例示的言語（例えば、「など」）の使用は、単に、本発明をより良く明らかにすることが意図され、別段の請求がない限り、本発明の範囲に対して限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の非請求要素を本発明の実行に不可欠であると示すものとして解釈するべきでない。

「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに連結された２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を指す。タンパク質は、ポリペプチド及びペプチドを含み、グリコシル化、脂質付着、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ－カルボキシル化、アルキル化、ヒドロキシル化及びＡＤＰ－リボシル化などの修飾もまた含み得る。タンパク質は、タンパク質ベースの薬物を含む、科学的又は商業的対象のものであり得、タンパク質には、とりわけ、酵素、リガンド、受容体、抗体及びキメラ又は融合タンパク質が含まれる。タンパク質は、よく知られた細胞培養方法を使用して種々のタイプの組換え細胞によって産生され、一般に、遺伝子操作技術によって細胞中に導入され（例えば、キメラタンパク質をコードする配列、又はコドン最適化配列、イントロンなしの配列など）、そこでそれはエピソームとして存在し得るか又は細胞のゲノム中に組み込まれ得る。

「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、からなる免疫グロブリン分子を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ又はＶＨ）及び重鎖定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含有する。各軽鎖は、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域に更に細分され得る。各々のＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順序で配置された、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプ又はサブクラスのグリコシル化及び非グリコシル化の両方の免疫グロブリンへの言及を含む。「抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体という用語はまた、１つより多い異なるエピトープに結合し得るヘテロ四量体免疫グロブリンを含む、二重特異性抗体を含む。二重特異性抗体は、一般に、参照により本出願に組み込まれる、米国特許第８，５８６，７１３号に記載されている。

「Ｆｃ融合タンパク質」は、そうでなければ天然において一緒には見出されない、そのうちの１つが免疫グロブリン分子のＦｃ部分である２つ以上のタンパク質の一部又は全部を含む。抗体由来のポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ｒａｔｈ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｔｅｃｈ，３５（２）：２３５－２５４（２０１５）、Ｌｅｖｉｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３（１）：２７－３４（２０１５））によって記載されている「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含み、これは、いくつかの実施形態では、免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインがそれに続くヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンドに結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ－１トラップ又はＶＥＧＦトラップなどの、トラップである。

「液体クロマトグラフィーフリー」という用語は、液体クロマトグラフィーの技術が、開示される方法及びシステムにおいて利用されないことを意味する。

ＩＩ．抗体を定量化するためのハイスループット及び質量分析ベースの方法
試料中、例えば、非ヒトマトリックス中のタンパク質薬物生成物を定量化するためのシステム及び方法が本明細書に開示される。一実施形態では、タンパク質薬物生成物は、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、又は組換えタンパク質である。抗体は、典型的には、モノクローナル抗体である。動物血清／血漿試料中のタンパク質薬物生成物分子の正確で信頼性のある定量化は、タンパク質ベース及び抗体ベースの治療薬の開発中の毒物動態学的及び薬物動態学的研究を支持するために重要である。別の実施形態は、試料中のｍＡｂ、典型的には、ヒト抗体を定量化するための、液体クロマトグラフフリー（ＬＣフリー）の、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）ベースの質量分析（ＭＳ）方法（図１）を含む、ハイスループットのシステム及び方法を提供する。別の実施形態は、試料中の総ヒトｍＡｂ定量化のための、ハイスループット分析のためのナノスプレーベースの直接注入（試料当たり＜１分、クロスラン（ｃｒｏｓｓ－ｒｕｎ）混入ゼロ）及び内部対照としてのＦｃ領域からの普遍的代用ペプチド（ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１））を利用する方法を提供する。

例示的な液体クロマトグラフィーフリーの方法は、タンパク質試料をペプチドに消化することと、配列番号１などの代用ペプチドのアミノ酸配列を有する重同位体標識ペプチド標準をスパイクインすることと、試料を分画することと、１つ以上のイオントラップ、２つ以上の四重極質量フィルタ、及びエレクトロスプレーイオナイザーを含有する直接注入ＭＳシステムを使用して試料を分析することと、を含む（図２Ａ）。

更に別の実施形態は、試料中の抗体濃度を定量化するための液体クロマトグラフィーフリーの方法であって、試料に内部標準、例えば、標識抗体をスパイクするステップと、試料中の抗体を消化して、ペプチドを生成するステップと、ペプチドを、例えば、固相抽出を使用して、分離するステップと、試料中の抗体の量を直接注入ＭＳシステムを使用して定量化するステップと、を含む、方法を提供する。一実施形態では、直接注入ＭＳシステムは、１つ以上のイオントラップ、２つ以上の四重極質量フィルタ、及びエレクトロスプレーイオナイザーを含む（図２Ｂ）。

更に別の実施形態は、試料中の標的抗体を定量化するための液体クロマトグラフィーフリーの方法であって、試料に標識標準抗体をスパイクするステップと、試料中の抗体を消化して、ペプチドを生成するステップと、ペプチドを分画するステップと、１つ以上のイオントラップ及び２つ以上の四重極質量フィルタ及びエレクトロスプレーイオナイザーを含有する直接注入ＭＳシステムを使用して標的抗体を定量化するステップと、を含む、方法を提供する（図２Ｃ）。

方法及びシステムの更なる詳細は、以下の節において提供される。

Ａ．消化
一実施形態では、目的のタンパク質又はタンパク質薬物生成物、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、又は組換えタンパク質は、典型的には、９６ウェルプレート中でペプチドに消化される。一実施形態では、標識内部標準ペプチド、例えば、配列番号１を、標的抗体を含有する試料中にスパイクし、次いで、試料をタンパク質消化に供する。別の実施形態では、標的抗体を含有する試料に、標識標準抗体をスパイクし、次いで、それを消化に供する。

タンパク質を消化する方法は、当該技術分野で知られている。タンパク質は、タンパク質分解酵素での酵素消化によって又は化学物質での非酵素消化によって消化され得る。タンパク質を消化するための例示的なタンパク質分解酵素としては、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ａｒｇ－Ｃ、Ａｓｐ－Ｎ、Ｇｌｕ－Ｃ、Ｌｙｓ－Ｃ、及びＬｙｓ－Ｎが挙げられるが、これらに限定されない。完全な消化を確実にするために、タンパク質分解酵素の組み合わせが使用され得る。タンパク質を消化するための例示的な化学物質としては、ギ酸、塩酸、酢酸、臭化シアン、２－ニトロ－５－チオシアノベンゾエート、及びヒドロキシルアミンが挙げられるが、これらに限定されない。

一実施形態では、方法の消化ステップは、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒからのＢｉｏｍｅｋ（登録商標）ＦＸ^Ｐ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにおいて９６ウェルプレートを使用して行われ、これは、今日の研究環境に重要な速度及び性能を提供する。フレキシブルプラットフォームは、マルチチャンネル（９６又は３８４）とＳｐａｎ－８ピペッティングとを組み合わせるシングル及びデュアルピペッティングヘッドモデルにおいて利用可能であり、ハイスループットワークフローに理想的である。

一実施形態では、試料を８Ｍ尿素で希釈し、還元条件下で１～１０の比率で一晩トリプシン処理する。例示的な還元剤としては、２－メルカプトエタノール及びジチオスレイトール（ＤＴＴ）が挙げられる。一実施形態では、試料を１０ｍＭ ＤＴＴを用いて還元する。

Ｂ．分画
消化後、試料を分画に供して、消化されたペプチドを分離する。一実施形態では、試料を、内部標準ペプチド（ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ、（配列番号１））の保持、及び方法感度の改善のための他の干渉の大半の除去を可能にする条件下で分画する。一実施形態では、分画は、固相抽出、特に、９６ウェルプレート中での逆相固相抽出を使用して行われる。

１．固相抽出
固相抽出（ＳＰＥ）パラメータを、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ逆相３０ｍｇプレート、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ逆相１０ｍｇプレート、Ｓｔｒａｔａ－Ｘ逆相１０ｍｇプレート、Ｓｔｒａｔａ－Ｘ逆相２ｍｇプレート、Ｓｔｒａｔａ－ＸＣ強陽イオン交換ミックスモードプレート、及びＳｔｒａｔａ－ＸＡ強陰イオン交換ミックスモードプレートを含むいくつかの市販のＳＰＥ製品を比較することによって探索した。

洗浄及び溶出パラメータを、消化した試料に対して、市販のプレート上で、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％アセトニトリル（ＡＣＮ）を使用して調べた（図８Ａ）。図８Ｂは、段階的溶出プロファイルを示す。図８Ｃは、示される洗浄及び溶出濃度のＡＣＮ下で質量分析によって決定した内部対照ペプチド強度を示す。２０％ＡＣＮ洗浄と２４％ＡＣＮ溶出が最適であると決定した。

Ｏａｓｉｓ ＨＬＢ逆相１０ｍｇ ９６プレート（図９Ａ）とＳｔｒａｔａ－Ｘ逆相１０ｍｇプレート（図９Ｂ）との間の溶出プロファイルの比較もまた行った。データは、２ｍｇ Ｓｔｒａｔａ－Ｘ逆相プレートが、６．３１Ｅ３の最も強いシグナルを提供したことを示す（図９Ｂ）。表１は、消化した試料を分画するための例示的なＳＰＥパラメータを示す。

Ｃ．質量分析
一実施形態では、分画されたペプチドは、エレクトロスプレーイオナイザーを備えた、１つ以上のイオントラップ及び１つ以上のハイブリッド四重極質量フィルタを含有する質量分析システムを使用して定量化される。例示的な質量分析システムとしては、ナノスプレーイオン化を開始するためのＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅ（登録商標）システムを備えたＰＲＭモードのＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ（商標）Ｐｌｕｓ質量分析計が挙げられるが、これらに限定されない。このシステムは、複合的なマトリックス中の低存在量の分析物のより正確な定量化のために前駆体の選択及び伝送を改善する先進的な四重極技術（ＡＱＴ）を有する。システムはまた、完全な定性的信頼性で再現性のある定量化を供給するための、洗練されたデータ非依存的取得（ＤＩＡ）及び並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を有する。最後に、システムは、ノイズを低減し、メンテナンス間隔を延長する先進的なアクティブビームガイド（ＡＡＢＧ）を有する。

一実施形態では、定量化データは、内在性及びＩＳＴペプチドの連続的ＰＲＭ取得を使用して取得される。いくつかの実施形態では、２重化ＰＲＭ取得が使用される。生成物イオンを定量化するためのデータは、異なるＭＳ^２スキャンにおいて取得される。

１．内部標準ペプチド
ＭＳ^２は、重同位体標識内部標準ペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）を使用して較正される。いくつかの実施形態では、内部標準ペプチドは、^１３Ｃ、^１５Ｎ、及び^２Ｈで標識され、例えば、１つ以上のＬｙｓ残基が同位体で標識され得る。配列番号１は、全てのヒトＩｇＧアイソタイプ中に存在し、酵素消化から確実に生成され得る。配列は、いかなる他の動物種においても見出され得ず、良好なＭＳイオン化効率を有する。いくつかの実施形態では、内部標準ペプチドは、試料中のタンパク質の消化の前に又はそれと同時に、分析される試料中にスパイクされる。

図１０Ａ及び１０Ｂは、配列番号１を使用して較正曲線を示す。ＭＳ^２分析のためのＨＣＤ衝突エネルギーを、重同位体標識内部標準ペプチドを使用して較正して、定量化使用に意図されるフラグメントイオンのための最良のシグナル強度を達成する。

２．内部標準抗体
いくつかの実施形態では、ＭＳ^２システムは、重同位体又は質量タグで標識された抗体を使用して較正される。いくつかの実施形態では、重同位体は、^１３Ｃ、^１５Ｎ、及び^２Ｈからなる群から選択される。例示的な内部標準抗体は、１つ以上のＬｙｓ残基上でＣ^１３及びＮ^１５で標識される。一実施形態では、ＳＩＬｕ（商標）ＭＡＢ Ｓｔａｂｌｅ－Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｅｌｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ｈｕｍａｎ）が使用され得る。

図１１Ａ及び１１Ｂは、標識内部標準抗体を使用して較正曲線を示す。図１３Ａは、ブランクのスキャンであり、１３Ｂは、ブランク中の内部標準を用いたスキャンを示す。図１３Ａについては、１つのロットのサル血清をトリプシンによって消化し、続いて、オフラインＳＰＥクリーンアップを行った。次いで、ＰＲＭ方法を使用してＭＳによって分析した。内部標準についてのシグナルは非常に低い（４．２７Ｅ２）。図１３Ｂについては、１０μｇ／ｍＬの内部標準をサル血清中にスパイクし、次いで、トリプシンによって消化し、続いて、オフラインＳＰＥクリーンアップを行った。次いで、ＰＲＭ方法を使用してＭＳによって分析した。見てのとおり、内部標準についてのシグナルは１．９７Ｅ４である。この実験は、ブランクのサル血清が内部標準についての干渉を含まないことを示す。

３．精度及び正確性
図１２は、品質管理分析から得られたデータを示す。４つのレベルのＮＩＳＴｍＡｂ、Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ＩｇＧ１ｋ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１～６００μｇ／ｍＬでサル血清中にスパイクした。各レベルについて、６つの試料を独立して調製した。全ての試料をトリプシンによって消化し、ＳＰＥによってクリーンアップした。全ての試料をＭＳによって分析した。較正曲線に基づいて、検出された濃度を計算した。正確性を、名目上の濃度で割った、平均の検出された濃度を使用することによって計算した。精度を、各レベルでの６つの試料の相対標準偏差（ＲＳＤ）％を使用して計算した。

４．選択性分析
図１４は、様々なロットのサル血液を使用した定量化下限（ＬＬＯＱ）の決定を示す。この実験を、この方法のマトリックス効果を評価するために行った。６つの異なるロットのサル血清を購入し、次いで、１μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬのＮＩＳＴ ｍＡｂを別々に各ロットのサル血清中にスパイクした。ＮＩＳＴ ｍＡｂを含まない各ロットのサル血清（ブランク）のシグナルもまた検出した。次いで、１μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬからのシグナルの、ブランク試料からのシグナルとの比率を計算した。比率は、ＦＤＡからの方法適格性の要件に基づいて、少なくとも５であるべきである。また、正確性を、名目上の濃度で割った検出された濃度を使用して計算した。正確性は、食品医薬品局（ＦＤＡ）からの方法適格性の要件に基づいて、ＬＬＯＤについて８０～１２０％以内であるべきである。

５．包括的適用性の評価
図１５Ａは、この方法において生成された較正曲線を示す。１μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの様々な濃度のＮＩＳＴｍＡｂをサル血清中にスパイクし、次いで、各試料に１０μｇ／ｍＬの内部標準をスパイクし、続いて、トリプシン消化及びＳＰＥクリーンアップを行った。全ての試料をＭＳによって分析した。各試料の強度を、ＩＳを使用して正規化し、次いで、名目上の濃度と共にプロットした。図１５Ｂは、１μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬのズームした領域を示す。示すように、曲線は低濃度範囲で全ての点によく当てはまる。図１５Ｃは、図１２と同様のデータを示す。唯一の違いは、ここではｍＡｂ１をＮＩＳＴｍＡｂの代わりに使用したことである。ｍＡｂ１はＩｇＧ４であり、ＮＩＳＴｍＡｂはＩｇＧ１である。データは、この方法がＩｇＧ１及びＩｇＧ４の両方に好適であることを示す。

図１６は、洗浄体積の増加がＬＬＯＱを改善することを示す棒グラフである。Ｘ軸は洗浄体積を表し、Ｙ軸は１μｇ／ｍＬ ｍＡｂでの応答／ブランクを表す。データは、ＳＰＥ中に洗浄体積を増加させることが、ＬＬＯＤを改善し得ることを示す。１μｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂをサル血清中にスパイクし、試料をトリプシンで消化した。ＳＰＥステップ中に、他の手順を同じに保ちながら、プレートを様々な体積の洗浄緩衝液で洗浄した。洗浄体積を１００μＬ～６００μｌに増加させたときに、ブランクと比較した試料における応答の比率は、４未満～６超に増加した。比率は、ＦＤＡからの方法適格性の要件に基づいて、ＬＬＯＤについて少なくとも５であるべきである。それで、洗浄体積を増加させることによって、ＬＬＯＤは１μｇ／ｍＬに改善された。

Ｄ．目的のタンパク質
一実施形態では、目的のタンパク質は、タンパク質薬物生成物であるか、又は原核若しくは真核細胞における発現に好適な目的のタンパク質である。例えば、タンパク質は、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、キメラ抗体若しくはその抗原結合フラグメント、ＳｃＦｖ若しくはそのフラグメント、Ｆｃ融合タンパク質若しくはそのフラグメント、増殖因子若しくはそのフラグメント、サイトカイン若しくはそのフラグメント、又は細胞表面受容体の細胞外ドメイン若しくはそのフラグメントであり得る。複合体中のタンパク質は、単一のサブユニットからなる単純ポリペプチド、又は２つ以上のサブユニットを含む複合多サブユニットタンパク質であり得る。目的のタンパク質は、バイオ医薬製品、食品添加物若しくは保存料、又は精製及び品質標準に供される任意のタンパク質生成物であり得る

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗原結合抗体フラグメント、単鎖抗体、ダイアボディ、トリアボディ若しくはテトラボディ、二重特異性四価免疫グロブリンＧ様分子（二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ－ＩＧ）と呼ばれる）、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、又はＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ４抗体である。別の実施形態では、抗体は、キメラヒンジを含む。更に他の実施形態では、抗体は、キメラＦｃを含む。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１抗体である。一実施形態では、抗体は、キメラＩｇＧ２／ＩｇＧ１／ＩｇＧ４抗体である。

いくつかの実施形態では、抗体は、抗プログラム細胞死１抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５７９Ａ１号に記載される抗ＰＤ１抗体）、抗プログラム細胞死リガンド－１（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２０３５８０Ａ１号に記載される抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、抗ＤＬＬ４抗体、抗アンギオポエチン－２抗体（例えば、米国特許第９，４０２，８９８号に記載される抗ＡＮＧ２抗体）、抗アンギオポエチン様３抗体（例えば、米国特許第９，０１８，３５６号に記載される抗ＡｎｇＰｔｌ３抗体）、抗血小板由来増殖因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，２６５，８２７号に記載される抗ＰＤＧＦＲ抗体）、抗Ｅｒｂ３抗体、抗プロラクチン受容体抗体（例えば、米国特許第９，３０２，０１５号に記載される抗ＰＲＬＲ抗体）、抗補体５抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３１３１９４Ａ１号に記載される抗Ｃ５抗体）、抗ＴＮＦ抗体、抗上皮増殖因子受容体抗体（例えば、米国特許第９，１３２，１９２号に記載される抗ＥＧＦＲ抗体又は米国特許出願公開第２０１５／０２５９４２３Ａ１号に記載される抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体）、抗プロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン－９抗体（例えば、米国特許第８，０６２，６４０号又は米国特許第９，５４０，４４９号に記載される抗ＰＣＳＫ９抗体）、抗増殖分化因子－８抗体（例えば、米国特許第８，８７１，２０９号又は同第９，２６０，５１５号に記載される抗ＧＤＦ８抗体（抗ミオスタチン抗体としても知られる））、抗グルカゴン受容体（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０４５Ａ１号又は同第２０１６／００７５７７８Ａ１号に記載される抗ＧＣＧＲ抗体）、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＩＬ１Ｒ抗体、インターロイキン４受容体抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１４／０２７１６８１Ａ１号又は米国特許第８，７３５，０９５号若しくは同第８，９４５，５５９号に記載される抗ＩＬ４Ｒ抗体）、抗インターロイキン６受容体抗体（例えば、米国特許第７，５８２，２９８号、同第８，０４３，６１７号又は同第９，１７３，８８０号に記載される抗ＩＬ６Ｒ抗体）、抗ＩＬ１抗体、抗ＩＬ２抗体、抗ＩＬ３抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ５抗体、抗ＩＬ６抗体、抗ＩＬ７抗体、抗インターロイキン３３（例えば、米国特許第９，４５３，０７２号又は同第９，６３７，５３５号に記載される抗ＩＬ３３抗体）、抗呼吸器多核体ウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第９，４４７，１７３号に記載される抗ＲＳＶ抗体）、抗分化抗原群３（例えば、米国特許第９，４４７，１７３号及び同第９，４７７，１７３号、並びに米国特許出願第６２／２２２，６０５号に記載される抗ＣＤ３抗体）、抗分化抗原群２０（例えば、米国特許第９，６５７，１０２号及び同第２０１５０２６６９６６Ａ１号、並びに米国特許第７，８７９，９８４号に記載される抗ＣＤ２０抗体）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗分化抗原群４８（例えば、米国特許第９，２２８，０１４号に記載される抗ＣＤ４８抗体）、抗Ｆｅｌ ｄ１抗体（例えば、米国特許第９，０７９，９４８号に記載される）、抗中東呼吸器症候群ウイルス（例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３３７０２９Ａ１号に記載される抗ＭＥＲＳ抗体）、抗エボラウイルス抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５０４０号に記載される）、抗ジカウイルス抗体、抗リンパ球活性化遺伝子３抗体（例えば、抗ＬＡＧ３抗体、又は抗ＣＤ２２３抗体）、抗神経成長因子抗体（例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１７０２９号並びに米国特許第８，３０９，０８８号及び同第９，３５３，１７６号に記載される抗ＮＧＦ抗体）、並びに抗プロテインＹ抗体からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、抗ＣＤ３×抗ＣＤ２０二重特異性抗体（米国特許出願公開第２０１４／００８８２９５Ａ１号及び同第２０１５０２６６９６６Ａ１号に記載される）、抗ＣＤ３×抗ムチン１６二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗Ｍｕｃ１６二重特異性抗体）、及び抗ＣＤ３×抗前立腺特異的膜抗原二重特異性抗体（例えば、抗ＣＤ３×抗ＰＳＭＡ二重特異性抗体）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、アブシキシマブ、アダリムマブ、アダリムマブ－ａｔｔｏ、ａｄｏ－トラスツズマブ、アレムツズマブ、アリロクマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カプロマブペンデチド、セルトリズマブペゴル、セミプリマブ、セツキシマブ、デノスマブ、ジヌツキシマブ、デュピルマブ、デュルバルマブ、エクリズマブ、エロツズマブ、エミシズマブ－ｋｘｗｈ、エムタンシンアリロクマブ、エビナクマブ、エボロクマブ、ファシヌマブ、ゴリムマブ、グセルクマブ、イブリツモマブチウキセタン、イダルシズマブ、インフリキシマブ、インフリキシマブ－ａｂｄａ、インフリキシマブ－ｄｙｙｂ、イピリムマブ、イキセキズマブ、メポリズマブ、ネシツムマブ、ネスバクマブ、ニボルマブ、オビルトキサキシマブ、オビヌツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オマリズマブ、パニツムマブ、ペムブロリズマブ、ペルツズマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レスリズマブ、リヌクマブ、リツキシマブ、サリルマブ、セクキヌマブ、シルツキシマブ、トシリズマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、トレボグルマブ、ウステキヌマブ、及びベドリズマブからなる群から選択される。

いくつかの実施形態では、目的のタンパク質は、Ｆｃ部分及び別のドメインを含有する組換えタンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃ部分に結合した受容体の１つ以上の細胞外ドメインを含有する、受容体Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ部分は、ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインがそれに続くヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、受容体Ｆｃ融合タンパク質は、単一のリガンド又は複数のリガンドのいずれかに結合する２つ以上の異なる受容体鎖を含有する。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、トラップタンパク質、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、リロナセプト、これは、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩｌ－１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有する、米国特許第６，９２７，００４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、又はＶＥＧＦトラップ（例えば、アフリベルセプト若しくはｚｉｖ－アフリベルセプト、これは、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含む、米国特許第７，０８７，４１１号及び同第７，２７９，１５９号を参照されたい）である。他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、ＳｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質であり、これは、Ｆｃ部分に結合した抗体の１つ以上の抗原結合ドメイン、例えば、可変重鎖フラグメント及び可変軽鎖フラグメント、のうちの１つ以上を含有する。

実施例１．
材料及び方法：
較正標準（１、２．５、５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００及び１０００μｇ／ｍＬ）並びに品質管理（ＱＣ）（１、３、６０及び６００μｇ／ｍＬ）を、ＮＩＳＴｍＡｂのストック溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）から、対照サル血清を用いた段階希釈によって調製した。選択性分析のために、２つの研究室品質管理（ＬＱＣ）試料を、ＮＩＳＴｍＡｂ、ヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体を、１μｇ／ｍＬ及び２μｇ／ｍＬでスパイクインすることによって、６つの異なるロットのブランクサル血清について各々調製した。２０μＬの各標準試料に、２００ｎｇの重同位体標識ｍＡｂ（ＩＳ－ｍＡｂ）をスパイクした後、トリプシン消化に供した。各試料を変性させ、還元し、トリプシンで一晩消化し、続いて、９６ウェル固相抽出（ＳＰＥ）プレートを使用してクリーンアップした。ＳＰＥ洗浄及び溶出条件を、標的ペプチド（ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ、（配列番号１））を保持し、方法感度の改善のために他の干渉の大半を除去するように最適化した。各試料を、ナノスプレーイオン化を開始するためのＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅシステムを備えたＰＲＭモードのＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計でのＭＳ分析に導入した。データを、各試料について４５秒間持続する多重化ＰＲＭ方法を使用して取得した。

結果：
定量化分析のための普遍的代用ペプチドを探して、ＦｃペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）を、その良好なＭＳ感度、抗体治療薬において一般的に使用されている２つのヒトＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１及びＩｇＧ４）における存在、並びに全ての一般的に使用される動物種からの非ヒトＩｇＧにおける不在のために選択した。方法開発中に、トリプシン消化条件、ＳＰＥ条件、ＰＲＭパラメータ、及びフラグメントイオン選択を全て最適化した。ＳＰＥ条件は、代用ペプチドの大半を保持しながら、大部分の干渉を除去するために不可欠であった。ＰＲＭパラメータ及びフラグメントイオン選択は、良好なデータ正確性及び方法感度への鍵であった。

試験物品としてＮＩＳＴｍＡｂ（ＩｇＧ１サブクラス）及び内製ｍＡｂ４（ＩｇＧ４サブクラス）の両方を使用して、較正曲線の良好な直線性を、１～１０００μｇ／ｍＬの試験した範囲で達成し得る。この方法の選択性を、６つの異なるロットのサル血清を使用して評価し、定量化下限（ＬＬＯＱ）を、様々なサル血清中で１～２μｇ／ｍＬであると決定した。加えて、この方法の精度及び正確性を、４つの異なるＱＣレベル（１、３、６０及び６００μｇ／ｍＬ）で、９５％～１０５％の正確性及び＜６％のＣＶで試験した。最後に、試料当たり＜１分の分析速度及びクロスラン混入ゼロで、この方法はハイスループット環境で容易に適用され得る。

方法評価を通じて、このＬＣフリーのＰＲＭ－ＭＳベースの方法は、２～１０００μｇ／ｍＬの定量化範囲で、動物血清中のヒト化治療用ｍＡｂのハイスループットで包括的な定量化に好適であると実証された。

上述の明細書において、本発明をその特定の実施形態に関連して記載し、多くの詳細を例証の目的のために提示してきたが、本発明には追加の実施形態を受ける余地があること、及び本明細書に記載される詳細の特定のものは本発明の基本原理から逸脱することなしにかなり変動され得ることが、当業者には明らかとなる。

本明細書で引用される全ての参考文献はそれらの全体が参照により組み込まれる。本発明は、その趣旨又は不可欠な特性から逸脱することなしに他の特定の形態で具現化され得、したがって、前述の明細書ではなく、添付の特許請求の範囲を、本発明の範囲を示すとして参照されたい。

Claims (19)

1. 試料中の標的抗体を定量化するための液体クロマトグラフィーフリーの方法であって、
   前記試料に、標識内部標準抗体をスパイクすることと、
   前記試料中の前記抗体を消化して、ペプチドを生成することと、
   前記ペプチドを分画することと、
   前記標的抗体を、１つ以上のイオントラップ及び２つ以上の四重極質量フィルタ及びエレクトロスプレーイオナイザーを含有する直接注入ＭＳ^２システムを使用して定量化することと、を含み、前記方法が、液体クロマトグラフィーフリーである、方法。
2. 分画の前に、前記ペプチドに、標識タグ付きＦｃペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）をスパイクするステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ペプチドが、固相抽出によって分画される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記固相抽出が、逆相固相抽出である、請求項３に記載の方法。
5. 標識内部標準抗体及び質量タグ付きＦｃペプチドが、重同位体で標識される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記重同位体が、^１３Ｃ、^１５Ｎ、及び^２Ｈからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
7. 前記標的抗体が、ヒトモノクローナル抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 質量分析システムが、タンデム質量分析システムである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 生体試料中のタンパク質薬物生成物を定量化する方法であって、
   前記試料に、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する既知量の重質量タグ付きペプチド標準をスパイクすることと、
   前記試料中のタンパク質薬物生成物をペプチドに消化することと、
   前記ペプチドを、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチドを保持する条件下で分画することと、
   前記タンパク質薬物生成物ペプチド及びペプチド標準を含有する前記試料を、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する前記ペプチドの存在について、ＭＳ^２システムを使用して分析して、前記システムを較正することであって、前記ＭＳ^２システムが、１つ以上のイオントラップ及び２つ以上の四重極質量フィルタ及びエレクトロスプレーイオナイザーを含む、分析することと、
   前記試料中に存在するタンパク質薬物生成物の量を、前記ペプチドの存在に基づいて定量化することと、を含み、前記方法が、液体クロマトグラフィーを利用しない、方法。
10. 薬物生成物イオン及び質量タグ付きペプチド標準イオンを定量化するためのデータが、異なるＭＳ^２スキャンにおいて取得される、請求項９に記載の方法。
11. 前記ペプチドが、逆相固相抽出を使用して分画される、請求項９に記載の方法。
12. 前記逆相固相抽出が、洗浄としての１５～２５％アセトニトリル及び２０～３０％アセトニトリル溶出を使用する、請求項４又は１１に記載の方法。
13. 前記試料を消化する前に、タンパク質薬物生成物の前記試料に、重同位体標識タンパク質薬物生成物をスパイクすることを更に含む、請求項９に記載の方法。
14. 前記タンパク質薬物生成物が、抗体若しくはその抗原結合フラグメント、組換えタンパク質、融合タンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１又は９に記載の方法。
15. 前記試料が、血清を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記方法が、１～１０００μｍ／ｍＬのダイナミックレンジを有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記方法が、１～２μｇ／ｍＬの定量化下限（ＬＬＯＱ）を有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記方法が、自動化ハイスループット方法である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記方法が、試料当たり１分未満の分析速度を有する、請求項１８に記載の方法。
    

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